CN103272272A

CN103272272A - 一种天然具孔皮肤补片及其制备方法

Info

Publication number: CN103272272A
Application number: CN2013101924695A
Authority: CN
Inventors: 孙先昌; 李垠埔; 马百聚; 林萍; 郭松; 于学珍
Original assignee: ZHENGHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd YANTAI
Current assignee: YANTAI ZHENGHAI BIO-TECH CO., LTD.
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103272272B

Abstract

本发明公开了一种天然具孔皮肤补片及其制备方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：（1）取离体的猪皮或牛皮，去除外表层的鬃毛后由表皮层向真皮层切除0.2-1.0mm厚度，取0.5-2.0mm厚度；（2）用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；（3）用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；（4）用碱溶液浸泡处理步骤（3）的产物；（5）用PBS缓冲液浸泡处理步骤（4）的产物；（6）用pH5.8-7.2的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；（7）将步骤（6）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到皮肤补片。采用本发明的皮肤补片进行皮肤修复具有如下优点：皮肤补片的渗液效果及与创面连续性好，不易产生瘢痕及斑点，且天然孔洞具有引导皮下组织再生的作用。

Description

一种天然具孔皮肤补片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种天然具孔皮肤补片及其制备方法。

背景技术

国内进行皮肤修补主要有两种方法，即植皮和用胶原蛋白海绵修补。植皮虽是“同种移植”，但是会造成二次创伤，并且真皮组织再生困难，会留下明显瘢痕。胶原蛋白海绵，是以动物组织为原料通过酶解、纯化制取高纯型胶原，再根据互贯网络技术制成。胶原海绵虽然保留了蛋白质的三股螺旋结构，但是去除了膜组织的天然空间结构，不利于皮肤组织再生和修复，且胶原海绵降解速度快、不能做到和组织再生同步。

皮肤修复手术通常创面较大，术后创面与修复材料间易积液造成修复效果不理想，现有的解决方法是对修复材料进行打孔处理。就目前已有的打孔方式，无论是贯穿孔还是半贯穿孔，都存在术后瘢痕甚至异色斑点的现象，影响患者生活质量。毛发、汗腺等皮下组织难于再生也是一大问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种天然具孔皮肤补片及其制备方法。

本发明提供的制备皮肤补片（天然具孔皮肤补片）的方法，包括如下步骤：

（1）取离体的猪皮或牛皮，去除外表层的鬃毛后由表皮层向真皮层切除0.2-1.0mm（如0.2-0.7mm、0.3-1.0mm、0.5±0.2mm、0.4±0.2mm或0.8±0.2mm）厚度，然后取0.5-2.0mm（如0.5-1.2mm、0.8-2.0mm、1.0±0.2mm、0.7±0.2mm或1.8±0.2mm）厚度的真皮及皮下组织层；

（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；

（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；

（4）使用碱溶液浸泡处理步骤（3）的产物；

（5）使用PBS缓冲液浸泡处理步骤（4）的产物；

（6）使用pH5.8-7.2（如pH5.8-6.5、pH6.5-7.2、pH5.8、pH6.5或pH7.2）的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；

（7）将步骤（6）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到皮肤补片。

所述步骤（2）又称脱细胞处理。所述步骤（2）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或KOH。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.5-4M（如0.5-0.8M、0.8-4M、0.5M、0.8M或4M）。所述步骤（2）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-7℃、3-25℃、2±2℃、5±2℃或23±2℃）、1-2.5小时（如1-1.5小时、1.5-2.5小时、1小时、1.5小时或2.5小时）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。

所述步骤（3）又称脱脂处理。所述步骤（3）中：所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，要求残留可控、无细胞毒性或低细胞毒性、不会污染环境。所述步骤（3）中：所述表面活性剂可为TritonX-100。所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-0.8g/100ml、0.8g-3g/100ml、0.5g/100ml、0.8g/100ml或3g/100ml）。所述步骤（3）中：所述浸泡处理的条件可为：8-28℃（如8-18℃、14-28℃、10±2℃、16±2℃或26±2℃）、16-18小时（如16-17小时、17-18小时、16小时、17小时或18小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。

所述步骤（4）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或KOH。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为1.5-10M（如1.5-3M、3-10M、1.5M、3M或10M）。所述步骤（4）中：所述浸泡处理的条件可为：0-10℃（如0-7℃、3-10℃、2±2℃、5±2℃或8±2℃）、15-60分钟（如15-30分钟、30-60分钟、15分钟、30分钟或60分钟）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。

所述步骤（5）中：所述PBS缓冲液的pH可为5.8-7.2（如5.8-6.0、6.0-7.2、5.8、pH6.0或7.2）。所述步骤（5）中：所述浸泡处理的条件可为：8-28℃（如8-20℃、16-28℃、10±2℃、18±2℃或26±2℃）、10-18小时（如10-16小时、16-18小时、10小时、16小时或18小时）。

