CN103283650A - 一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法。本发明是将硬头鳟受精卵在7℃条件下，受精卵受精12-14min后移入浓度为240mg/L、温度为12-14℃的6-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤)的溶液中浸泡处理14-16min后迅速移入孵化水体中正常孵化。50天左右，受精卵孵化出硬头鳟三倍体仔鱼。孵化期间受精卵发眼率为68%以上，苗种孵化率达到90%以上，得到的仔鱼经流式细胞仪检测，三倍体率达到81%。本发明提供的硬头鳟三倍体苗种制备方法，缓解了鲑鳟鱼养殖过程中由于长期的近亲繁殖和缺乏系统的选育,导致养殖个体出现了性早熟、个体小型化、病害滋生等问题，具有较好的市场价值。

Description

一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法

技术领域

本发明涉及水产生物育种技术领域，具体地涉及一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法。

背景技术

鲑鳟鱼是世界目前主要养殖的鱼类之一,由于其自身的品质和对生活环境的特殊要求,决定了它绿色、环保营养食品的性质,因此颇受消费者的青睐。鲑鳟鱼是我国目前主要的冷水性养殖鱼类,随着我国鲑鳟鱼养殖的迅速发展，基础理论研究相对滞后，鲑鳟鱼亲鱼种质退化导致苗种质量退化生产效益下降等问题逐渐突出，从而制约了鲑鳟鱼养殖业的可持续发展。利用现代生物技术，培育生长迅速、个体大、肉质好、抗病能力强的种苗，将成为我国鲑鳟鱼养殖业的持续、稳定、健康发展的必由之路。

与普通的二倍体鱼类相比，三倍体鱼类具有生长速度快、成活率高、抗病力强、肉质好、安全健康等优点：①三倍体鱼类生长速度比二倍体快30-40%，有利于生产大型个体，可有效的提高群体产量；②鲑科三倍体鱼类不育，避免了性腺发育阶段和产卵季节因能量转移和婚姻色出现而导致的鱼肉品质下降及表观特征变化，避免了其繁殖期生物学死亡，延长养殖周期；③三倍体鱼类对环境没有潜在的威胁，三倍体可减少鱼类的基因混杂，有效控制自然水域中鱼类的过度繁殖，避免养殖品种的退化，保护物种的多样性；④没有外来基因，属于人类可以安全食用的健康食品，比起转基因技术更为人们所接受；⑤三倍体鱼肉质鲜嫩、可食部分高、体形稳定美观、商品价值高。由于三倍体鱼类具有上述优势，因此通过三倍体制备技术获得生长快速、适应性和抗病力强的优质苗种具有巨大的潜力。

自上世纪80年代以来,三倍体鱼类的人工诱导工作取得了长足进展。目前对三倍体苗种制备的研究主要集中在纯种虹鳟鱼的三倍体制备，其方法为热休克法或静水压方法。现有热休克方法制备纯种三倍体虹鳟鱼的技术是当在26.5℃的条件下，受精卵发眼率为67.80%-70.28%，鱼苗三倍体率能够达到50%-65%；当在28℃条件下，受精卵发眼率为29.78%-32.75%，鱼苗三倍体率能够达到80.95%-83.18%；在30℃条件下，能够得到非常高的三倍体率，达到90%以上，但其发眼率通常不超过10%，且苗种畸形率高，始终无法形成规模化生产，其原因为现有的纯种生产三倍体苗种制备技术或无法达到生产要求的三倍体率或无法达到可用于生产的苗种成活率，一直无法实现规模化生产。因此，迫切需要一种技术成熟、效果稳定且能规模化生产的三倍体鱼苗制备技术，提高受精卵的发眼率和苗种三倍体率。

6-二甲基氨基嘌呤（N6-Dimethyladenine,6-DMAP）在多种贝类多倍体诱导中取得了良好效果，但由于鲑鳟鱼对生长环境水质要求较高，特别对化学物质敏感，至今未有6-二甲基氨基嘌呤应用于鲑鳟鱼三倍体诱导的成功报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法，以克服现有技术的不足。

