CN102217561B - 一种海湾扇贝雄性不育体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海湾扇贝雄性不育体的制备方法。选择与海湾扇贝同属、染色体数目相同、配子形态和尺寸相近，且同为雌雄同体的秘鲁扇贝与海湾扇贝杂交，以制备雄性不育体。这些雌雄不育体随着性腺发育，精巢逐渐被卵巢所取代，性腺发育成熟时，整个性腺呈雌性特有的橘红色，且只能产生卵子而能不产生精子。本专利所阐述的方法具有不育体比例高和技术效果稳定、相对简单、易推广等优点。

Description

一种海湾扇贝雄性不育体的制备方法

技术领域

本发明涉及海湾扇贝，具体地说是用北方海湾扇贝(Argopectenirradians irradians)和秘鲁扇贝(Argopecten purpuratus)进行种间杂交获得雄性不育体的制备方法，特别提供了一种雌雄同体型海湾扇贝雄性不育体的制备方法。

背景技术

雄性不育体的制备一直是海湾扇贝生产性完全杂交制种的关键。北方海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)原产于美国大西洋沿岸，左右壳几近相等，壳面放射肋16～21条，适温2～34℃，适盐25～34，以浮游植物和有机碎屑为食。在原产地的繁殖期为9～10月份。幼苗当年秋季可达5cm以上，较大个体7cm。生物学最小型为2.2cm，当年可达性成熟，翌年形成生殖高峰。寿命12～16个月，少数可达24个月。海湾扇贝为雌雄同体，生殖腺位于腹嵴，精巢位于腹嵴外周缘，卵巢位于精巢内侧。被覆在未成熟生殖腺外表的一层黑膜在成熟过程中逐渐消退，成熟的卵巢为橘红色，精巢为乳白色。精子和卵子进入肾腔后，由外肾殖孔排入外套腔内，再靠水流作用排出体外，行体外受精。

1982年中国科学院海洋研究所张福绥院士将海湾扇贝引种到我国，因其生长速度快、养殖效益高，在世界上首次形成了海湾扇贝养殖业，并成为我国海水养殖的支柱产业之一。近些年来，由于环境恶化及近交衰退等原因，养殖海湾扇贝病害频发、贝体小型化、长势低化，严重影响了产业的健康可持续发展。因此，抗性强、长势好的海湾扇贝新品种已成为产业发展的迫切需求。实践表明，杂交育种是提高养殖扇贝抗性等生产性能的有效途径。

目前海湾扇贝的杂交育种主要是通过群体混交和精控杂交。群体混交虽可扩大杂交规模，适合在生产中应用，但作为雌雄同体型动物，海湾扇贝的成熟精卵通过同一生殖孔道从体内排出体外，而大多数情况下是精子先于卵子排出。因此在同一个容器内卵子很容易遭到同一个体精子的“污染”，从而导致自体受精，使杂交效率低化，难以达到生产性要求。精控杂交虽可实现完全的定向杂交，但其操作繁琐，无法进行生产性应用。海湾扇贝未受精的纯净卵子的获得，要远难于纯净精子的获得，特别是规模化生产时其难度差异就更大了，甚至可以说是根本无法进行严格意义上的生产性定向完全杂交。因此，海湾扇贝雌雄同体的生殖特性是实现其高效定向完全杂交技术应用的主要障碍。为了保证杂交技术的有效应用，海湾扇贝雄性不育体化技术，即创制只能产生卵子，不能产生精子的雄性不育体，是实现海湾扇贝生产性高效杂交制种的技术关键。

对于雌雄异体动物的育种不存在雄性不育性的技术需求。在软体动物门、双壳纲、扇贝科的种类，其大多数种属也都是雌雄异体生殖类型，仅在海湾扇贝属，其大多数种类是完全雌雄同体生殖类型，而其多有较高的经济价值，几个亚种或种亦已引种到中国养殖。

