CN103007334A

CN103007334A - 一种液体创口修复膜及其制备方法

Info

Publication number: CN103007334A
Application number: CN2012105674552A
Authority: CN
Inventors: 顾海鹰; 夏栋林; 李晓东; 何红; 王雨飞; 陈超; 陈燕培
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Sino-British Arnokang (ningxia) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN103007334B

Abstract

本发明公开了一种液体创口修复膜及其制备方法。该液体创口修复膜包括底液和膜液；底液为羧甲基壳聚糖（CMC）的生理盐水溶液，其中羧甲基壳聚糖在底液中的浓度为0.5～5.0mg/mL；膜液包含聚乙烯醇缩丁醛（PVB）和乙醇溶液，其中乙醇溶液的浓度为80～100%，聚乙烯醇缩丁醛的用量为每10mL乙醇溶液中加入0.5～1.7g。本发明液体创口修复膜具有快干、防水、透气、阻菌等特点，且生物安全性高，疗效确切。

Description

一种液体创口修复膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种液体创口修复膜及其制备方法。

背景技术

目前医疗领域中用于创口修复的产品如各种创口贴，价格低廉、使用便捷等优点，常被人们当做简便易行的处理伤口的产品，但是传统创口贴具有以下缺点：（1）透气性差，不具备防水透气的功效；（2）与伤口贴服差，创口贴往往通过粘结层固定在伤口，伤口与外界密封性差，易于灰尘或者水渗入伤口，使伤口感染且疤痕过大；（3）各种现有的创口贴均具有固定的尺寸，对某些特定的创伤部位不方便使用。所以传统的创口贴如果使用不当，往往会造成创口愈合变慢、溃疡，甚至伤口组织感染。目前市面上的部分创口贴中也加入的一些药物，但仅发挥抑菌、消炎作用且常发生耐药性。当遇到较大伤口时，往往不做任何处理到医院就诊，增加了伤口感染的几率。当然目前也有液体创口贴的研究及产品的上市，主要是将促进创面修复的有效成分与成膜作用的化学物混合，生物兼容性和生物安全性差，同时也难以提供湿润的利于皮肤细胞增殖、伤口愈合。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种生物兼容性高、生物安全性良好且疗效确切，能够提供创面愈合湿润环境的液体创口修复膜及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种液体创口修复膜，包括底液和膜液；底液为羧甲基壳聚糖（CMC）的生理盐水溶液，其中羧甲基壳聚糖在底液中的浓度为0.5～5.0mg/mL；膜液包含聚乙烯醇缩丁醛（PVB）和乙醇溶液，其中乙醇溶液的浓度为80～100%，聚乙烯醇缩丁醛的用量为每10mL乙醇溶液中加入0.5～1.7g。

上述膜液中还包含壳聚糖及丙三醇，壳聚糖与聚乙烯醇缩丁醛的重量比为1:5～1:12，丙三醇的用量为每10mL乙醇溶液中加入0.05～0.80mL。

本发明还提供了上述液体创口修复膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）底液制备：取羧甲基壳聚糖烘干，灭菌，溶解于生理盐水中，制得底液；

（2）膜液制备：取聚乙烯醇缩丁醛，加入乙醇溶液中，在50℃下（可置于恒温水浴锅中），搅拌至完全溶解，即得所述膜液。

其中，步骤（2）膜液制备过程中，在搅拌前，还需要再乙醇溶液中加入壳聚糖；壳聚糖与聚乙烯醇缩丁醛的重量比为1:5～1:12。置于50℃恒温水浴锅中，搅拌至完全溶解后，还可加入丙三醇，混合搅拌均匀即得膜液；丙三醇的用量为每10mL乙醇溶液中加入0.05～0.8mL。

