CN113444637B - 一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，包括：细胞培养及分组给药系统，用于监测不同时间点各组相比EPCs对照组，进行LPS处理后细胞的增殖变化情况以及与氢气浓度依赖性的关系；Transwell细胞迁移检测系统以及Tube forming test成管能力变化检测系统；分别用于实施Transwell检测细胞迁移实验和Tube forming test检测细胞成管能力实验以监测不同时间点各组相比EPCs加入LPS刺激后细胞迁移能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞迁移能力是否得到修复以及与氢气浓度依赖性的关系。还公开了对应的研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验方法。

Description

一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法
技术领域
本发明涉及医学实验系统及方法技术领域，特别是涉及一种研究内皮祖细胞损伤修护的 氢气培养实验系统及方法。
背景技术
自从Asahara等1997年首先从人外周血分理处EPCs后，很多学者对其进行了广泛研究。 EPCs参与了组织缺血或损伤后血管修复和损伤血管的再内皮划，并可向肿瘤组织归巢参与肿 瘤血管新生。EPCs的分离获得了血管发生的新机制：即来源于骨髓的EPCs增殖、趋化、分 化，参与新生血管的形成，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复理论，EPCs 和中风、胶质瘤以及脑创伤等神经系统疾病有着密切联系，但目前的研究处于初级阶段。
EPCs与血管新生的关系及其在治疗性血管新生中具有的价值逐渐受到人们的重视。有人 开始通过移植EPC进行治疗性血管新生，以促进某些缺血性疾病的微血管生长，并在治疗肢 体缺血性疾病和心肌梗死方面取得了不少进展。体外扩增EPCs为治疗性血管新生提供了充 足的细胞来源，此外EPCs还可作为基因治疗的载体并对EPCs进行基因修饰，即EPCs可以 作为基因治疗的载体将目的基因携带到血管生成组织进行表达，利用EPCs向血管生成区归 巢，并整合到新生血管内膜中的现象定向致导治疗疾病。然而，EPCs在应用于临床治疗之前， 还有以下问题需要解决：(1)EPCs的分离、培养和坚定尚未标准化，因此不好比较各个实 验室的研究结果；(2)外周或骨髓中EPCs含量较少，体外培养如何有效扩增仍需进一步研 究；(3)应用EPCs进行治疗时，如何避免其可能促进肿瘤生长；(4)对于心急梗死和肢 体缺血等疾病，EPCs移植治疗容易到达病变部位，但用于中枢神经系统疾病治疗，如何有效 地透过血脑屏障，以达到损伤或病变部位，仍需深入研究。
氢气是无色、无味、无毒的气体分子，具有重要的生理性调节作用，是近些年发现的能 有效治疗脑血管疾病的新颖介质。如通过给大鼠吸入2％的氢气，发现氢气可明显减轻毒性氧 自由基·OH和OONO-的损伤，抑制I/R后的神经细胞凋亡，抑制神经小胶质细胞增生，减 少大鼠缺血后的脑梗死面积，证实了氢气具有选择性抗氧化及细胞凋亡等作用。富氢水可以 通过影响线粒体通透性转换孔的开放，减轻全脑缺血/再关注的大鼠脑损伤，减少神经细胞凋 亡，并进一步实验证实，该保护作用是通过清除脑I/R产生的自由基来实现的。截止目前， 经众多学者实验证实请求对脑缺血性疾病、代谢综合征、器官移植、肿瘤放化疗不良反应、2 型糖尿病等150多种人类重大疾病具有显著的疗效。
然而，目前还没有用于研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法作为氢气修 复作用的实验支撑，从而无法具象的展示请求对细胞修复损伤的作用和效果。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统， 包括：细胞培养及分组给药系统；Transwell细胞迁移检测系统；以及Tubeforming test成管 能力变化检测系统；其中所述细胞培养及分组给药系统用于监测不同时间点各组相比EPCs 对照组，进行LPS处理后细胞的增殖变化情况以及与氢气浓度依赖性的关系；所述Transwell 细胞迁移检测系统用于实施Transwell检测细胞迁移实验以监测不同时间点各组相比EPCs加 入LPS刺激后细胞迁移能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞迁移能力是否得到 修复以及与氢气浓度依赖性的关系；所述Tube formingtest成管能力变化检测系统用于实施 Tube forming test检测细胞成管能力实验以监测不同时间点各组相比EPCs对照组加入LPS 刺激后细胞成管能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞成管能力是否得到修复以 及与氢气浓度依赖性的关系。