所述步骤（6）中：所述的辐照保护剂可以是阻隔剂、稳定剂、还原剂中的一种或几种。所述步骤（6）中：所述辐照保护试剂可为芦丁。所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度可为0.01-0.2g/100ml（如0.01-0.1g/100ml、0.1g-0.2g/100ml、0.01g/100ml、0.1g/100ml或0.2g/100ml）。所述步骤（6）中：所述浸泡处理的条件可为：18-28℃（如18-25℃、21-28℃、20±2℃、23±2℃或26±2℃）、1-6小时（如1-5.5小时、5.5-6小时、1小时、5.5小时或6小时）。所述辐照保护试剂溶液具体可为辐照保护试剂水溶液。

所述辐照灭菌具体可为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量可为15-30KGy（如15-25KGy、25-30KGy、15KGy、25KGy或30KGy）。

以上任一所述方法制备得到的皮肤补片也属于本发明的保护范围。

本发明采用特定的取材部位，该部位的原料加工后可得到具有适宜的天然孔洞的细胞外胶原基质。

本发明中，对胶原材料进行了辐照保护处理，在胶原材料上结合辐照保护剂，降低辐照过程对胶原材料固有结构的破坏，从而避免其在使用过程中降解过快，使降解与组织的生长速度同步，同时降解产物可被机体吸收利用，有利于缺损组织的再生性修复。

本发明得到的皮肤补片为具有天然孔洞的皮肤补片（主要成分为胶原蛋白）。采用本发明的皮肤补片进行皮肤修复具有如下优点：皮肤补片的渗液效果及与创面连续性好，不易产生瘢痕及斑点，且天然孔洞具有引导皮下组织再生的作用。

附图说明

图1为实施例1的步骤1的产物组织切片的HE染色结果。

图2为实施例1的步骤8的产物组织切片的HE染色结果。

图3为实施例1的步骤8的产物的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

芦丁：国药集团化学试剂有限公司，产品编号为U1606503，CAS编号为250249-75-3。该商购的芦丁的分子式为C₂₇H₃₀O₁₆·3H₂O，实施例中制备的芦丁溶液的浓度均以C₂₇H₃₀O₁₆计。

芦丁的结构式如下：

实施例1、天然具孔皮肤补片的制备

1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的猪的猪皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。

2、将步骤1得到的猪皮解冻并充分清洗，去除内表层的脂肪和外表层的鬃毛，用去离子水冲洗干净，由表皮层向真皮层切除0.5±0.2mm厚度后取1.0±0.2mm厚度的真皮及皮下组织层。

3、第一次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤2的产物。

本步骤的目的为：破坏细胞结构，破坏并溶解非目标成分（目标成分为胶原蛋白，非目标成分指的是留的少量脂肪、非胶原类蛋白、毛囊毛发等）。

具体步骤：使用0.8M NaOH水溶液，5±2℃浸泡处理1.5小时，然后用清水洗涤。

4、表面活性剂处理

使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤3的产物。

本步骤的目的为：进一步脱除非目标成分（主要为脂类物质，包含脂肪、细胞膜残片等）。

具体步骤：使用0.8g/100ml TritonX-100水溶液16±2℃浸泡处理17小时，然后用清水洗涤。

5、第二次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤4的产物。

本步骤的目的为：病毒灭活、去内毒素。

具体步骤：使用3M NaOH水溶液，5±2℃浸泡处理30分钟，然后用清水洗涤。

6、缓冲处理

使用PBS缓冲液浸泡处理步骤5的产物。

具体步骤：使用pH6.0的PBS缓冲液，18±2℃浸泡16小时，然后用清水洗涤。

pH6.0的PBS缓冲液的制备方法：取磷酸二氢钾6.8g，加80ml0.1M NaOH水溶液，用水稀释至1000ml。

7、辐射保护剂处理

用pH5.8-7.2的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤6的产物。

具体步骤：使用pH6.5、0.1g/100ml的芦丁水溶液，23±2℃浸泡处理5.5小时，然后用清水洗涤。

8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为25KGy）。

实施例2、天然具孔皮肤补片的制备

1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的牛的牛皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。

2、将步骤1得到的牛皮解冻并充分清洗，去除内表层的脂肪和外表层的鬃毛，用去离子水冲洗干净，由表皮层向真皮层切除0.4±0.2mm厚度后取0.7±0.2mm厚度的真皮及皮下组织层。