为了获得雄性不育体海湾扇贝，理论上可有多条途径，如激素诱导法等，但因其技术难度高、效率低等原因尚无成功案例，而其还有环境和食品安全等原因更增加了实际操作的难度。近几年，我们采用多种扇贝对海湾扇贝进行杂交方法以期获得雄性不育体，如海湾扇贝×栉孔扇贝(正反交)、海湾扇贝×华贵栉孔扇贝(正反交)、海湾扇贝×虾夷扇贝(正反交)等，这些组合的受精都存在明显的困难，或在胚胎发育期因畸形而夭折，其更难言及雄性不育体的获得了。同时在Argopecten irradians种内的亚种间杂交研究也在进行。原产于美国弗吉尼亚及其毗邻水域的北方海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)是海湾扇贝(Argopecten irradians)的一个亚种，是我国目前的主养品种，而其另一个产于墨西哥湾及其毗邻水域的姊妹亚种墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)也已引种到我国进行养殖。该两个亚种的正反交实验表明，其精卵可正常受精并发育，但其子代中未发现雄性不育体的存在。因此，通过海湾扇贝(Argopecten)属内不同种间的杂交是可能获得雄性不育体的一个新途径。

发明内容

2009年有关产业单位从南美洲引进一批秘鲁扇贝(Argopectenpurpuratus)以期直接用于养殖生产。鉴于秘鲁扇贝与海湾扇贝性状的互补性，特别是鉴于两种扇贝染色体数目相同、配子形态和尺寸相近、同源性较强、分化历史不远，且同为雌雄同体生殖类型等因素，在前期海湾扇贝亚种间杂交的基础上，我们重点开展了海湾扇贝和秘鲁扇贝属内种间杂交研究，以期在海湾扇贝雄性不育性研究方面取得突破。经过严格的杂交实验及近一年的跟踪养殖试验观察，海湾扇贝×秘鲁扇贝(正反交)组合可产生较高比例的雄性不育体。到目前为止，除本专利所述，尚未见有制备海湾扇贝雄性不育体及以此为基础的进一步方法或产品的报道，更不论其它贝类或其它动物的这方面报道。到目前为止，海湾扇贝×秘鲁扇贝(正反交)杂交组合是海湾扇贝乃至所有贝类通过种间杂交途径制备并获得雄性不育体之唯一途径。

海湾扇贝雄性不育体的创制成功，为雄性不育系的建立奠定了基础，并使海湾扇贝生产性杂交制种成为可能。同时，海湾扇贝的雄性不育化也将为贝类的性别演化与控制机制等基础理论研究提供新的研究平台。

本发明所要解决的技术问题是提供了一种适合制备海湾扇贝雄性不育体的方法，填补了海湾扇贝乃至贝类雄性不育体制备的空白。本发明所具有不育体比例高，效果稳定，技术相对简单，容易推广等优点。

本发明提供了如下的技术方案：

一种海湾扇贝雄性不育体的制备方法，通过北方海湾扇贝(Argopectenirradians irradians)与秘鲁扇贝(Argopecten purpuratus)种间杂交获得海湾扇贝雄性不育体，这些不育体可达性成熟，发育成熟的不育体只有橘红色雌性性腺，并只能产生卵子而不能产生精子。

具体操作过程如下：

1亲本的促熟和催产，

a.促熟：亲贝的促熟是在每年的1～4月份，海湾扇贝亲贝催熟的起始温度和当时自然海水温度一致，一般为7～8℃；秘鲁扇贝亲贝催熟的起始温度和引进时引进地的自然海水温度一致，为11～12℃；每天升温0.5～1℃，逐渐升至16℃，稳定3～5天后，再升至18～20℃培养；促熟过程一共持续15～20天；

b.投喂饲料为新鲜硅藻，并辅以人工饲料；人工饲料为螺旋藻粉或蛋黄，占投喂饲料总重量的5～10％；

c.经过促熟的海湾扇贝和秘鲁扇贝亲本，阴干15～30mins后，用注射器向闭壳肌注射0.015～0.025mM的5-羟色胺0.05～0.15mL。2亲本精、卵的分别排放和收集，