上述液体创口修复膜的优选制备工艺如下：

（1）底液制备：取10.0g壳聚糖于三颈烧瓶中，加入异丙醇100mL，50～60℃搅拌10min，在搅拌状态下将25mL浓度为10mol/L的NaOH溶液分5批20分钟内加完，再搅拌10min，置室温下溶胀12～15h，将60g氯乙酸分5批加入到溶胀后的壳聚糖中，再升温至60℃，继续搅拌3h后停止，真空抽滤，滤渣用乙醇多次洗涤后，50℃烘干即得羧甲基壳聚糖，干燥器内保存。使用前烘干过夜，灭菌，并溶解于无菌生理盐水，形成浓度为0.5-5.0mg/mL，作为液体创口修复膜的底液。

（2）称取聚乙烯醇缩丁醛3.5g，壳聚糖0.3g。量取95%乙醇35mL，置于恒温水浴锅中边加热边搅拌，待成膜物质完全溶解后，加入丙三醇1mL混合搅拌均匀得膜液，搅拌速度为300～400rpm。所得作为液体创口修复膜的膜液。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、通过底液和膜液结合使用，利用底液止血、促进细胞增殖等功效对创面进行伤口愈合；利用膜液速干，与创面紧密贴合，防水、抗菌、透气，并为底液提供湿润、无菌的良好愈合环境。

2、底液采用羧甲基壳聚糖的止血效果、创面修复、促进细胞增殖效果，对伤口进行护理；同时羧甲基壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，且无毒副作用，可明显促进正常皮肤成纤维细胞的增殖，从而抑制瘢痕疙瘩皮肤成纤维细胞的增殖，防止疤痕增生，有利于外观和功能的恢复，使伤口得到高质量愈合。

3、膜液采用聚乙烯醇缩丁醛和乙醇配制成的膏体，涂在皮肤或创面上，能够快干，产生一层透气的紧贴于皮肤的耐水薄膜。既可保持膜液与皮肤之间涂覆底液的湿润和无菌环境，又能阻挡灰尘细菌，替代了传统的纱布胶布包扎，从而克服皮肤用药容易被蹭掉的缺点。

4、同时膜液中还加入壳聚糖，具有缓释作用，延长促进伤口愈合的作用时间，有利于新生修复组织的结构重塑和构建，能增强或恢复伤口愈合后的力学强度。并利用丙三醇作为增稠剂，滋润皮肤，防止皮肤龟裂，对伤口有保湿作用。

附图说明

图1为实施例二中膜液中壳聚糖的缓释曲线图；

图2为效果实施例一中的阻菌性试验结果图；

图3为各实施例修复膜对SD大鼠急性皮肤创伤愈合的病理切片图；

图4为各实施例修复膜对SD大鼠缺损性慢性皮肤溃疡愈合的速度比较图；

图5为各实施例修复膜对SD大鼠缺损性慢性皮肤溃疡愈合的病理切片图。

图2中，1-纱布对照组，2-膜液组，3-滴加粘质沙雷氏菌培养后的纱布对照组，4-滴加粘质沙雷氏菌培养后的膜液组；

图3、图4和图5中，a-对照组，b-实施例一组，c-实施例二组，d-实施例三组，e-实施例四组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明液体创口贴进行详细说明。

羧甲基壳聚糖的制备：取10.0g壳聚糖于三颈烧瓶中，加入异丙醇100mL，50～60℃搅拌10min，在搅拌状态下将10mol/L NaOH 25mL溶液分5批20分钟内加完，再搅拌10min，置室温下溶胀12～15h，将60g氯乙酸分5批加入到溶胀后的壳聚糖中，再升温至60℃，继续搅拌3h后停止，真空抽滤，滤渣用乙醇多次洗涤后，50℃烘干即得羧甲基壳聚糖，干燥器内保存。

红外光谱分析：采用KBr压片，Avatar 370傅立叶变换红外光谱仪测定制备的羧甲基壳聚糖，结果显示在IR图谱于1635.56cm^-1和1385.22cm^-1处出现了羧甲基钠盐的特征吸收峰，说明壳聚糖发生了羧甲基化反应，生成了羧甲基壳聚糖。

羧甲基取代度（DS）的测定：精确称取0.5g羧甲基壳聚糖溶于50mL 0.1mol/L标准HCl溶液中，置磁力搅拌器上完全溶解，用0.1mol/L标准Na0H溶液滴定，分别记下pH 2.1和pH4.3时所耗NaOH体积V₁、V₂（mL）。

