CN104186384B - 海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法及应用。该雄性不育系是不能产生有功能的精子，但其卵子能正常受精、发育，并能将其雄性不育特性遗传给后代的杂交扇贝品系，其中海紫杂交扇贝是海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代。首先构建大量的子一代海紫杂交家系，从中找到雄性不育的个体，然后用雄性不育个体的父本紫扇贝的精子连续回交选育，直到回交后代全部为雄性不育且卵子可育，即获得海紫杂交扇贝的雄性不育系；用雄性不育系与保持系杂交规模化生产雄性不育系亲贝，用雄性不育系亲贝与恢复系杂交规模化生产海紫杂交扇贝商品苗种。本发明首次在动物中建立了扇贝的雄性不育系，有效克服了雌雄同体扇贝杂交中自体受精的障碍。

Description

海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法与应用

技术领域

本发明属于贝类育种技术--杂交扇贝商品苗种培育方法，尤其是涉及海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)雄性不育系的构建方法及应用。

背景技术

海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)原产于美国大西洋沿岸，于1982年引入我国。海湾扇贝生长速度快，温度适应范围广，抗逆性强，非常适合我国北方海域的养殖，目前产量和养殖面积占我国扇贝养殖的50％以上。但是由于引进后长期近交，海湾扇贝在养殖过程中种质退化严重，表现为商品贝规格越来越小，育苗养殖过程中死亡率较高，因此扇贝养殖业迫切需要对海湾扇贝进行遗传改良，其中杂交育种是最有效的种质改良方法之一。

为此，发明人自2007年首次从秘鲁引进了紫扇贝(Argopecten purpuratus)。紫扇贝是原产于南太平洋的一种速生型中型扇贝，与海湾扇贝都属于Argopecten属，染色体数相同，且都是雌雄同体，但二者在个体大小、生长和温度适应性等方面性状互补。因此发明人又通过将紫扇贝与海湾扇贝进行种间杂交，培养出正交(紫扇贝卵子和海湾扇贝精子受精)和反交(海湾扇贝卵子和紫扇贝精子受精)两种杂交子一代。杂交子一代的个体重比同期培育的海湾扇贝提高约100％，当年可长到7-8公分，而且第二年可继续养殖达到更大规格，个体重达到200克以上，其抗逆性增强，特别是在山东地区能够顺利度夏和越冬，显示出巨大的产业潜力(王春德等，2009.紫扇贝与海湾扇贝种间杂交的研究。海洋科学，33(10)：84-87；Chunde Wang等，2011.Introduction of the Peruvianscallop and its hybridization with the bay scallop in China，Aquaculture,2011,310:380-387)。

上述杂交子一代虽然可以产生较大的杂种优势，但是要大面积推广仍存在着较大的困难，这是因为海湾扇贝和紫扇贝都是雌雄同体的扇贝，繁殖时同时排放精子和卵子，排放的卵子容易受到同种精子的污染，难以大量获得未受精卵用于种间杂交，从而导致所获得的商品苗种中真正的杂交后代比例大大降低，因而使其产量的提高幅度大大受限。

研究发现，上述两种Argopecten扇贝的雌雄同体特性与许多农作物的雌雄同株特性相似。在雌雄同株的农作物如水稻育种中也存在着同花授粉的问题，需要人工去雄，这一点与紫扇贝与海湾扇贝杂交过程中遇到的自体受精问题相似。农业上解决这个问题的关键依赖于雄性不育植株的发现，利用雄性不育株与其父本连续回交，就可以选育出雄性不育系、保持系和恢复系，以此来构建农作物育种中的三系配套育种体系，实现杂交种的大规模生产，从而解决杂交制种难题。迄今为止，国内外已经在众多的农作物中建立了三系配套育种体系，并广泛应用于植物杂交种的生产中，成为大幅度提高农作物产量的主要途径。