优选的，所述细胞培养及分组给药系统包括第一细胞培养箱，酶标仪以及96孔板。
优选的，所述Transwell细胞迁移检测系统包括第二细胞培养箱,光学显微镜以及倒置拍 照显微镜。
优选的，所述Tube forming test成管能力变化检测系统包括枪头盒、EP管、24孔板、冰 盒、孵箱以及荧光显微镜。
本发明的目的还在于提供一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验方法，包括如下 步骤：
步骤1，通过所述细胞培养及分组给药系统进行细胞培养及分组给药，从而将通过分离 实验得到的EPCs细胞分为EPCs组、EPCs+20μg/mL LPS组；EPCs+20μg/mL LPS+20％氢气 组、EPCs+20μg/mL LPS+40％氢气组以及EPCs+20μg/mL LPS+60％氢气组；
步骤2，通过所述Transwell细胞迁移检测系统实施细胞迁移检测实验；以及
步骤3，通过所述Tube forming test成管能力变化检测系统实施成管能力变化检测实验。
优选的，所述步骤1包括：
步骤11，在第一细胞培养箱内采用EPCs传代培养3天后，用0.25％胰蛋白酶消化搜集 贴壁细胞，1500rpm/min离心4分钟，弃去上液，悬浮于M199培养基中，吹打混匀，计数，调节细胞浓度至10^5/mL；
步骤12，将等量的EPCs细胞接种到96孔板中，设置3个复孔，每孔加100μL，培养24h待细胞贴壁后；
步骤13，配制1mg/mL的LPS母液，按照上述分组进行给药并且通氢处理，其中氢气浓 度分别为20％、40％、60％；
步骤14，24h、48h、72h后，在所述96孔板的每孔加入配置好的5mg/ml MTT溶液20μL， 置于培养箱中继续孵育，4h后小心吸去上清液，每孔加入200μL DMSO，室温于摇床震荡10min；
步骤15，酶标仪492nm波长测出不同时间点OD值，用测得的OD值进行细胞活性影响的分析。
优选的，所述步骤2包括：
步骤21，待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入300μL细胞悬液，按照分组进行培 养，48h后在下室内加入600μL的含有血清的培养基，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件下分别培养24h、48h、72h；
步骤22，取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30分钟后，采用0.1％结晶紫染色10分钟；
步骤23，将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在所述光学显微镜以及倒置拍照显微 镜下拍照观察。
优选的，所述步骤3包括：
步骤31，将Matrigel基质胶4℃过夜溶解，将所述枪头盒、EP管、24孔板均在4℃ 过夜预冷；
步骤32，次日在所述冰盒上进行铺胶，将Matrigel基质胶250ul/孔加入24孔板，在37 ℃的所述孵箱放置30min；
步骤33，在胶凝固的过程中，按照所述步骤1获得的细胞分组开始准备细胞悬液，细 胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105ell/mL；
步骤34，所述24孔板的每孔接种50000细胞，然后放入所述孵箱中培养6h；
步骤35，6小时后加入钙黄绿素Calcein AM染色，Calcein AM终浓度为0.25ug/ml；
步骤36，钙黄绿素染色30分钟后在所述荧光显微镜下观察拍摄。
优选的，所述步骤1的所述EPCs细胞获得的步骤包括：
EPCs分离和诱导，包括：颈椎脱臼处死，无菌条件下取小鼠四肢骨，吸取含100IU/mL 肝素的M199基本培养液，冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓，其中M199培养基10g，FBS20％，NaHCO32.2g，L-谷氨酰胺300mg，抗坏血酸37.5mg，青霉素10万单位，链霉素10 万单位；以1000r/min的速度离心5min，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞，用滴管轻 轻滴加到密度为1.083*10^3g/L的histopaque-1083分离液上；以2200r/min的速度离心20min，离心后可观察到离心管内液体分为3层：底层为红细胞层；中间层可观察到约2-3mm厚的白膜层，此层即为单核细胞层；上层为血清层。取界面层的单个核细胞，培养液洗涤，计数备用；将提取出来的单核细胞加于新的FN包被孔板内中，加入含10ng/ml EGF、10ng/ml的bFGF、 10ng/ml的VEGF因子的M199完全培养基继续培养；细胞接种后第4天首次更换细胞培养液， 弃去未贴壁细胞，将贴壁细胞继续培养，此后每2天更换培养液1次；