计算公式如下：DS=0.203A/(1-0.058A)，A=（V₂-V₁）*C/W

W---样品重量（g）；C---NaOH标准溶液的浓度（mol/L）

结果：DS=1.033。结合红外测定结果显示在壳聚糖羟基和氨基上都获得了取代，以醇羟基为主。说明壳聚糖发生了羧甲基化反应生成了羧甲基壳聚糖。

水溶性的测定：100g水中溶解CMC的质量W（g），W=0.712g，取代度大于0.7，表明合成的羧甲基壳聚糖易溶于水。

筛选实施例

底液CMC浓度筛选

取羧甲基壳聚糖使用前烘干过夜，准确称量。溶于无菌生理盐水中，分别制备浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL和20.0mg/mL的CMC生理盐水溶液。

生物兼容性试验：取复苏冻存的L-929细胞，以1.0×10⁴/mL密度接种至96孔板中，培养24h后弃去原培养液，在各组中分别加入含有不同浓度CMC的生理盐水溶液，分别为0mg/mL（空白对照组）、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL、20.0mg/mL共七组，每孔培养液体积为200μL，平行10孔，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。12h后采用MTT法评价羧甲基壳聚糖对L-929细胞的生长影响，酶标仪490nm处测量OD值。同法依次测24，48，72小时各组OD值。以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。对各组细胞4个时间点测得的OD值进行方差分析（见表1）：

表1 不同浓度CMC生理盐水溶液的生物兼容性评价结果

从表1可以看出，羧甲基壳聚糖在0.5～5.0mg/mL的浓度范围内生物兼容性较好，细胞的毒级均为1级及以下，1.0mg/mL组对L-929细胞的具有促进生长作用；当浓度超过10.0mg/mL生物兼容性变差，特别是浓度高于20.0mg/mL。

实施例一

底液制备：取筛选实施例中制备的浓度为0.5mg/mL的CMC生理盐水溶液作为底液。

膜液制备：称取聚乙烯醇缩丁醛1.5g，量取80%乙醇30mL，于三颈烧瓶中边加热边搅拌，待成膜物质完全溶解后，即得作为液体创口贴的膜液。

使用时，先将底液涂覆于伤口上，然后涂抹膜液。表面涂覆的膜液在90s内即干，能有效保持底液的湿润、无菌环境，为创面愈合提供良好的条件。

实施例二

底液制备：取筛选实施例中制备的浓度为1.0mg/mL的CMC生理盐水溶液作为底液。

膜液制备：称取聚乙烯醇缩丁醛3.5g，壳聚糖0.3g，量取95%乙醇35mL，于三颈烧瓶中边加热边搅拌，待成膜物质完全溶解后，加入丙三醇1mL混合搅拌均匀得膜液，搅拌速度为300～400rpm。所得作为液体创口贴的膜液。

将膜液涂抹在玻璃上，成膜后撕下，并称取0.1g，投入100mL磷酸缓冲溶液模拟胃模拟肠液（pH 7.45）中，于37℃以100rpm的速度搅拌，释放180min。每隔一段时间从中吸取2mL溶液，测定壳聚糖的含量，同时补充相同体积的磷酸盐缓冲溶液。壳聚糖的含量使用紫外分光光度法在262nm处测定，根据测定的壳聚糖含量计算出不同时间的释放百分比，如图1所示。

由图中可以看出：壳聚糖逐渐从膜中析出，4h时达到最高，以后逐步减弱。利用壳聚糖能够包裹药物，并且随着壳聚糖逐步释放，能够实现在液体创口修复膜中添加促进创面愈合的药物，并且利用其缓释功能，达到延长药物疗效的功能。

实施例三

底液制备：取筛选实施例中制备的浓度为2.0mg/mL的CMC生理盐水溶液作为底液。

膜液制备：称取聚乙烯醇缩丁醛5.1g，壳聚糖1.0g，量取无水乙醇30mL，于三颈烧瓶中边加热边搅拌，待成膜物质完全溶解后，加入2.4mL丙三醇即得作为液体创口贴的膜液。