本发明提供的硬头鳟三倍体苗种的制备方法，包括以下步骤：

1）使硬头鳟亲鱼卵子和精子体外受精；

2）6-二甲基氨基嘌呤处理受精卵；

3）受精卵在养殖用水中孵化。

其中，步骤1）的硬头鳟鱼卵受精温度是6-11℃。

步骤1）硬头鳟亲鱼培育水温为10-13℃，流水池水交换量为2h/次。

所述步骤1）分别将硬头鳟亲鱼鱼卵和精液取出，精液用孵化用水清洗，方法为精液与孵化用水的体积比为1-1.5：2500-3000，搅拌1-1.5min后倒掉水，同样方法反复冲洗3-5次；按照雄性亲鱼与雌性亲鱼1：2-4的尾数比例进行精子与卵子的受精。

本发明制备方法的步骤2）中，受精卵在受精12-14min后，将受精卵移入220-240mg/L的6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）溶液中浸泡处理。

优选地，受精卵在受精12min后，移入6-二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡处理。6-二甲基氨基嘌呤溶液的温度为12-14℃。浸泡时间为14-16min。

将步骤2）浸泡处理的受精卵迅速移入6-11℃孵化水体中孵化48-60天，得到硬头鳟三倍体仔鱼。

本发明还提供了6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP)在制备硬头鳟三倍体苗种中的应用。

进一步地，采用浓度为240mg/L、温度为12℃的6-二甲基氨基嘌呤溶液处理硬头鳟受精卵。

本发明提供一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法，具体操作为：选取硬头鳟雌鱼鱼卵和雄鱼精子进行体外受精，7℃条件下鱼卵受精12min后，将受精卵迅速移入浓度为240mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理硬头鳟受精卵15min；之后迅速移入7℃水体中正常孵化50天，得到硬头鳟三倍体鱼苗。

本发明制备方法所用的水体均为符合国家渔业水质标准规定的孵化用水。

本发明提供了上述制备方法在硬头鳟三倍体苗种育种工作中的应用。

本发明意外地发现通过一定浓度、温度的6-二甲基氨基嘌呤溶液处理硬头鳟受精卵，能够抑制硬头鳟受精卵第二极体的排出，在此基础上，本发明经过大量实验反复摸索实验条件，实现了规模化制备硬头鳟三倍体苗种，应用该方法的受精卵发眼率达到68%，苗种孵化率达到90%以上，苗种三倍体率达到81%，该发明方法受精卵发眼率与正常鲑鳟鱼生产相近，三倍体率达到了生产需求，实现了三倍体苗种的规模化生产，得到的硬头鳟苗种具有三倍体优势。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的硬头鳟亲鱼为北京市水产科学研究所由北欧玛生物科技有限公司购买的发眼卵培育而成。

实施例1 硬头鳟三倍体苗种制备方法（1）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟亲鱼发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为10℃，流水池水交换量为2h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性硬头鳟的精液挤入水盆内，水温10℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1：2500的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

硬头鳟鱼卵受精12min后，将受精卵迅速移入浓度为240mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡15min后，迅速移入7℃孵化水体中正常孵化。

经过50天孵化出鱼苗，期间三倍体受精卵发眼率为68%，苗种孵化率为90%，其苗种经流式细胞仪检测为三倍体率为81%的硬头鳟三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的84%。

实施例2 硬头鳟三倍体苗种制备方法（2）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟亲鱼发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为13℃，流水池水交换量为2h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性硬头鳟的精液挤入水盆内，水温9℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1：3000的孵化用水，轻轻搅拌，1.5min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

硬头鳟鱼卵受精13min后，将受精卵迅速移入浓度为220mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡15min后，迅速移入7℃孵化水体中正常孵化。

经过52天孵化出鱼苗，期间三倍体受精卵发眼率为83%，苗种孵化率为91%，其苗种经流式细胞仪检测为三倍体率为78%的硬头鳟三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的82%。