但是在动物育种中，国内外迄今为止尚无发现雄性不育且雌性可育个体的报道，因而也无法建立类似于农作物的雄性不育系、保持系和恢复系，用于杂交育种。显然，如果在动物育种中能够构建起类似的包括雄性不育系、保持系和恢复系的三系配套育种体系，也就可以实现雌雄同体型动物的低成本、规模化种间杂交，提高杂交效率，提高育种动物的抗逆性和产量，从而实现动物育种技术的重大突破。雄性不育系的选育是三系配套育种体系的核心品系，是建立三系配套育种体系的关键和前提。

发明内容

本发明的目的是实现在动物育种中，具体地说是在雌雄同体型扇贝中首次建立海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法，以克服现有杂交扇贝育种技术的不足。

本发明的另一目的是利用上述雄性不育系与保持系杂交，建立大规模、低成本生产海紫杂交扇贝雄性不育系种贝的应用方法。

本发明的第三个目的是利用上述雄性不育系与恢复系杂交，建立大规模、低成本生产海紫杂交扇贝商品苗种的应用方法。

上述的三系是指扇贝雄性不育系及其保持系和恢复系。其中的雄性不育系是雄性性腺发育不正常，不能产生有功能的精子，但其卵子发育正常，能接受正常精子而受精，并能将其雄性不育特性遗传给后代的品系。显然雄性不育系是三系配套体系中的核心品系，其主要作用是在杂交苗种商业化生产中提供大量的未受精卵子，同时其繁育依赖于与其配套的保持系。雄性不育系是利用偶然发现的雄性不育且卵子可育的个体与其父本连续回交建立回交家系，当回交家系的所有个体均为雄性不育且卵子可育时所获得的杂交扇贝品系。

上述的保持系又称雄性不育系保持系，当作为父本与雄性不育系杂交时，能使子一代保持雄性不育特性，保持系的主要作用是提供雄性不育系繁育所必需的精子。保持系是通过用紫扇贝与雄性不育个体不断回交，当回交后代全部表现为雄性不育且卵子可育时所获得的紫扇贝品系。保持系是能够正常繁育的雌雄同体品系，可以通过自交繁育下一代保持系。

恢复系又称雄性不育系恢复系，用它的精子给雄性不育系的卵子受精后，所产生的杂交后代雌性和雄性育性均恢复正常。因此，在动物育种中，恢复系的作用是提供精子与雄性不育系的卵子受精，以实现优良杂交扇贝商品苗种的培育。恢复系是通过用紫扇贝与雄性不育系种贝连续回交，当回交后代全部表现为雌雄同体时所获得的紫扇贝品系。恢复系是能够正常繁育的雌雄同体品系，可以通过自交繁育下一代恢复系。

本发明基于以下构思和实践：1)发明人研究发现了海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)子一代中存在2-10％的雄性不育个体，这些个体不产生有活性的精子，但其卵子可以被紫扇贝的精子受精，且所获得的受精卵能够正常发育，即获得了回交扇贝；2)研究进一步发现，由此获得的回交扇贝性腺成熟后约有10％的个体仍为雄性不育且其卵子可被紫扇贝精子受精，因此只要将上述雄性不育个体的卵子与父本紫扇贝自交后代的精子连续多代回交，就能选育出后代全部为雄性不育且卵子可育的雄性不育系(母本)-紫扇贝(父本)组合，该组合中的紫扇贝品系具有使相应的雄性不育系的后代仍保持雄性不育特性的能力，即获得海紫杂交扇贝的雄性不育系和该雄性不育系的保持系；3)研究还发现，用紫扇贝精子与海紫杂交扇贝中雄性不育个体的卵子回交所培育的回交扇贝养成后约90％个体仍表现为雌雄同体，因此可以通过建立多个回交家系并进行配合力测验的方法，选育出其后代全部为雌雄同体且性状优良的雄性不育系(母本)-紫扇贝(父本)组合，这个组合中的紫扇贝品系具有使雄性不育系恢复雄性育性的能力，即获得海紫杂交扇贝雄性不育系的恢复系；4)应用海紫杂交扇贝雄性不育系与相应的保持系杂交可以大规模生产雄性不育且卵子可育的种贝；通过将这些雄性不育系种贝与相应的恢复系的精子杂交，能实现方便、高效、规模化生产海紫杂交扇贝商品苗种，且所获得的杂交扇贝商品苗种在生长、个体大小和温度耐受性方面具有显著的优势。