实施例四

底液制备：取筛选实施例中制备的浓度为5.0mg/mL的CMC生理盐水溶液作为底液。

膜液制备：称取聚乙烯醇缩丁醛1.5g，壳聚糖0.3g，量取95%乙醇30mL，于三颈烧瓶中边加热边搅拌，待成膜物质完全溶解后，即得作为液体创口贴的膜液。

效果实施例一

膜液性能实施例：取实施例四中制备的膜液进行如下试验。

防水性：将膜液涂抹在玻璃上，成膜后撕下，试验样品在21±2℃，相对湿度（RH）为60±15%条件下，能够承受500mm的静水压＞300s。

水蒸气透过率(MVTR)：首先将膜液涂抹在玻璃上，成膜后撕下。将圆形样品精确地盖在试验容器的凸缘上，使液面与放置后的膜之间的空气间隙为5±1mm。称量并记录容器、样品和液体的质量(W₁)。将容器倒放于温度为(37±1)℃的恒温恒湿箱(10%RH)中。24h后，从恒温恒湿箱中取出容器，立即对容器和样品称量，记录质量(W₂)。

用公式MVTR＝(W₁-W₂)×1000×24/T计算水蒸气透过率，上述膜液成膜的水蒸气透过率为2176.5±334.4g·m^-2·24h^-1。大于目前行业标准1000g·m^-2·24h^-1。说明本发明修复膜具有良好的透气性。

阻菌性：参照15011607-2006国际标准，采用琼脂接触攻击试验法进行检测，以双层医用纱布为对照，在测试物表面滴加5滴粘质沙雷菌，24h后移去测试物，48h后观察培养皿是否有粘质沙雷菌生长，如图2所示。从图中可以看出，滴加培养后的膜液组4能够有效阻挡细菌（粘质沙雷菌）的渗透，防止细菌对创面的感染。

效果实施例二

液体创口修复膜的安全性评价

皮肤刺激试验：

动物背部两侧各以电推剪去动物背毛，制造二个脱毛区，面积约3×4cm²，观察24小时，选用无损伤部位进行实验。将受试动物人工固定，将每只豚鼠左侧脱毛区分别用实施例一至四制备的液体创口修复膜直接涂布，右侧脱毛区作为自身对照。

4小时后，去掉所有覆盖物，以温水洗净药物，然后将动物放回笼内，自由进食饮水。分别于1h、24h、48h、72h后观察豚鼠中毒症状和皮肤刺激反应。结果显示：各实施例的液体创口修复膜对所有动物均无明显刺激症状。

致敏试验

采用Buehler斑贴法，使用豚鼠30只，共分4组，即受试物诱导组和非诱导组各10只动物，阳性对照物诱导组和非诱导组各5只动物。剂量设计如下表2所示，受试物分别采用实施例一至四制备的修复膜。试验期间对受试动物一般状态、给药部位皮肤有无异常进行观察。于激发给药后24及48h观察，各组均未出现皮肤红斑或水肿的豚鼠（参照中华人民共和国国家标准GBZ/T 240.7-2011《化学品毒理学评价程序和试验方法第7部分：皮肤致敏试验》）。试验表明，各实施例制备的液体创口修复膜对皮肤不具有致敏作用。

表2 致敏试验剂量设计

效果实施例一

对大鼠创伤止血效果

采取股静脉进行止血试验，采用乙醚吸入麻醉SD大鼠，将大鼠仰卧固定在手术台上，在其一侧腹股沟处游离解剖出股静脉后用尖头刀挑破，即完成出血模型的制作。模型制作完成后，令大鼠自由出血3s，分别使用实施例一至四制备的液体创口修复膜进行止血，一组大鼠不使用任何止血材料，作为空白对照组。观察各项指标，如表3所示。结果显示：空白对照组的平均止血时间为6.32±0.43min，失血量4.57±0.39g/kg；采用本发明制备的液体创口修复膜止血时间平均缩短3分钟，失血量最小1.59±0.61g/kg（实施例三），各实施例组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

