CN108079364A - 一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，所述方法的步骤包括：对活体青蛙进行清洗；剥取所述青蛙皮；将剥取的青蛙皮进行初步消毒处理；将所述青蛙皮放入密封袋内，并加入辐照保护液；对青蛙皮进行辐照消毒等；还可以经真空冷冻干燥处理制成易于保存的成品。本发明的有益效果是：采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，辐照消毒过程采用辐照保护液，可充分灭菌消毒并使蛙皮具有蛙皮细胞活力，并保持完整皮肤结构，具备表皮及真皮，经临床实验具有突出的治疗效果。经真空冷冻干燥处理使制成的蛙皮烧伤创面生物敷料可在常规环境下长期保存，使用方便，医疗及市场前景十分良好。
Description
技术领域
本发明属于烧伤创面覆盖材料，尤其涉及一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法。
背景技术
目前在烧伤外科临床应用的异种皮主要是猪皮加工制成的脱细胞真皮基质敷料，该敷料以猪真皮为原料制备，不包括皮肤的表皮层，再经脱细胞工艺，去掉真皮中的细胞成分，剩余部分为真皮的胶原纤维结构，即为脱细胞真皮基质敷料。脱细胞猪皮应用于烧伤创面可减少水份蒸发、减少蛋白质丢失，减轻创面疼痛，刺激肉芽形成，保护上皮生长等。但该类型敷料的缺陷是：
1、由于不含表皮，不具备皮肤完整结构，因而贴附于创面后一侧真皮基质直接暴露在空气当中，很快干燥脱水，保湿力弱，且揭去时困难。
2、在脱细胞及灭菌消毒过程中，丧失了细胞活性，不含细胞成分，不能通过活细胞分泌生长因子等改善创面修复的微环境。
在临床实践中，采用猪皮加工制成的脱细胞真皮基质抗感染能力弱，只能用于早期新鲜二度烧伤创面，在烧伤后期的肉芽创面或有坏死组织残留的创面则不能应用，否则极易发生皮下积液积脓，引起感染。
青蛙属于两栖动物。生物学实验发现，给活蛙动手术，在不做任何消毒的情况下，其内脏和皮肤均不会发生感染，提示蛙皮存在较强的抗菌物质。目前发现其活性成份为多肽（蛙皮肽），有明显抗炎、抗菌作用。与猪皮相比较，蛙皮覆盖深度烧伤创面，可减少深度创面愈合天数及抗生素使用天数、减少创面感染发生率、增加细菌阴转率较少且排异反应小，明显优于猪皮，可以成为良好的烧伤创面生物敷料。但目前还缺少关于使用蛙皮的临床资料。更没有成品化的蛙皮面世。
采用青蛙皮制备烧伤创面生物敷料需要解决的主要问题是保证临床应用的安全性：青蛙为两栖动物，容易携带寄生虫，彻底杀灭寄生虫、细菌方可保证安全用于人体创面，但彻底杀灭寄生虫和细菌又会严重损害细胞的活力。另外还需要解决青蛙皮蛙皮烧伤创面生物敷料的保存问题，除液氮及深低温冰箱（-80℃）储皮外，通常使用的异种皮保存方式有以下几种：①纯甘油4 ℃保存。②体积分数50%的甘油-80 ℃保存。③乙醇4 ℃保存。④冷冻干燥常温保存。在此4种保存方式中，只有冷冻干燥可以常温保存，其他保存方式均需低温或深低温保存，且有研究表明，体积分数50%甘油溶液深低温保存不宜超过6个月，纯甘油4℃保存不宜超过3个月，而冷冻干燥及辐照灭菌后，常温下其有效期可达2年。由此可见冷冻干燥是最便于临床应用的一种保存方式。
发明内容
本发明的目的是提出一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法的技术方案，采用青蛙皮制成制成具备细胞活力的蛙皮烧伤创面生物敷料，并可采用常规方法保存，提高烧伤治疗效果。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，所述方法的步骤包括：
a. 对活体青蛙进行清洗；
b. 剥取所述青蛙皮；
c. 将步骤b剥取的青蛙皮进行初步消毒处理；
d. 将所述青蛙皮放入密封袋内，并加入辐照保护液；
e. 对青蛙皮进行辐照消毒；
f. 在无菌工作间中取出青蛙皮。
更进一步，所述青蛙是人工养殖牛蛙。
更进一步，步骤a中，将青蛙置于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡40min；步骤b中，于皮肤与肌肉间的疏松结蹄组织间隙，钝性分离青蛙皮，被剥取的所述青蛙皮包括表皮和真皮，去除头部和四肢的青蛙皮，以手术器械锐性剥离少量依然粘附在皮片上的肌肉、筋膜和血管。
更进一步，步骤c包括：
c1. 将步骤b剥取的青蛙皮在生理盐水中清洗；
c2. 浸入0.1%新洁尔灭溶液中浸泡20min；
c3. 再次将青蛙皮用生理盐水清洗至少三遍；
c4. 将所述青蛙皮浸入浓度为16万单位/L的庆大霉素生理盐水浸泡60min。
更进一步，在步骤d中，辐照保护液的配置方法为：在所述密封袋内加生理盐水，所述生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的10倍～20倍，将所述密封袋内空气抽出，向密封袋内注入氢气，并使用高压加压仓对密封袋进行持续 3h时的高压加压。
更进一步，所述生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的18倍，所述高压加压的压力为0.4MPa。
