CN1385060A - 一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法 - Google Patents

一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法 Download PDF

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Abstract

一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法,将受精卵与母体一起孵育,并用细胞松弛素B或热休克处理或用6－DMAP处理,最后通过抑制受精卵第二极体的排放获得三倍体幼体,所述的受精卵是中华绒螯蟹的母体自然产出的。本发明的优点是:能批量获得受精卵;大大提高了三倍体的倍化率,使三倍体诱导率稳定在60－80%。低温孵育大大延长了进行遗传操作的有效时间段,使进行三倍体诱导的可操作性明显提高。

Description

一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法
本发明涉及一种水产养殖方法，特别是涉及一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法。
在现有技术中，鱼类和贝类三倍体的诱导方法研究的较多，而且某些种类如太平洋牡蛎等已经进入大规模应用阶段。现有的中华绒螯蟹三倍体的诱导方法，一般先从母体卵巢中取出卵子，从纳精囊中取出精子，然后进行人工受精，所得的受精卵在20℃下孵育，孵育15分钟后，采用药物或温度处理或用浓度为1.5mg/L的细胞松弛素B(C.B)溶液处理，最后通过抑制第一极体的排放获得三倍体胚胎。其中处理持续时间1.5分钟，处理温度40℃，囊胚期检测得到三倍体最高诱导率50％。该方法的缺点是受限于中华绒螯蟹(河蟹)抱卵孵化的繁殖生物学特性，难以克服离体培养的困难，受精卵最多只能发育到囊胚晚期即死亡，故目前对中华绒螯蟹三倍体诱导的研究仅限于胚胎期，根本无法培育出幼蟹，因此也无法进入实用阶段。尽管近年来有学者称人工受精和体外培养受精卵可获成功，但从其胚胎存活率和孵化率都难以进行规模化生产。从受精开始就进行体外培养的受精卵只有部分能顺利发育至囊胚晚期或早期原肠胚，随后陆续停滞发育而夭折。所以，进行中华绒螯蟹的三倍体育种无论采用人工受精还是抑制第一极体首先必须克服受精卵离体培养的困难。
本发明的目的是提供一种新的中华绒螯蟹三倍体的诱导方法，它能克服现有方法的上述缺点，并且工艺流程可操作性强，诱导率高而稳定，适于规模生产，不仅能培育出幼蟹而且还能养成。
一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法，包括将受精卵孵育，并用细胞松弛素B或热休克处理或用6-DMAP处理，最后通过抑制受精卵极体的排放获得三倍体幼体，其特征是所述的受精卵是中华绒螯蟹的母体自然产出的。
本发明的优点是：顺应中华绒螯蟹抱卵孵化的繁殖生物学特性，无须离体培养，能批量获得受精卵；在提高受处理卵同步率的基础上，大大提高了三倍体的倍化率，低温孵育大大延长了进行遗传操作的有效时间段，使进行三倍体诱导的可操作性明显提高；在第二极体排放前进行处理，使受精卵能安然粘附于母体腹肢刚毛上直至孵化，故可获得中华绒螯蟹的三倍体幼体，并且三倍体诱导率稳定在60-80％。
下面通过实施例说明本发明。
根据中华绒螯蟹的繁殖生物学特性和生殖发育学原理，针对已有诱导方法中存在的主要问题，本实例改人工受精为自然受精，受处理卵为中华绒螯蟹的母体自然产出，在较低温度下将受精卵连同母体一起孵育，即将抱卵蟹整体作为处理对象，同时用6-DMAP作为诱导剂进行处理，最后通过抑制受精卵第二极体的排放获得三倍体幼体。
改人工受精为自然受精获得受精卵的具体作法是：将雌雄蟹分别放入用于交配促产的圆形塑料缸中，温度恒定在12℃，随即将雌雄蟹按2∶1合并于同一缸中，促使其交配。确认蟹交配后移走雄蟹，同时观察雌蟹的行为，等待产卵。开始产卵的时间记为受精零时。
将受精卵连同母体一起处理的具体作法是：刚产出的受精卵呈稀释流动状，受刺激容易脱落。抱卵蟹在12-15℃下培育至4小时后，受精卵逐渐粘附于雌蟹腹肢的刚毛上，不易分离。当进行三倍体诱导时，将受精卵连同整只雌蟹个体一起浸泡于处理液中。在12-15℃下受处理卵发育的同步率明显高于20℃，而受处理卵发育的同步性对获得高而稳定的诱导率是至关重要的。所以本实施例从雌雄蟹交配到雌蟹产卵均在12℃水温下进行。从受精零时到产卵后4小时，培育水温缓慢升到15℃。改抑制第一极体为抑制第二极体的具体作法是：产卵后4小时的抱卵蟹的水温已由12℃缓慢升到15℃，受精卵第一极体已经排放，而第二极体还未开始排放。将此发育时期的抱卵蟹放入150-300umol/L 6-DMAP处理液中浸泡30分钟，然后用海水冲洗抱卵蟹2-3次，最后将处理好的抱卵蟹放进孵化池中进行孵化。
本实施例中养殖水盐度为20‰，PH值为7.8-8.5，囊胚期检测得到三倍体最高诱导率80％，且继续发育，得到了三倍体幼体。蚤状幼体群体检测，三倍体率达85.3％。幼蟹期检测，随机取26个个体，有16个是三倍体。

Claims (4)

1、一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法，包括将受精卵孵育，并用细胞松弛素B或热休克处理或用6-DMAP处理，最后通过抑制受精卵极体的排放获得三倍体幼体，其特征是所述的受精卵是中华绒螯蟹的母体自然产出的。
2、如权利要求1所述的诱导方法，其行征是所述的孵育是将受精卵与母体一起孵育。
3、如权利要求1所述的诱导方法，其特征是所述的孵育温度为12-15℃。
4、如权利要求1所述的诱导方法，其特征是所述的抑制受精卵极体排放为抑制受精卵第二极体排放。
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