5d细胞免疫荧光检测，包括：用培养基将DiI-Ac-LDL红色荧光标记人源乙酰化低密度 脂蛋稀释成50ug/ml；将稀释好的荧光标记的低密度脂蛋白加到细胞中，37℃温育4h；去掉 培养基；用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；用4％多聚甲醛固定细胞室温10min；用10ug/ml FITC标记荆豆凝集素I室温孵育1h；用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；室温避光孵育Hoechst 10min；荧光显微镜下观察拍照；
免疫荧光检测目的蛋白变化，包括：4％多聚甲醛固定孔板内各组细胞；PBS清洗3遍， 每次5min；0.1％Triton X-100室温通透10min；PBS清洗3遍，每次5min；5％FBS封闭，37℃，1h；加入一抗后在4℃下孵育过夜；PBS清洗3遍，每次5min；CY3/FITC标记的二 抗37℃孵育1h；PBS漂洗3次，5min/次；室温避光孵育Hoechst 10min；在荧光显微镜下观 察拍照。Hoechest可染细胞核。Hoechest 33258是膜透性的,因此在活细胞时候能轻松进入； DAPI是半透性的，有选择性的进入。因此Hoechest 33258一般用来染活细胞，可以长驱直 入；DAPI一般是染固定细胞。
本发明的有益效果：
利用本发明的系统和方法可以研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法作为 氢气修复作用的实验支撑，量化和具象的展示请求对细胞修复损伤的作用和效果，从而进一 步研究氢气对LPC处理EPCs细胞损伤的修复作用。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实 施例。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。本发明的目 标及特征考虑到如下结合附图的描述将更加明显，附图中：
附图1为根据本发明实施例的研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统的结构示意 图；
附图2为根据本发明实施例的EPCs分离和诱导实验结果示意图；
附图3为根据本发明实施例的5d细胞免疫荧光检测结果示意图；
附图4为根据本发明实施例的10d免疫荧光检测结果示意图；
附图5为根据本发明实施例的21d免疫荧光检测结果示意图；
附图6为根据本发明实施例的细胞培养及分组给药实验结果图；
附图7为根据本发明实施例的Transwell检测细胞迁移中加入LPS刺激后细胞迁移能力 对比示意图；
附图8为根据本发明实施例的Transwell检测细胞迁移通入不同浓度的氢气处理，细胞迁 移能力得到修复的对比示意图；
附图9为根据本发明实施例的Tube forming test成管能力变化检测加入LPS刺激后细胞 迁移能力对比示意图；
附图10为根据本发明实施例的Tube formingtest成管能力变化检测通入不同浓度的氢气 处理，细胞迁移能力得到修复的对比示意图。
具体实施方式
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发 明的上述以及其他目的、优点和特征。
如图1所示本实施例研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，包括：细胞培养及 分组给药系统；Transwell细胞迁移检测系统；以及Tube forming test成管能力变化检测系统； 其中所述细胞培养及分组给药系统用于监测不同时间点各组相比EPCs对照组，进行LPS处 理后细胞的增殖变化情况以及与氢气浓度依赖性的关系；所述Transwell细胞迁移检测系统用 于实施Transwell检测细胞迁移实验以监测不同时间点各组相比EPCs加入LPS刺激后细胞迁 移能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞迁移能力是否得到修复以及与氢气浓度 依赖性的关系；所述Tube forming test成管能力变化检测系统用于实施Tube formingtest检测 细胞成管能力实验以监测不同时间点各组相比EPCs对照组加入LPS刺激后细胞成管能力变 化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞成管能力是否得到修复以及与氢气浓度依赖性的 关系。其中，细胞培养及分组给药系统包括第一细胞培养箱，酶标仪以及96孔板。Transwell 细胞迁移检测系统包括第二细胞培养箱,光学显微镜以及倒置拍照显微镜。Tube forming test 成管能力变化检测系统包括枪头盒、EP管、24孔板、冰盒、孵箱以及荧光显微镜。