a.海湾扇贝和秘鲁扇贝的亲本被分别单个放入单独的预置升温海水的容器中，在30mins内水温从18～20℃逐渐升至24℃；

b.水温升至24℃后的15～30mins，亲本开始排出精子，这个过程持续45～60mins；每个个体的精子被单独收集；

c.排精结束后，用22～24℃海水对精子排放后的扇贝充分冲洗，以清除亲本壳内外粘污的精子；

d.亲本排精后约15～20mins，开始排卵，每个个体可排卵3～4次；每个亲本排出的卵子也被单独收集；在人工授精前，避免意外受精；

e.将收集的卵子倒入≥400目的筛网内，用22～24℃海水对卵子进行反复冲洗，以防卵子表面被其它精子的意外粘污。

3海湾扇贝和秘鲁扇贝的杂交，

a.海湾扇贝和秘鲁扇贝实行一对一正反向杂交，用海湾扇贝的精子给秘鲁扇贝的卵子授精，同时也用秘鲁扇贝的精子给海湾扇贝的卵子授精，建立正反交杂交组合；控制每个卵子表面附有精子5～10个；

b.为了确保没有自体受精的发生，在杂交的同时，分别取海湾扇贝亲本和秘鲁扇贝亲本的部分卵子不加入精液，以为对照；1～2小时后镜检，如发现有受精胚体出现，则其相应的正反向杂交组合被放弃。

4海湾扇贝和秘鲁扇贝杂交子代的培养，

a.受精卵在22～24℃沙滤海水中20～24小时孵化成面盘幼虫，面盘幼虫培养密度为5～7个/ml；

b.幼虫孵化后开始投喂金藻，5天及5天后投喂等体积混合的金藻和硅藻，根据幼虫胃内饲料镜检情况，以决定每天投入的饲料次数和数量；

c.当30～40％幼虫出现眼点时，投入聚乙烯网片用做幼虫的附着基；

d.孵化后的10～13天，幼虫经过附着变态成为稚贝；将稚贝和其附着基装入50～70目尼龙网袋培育，每个网袋放入1～2片附有稚贝的附着基；

e.当稚贝壳长达到600～800μm时进行降温培育，每天降温1～2℃，直至温度降至室外自然海水温度，并直接转入海区或海水池塘养殖；

f.当稚贝壳长达到0.3～5cm时，将其从附着基上刷至20～30目尼龙网袋中继续海上培养，壳长达2.5～3.5cm时，转移至养成笼进行海上养成，养成笼每层置25～35个幼贝。

5杂交子代雄性不育体的鉴定，

a.对生长1龄或1龄后的杂交后代进行升温促熟；促熟方法如权利要求3所述步骤a；

b.促熟后的杂交贝通过肉眼观察性腺发育情况；

c.将水温升至22～24℃，对促熟的杂交贝进行催产，镜检观察是否有精子排放或所产卵子是否有精子污染；

d.性腺切片的辅助观察：性腺的切片将杂交个体性腺剪下，浸入Bouin’s液固定≥8小时，放入体积浓度70～80％乙醇保存；经30％，50％，70％，95％乙醇脱水，二甲苯透明，透蜡，石蜡包埋，切片厚度5μm，采用HE(苏木精-伊红)染色后用中性树胶制成永久装片；显微镜观察性腺发育情况，确定性腺内是否有成熟精子；

e.大部分个体性腺发育为完全橘红色，乳白色“精区”退化，只产生卵子，不产生精子，这类个体被确定为雄性不育体。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点：