3、第一次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤2的产物。

具体步骤：使用0.5M NaOH水溶液，2±2℃浸泡处理2.5小时，然后用清水洗涤。

4、表面活性剂处理

使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤3的产物。

具体步骤：使用0.5g/100ml TritonX-100水溶液10±2℃浸泡处理18小时，然后用清水洗涤。

5、第二次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤4的产物。

本步骤的目的为：病毒灭活、去内毒素。

具体步骤：使用1.5M NaOH水溶液，2±2℃浸泡处理60分钟，然后用清水洗涤。

6、缓冲处理

使用PBS缓冲液浸泡处理步骤5的产物。

具体步骤：使用pH5.8的PBS缓冲液，10±2℃浸泡18小时，然后用清水洗涤。

pH5.8的PBS缓冲液的制备方法：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g，加水使溶解成1000ml。

7、辐射保护剂处理

用pH5.8-7.2的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤6的产物。

具体步骤：使用pH5.8、0.01g/100ml的芦丁水溶液，26±2℃浸泡处理6小时，然后用清水洗涤。

8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为15KGy）。

实施例3、天然具孔皮肤补片的制备

2、将步骤1得到的猪皮解冻并充分清洗，去除内表层的脂肪和外表层的鬃毛，用去离子水冲洗干净，由表皮层向真皮层切除0.8±0.2mm厚度后取1.8±0.2mm厚度的真皮及皮下组织层。

3、第一次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤2的产物。

具体步骤：使用4M KOH水溶液，23±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。

4、表面活性剂处理

使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤3的产物。

具体步骤：使用3g/100ml TritonX-100水溶液26±2℃浸泡处理16小时，然后用清水洗涤。

5、第二次碱处理

使用碱溶液浸泡处理步骤4的产物。

本步骤的目的为：病毒灭活、去内毒素。

具体步骤：使用10M KOH水溶液，8±2℃浸泡处理15分钟，然后用清水洗涤。

6、缓冲处理

使用PBS缓冲液浸泡处理步骤5的产物。

具体步骤：使用pH7.2的PBS缓冲液，26±2℃浸泡10小时，然后用清水洗涤。

pH7.2的PBS缓冲液的制备方法：取50ml0.2M磷酸二氢钾水溶液和35ml0.2M氢氧化钠水溶液，用水稀释至200ml。

7、辐射保护剂处理

用pH5.8-7.2的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤6的产物。

具体步骤：使用pH7.2、0.2g/100ml的芦丁水溶液，20±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。

8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为30KGy）。

实施例4、天然具孔皮肤补片的脱细胞效果

1、组织切片（HE染色）

实施例1的步骤1的产物组织切片的HE染色结果见图1，可见大量细胞。

实施例1的步骤8的产物组织切片的HE染色结果见图2，可见细胞已被完全脱除，仅留下胶原蛋白支架。实施例2的步骤8的产物组织切片的HE染色结果、实施例3的步骤8的产物组织切片的HE染色结果均与图2一致。

实施例1的步骤8的产物的照片见图3。

2、DNA残留检测

分别检测实施例1的步骤8的产物、实施例2的步骤8的产物和实施例3的步骤8的产物的DNA残留量，方法如下：取约0.1g待测物质，剪碎，加入5ml5%胰酶溶液，37℃消化过夜，取沉淀采用Qiagen组织提取DNA试剂盒提取基因组DNA，然后在微量分光光度计上检测。A260/280=1.63，计算得出每克待测物质中的DNA含量。每0.1g实施例1的步骤8的产物中仅含有0.73微克DNA，残留量很低。每0.1g实施例2的步骤8的产物中仅含有0.71微克DNA，残留量很低。每0.1g实施例3的步骤8的产物中仅含有0.72微克DNA，残留量很低。

实施例5、对照补片的制备

不进行步骤7，其它均同实施例1。

得到对照补片。

实施例6、天然具孔外科补片的性能

一、产品撕裂力的验证

采用力学测量仪（微机控制电子万能试验机，深圳市新三思计量技术有限公司，型号CMT8502），以25mm/min的速度对使用缝合线缝合的产品进行拉伸，实施例5得到的对照补片的撕裂力大约是4-6N，实施例1得到的天然具孔外科补片、实施例2得到的天然具孔外科补片和实施例3得到的天然具孔外科补片的撕裂力均为6-11N，完全符合缝合要求。

二、产品体外降解的验证

分别将实施例1的步骤8的产物、实施例2的步骤8的产物和实施例3的步骤8的产物进行体外降解试验，方法如下：将待测产品干燥至恒重，称重后，每克待测产品加入70ml pH7.4的PBS缓冲液，37±1℃静置放置；分别于1周、2周和4周后过滤；收集滤出物，干燥至恒重后称重；收集滤液，旋转蒸发得到干物质，检测其中的羟脯氨酸浓度。

检测其中的羟脯氨酸浓度的方法如下(参考GBT9695.23-2008，肉与肉制品羟脯氨酸含量测定)：

甲基红指示剂：取甲基红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠水溶液7.4ml使溶解，再加水稀释至200ml；变色范围pH4.2-6.3(红→黄)。