实验部分包括两个部分：
第一部分，小鼠骨髓来源EPCs细胞分离及鉴定
一、EPCs分离和诱导
1.1实验材料
ICR小鼠(4-6w)(常州卡文斯)，FBS(Gibico)，M199培养基(Hyclone)，梯度离 心液Histopaque-1083(Sigma)，0.25％胰蛋白酶(Hyclone)
纤维粘连蛋白(FN)包被的细胞孔板(BD)，1ml无菌注射器，细胞培养箱(ThermoScientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS,IX71)，60mm细胞培养皿(NEST)
1.2实验方法
1)颈椎脱臼处死，无菌条件下取小鼠四肢骨，吸取含肝素(100IU/mL)的M199基本培 养液(M199培养基10g，FBS 20％，NaHCO32.2g，L-谷氨酰胺300mg，抗坏血酸37.5mg， 青霉素10万单位，链霉素10万单位)，冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓；
2)1000r/min离心5min，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞，用滴管轻轻滴加到密 度为1.083*10^3g/L的histopaque-1083分离液上；
3)2200r/min离心20min，离心后可观察到离心管内液体分为3层：底层为红细胞层； 中间层可观察到约2-3mm厚的白膜层，此层即为单核细胞层；上层为血清层。取界面层的单 个核细胞，培养液洗涤，计数备用；
4)将提取出来的单核细胞加于新的FN包被孔板内中，加入含因子(10ng/ml EGF、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的VEGF)的M199完全培养基继续培养；
5)细胞接种后第4天首次更换细胞培养液，弃去未贴壁细胞，将贴壁细胞继续培养，此 后每2天更换培养液1次。
1.3实验结果
如图2所示，EPCs分离和诱导实验结果，实验结果显示：成功分离出小鼠骨髓来源EPCs 细胞，细胞状态良好，可以用于后期实验。
二、5d细胞免疫荧光检测(Dil+FITC)
2.1实验材料
Human DiI-Ac-LDL红色荧光标记人源乙酰化低密度脂蛋白(复申生物，FS1088)，FITC 标记荆豆凝集素I(复申生物，FS1109)，5％FBS(Gibico)，PBS(CTCC)，4％多聚甲醛 光学显微镜(XDS-1A)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS,IX71)
2.2、实验方法
1)用培养基将DiI-Ac-LDL红色荧光标记人源乙酰化低密度脂蛋稀释成50ug/ml；
2)将稀释好的荧光标记的低密度脂蛋白加到细胞中，37℃温育4h；
3)去掉培养基；
4)用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；
5)用4％多聚甲醛固定细胞室温10min；
6)用10ug/ml FITC标记荆豆凝集素I室温孵育1h；
7)用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；
8)室温避光孵育Hoechst 10min；
9)荧光显微镜下观察拍照。
2.3实验结果
如图3所示，EPCs细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝 集素I的功能，当内皮祖细胞吞噬了Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白后，在荧光显微镜下可见 红色荧光，当内皮祖细胞吞噬了FITC标记的荆豆凝集素I后，可见绿色荧光。
三、免疫荧光检测目的蛋白变化(10d和21d)
3.1实验材料
4％多聚甲醛(上海润捷)，0.1％Triton(上海润捷)，5％FBS(Lonsera)，Hoechst(碧云天)
细胞培养箱(Thermo)，荧光倒置显微镜(OLYMPUS,IX71)，超净工作台(苏州安泰科技 有限公司)，
3.2实验方法