1.本发明涉及海湾扇贝雄性不育体的制备方法，目前尚未见到关于海湾扇贝乃至所有贝类雄性不育体制备方法的报道。

2.本发明为海湾扇贝生产性完全杂交制种技术新方案提供的材料基础。

3.本发明用来制备雄性不育体的方法是采用种间杂交方法，该方法保证了雌性不育体的持续获得。

4.本发明通过种间杂交成功培育出海湾扇贝的雄性不育体，与其他方法，例如激素法相比，制备的雄性不育体比例高、技术效果稳定、且没有污染和潜在的食品安全问题。

5.本发明通过海湾扇贝和秘鲁扇贝的杂交获得海湾扇贝雄性不育体，其杂交对象的选择适合，没有配子隔离，且F₁可达性成熟。

6.本发明通过种间杂交成功培育出海湾扇贝的雄性不育体，雄性不育体的制作技术较为简单、效果稳定、易于推广。

7.本发明所涉及的雌雄同体杂交方法，采用雌雄同体扇贝精、卵分别单独控制排放技术，能够确保种间的严格定向杂交。

具体实施方式

实施例：

亲本的促熟和催产：2009年4月，将北方海湾扇贝(Argopecten irradiansirradians)和秘鲁扇贝(Argopecten purpuratus)亲本培育水温升至20℃并恒温在20℃，以对其进行恒温促熟。海湾扇贝亲贝催熟的起始温度和当时当地自然海水温度一致，为7℃；秘鲁扇贝亲贝催熟的起始温度和引进时引进地的自然海水温度一致，为11℃；分别每天升温1℃，逐渐升至18℃，稳定3天后，再升至20℃恒温培养；促熟过程一共持续18天；投喂饲料为新鲜硅藻，并辅以人工饲料蛋黄，蛋黄占饲料总重量的10％；采卵前将经过促熟的海湾扇贝和秘鲁扇贝亲本阴干15min，用微量注射器向闭壳肌注射100μl浓度为200μM的5-羟色胺，以促进精卵的单独排放，然后对每个个体分别进行精卵的排放和收集。

1.亲本精、卵的分别排放和收集：

对先行排精个体的精子进行收集后，海湾扇贝和秘鲁扇贝的亲本被分别单个放入5L的塑料桶中待产，在30mins内水温从20℃逐步升至24℃；

水温升至24℃后的15～30mins，亲本开始排出精子，这个过程持续45～60mins；每个个体的精子被单独收集；排精结束后，用22～24℃海水对精子排放后的亲本壳内外进行彻底的清洗，清除亲本壳内外粘污的精子，以避免所粘留精子对后续所排自体卵子的意外受精；亲本排精后约15～20mins，开始排卵，每个个体可排卵3～4次；每个亲本排出的卵子也被单独收集，在人工授精前，避免意外受精；将收集的卵子倒入400目的筛网内，用22～24℃清洁海水对卵子进行反复冲洗，以防卵子表面被其它精子的意外粘污。

2.海湾扇贝和秘鲁扇贝的杂交：

在获得两种扇贝无意外污染的精卵后，海湾扇贝和秘鲁扇贝实行一对一正反向杂交，分别用海湾扇贝的精子给秘鲁扇贝的卵子授精，用秘鲁扇贝的精子给海湾扇贝的卵子授精，建立正反交杂交组合；每个卵子表面控制精子5～10个；制备8个海湾扇贝×秘鲁扇贝(正交)，8个秘鲁扇贝×海湾扇贝(反交)杂交系。

为了确保没有自体受精的发生，在杂交的同时，分别取海湾扇贝亲本和秘鲁扇贝亲本的部分卵子不加入精液，作为对照，1～2小时后镜检，如发现有受精胚体出现，则其相应的正反向杂交组合被放弃。

3.海湾扇贝和秘鲁扇贝杂交子代的培养：

受精卵在22～24℃沙滤海水中20～24小时孵化成面盘幼虫，幼虫孵化后开始投喂金藻，5日龄前幼虫投喂金藻；5日及5日后投喂等体积混合的金藻和硅藻，根据幼虫胃内饲料镜检情况，来决定每天投入的饲料次数和数量；杂交幼虫的培养密度5～7个/ml，用于幼虫培养的海水控制在22～24℃左右。