更进一步，在步骤e中，对所述双层密封袋内的青蛙皮进行剂量为3.0 kGy的钴60静态辐照，辐照时间为3h。
更进一步，在步骤d中，将所述青蛙皮放入双层密封袋内；在步骤f中，去除双层密封袋的外层，双层密封袋的内层进入无菌工作间后打开，取出蛙皮。
更进一步，所述方法包括真空冷冻干燥处理，所述真空冷冻干燥处理的步骤包括：
g. 配置真空冷冻干燥保护液；
h. 将步骤f取出的所述青蛙皮置于所述真空冷冻干燥保护液中，室温孵育1h；
i. 将所述青蛙皮从所述真空冷冻干燥保护液中取出，预冻降温至-40℃后移入消毒的真空冷冻干燥机内，冷冻干燥6h～8 h，使所述青蛙皮含水量≤5%；
j. 将步骤i处理后的青蛙皮置于密封袋内，将所述密封袋抽真空。
更进一步，在步骤g中，所述真空冷冻干燥保护液的配制方法为：在灭菌生理盐水中加入海藻糖、二甲基亚砜，配置成海藻糖最终浓度为0.7mol/L、二甲基亚砜最终浓度为10%的溶液。
本发明的有益效果是：采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，辐照消毒过程采用辐照保护液，可充分灭菌消毒并使蛙皮具有蛙皮细胞活力，并保持完整皮肤结构，具备表皮及真皮，经临床实验具有突出的治疗效果。经真空冷冻干燥处理使制成的蛙皮烧伤创面生物敷料可在常规环境下长期保存，使用方便，医疗及市场前景十分良好。
下面结合实施例对本发明作一详细描述。
具体实施方式
实施例一：
一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，本实施例中的青蛙是人工养殖牛蛙。其制备方法的步骤包括：
a. 对活体青蛙进行清洗；具体方法是，将青蛙置于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡40min。
b. 剥取所述青蛙皮；具体方法是，于皮肤与肌肉间的疏松结蹄组织间隙，钝性分离青蛙皮，被剥取的所述青蛙皮包括表皮和真皮，去除头部和四肢的青蛙皮，以手术器械锐性剥离少量依然粘附在皮片上的肌肉、筋膜和血管。本实施例所剥取的牛蛙皮质量为15g。
c. 将步骤b剥取的青蛙皮进行初步消毒处理；本步骤包括：
c1. 将步骤b剥取的青蛙皮在生理盐水中清洗，清洗方法是更换生理盐水清洗三遍，每遍清洗不少于1min。
c2. 浸入0.1%新洁尔灭溶液中浸泡20min。
c3. 再次将青蛙皮用生理盐水清洗至少三遍，每遍清洗不少于1min。
c4. 将所述青蛙皮浸入浓度为16万单位/L的庆大霉素生理盐水浸泡60min。
d. 将所述青蛙皮放入双层密封袋内，并加入辐照保护液，（辐照保护液是一种氢饱和的生理盐水，具有保护细胞活力的作用）；辐照保护液的配置方法为：在装有青蛙皮的密封袋内层加生理盐水，通常生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的10倍～20倍，本实施例中，生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的18倍，为270g；将密封袋内层的空气抽出，向密封袋内层注入氢气、并使密封袋密封（内、外两层均密封）。使用高压加压仓对密封袋进行持续3h时的高压加压使溶于生理盐水的氢气饱和。本实施例中，高压加压的压力为0.4MPa。
e. 对青蛙皮进行辐照消毒；具体方法是，对所述双层密封袋内的青蛙皮进行剂量为3.0 kGy的钴60静态辐照，辐照时间为3h。
f. 在无菌工作间中取出青蛙皮，具体方法是，去除双层密封袋的外层，双层密封袋的内层进入无菌工作间后打开，取出蛙皮。
取出的蛙皮即可作为烧伤创面生物敷料，用于对烧伤创面贴敷。
由于采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，抗感染能力强，辐照消毒过程采用辐照保护液，可充分灭菌消毒并使蛙皮具有蛙皮细胞活力，并保持完整皮肤结构，具备表皮及真皮，经临床实验具有突出的治疗效果。特别是对一些重度烧伤的治疗中具有突出的疗效。
实施例二：
一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料。本实施例是实施例一所述的蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法的特例。
本实施例中，在步骤d，生理盐水的加入量为青蛙皮质量的20倍。对于一些养殖环境较好、寄生虫和细菌携带量较少的牛蛙，可采用本实施例的生理盐水加入量。较多的生理盐水加入量，在辐照消毒过程中可进一步降低蛙皮细胞活性的损失，但同时也会降低辐照消毒的效果。根据实验分析，若生理盐水的加入量超过青蛙皮质量的20倍，将显著降低辐照消毒的效果。
实施例三：
一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料。本实施例是实施例一所述的蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法的特例。