实施例3 硬头鳟三倍体苗种制备方法（3）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟亲鱼发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为12℃，流水池水交换量为2h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性硬头鳟的精液挤入水盆内，水温10℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1.5：3000的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

硬头鳟鱼卵受精14min后，将受精卵迅速移入浓度为240mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡15min后，迅速移入9℃孵化水体中正常孵化。

经过48天孵化出鱼苗，期间三倍体受精卵发眼率为71%，苗种孵化率为90%，其苗种经流式细胞仪检测为三倍体率为75%的硬头鳟三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的86%。

实施例4 硬头鳟三倍体苗种制备方法（4）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟亲鱼发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为11℃，流水池水交换量为2h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性硬头鳟的精液挤入水盆内，水温11℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1.5：2500的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复5次，将精液清洗干净，放置等待处理。

硬头鳟鱼卵受精12.5min后，将受精卵迅速移入浓度为230mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡16min后，迅速移入8℃孵化水体中正常孵化。

经过51天孵化出鱼苗，期间三倍体受精卵发眼率为71%，苗种孵化率为89%，其苗种经流式细胞仪检测为三倍体率为78%的硬头鳟三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的82%。

实施例5 不同浓度6-DMAP溶液对三倍体苗种孵化率和三倍体率的影响

配制以下表1中各浓度的6-DMAP溶液，温度均为12℃待用。硬头鳟鱼卵受精12min后，将受精卵倒入漏水的盆中，待受精卵没有水流出后迅速移入以下不同浓度的6-DMAP溶液中浸泡处理15min后，迅速移入7℃孵化水体中正常孵化，其他培育条件参见实施例1。孵化50天，观察并记录不同浓度6-DMAP溶液处理受精卵后，对硬头鳟三倍体苗种的影响，结果见表1。结果显示，当6-DMAP溶液浓度为240mg/L时，三倍体率效果最好。

表1 不同浓度6-DMAP溶液处理受精卵对三倍体苗种的影响

实施例6 6-DMAP溶液（240mg/L、12℃）处理受精卵不同时间对三倍体苗种孵化率和三倍体率的影响

参照实施例1的方法培养硬头鳟三倍体苗种，使用浓度为240mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液处理硬头鳟受精卵不同时间，见表2，其他培育条件同实施例1。孵化50天，观察并记录6-DMAP溶液处理受精卵不同时间，对硬头鳟三倍体苗种的影响，结果见表2。结果显示，用240mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液处理硬头鳟受精卵15min，硬头鳟三倍体获得率较高。

表2 不同处理时间6-DMAP溶液浸泡受精卵对三倍体苗种的影响

Claims (10)

1.一种硬头鳟三倍体苗种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使硬头鳟亲鱼卵子和精子体外受精；

2）6-二甲基氨基嘌呤处理受精卵；

3）受精卵在养殖用水中孵化。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）的硬头鳟鱼卵受精温度是6-11℃。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）硬头鳟亲鱼培育水温为10-13℃，流水池水交换量为2h/次。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）分别将硬头鳟亲鱼鱼卵和精液取出，精液用孵化用水清洗，方法为精液与孵化用水的体积比为1-1.5：2500-3000，搅拌1-1.5min后倒掉水，同样方法反复冲洗3-5次；按照雄性亲鱼与雌性亲鱼1：2-4的尾数比例进行精子与卵子的受精。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，受精卵在受精12-14min后，将受精卵移入220-240mg/L的6-二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡处理。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，6-二甲基氨基嘌呤溶液的温度为12-14℃。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，浸泡时间为14-16min。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤2）浸泡处理的受精卵迅速移入6-11℃孵化水体中孵化48-60天。

9.6-二甲基氨基嘌呤在制备硬头鳟三倍体苗种中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，用浓度为220-240mg/L、温度为12-14℃的6-二甲基氨基嘌呤溶液处理硬头鳟受精卵。