当杂交扇贝幼虫30～40％出现眼点时(此时杂交贝壳长至约190～210μm)，投入聚乙烯网片作为幼虫的附着基；

幼虫孵化后的10～13天，幼虫附着结束，扇贝的幼虫变态成为稚贝，将稚贝和其附着基装入60目尼龙网袋(或聚乙烯网袋)培育，每个网袋放入1～2片附着基；

当稚贝壳长达到600～800μm时进行降温培育，每天降温2℃，直至温度降至自然海水温度，直接挂海上培养；

当稚贝壳长达到0.3～5cm时，将其从附着基上刷至20～30目尼龙网袋中继续海上培养，壳长达2.5～3.5cm时，转移至养成笼进行海上养殖，养成笼每层25～35个幼贝。

4.杂交后代雄性不育体的鉴定方法如下：

每个杂交系取10个只有雌性腺个体进行催产和镜检，取3只个体进行性腺切片观察。

a.2010年4月对1龄杂交后代进行室内升温催熟；

催熟的起始温度和当时当地自然海水温度一致，为7℃；分别每天升温1℃，逐渐升至16℃，稳定3天后，再升至20℃培养；促熟过程一共持续20天；

b.促熟后的杂交贝通过肉眼观察性腺发育情况；50.0～84.9％以上个体只保留橘红色雌性性腺(表1)；

c.将水温升至22～24℃，利用22～24℃海水对促熟的杂交贝进行催产，镜检观察是否有精子排放或所产卵子是否有精子污染；

d.性腺切片的辅助观察(任成林等，动物组织H1 E1染色石蜡切片技术的改进，河北北方学院学报，2007，23：41～45)：性腺的切片将杂交个体性腺剪下，浸入Bouin’s液固定≥8小时，放入体积浓度70-80％乙醇保存；经30％，50％，70％，95％乙醇脱水，二甲苯透明，透蜡，石蜡包埋，切片厚度5μm，采用HE(苏木精-伊红)染色后用中性树胶制成永久装片；显微镜观察性腺发育情况，看性腺内是否有熟精子；

e.大部分个体性腺发育为完全橘红色、乳白色“精区”退化，只产生卵子，不产生精子，这类个体被确定为雄性不育体。

具体结果见表1：

表1：实施例1～16为16对重复配对杂交组合子代的各生产指标及雄性不育体比例，其中8个为利用海湾扇贝卵子和秘鲁扇贝精子的正向杂交(AI/AP)，8个为利用秘鲁扇贝的卵子和海湾扇贝的精子的反向杂交(AP/AI)。

实施例	交配组合	个体数	雄性不育体数	雄性不育体比例(％)
					1	AI/AP	53	39	73.6
2	AI/AP	26	21	80.8
					3	AI/AP	18	11	61.1
4	AI/AP	19	11	57.9
					5	AI/AP	33	18	54.5
6	AI/AP	26	13	50.0
					7	AI/AP	27	22	81.5
8	AI/AP	53	45	84.9
					9	AP/AI	57	30	52.6
10	AP/AI	67	42	62.7
					11	AP/AI	43	27	62.8
12	AP/AI	39	22	56.4
					13	AP/AI	27	19	70.4
14	AP/AI	9	6	63.0
					15	AP/AI	55	40	72.7
16	AP/AI	26	15	57.7

注：AI为海湾扇贝；AP为秘鲁扇贝。

本发明所实施例均是在大连壹桥海洋苗业责任有限公司育苗室进行的。

通过表1可以看出，杂交F₁在1龄时经过促熟产生雄性不育体的比例较高。

Claims (1)

1.一种海湾扇贝雄性不育体的制备方法，其特征在于：通过海湾扇贝与秘鲁扇贝的种间杂交以获得海湾扇贝雄性不育体，这些不育体可达性成熟，性成熟时只有橘红色雌性性腺，并只能产生卵子而不能产生精子；

