CN111171131A

CN111171131A - 具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白n端肽段及其用途

Info

Publication number: CN111171131A
Application number: CN202010033124.5A
Authority: CN
Inventors: 徐海君; 薛文华; 王琪琦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111171131B

Abstract

本发明涉及生物分子高效运载技术，旨在提供一种具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段及其用途。该肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该肽段作为褐飞虱卵巢靶向生物分子转运载体的用途，是以所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段携带生物分子通过褐飞虱母体血淋巴靶向进入卵中；所述生物分子是核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒或小分子化合物中的任意一种，或者是任意多种的复合物。可以将本发明提供的肽段用作生物分子运输载体，特别是用作基因编辑元件运输载体携带生物分子进入褐飞虱卵巢。与其它外源的高分子材料或外源蛋白相比，VgNPP来源于褐飞虱本身，因此对褐飞虱无毒副作用，有着非常广阔的应用前景。

Description

具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N 端肽段及用途，具体涉及生物分子高效运载技术方法。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal))，半翅目、飞虱科，单食性害虫，以直接刺吸水稻的韧皮部汁液以及传播水稻病毒危害水稻。褐飞虱的爆发可导致大面积水稻“虱烧”，目前褐飞虱已经成为亚洲不少国家水稻生长上的重要害虫。由于其重要的经济价值和生态意义，长期以来，褐飞虱的主要研究都集中在生殖发育、农药抗性、翅型分化、长距离迁徙等方面。应用于基因功能研究的RNA干扰技术在褐飞虱成灾的分子机制研究中起着重要的作用。但是，RNA干扰只能非持续性的部分降低基因转录，某些转录因子、胚胎表达等基因干扰效率较低。因此，遗传操作技术急需被应用在褐飞虱的研究中来克服上述问题，但迄今为止对褐飞虱的研究仍缺方便、简洁、成熟的遗传操作手段。

对于一个行之有效的遗传操作技术而言，将生物分子便捷的运送进入目的组织或细胞的载体至关重要。近年来，生物分子运输载体对其安全性、低毒性、低免疫反应等特性都提出了要求。迄今比较常用的生物大分子细胞或组织内导入方式有病毒载体、电穿孔、脂质体转染、显微注射等。其中病毒载体有较高的转运效率，但是病毒转运前期准备复杂，且存在生物安全因素。而电穿孔介导生物分子系进入细胞或组织方法简单，普适性高，但是仪器要求高，同时存在较高的细胞或组织致死率。脂质体介导法通过细胞融合的方式将复合体转运到细胞内，表现出较高的转染效率，但是脂质体对细胞有较高的毒性，同时价格昂贵。显微注可以通过微细玻璃管直接将注射进入细胞，是最直接的方式，但是需要精密的仪器设备，致死率过高。由于上述缺点，寻找新型的、理想的褐飞虱卵巢(胚胎)生物分子输送系统对于褐飞虱的防治、暴发成灾机制研究至关重要。

对于褐飞虱而言，2018年薛文华等人使用CRISPR/Cas9(clustered regularlyinterspaced palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系统将体外合成的Cas9 mRNA与目的基因的gRNA复合体直接注射进入褐飞虱胚胎成功编辑褐飞虱两个眼颜色素相关基因(Insect Biochem Mol Biol 2018,93,19-26)，为褐飞虱遗传操作和绿色防控提供了理论和技术支持。但直接注射胚胎的方法会导致极较低的胚胎存活率。昆虫卵黄原蛋白vitellogenin(Vg)可能通过与卵黄原蛋白受体(VgRs)结合，特异性从血淋巴进入卵巢，但具体的分子机制至今仍不清楚。昆虫Vg蛋白的分子量通常比较大(>150kDa)，很难与目标蛋白融合表达纯化，因此不可直接用于转运载体的开发。所以，目前急需一种便捷、高效、无损伤的可将生物分子运送至褐飞虱卵巢中的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段及其用途。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段(VgNPP)，该肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，包含50个氨基酸，具体序列如下：