本发明的海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法如下：

1)海紫杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育：选择优良的海湾扇贝与紫扇贝个体同步促熟后，用常规的紫扇贝阴干和温度刺激方法诱导海湾扇贝和紫扇贝产卵，并分别收集海湾扇贝和紫扇贝的卵子，同时诱导紫扇贝排精，并用500目筛绢过滤获得紫扇贝精子，然后向海湾扇贝的卵子中加入适量的紫扇贝精子，受精卵正常发育后即获得海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子与紫扇贝精子受精)子一代家系，待用于选择雄性不育个体，同时将紫扇贝的卵子用自体的精子受精，建立该紫扇贝的自交家系。由于杂交子一代中雄性不育个体存在的比例很低，因此需要构建大量的杂交子一代家系，从而找到雄性不育的个体用于雄性不育系的选育。

2)海紫杂交扇贝雄性不育系的选育：选择上述海紫杂交扇贝子一代家系中的雄性不育个体，与父本紫扇贝自交家系中的优良个体同步促熟，性腺成熟后用常规的紫扇贝阴干和温度刺激的方法诱导上述杂交子一代扇贝排卵并收集卵子，同时诱导紫扇贝排精，并用500目筛绢过滤获得紫扇贝精子，将上述获得的杂交子一代的卵子与紫扇贝精子受精，收集受精且发育正常的受精卵建立回交家系，同时将供精的紫扇贝自体受精建立自交家系；翌年将回交家系及其父本紫扇贝自交家系促熟，选择回交家系中仍为雄性不育的个体用常规的紫扇贝产卵诱导方法刺激产卵后，用其父本紫扇贝自交后代的精子继续回交，同时仍将供精的紫扇贝继续自交建立自交家系；以后每年按照同样的方法连续回交选育，直到回交后代全部为雄性不育且卵子可育的个体，即获得海紫杂交扇贝雄性不育系。雄性不育系是三系配套育种体系的核心品系，是前提，建立海紫杂交扇贝雄性不育系的目的是为杂交扇贝苗种的生产提供大量的雄性不育扇贝种贝，从而实现方便、高效、规模化获得大量的未受精卵。

3)海紫杂交扇贝雄性不育系种贝的扩繁：本发明通过海紫杂交扇贝雄性不育系与保持系的杂交繁育下一代海紫杂交扇贝雄性不育系扇贝，从而实现海紫杂交扇贝雄性不育系种贝的扩繁，并将雄性不育系种贝用于下述的海紫杂交扇贝商品苗种生产。

4)海紫杂交扇贝商品苗种的生产方法：首先按照5:1的比例选择海紫杂交扇贝的雄性不育系和恢复系种贝，并按常规方法促熟后分别刺激雄性不育系种贝产卵和恢复系种贝产卵排精，再将该恢复系的精卵混合液用500目筛绢过滤即获得恢复系的精液，将恢复系的精液加入产卵池中并搅拌，且加入精子的量以每个卵子周围有5-6个精子为宜，最后按常规方法孵化后即获海紫杂交扇贝商品苗种。

本发明的雄性不育系构建方法也应用于紫海杂交扇贝(紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代)、紫墨杂交扇贝(紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代)和墨紫杂交扇贝(墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)等Argopecten属杂交扇贝的育种，并且应用于建立这些杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。