所述雄性不育体的具体制备操作过程如下，

1)亲本的促熟和催产具体过程如下：

a.促熟：亲贝的促熟是在每年的1～4月份，海湾扇贝亲贝催熟的起始温度和当时自然海水温度一致，为7～8℃；秘鲁扇贝亲贝催熟的起始温度和引进时引进地的自然海水温度一致，为11～12℃；每天升温0.5～1℃，逐渐升至16℃，稳定3～5天后，再升至18～20℃培养；促熟过程一共持续15～20天；

b.投喂饲料为新鲜硅藻，并辅以人工饲料；人工饲料为螺旋藻粉或蛋黄，占饲料总重量的5～10％；

c.经过促熟的海湾扇贝和秘鲁扇贝亲本，阴干15～30mins后，用注射器向闭壳肌注射0.015～0.025mM的5-羟色胺0.05～0.15mL；

2)亲本精、卵的分别排放和收集具体过程如下：

a.海湾扇贝和秘鲁扇贝的亲本被分别单个放入单独的预置升温海水的容器中，在30mins内水温从18～20℃逐渐升至24℃；

b.水温升至24℃后的15～30mins，亲本开始排出精子，这个过程持续45～60mins；每个个体的精子被单独收集；

c.排精结束后，用22～24℃海水对精子排放后的扇贝充分冲洗，以清除亲本壳内外粘污的精子；

d.亲本排精后15～20mins，开始排卵，每个个体可排卵3～4次；每个亲本排出的卵子也被单独收集；在人工授精前，避免意外受精；

e.将收集的卵子倒入≥400目的筛网内，用22～24℃海水对卵子进行反复冲洗，以防卵子表面被其它精子的意外粘污；

3)海湾扇贝和秘鲁扇贝的杂交具体方法如下：

a.海湾扇贝和秘鲁扇贝实行一对一正反向杂交，用海湾扇贝的精子给秘鲁扇贝的卵子授精，同时也用秘鲁扇贝的精子给海湾扇贝的卵子授精，建立正反交杂交组合；控制每个卵子表面附有精子5～10个；

b.为了确保没有自体受精的发生，在杂交的同时，分别取海湾扇贝亲本和秘鲁扇贝亲本的部分卵子不加入精液，以为对照；1～2小时后镜检，如发现有受精胚体出现，则其相应的正反向杂交组合被放弃；

4)海湾扇贝和秘鲁扇贝杂交子代的培养具体过程如下：

a.受精卵在22～24℃沙滤海水中20～24小时孵化成面盘幼虫，面盘幼虫培养密度为5～7个/ml；

b.幼虫孵化后开始投喂金藻，5天及5天后投喂等体积混合的金藻和硅藻，根据幼虫胃内饲料镜检情况，以决定每天投入的饲料次数和数量；

c.当30～40％幼虫出现眼点时，投入聚乙烯网片用做幼虫的附着基；

d.孵化后的10～13天，幼虫经过附着变态成为稚贝；将稚贝和其附着基装入50～70目尼龙网袋培育，每个网袋放入1～2片附有稚贝的附着基；

e.当稚贝壳长达到600～800μm时进行降温培育，每天降温1～2℃，直至温度降至室外自然海水温度，并直接转入海区或海水池塘培育；

f.当稚贝壳长达到0.3～0.5cm时，将其从附着基上刷至20～30目尼龙网袋中继续海上培养，壳长达2.5～3.5cm时，转移至养成笼进行海上养殖，养成笼每层置25～35个幼贝；

5)杂交后代雄性不育体的鉴定方法如下：

a.对生长1龄或1龄后的杂交后代进行升温促熟；促熟方法如权利要求3所述步骤a；

b.促熟后的杂交贝通过肉眼观察性腺发育情况；

c.将水温升至22～24℃，对促熟的杂交贝进行催产，镜检观察是否有精子排放或所产卵子是否有精子污染；

d.性腺切片的辅助观察：性腺的切片将杂交个体性腺剪下，浸入Bouin’s液固定≥8小时，放入体积浓度70～80％乙醇保存；经30％，50％，70％，95％乙醇脱水，二甲苯透明，透蜡，石蜡包埋，切片厚度5μm，采用HE(苏木精-伊红)染色后用中性树胶制成永久装片；显微镜观察性腺发育情况，确定性腺内是否有成熟精子；

e.大部分个体性腺发育为完全橘红色，乳白色“精区”退化，只产生卵子，不产生精子，这类个体被确定为雄性不育体。