1)4％多聚甲醛固定孔板内各组细胞；
2)PBS清洗3遍，每次5min；
3)0.1％Triton X-100室温通透10min(细胞核和细胞质表达需要通透，细胞膜表达不需要)；
4)PBS清洗3遍，每次5min；
5)5％FBS封闭，37℃，1h；
6)加入一抗(根据抗体说明书进行稀释)，4℃孵育过夜；
7)PBS清洗3遍，每次5min；
8)CY3/FITC标记的二抗37℃孵育1h(此处选择CY3或者FITC需要根据一抗信息确定)；
9)PBS漂洗3次，5min/次；
10)室温避光孵育Hoechst 10min；
11)荧光显微镜下观察拍照。
3.3实验结果
如图4所示10d免疫荧光检测结果：
10d时对细胞进行免疫荧光检测，可见分离出的细胞成功表达C-kit、VEGFR和SCA-1。
如图5所示21d免疫荧光检测结果：
21d免疫荧光检测可见细胞成功表达eNOS和CD31，综上分离出的EPCs细胞可以用于 后期具体实验。
第二部分观察氢气对LPS处理EPCs细胞损伤修复作用
一.细胞培养及分组给药
1.1实验材料
EPCs细胞(第一部分分离得到)，FBS(Gibico)，M199培养基(Hyclone)，0.25％胰蛋白酶(Hyclone)
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS, IX71)，96孔板(NEST)
1.2实验方法
实验分组：
A：EPCs组；
B：EPCs+LPS(20μg/mL)组；
C：EPCs+LPS(20μg/mL)+氢气(20％)组；
D：EPCs+LPS(20μg/mL)+氢气(40％)组；
E：EPCs+LPS(20μg/mL)+氢气(60％)组；
1)EPCs传代培养3天后，用0.25％胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，1500rpm/min离心4分 钟，弃去上液，悬浮于M199培养基中，吹打混匀，计数，调节细胞浓度至10^5/mL；
2)将等量的EPCs细胞接种到96孔板中，设置3个复孔，每孔加100μL，培养24h待细胞贴壁后；
3)配制1mg/mL的LPS母液，按照上述分组进行给药并且通氢处理(氢气浓度分别为20％、40％、60％)；
4)24h、48h、72h后，每孔加入配好的MTT溶液(5mg/ml)20μL，置于培养箱中继续 孵育，4h后小心吸去上清液，每孔加入200μL DMSO，室温于摇床震荡10min；
5)酶标仪492nm波长测出不同时间点OD值，用测得的OD值进行细胞活性影响的分析。
1.3实验结果
如图6所示，实验结果显示：24h、48h、72h三个时间点各组变化情况基本类似，即相比EPCs对照组，加入20μg/ml的LPS处理，细胞的增殖显著受到抑制，当将细胞放入不同 浓度的(20％、40％、60％)条件下，细胞的抑制率逐渐降低，且与氢气浓度呈剂量依赖性，其中72h，60％氢气浓度下效果很显著。
二.Transwell检测细胞迁移
2.1实验材料
Tanswell plate:Costar,Coring Incorporated,USA，聚碳酯膜微孔(0.8μm)，0.1％结晶紫染 液(CTCC)
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000),光学显微镜(XDS-1A),倒置拍照显微镜(OLYMPUS, IX71)
2.2实验方法
1)待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入300μL细胞悬液，按照分组 进行培养，48h后在下室内加入600μL的含有血清的培养基，放入细胞培养箱，在37℃， 5％CO2条件下分别培养24h、48h、72h。
2)取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色10min。
3)小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在显微镜下拍照观察。
2.3实验结果
如图7-8所示，Transwell检测细胞迁移实验结果显示：24h、48h、72h各组变化情况类 似，即相比EPCs对照组，加入LPS刺激后细胞迁移能力显著降低，当通入不同浓度的氢气处理，细胞迁移能力得到修复，且与氢气浓度呈剂量依赖性，其中72h呈现出来的效果最为显著。
三.Tube forming test检测成管能力的变化
3.1实验材料
Matrigel BD Incorporated，USA，-20℃保存，钙黄绿素(Solarbio，C7600)
3.2实验方法
1)Matrigel基质胶4℃过夜溶解，枪头盒、EP管、24孔板均4℃过夜预冷；