表3 各实施例制备修复膜对大鼠后肢股静脉创面平均失血量（g/k g）和止血时间（min）

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

从表3测得的数值可以看出，各实施例组的止血时间和出血量都比对照组少，止血效果明显。其中底液中CMC浓度为2.0mg/mL的液体创口修复膜（实施例三）的止血效果最好，所用止血时间最少。

效果实施例二

SD大鼠急性皮肤创伤治疗试验

在SD大鼠背部剪成直径为2厘米的圆形，割破皮肤（表皮、真皮)，深达筋膜，建立SD大鼠急性皮肤创伤模型。随后分别采用实施例一至四制备的液体创口修复膜对伤口进行治疗。一组大鼠不使用任何止血材料，作为空白对照组。SD大鼠创伤面积比较见表4，创伤愈合时间比较见表5。

表4 各组修复膜治疗SD大鼠急性创伤后创面面积比较(cm²,n=3,t/d)

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

从表4可以看出，从第3天开始，采用本发明制备的液体创口修复膜表现出优越的性能，各组与对照组相比，P<0.05，统计学差异明显。到第11天，采用底液中CMC浓度为2.0mg/mL的液体创口修复膜（实施例三）处理的创面基本愈合，其与对照组比较，P<0.01，统计学差异显著。

表5 各组修复膜治疗SD大鼠急性皮肤创伤后创面愈合时间比较

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

从表5各组大鼠创面愈合时间可以看出，底液中CMC浓度为2.0mg/mL的液体创口修复膜（实施例三）处理的创面愈合时间要比不做处理的对照组提前2.5天左右，效果显著。

对各实验组样本的HE染色切片进行光镜观察，从图3的病理切片（第7天）上可以看出，对照组a缺口还未闭合，纤维收缩未完毕，上皮化未开始。实施例三组d恢复效果最好，颗粒层、生发层和真皮层最薄，肉芽组织最小，接近正常组皮肤。

基于以上分析可以得出，底液中CMC浓度为2.0mg/mL的液体创口修复膜（实施例三）处理液体创口贴对创伤修复效果最好。

效果实施例三

缺损性慢性皮肤溃疡治疗试验

缺损性慢性皮肤溃疡模型建立时，取健康SD大鼠25只，实验前用梯子剃毛，面积为3.5×3.5cm²。用乙醚麻醉，将半径为2cm的圆形图章在大鼠背部正中印出标记，用剪刀按印迹范围剪去全层皮肤及皮下结缔组织，避开较大血管，深至筋膜，造成缺损创面。用50％冰醋酸涂创面1次/d，共1周。形成缺损性慢性皮肤溃疡模型。采用实施例一至四制备的液体创口修复膜对其进行治疗，结果如下表6所示。

表6 各实施例修复膜治疗SD大鼠慢性创伤后创面面积比较

(cm²,n=6,t/d)

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

从表6可以看出：本发明制备的液体创口修复膜从第5天开始在治疗SD大鼠慢性创面方面突显其优越性，特别是底液中CMC浓度为5.0mg/mL的液体创口修复膜（实施例四），在第30天时，创面基本愈合，而对照组还有较大的创伤面积。

图4为采用实施例一至四制备的液体创口修复膜治疗SD大鼠慢性创面愈合速度比较图，从图中可以看出，采用本发明制备的液体创口修复膜均能够加快慢性溃疡的愈合速度。

从病理切片（第二十天）（如图5所示）上可以看出，各实施例修复膜b、c、d、e在促进SD大鼠急性皮肤损伤愈合过程中，创面下纤维母细胞、纤维组织及小血管增生十分明显，间质中炎性反应较重，多核白细胞数量较多，但创面炎性渗出物极少，创面相当平整湿润，创缘处的鳞状上皮细胞已经向创面迁移，说明本发明液体创口修复膜能抑制皮肤溃疡表面炎症反应，减少炎性分泌物，促进成纤维细胞及上皮细胞的生长，加速溃疡皮肤的修复，并成生理性愈合；对照组a创面下的纤维母细胞与血管的增生不及新型液体创口修复膜组，其创面的炎性分泌较多，创伤愈合欠佳。