本发明的方法也应用于其他雌雄同体型扇贝的种间杂交育种，例如Pecten属扇贝的种间杂交，本发明的基本方法也适用于其他雌雄同体型无脊椎动物的种间杂交育种。

本发明构建的海紫杂交扇贝雄性不育系是首次在动物界中建立的，是动物三系配套育种体系的核心和前提，应属于动物育种技术中的重大突破。本发明有效克服了雌雄同体扇贝杂交过程中自体受精的障碍，实现了低成本和规模化获得完全的杂交后代，因此可充分利用杂种优势，达到了使所培育的海紫杂交扇贝商品苗种同时具有紫扇贝和海湾扇贝的特性，在生长、个体大小和温度耐受性方面比海湾扇贝具有显著优势，因此能在北方海区如青岛、大连等海域成功养殖，且当年产量可比海湾扇贝提高50％以上。

具体实施方式

本发明首次构建了海紫杂交扇贝雄性不育系，并建立了用雄性不育系大规模生产海紫杂交扇贝雄性不育系种贝和海紫杂交扇贝商品苗种的方法，具体步骤如下：

实施例1

1)海紫杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育：第一年选择50个性腺发育成熟的海湾扇贝和50个紫扇贝，阴干刺激30分钟后将每个扇贝放在预先加入23℃海水的单独的容器中使其产卵、排精，单独收集每个海湾扇贝的卵子和每个紫扇贝的精子和卵子，向每个海湾扇贝的卵子悬浮液中加入少量来自单个紫扇贝的精液，搅拌使精卵混合均匀，显微镜下观察使每个卵子周围有5-6个精子，并将受精卵置于黑暗环境下孵化，即获得海紫杂交子一代家系。用上述方法建立至少20个这样的杂交家系，同时将供精的紫扇贝精卵混合受精，建立相应数量的紫扇贝自交家系，按照常规的扇贝育苗方法进行幼虫培育、保苗和养成后，用于雄性不育个体的筛选。

2)海紫杂交扇贝雄性不育系的选育：第二年春季将海紫杂交子一代家系促熟后，选择50个性状优良的雄性不育个体，用常规的紫扇贝产卵诱导方法刺激产卵，分别用其父本紫扇贝的精子受精，收集正常受精、发育的受精卵建立回交家系，收集正常受精、发育的受精卵建立回交家系，同时将提供精子的紫扇贝自繁建立自交家系，建立至少20个回交家系和相应的紫扇贝自交家系并按照常规的紫扇贝育苗方法进行幼虫培育、保苗、养成；第三年春季，将回交家系和紫扇贝自交家系促熟后，选择50个性状优良的回交家系中的雄性不育个体，用其父本紫扇贝的自交后代精子回交，收集正常受精、发育的受精卵继续建立回交家系，同时继续繁育紫扇贝的自交家系，选择建立20个以上性状优良的回交家系及其相应的紫扇贝自交家系；以后每年按照同样的方法选择性状优良的雄性不育扇贝与其父本紫扇贝的自交家系回交，直到回交后代的所有个体均表现为性状优良、雄性不育且卵子可育，即获得海紫杂交扇贝雄性不育系。

3)海紫杂交扇贝雄性不育系种贝的扩繁方法：每年用海紫杂交扇贝雄性不育系与保持系种贝杂交扩繁下一代海紫杂交扇贝雄性不育系扇贝，同时按常规扇贝育苗方法自交扩繁恢复系。

4)海紫杂交扇贝商品苗种的生产方法：春季育苗时按照5:1的比例选择海紫杂交扇贝雄性不育系和恢复系种贝促熟后，在产卵池中刺激雄性不育系种贝产卵，在水桶中刺激恢复系种贝排精，并用500目筛绢过滤获得不含卵子的恢复系紫扇贝精液；将恢复系的精液均匀泼洒到产卵池中并立即搅拌，随时取样在显微镜下观察受精情况，精液加入量以每个卵子周围有5-6个精子为宜；受精卵按照常规方法孵化，发育后即获得海紫杂交扇贝商业苗种。