2)次日在冰盒上进行铺胶，将Matrigel基质胶250ul/孔加入24孔板，37℃孵箱放置 30min；
3)在胶凝固的过程中，可以开始准备细胞悬液(细胞按照之前的分组)，细胞消化后将 细胞悬液浓度调整到2×105ell/mL。
4)每孔接种50000细胞，然后放入孵箱中培养6h。
5)6小时后加入钙黄绿素CalceinAM染色，CalceinAM终浓度为0.25ug/ml。
6)钙黄绿素染色30分钟后于荧光显微镜下观察拍摄。
3.3实验结果
Tube forming test检测细胞成管能力实验结果显示：24h、48h、72h各组变化情况类似， 即相比EPCs对照组，加入LPS刺激后细胞成管能力显著减弱，当通入不同浓度的氢气处理， 细胞成管能力得到修复，且与氢气浓度呈剂量依赖性，其中72h呈现出来的效果最为显著。
本实施例的系统和方法可以研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统及方法作为氢 气修复作用的实验支撑，量化和具象的展示请求对细胞修复损伤的作用和效果，从而进一步 研究氢气对LPC处理EPCs细胞损伤的修复作用。
虽然本发明已经参考特定的说明性实施例进行了描述，但是不会受到这些实施例的限定 而仅仅受到附加权利要求的限定。本领域技术人员应当理解可以在不偏离本发明的保护范围 和精神的情况下对本发明的实施例能够进行改动和修改。

Claims (9)

1.一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，其特征在于包括：细胞培养及分组给药系统；Transwell细胞迁移检测系统；以及Tube forming test成管能力变化检测系统；其中所述细胞培养及分组给药系统用于监测不同时间点各组相比EPCs对照组，进行LPS处理后细胞的增殖变化情况以及与氢气浓度依赖性的关系；所述Transwell细胞迁移检测系统用于实施Transwell检测细胞迁移实验以监测不同时间点各组相比EPCs加入LPS刺激后细胞迁移能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞迁移能力是否得到修复以及与氢气浓度依赖性的关系；所述Tube forming test成管能力变化检测系统用于实施Tube
forming test检测细胞成管能力实验以监测不同时间点各组相比EPCs对照组加入LPS刺激后细胞成管能力变化情况以及通入不同浓度的氢气处理后细胞成管能力是否得到修复以及与氢气浓度依赖性的关系。
2.根据权利要求1所述的一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，其特征在于：所述细胞培养及分组给药系统包括第一细胞培养箱，酶标仪以及96孔板。
3.根据权利要求2所述的一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，其特征在于：所述Transwell细胞迁移检测系统包括第二细胞培养箱,光学显微镜以及倒置拍照显微镜。
4.根据权利要求3所述的一种研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统，其特征在于：所述Tube forming test成管能力变化检测系统包括枪头盒、EP管、24孔板、冰盒、孵箱以及荧光显微镜。
5.一种根据权利要求4所述研究内皮祖细胞损伤修护的氢气培养实验系统的实验方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1，通过所述细胞培养及分组给药系统进行细胞培养及分组给药，从而将通过分离实验得到的EPCs细胞分为EPCs组、EPCs+20μg/mL LPS组；EPCs+20μg/mL LPS+20％氢气组、EPCs+20μg/mL LPS+40％氢气组以及EPCs+20μg/mL LPS+60％氢气组；
步骤2，通过所述Transwell细胞迁移检测系统实施细胞迁移检测实验；以及
步骤3，通过所述Tube forming test成管能力变化检测系统实施成管能力变化检测实验。
6.根据权利要求5所述的实验方法，其特征在于所述步骤1包括：
步骤11，在第一细胞培养箱内采用EPCs传代培养3天后，用0.25％胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，1500rpm/min离心4分钟，弃去上液，悬浮于M199培养基中，吹打混匀，计数，调节细胞浓度至10^5/mL；
步骤12，将等量的EPCs细胞接种到96孔板中，设置3个复孔，每孔加100μL，培养24h待细胞贴壁后；
步骤13，配制1mg/mL的LPS母液，按照上述分组进行给药并且通氢处理，其中氢气浓度分别为20％、40％、60％；