从上述实施例可以看出，液体创口修复膜的底液中羧甲基壳聚糖溶于水，膜液能够承受500mm静水压300s，水蒸气通过率2176.5±334.4g·m^-2·24h^-1，能够阻挡细菌穿透；同时对皮肤无刺激作用，为弱致敏物，同时生物兼容性高。同时膜液中壳聚糖能够缓释，延长促进伤口愈合的作用时间。能够明显止血，各实施例组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），能够快速促进SD大鼠急性皮肤创伤、缺损性慢性皮肤溃疡愈合，P<0.05。

本发明构建的液体创口修复膜，具有使用方便、快干、防水、透气、阻菌等特点，且安全性高，不对皮肤产生刺激及致敏作用；同时膜液中壳聚糖能够缓释，延长促进伤口愈合的作用时间；底液中含羧甲基壳聚糖浓度为0.5～5.0mg/mL的液体创口修复膜对急性皮肤创伤修复和缺损性慢性皮肤溃疡均具有明显的治疗效果，可以显著地促进溃疡创面的生长与愈合，缩短皮肤愈合时间，且能达到良好的生理性修复。在进行止血和治疗急性皮肤创伤时，优选底液中CMC浓度为2.0mg/mL的液体创口修复膜；在治疗缺损性慢性皮肤溃疡时，优选底液中CMC浓度为5.0mg/mL的液体创口修复膜。同时，本发明的膜液和底液能够包含溶于水和不溶于水的一些特殊药物，为针对不同的创面类型，添加有效药物提供了条件。因此，本发明液体创口修复膜将具有广泛的实际应用前景，为创伤患者带来福音。

Claims

1.一种液体创口修复膜，其特征在于：包括底液和膜液；所述底液为羧甲基壳聚糖的生理盐水溶液；所述羧甲基壳聚糖在底液中的浓度为0.5～5.0mg/mL；所述膜液包含聚乙烯醇缩丁醛和乙醇溶液；所述乙醇溶液的浓度为80～100%；所述聚乙烯醇缩丁醛的用量为每10mL乙醇溶液中加入0.5～1.7 g。

2.根据权利要求1所述的液体创口修复膜，其特征在于：所述膜液中还包含壳聚糖；所述壳聚糖与所述聚乙烯醇缩丁醛的重量比为1:5～1:12。

3.根据权利要求1所述的液体创口修复膜，其特征在于：所述膜液中还包含丙三醇；所述丙三醇与乙醇溶液的体积比为0.5:100～8:100。

4.一种如权利要求1所述液体创口修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）底液制备：取所述羧甲基壳聚糖烘干，灭菌，溶解于所述生理盐水中，制得所述底液；

（2）膜液制备：取所述聚乙烯醇缩丁醛，加入乙醇溶液中，在50℃下加热搅拌至完全溶解，即得所述膜液。

5.根据权利要求4所述液体创口修复膜的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖通过以下步骤制备：取10.0 g壳聚糖于三颈烧瓶中，加入异丙醇100 mL，50～60℃搅拌10 min，在搅拌状态下将25 mL，浓度为10 mol/L 的NaOH溶液分5批20分钟内加完，再搅拌10 min，置室温下溶胀12～15 h，将60 g氯乙酸分5批加入到溶胀后的壳聚糖中，再升温至60 ℃，继续搅拌3 h后停止，真空抽滤，滤渣用乙醇多次洗涤后，50℃烘干即得。

6.根据权利要求4所述液体创口修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）膜液制备过程中，在加热搅拌前，还需要在所述乙醇溶液中加入壳聚糖；所述壳聚糖与所述聚乙烯醇缩丁醛的重量比为1:5～1:12。

7.根据权利要求4所述的液体创口修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）加热搅拌至完全溶解后，加入丙三醇，混合搅拌均匀即得所述膜液；所述丙三醇与乙醇溶液的体积比为0.5～8:100。