实施例2

2008年3月底，取性腺发育成熟的海湾扇贝，经温度刺激后获得海湾扇贝卵子，用紫扇贝的精子授精后获得海湾扇贝与紫扇贝杂交子一代苗种并养成。2009年春天，将上述杂交子一代扇贝促熟后从中选择个体大且仅雌区发育的扇贝，阴干30分钟后将扇贝置于盛有23℃海水的容器中刺激产卵，以来自多个紫扇贝的精子混合授精，培育出子一代海紫杂交扇贝与紫扇贝的回交群体。该回交群体在2010年春季促熟后大部分表现为雌雄同体，但还有<10％的个体仍表现为雄性不育。

继续将上述雄性不育的个体用其父本紫扇贝自交后代的精子回交，经过一代至多代选育就可获得后代全部为雄性不育且卵子可育的雄性不育系(母本)-保持系(父本)组合，从而分别获得雄性不育系和保持系。性腺促熟后用常规扇贝产卵诱导方法催产雄性不育系扇贝可获得大量未受精的卵子，将其用保持系的精子受精，就可大规模获得用于海紫杂交扇贝商品苗种生产的雄性不育系种贝。

最后将上述获得的海紫杂交扇贝的雄性不育系种贝性腺促熟后，用常规的扇贝催产方法获得大量未受精的卵子，将其用相应的恢复系的精子受精，就可大规模生产海紫杂交扇贝商品苗种。

实施例3

2012年用海紫杂交子一代家系中仅卵区发育的雄性不育个体，经刺激后其中有20个雄性不育个体产卵，将这些卵子与单个紫扇贝的精子回交，成功获得2个回交家系，在2012年11月中旬收获时，与同期的海湾扇贝比较，其中一个回交家系的壳高、壳长、壳宽和体重分别提高28.2％、29.5％、16.4％和74.0％，2013年春季促熟后发现其后代大部分仅雌区发育，证明通过用紫扇贝精子与雄性不育个体回交能够选育出海紫杂交扇贝雄性不育系。

实施例4

2013年和2014年，利用引进的海湾扇贝与紫扇贝共建立了海湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交子一代家系12个，并建立了供精紫扇贝的自交家系，按照实施例1的方法，可在1-3年内选育出海紫杂交扇贝的雄性不育家系及其相应的保持系和恢复系，实现海紫杂交扇贝苗种的商业化生产。

实施例5

本发明用于紫海杂交扇贝雄性不育系的构建及应用

本发明建立的雄性不育系的构建方法也应用于紫海杂交扇贝(紫扇贝卵子与海湾扇贝精子的杂交后代)的育种，并且应用于建立紫海杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。

首先选择紫扇贝和海湾扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集的紫扇贝卵子以及海湾扇贝的精子和卵子，将的紫扇贝卵子与海湾扇贝的精子受精建立海紫杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将海湾扇贝的精子和卵子混合受精，建立海湾扇贝自交家系；第二年从紫海杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用海湾扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育系，同时将父本海湾扇贝自体受精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了紫海杂交扇贝的雄性不育系及相应的保持系。

用上述紫海杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫海杂交扇贝雄性不育种贝；用紫海杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫海杂交扇贝苗种。

实施例6

本发明用于紫墨杂交扇贝雄性不育系的构建及应用

本发明建立的雄性不育系的构建方法也应用于紫墨杂交扇贝(紫扇贝卵子与墨西哥湾扇贝精子的杂交后代)育种，并且应用于建立紫墨杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。

首先选择紫扇贝和墨西哥湾扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集紫扇贝的卵子以及墨西哥湾扇贝的精子和卵子，将紫扇贝的卵子与墨西哥湾扇贝的精子受精建立紫墨杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将墨西哥湾扇贝的精子和卵子混合受精，建立墨西哥湾扇贝自交家系；第二年从紫墨杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用墨西哥湾扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育家系，同时将父本墨西哥湾扇贝自体受精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了紫墨杂交扇贝的雄性不育系及相应的保持系。