步骤14，24h、48h、72h后，在所述96孔板的每孔加入配置好的5mg/ml MTT溶液20μL，置于培养箱中继续孵育，4h后小心吸去上清液，每孔加入200μLDMSO，室温于摇床震荡10min；
步骤15，酶标仪492nm波长测出不同时间点OD值，用测得的OD值进行细胞活性影响的分析。
7.根据权利要求5所述的实验方法，其特征在于所述步骤2包括：
步骤21，待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入300μL细胞悬液，按照分组进行培养，48h后在下室内加入600μL的含有血清的培养基，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件下分别培养24h、48h、72h；
步骤22，取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30分钟后，采用0.1％结晶紫染色10分钟；
步骤23，将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在所述光学显微镜以及倒置拍照显微镜下拍照观察。
8.根据权利要求5所述的实验方法，其特征在于所述步骤3包括：
步骤31，将Matrigel基质胶4℃过夜溶解，将所述枪头盒、EP管、24孔板均在4℃过夜预冷；
步骤32，次日在所述冰盒上进行铺胶，将Matrigel基质胶250ul/孔加入24孔板，在37℃的所述孵箱放置30min；
步骤33，在胶凝固的过程中，按照所述步骤1获得的细胞分组开始准备细胞悬液，细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105ell/mL；
步骤34，所述24孔板的每孔接种50000细胞，然后放入所述孵箱中培养6h；
步骤35，6小时后加入钙黄绿素Calcein AM染色，Calcein AM终浓度为0.25ug/ml；
步骤36，钙黄绿素染色30分钟后在所述荧光显微镜下观察拍摄。
9.根据权利要求5所述的实验方法，其特征在于所述步骤1的所述EPCs细胞获得的步骤包括：
EPCs分离和诱导，包括：颈椎脱臼处死，无菌条件下取小鼠四肢骨，吸取含100IU/mL肝素的M199基本培养液，冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓，其中M199培养基10g，FBS 20％，NaHCO3 2.2g，L-谷氨酰胺300mg，抗坏血酸37.5mg，青霉素10万单位，链霉素10万单位；以1000r/min的速度离心5min，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞，用滴管轻轻滴加到密度为1.083*10^3g/L的histopaque-1083分离液上；以2200r/min的速度离心20min，离心后可观察到离心管内液体分为3层：底层为红细胞层；中间层可观察到2-3mm厚的白膜层，此层即为单核细胞层；上层为血清层；取界面层的单个核细胞，培养液洗涤，计数备用；将提取出来的单核细胞加于新的FN包被孔板内中，加入含10ng/ml EGF、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的VEGF因子的M199完全培养基继续培养；细胞接种后第4天首次更换细胞培养液，弃去未贴壁细胞，将贴壁细胞继续培养，此后每2天更换培养液1次；
5d细胞免疫荧光检测，包括：用培养基将DiI-Ac-LDL红色荧光标记人源乙酰化低密度脂蛋稀释成50ug/ml；将稀释好的荧光标记的低密度脂蛋白加到细胞中，37℃温育4h；去掉培养基；用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；用4％多聚甲醛固定细胞室温10min；用10ug/mlFITC标记荆豆凝集素I室温孵育1h；用PBS清洗细胞，5min/次，洗3次；室温避光孵育Hoechst10min；荧光显微镜下观察拍照；
免疫荧光检测目的蛋白变化，包括：4％多聚甲醛固定孔板内各组细胞；PBS清洗3遍，每次5min；0.1％Triton X-100室温通透10min；PBS清洗3遍，每次5min；5％FBS封闭，37℃，1h；加入一抗后在4℃下孵育过夜；PBS清洗3遍，每次5min；CY3/FITC标记的二抗37℃孵育1h；PBS漂洗3次，5min/次；室温避光孵育Hoechst 10min，其中Hoechest可染细胞核；在荧光显微镜下观察拍照。
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