本实施例中，在步骤d，生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的10倍。对于一些寄生虫和细菌携带量较多的牛蛙，或难以确定牛蛙品质，且需要最高的消毒灭菌效果的蛙皮，可采用本实施例的生理盐水加入量。较少的生理盐水加入量，可增强辐照消毒的效果，但在辐照消毒过程中可增加蛙皮细胞活性的损失。根据实验分析，若生理盐水的加入低于过青蛙皮质量的10倍，将显著降低蛙皮细胞的活力。
实施例四：
一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，本实施例的方法是对实施例一所述的方法制成的蛙皮烧伤创面生物敷料进行真空冷冻干燥处理，真空冷冻干燥处理的步骤包括：
g. 配置真空冷冻干燥保护液；具体方法是，在灭菌生理盐水中加入海藻糖、二甲基亚砜，配置成海藻糖最终浓度为0.7mol/L、二甲基亚砜最终浓度为10%的溶液。
h. 将步骤f取出的所述青蛙皮置于真空冷冻干燥保护液中，室温孵育1h。
i. 将所述青蛙皮从所述真空冷冻干燥保护液中取出，预冻降温至-40℃后移入消毒的真空冷冻干燥机内，冷冻干燥6h～8 h，使青蛙皮含水量≤5%。
j. 将步骤i处理后的青蛙皮置于密封袋内，将所述密封袋抽真空。
经真空冷冻干燥处理的蛙皮烧伤创面生物敷料可保存在4℃环境中，即通常的冷藏环境中，如冰箱中。保存有效期可达两年。
经真空冷冻干燥处理的蛙皮烧伤创面生物敷料在使用时，用生理盐水复水半小时，即可恢复皮片外观，清洗3次即可使用。
Claims (10)
1.一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，采用青蛙皮制成烧伤创面生物敷料，其特征在于，所述方法的步骤包括：
a. 对活体青蛙进行清洗；
b. 剥取所述青蛙皮；
c. 将步骤b剥取的青蛙皮进行初步消毒处理；
d. 将所述青蛙皮放入密封袋内，并加入辐照保护液；
e. 对青蛙皮进行辐照消毒；
f. 在无菌工作间中取出青蛙皮。
2.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，所述青蛙是人工养殖牛蛙。
3.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，步骤a中，将青蛙置于0.1%新洁尔灭溶液中浸泡40min；步骤b中，于皮肤与肌肉间的疏松结蹄组织间隙，钝性分离青蛙皮，被剥取的所述青蛙皮包括表皮和真皮，去除头部和四肢的青蛙皮，以手术器械锐性剥离少量依然粘附在皮片上的肌肉、筋膜和血管。
4.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，步骤c包括：
c1. 将步骤b剥取的青蛙皮在生理盐水中清洗；
c2. 浸入0.1%新洁尔灭溶液中浸泡20min；
c3. 再次将青蛙皮用生理盐水清洗至少三遍；
c4. 将所述青蛙皮浸入浓度为16万单位/L的庆大霉素生理盐水浸泡60min。
5.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，在步骤d中，辐照保护液的配置方法为：在所述密封袋内加生理盐水，所述生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的10倍～20倍，将所述密封袋内空气抽出，向密封袋内注入氢气，并使用高压加压仓对密封袋进行持续 3h时的高压加压。
6.根据权利要求5所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，所述生理盐水的加入量为所述青蛙皮质量的18倍，所述高压加压的压力为0.4MPa。
7.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，在步骤e中，对所述双层密封袋内的青蛙皮进行剂量为3.0 kGy的钴60静态辐照，辐照时间为3h。
8.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，在步骤d中，将所述青蛙皮放入双层密封袋内；在步骤f中，去除双层密封袋的外层，双层密封袋的内层进入无菌工作间后打开，取出蛙皮。
9.根据权利要求1所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，所述方法包括真空冷冻干燥处理，所述真空冷冻干燥处理的步骤包括：
g. 配置真空冷冻干燥保护液；
h. 将步骤f取出的所述青蛙皮置于所述真空冷冻干燥保护液中，室温孵育1h；
i. 将所述青蛙皮从所述真空冷冻干燥保护液中取出，预冻降温至-40℃后移入消毒的真空冷冻干燥机内，冷冻干燥6h～8 h，使所述青蛙皮含水量≤5%；
j. 将步骤i处理后的青蛙皮置于密封袋内，将所述密封袋抽真空。
10.根据权利要求9所述的一种蛙皮烧伤创面生物敷料制备方法，其特征在于，在步骤g中，所述真空冷冻干燥保护液的配制方法为：在灭菌生理盐水中加入海藻糖、二甲基亚砜，配置成海藻糖最终浓度为0.7mol/L、二甲基亚砜最终浓度为10%的溶液。
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