用上述紫墨杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫墨杂交扇贝雄性不育种贝；用紫墨杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫墨杂交扇贝苗种。

实施例7

本发明用于墨紫杂交扇贝雄性不育系的构建及应用

本发明建立的雄性不育系的构建方法也应用于墨紫杂交扇贝(墨西哥湾扇贝卵子与紫扇贝精子的杂交后代)育种实践，并且应用于建立墨紫杂交扇贝商品苗种的规模化生产方法。

首先选择紫扇贝和墨西哥湾扇贝同步促熟并刺激同时产卵、排精，分别收集墨西哥湾扇贝的卵子以及紫扇贝的精子和卵子，将墨西哥湾扇贝的卵子与紫扇贝的精子受精建立墨紫杂交子一代家系，用于选择雄性不育个体，同时将紫扇贝的精子和卵子混合受精，建立紫扇贝自交家系；第二年从墨紫杂交子一代家系中选择雄性不育的个体，用紫扇贝的精子与其受精，若受精卵正常发育则建立回交家系，用于继续选育雄性不育家系，同时将父本紫扇贝自体受精建立自交家系；这样经过一代至多代选择，当回交后代全部表现为雄性不育时，就获得了墨紫杂交扇贝的雄性不育系及其相应的保持系。

用上述墨紫杂交扇贝的雄性不育系卵子与保持系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产紫杂交扇贝雄性不育种贝；用紫杂交扇贝雄性不育种贝与恢复系的精子杂交，即可实现高效、方便、规模化生产墨紫杂交扇贝苗种。

Claims (3)

1.一种海紫杂交扇贝雄性不育系的构建方法，其特征在于：

1)海紫杂交扇贝雄性不育个体的筛选及其父本的繁育：首先构建20个以上海紫杂交扇贝子一代家系，同时建立供精的父本紫扇贝自交家系，用于下述雄性不育系的选育；

2)海紫杂交扇贝雄性不育系的选育：第二年从上述海紫杂交扇贝子一代家系中选择50个雄性不育个体，促熟后刺激其排卵，用该雄性不育个体的父本紫扇贝自交家系中优良个体的精子受精，收集正常发育的受精卵建立回交家系20个以上，同时将供精的紫扇贝自体受精建立自交家系；翌年选择回交家系中仍为雄性不育的个体50个促熟并刺激产卵后，用该雄性不育个体的父本紫扇贝自交后代的精子继续回交，建立20个以上回交家系，同时仍将供精的紫扇贝继续自交建立自交家系；以后每年按照同样的方法连续回交选育，直到回交后代全部为雄性不育且卵子可育的个体，即获得海紫杂交扇贝雄性不育系；同时，将上述能使雄性不育系后代继续保持雄性不育特性的紫扇贝自交家系用常规的扇贝育苗方法自交扩繁，即获得该雄性不育系的保持系。

3)海紫杂交扇贝雄性不育系种贝的扩繁：通过上述雄性不育系与保持系的杂交繁育下一代海紫杂交扇贝雄性不育系扇贝，从而实现海紫杂交扇贝雄性不育系的扩繁。

2.权利要求1的方法构建的海紫杂交扇贝雄性不育系在规模化生产海紫杂交扇贝雄性不育系种贝中的应用，即用海紫杂交扇贝雄性不育系与相应的保持系杂交，以规模化繁育雄性不育且卵子可育的下一代海紫杂交扇贝雄性不育系种贝。

3.权利要求1的方法构建的海紫杂交扇贝雄性不育系在生产海紫杂交扇贝商品苗种的应用，即用海紫杂交扇贝雄性不育系的卵子与相应的恢复系的精子杂交，获得海紫杂交扇贝商品苗种。