氧化剂溶液：（a）液，即氯氨T水溶液，制备方法：称取7.0g氯氨T于100ml水中，贮存在棕色瓶中置于暗处；（b）液，即醋酸－柠檬酸缓冲溶液（pH6.0），制备方法：称取醋酸钠·3H₂O57.0g，柠檬酸三钠·2H₂O37.5g，柠檬酸·H₂O5.5g，加少量水溶解，再加入385ml异丙醇，用水稀释至1000ml；临用前将（a）和（b）液按1：4体积混合，即得到氧化剂溶液，置于棕色瓶中。

艾氏试剂（显色剂）：对二甲氨基苯甲醛1.18mol/L，高氯酸2.44mol/L，异丙醇0.74%（体积分数），溶剂为水，临用前配制，置于棕色瓶中。

羟脯氨酸标准品储备液（1.6mmol/L）：称取20.98mg羟脯氨酸，溶于0.001mol/L盐酸水溶液中，使总体积为100ml，4°C可保存数月。制备不同浓度的羟脯氨酸溶液时，取羟脯氨酸标准品储备液，用水稀释即可。

1、样品处理

取供试品0.1g左右，放入具塞试管中，加入10ml6mol/l盐酸水溶液，封口后置135°C烤箱中水解4小时，冷却后打开封口加入2滴甲基红指示剂使之呈红色，用6mol/l氢氧化钠水溶液中和该液至中性呈微黄色，然后用纯化水稀释至1000ml，过滤，作为样品供试液。

2、样品测定

于带塞的比色管中，加入0.5ml样品供试液，加入0.5ml纯化水、2ml异丙醇，1ml氧化剂溶液、摇匀，室温放置4分钟使其氧化，再加入2ml艾氏试剂，加塞摇匀，放入60℃水浴中加热显色，20分钟后室温放置1小时，用1cm比色皿在560nm处测定吸光度。

3、制作标准曲线

分别取蒸馏水、16μmol/l羟脯氨酸溶液、32μmol/l羟脯氨酸溶液、48μmol/l羟脯氨酸溶液、64μmol/l羟脯氨酸溶液和80μmol/l羟脯氨酸溶液、，置于六个1cm比色皿，测定吸光度，绘制标准曲线。

4、将步骤2测得的吸光对，对照标准曲线，得出比色皿中的羟脯氨酸浓度（μmol/L）。

羟脯氨酸分子量：131.13。

结果见表1。

表1产品体外降解实验的结果

实施例2得到的天然具孔外科补片、实施例3得到的天然具孔外科补片的结果与实施例1得到的天然具孔外科补片的结果基本一致。结果表明，实施例1至实施例3得到天然具孔外科补片较实施例5得到的对照补片的降解时间延长，可以避免过早降解的现象。

实施例7、动物实验

实验动物：SD大鼠、体重250-300g，雄性。

用浓度0.5%戊巴比妥钠5mg/100g腹腔注射麻醉大鼠，用8%硫化钠脱毛。大鼠背部制作一处相当于体表面积0.5%的深Ⅱ度烫伤，蒸汽烫伤时间为5s（压力为0.12kPa），将实施例1制备的天然具孔外科补片移植于烫伤创口并缝合，然后打包加压，用石膏外固定。20天后，可以观察到，进行天然具孔外科补片移植的大鼠伤口完全愈合，外观接近原皮肤组织。不进行天然具孔外科补片移植的大鼠伤口比最初略有缩小，但坏死干痂未脱。

分别用实施例2制备的天然具孔外科补片、实施例3制备的天然具孔外科补片代替实施例1制备的天然具孔外科补片进行上述实验，效果与实施例1制备的天然具孔外科补片一致。

Claims

1.一种制备皮肤补片的方法，包括如下步骤：

（1）取离体的猪皮或牛皮，去除外表层的鬃毛后由表皮层向真皮层切除0.2-1.0mm厚度，然后取0.5-2.0mm厚度的真皮及皮下组织层；

（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；

（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；

（4）使用碱溶液浸泡处理步骤（3）的产物；

（5）使用PBS缓冲液浸泡处理步骤（4）的产物；

（6）使用pH5.8-7.2的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物可为NaOH或KOH；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.5-4M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-2.5小时。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中：所述表面活性剂为TritonX-100；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：8-28℃、16-18小时。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物可为NaOH或KOH；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为1.5-10M；所述浸泡处理的条件为：0-10℃、15-60分钟。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）中：所述PBS缓冲液的pH为5.8-7.2；所述浸泡处理的条件为：8-28℃、10-18小时。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）中：所述辐照保护试剂为芦丁；所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度为0.01-0.2g/100ml；所述浸泡处理的条件为：18-28℃、1-6小时。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述灭菌为钴-60辐射灭菌。

8.权利要求1至7中任一所述方法制备得到的皮肤补片。