Met-Asn-Ala-Thr-Leu-Val-Ser-Val-Ser-His-Ala-Ser-Ser-Gly-Ser-Pro-Gln-Ser-Val-Gln- Asn-Pro-Gln-Lys-Ile-Asn-Asp-Leu-Val-Tyr-Glu-Phe-AsnPro-Ala-Ser-Asn-Ser-Glu-Ser-Asn- Gln-Arg-Ser-Ser-His-Tyr-Thr-Arg-Gln(甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-缬氨酸-丝氨酸-组氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-脯氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-谷氨酸-丝氨酸-天冬酰胺--谷氨酰胺-精氨酸--丝氨酸-丝氨酸-组氨酸-酪氨酸-苏氨酸-精氨酸-谷氨酰胺)。

本发明进一步提供了一种多肽，该多肽包括所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段；或者具有与所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段相比同源性高于30％的肽段。

本发明进一步提供了一种融合蛋白，该融合蛋白含有权利要求1所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段，该肽段与目的蛋白直接连接或者通过接头与其连接以用于荧光标记或基因编辑(例如用作标记绿色荧光蛋白GFP和用作基因编辑的Cas9蛋白)。

本发明中，所述肽段、多肽或融合蛋白通过人工合成或重组表达获得。

本发明进一步提供了用于编码所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或所述融合蛋白的编码基因核酸。

本发明进一步提供了含有所述编码基因核酸的真核表达载体或原核表达载体。

本发明进一步提供了含有所述的编码基因核酸或载体的宿主细胞或重组表达细菌。

本发明进一步提供了所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段作为褐飞虱卵巢靶向生物分子转运载体的用途。

本发明中，是以所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段携带生物分子通过褐飞虱母体血淋巴靶向进入卵中；所述生物分子是核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒或小分子化合物中的任意一种，或者是任意多种的复合物。

本发明进一步提供了所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养宿主细胞或重组表达细菌，从培养物中回收褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或者融合蛋白。

发明原理描述：

申请人获取了褐飞虱Vg蛋白的N端一段短肽(vitellogenin N-terminalpolypeptide， VgNPP)。经实验验证发现，该肽段可以通过血淋巴靶向进入褐飞虱卵巢的功能，并可携带蛋白质等生物分子跨卵巢滤泡细胞进入卵内，是一种极具生物学研究和应用价值的蛋白、核酸等生物活性分子的进卵运输载体。通过VgNPP与目标生物分子的融合注入母体，便可将目标蛋白从母体的血淋巴转运入卵巢中，避免了传统遗传操作的胚胎微注射的高技术要求及繁琐步骤。这一运载技术体对褐飞虱的遗传研究与防治均具有重要的意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供了褐飞虱卵巢靶向的关键肽段VgNPP，可以将其用作生物分子运输载体的用途及应用，特别是用作基因编辑元件运输载体携带生物分子进入褐飞虱卵巢。

2、与其它外源的高分子材料或外源蛋白相比，VgNPP来源于褐飞虱本身，因此对褐飞虱无毒副作用。作为褐飞虱基因功能、遗传操作研究的分子载体，有着非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的VgNPP携带生物分子从血淋巴进入卵巢原理示意图。

图2为褐飞虱VgNPP与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白(VgNPP-GFP)的原核表达的SDS-PAGE电泳图。

图中，泳道1为蛋白预染marker，泳道2为原核表达诱导后的蛋白样品，泳道3为未诱导的蛋白样品。箭头指示VgNPP-GFP融合蛋白的表达。

图3为将VgNPP-GFP注射母体后的卵巢解剖图。

图中，绿色荧光表示已进入卵巢的VgNPP-GFP融合蛋白。

图4为褐飞虱VgNPP与绿色荧光蛋白GFP、Cas9的融合蛋白(VgNPP-GFP-Cas9) 的原核表达的SDS-PAGE电泳图。

图中，泳道1为蛋白预染marker，泳道2为未诱导的蛋白样品，泳道3为原核表达诱导后的蛋白样品。箭头指示VgNPP-GFP-Cas9融合蛋白的表达。

图5为将VgNPP-GFP-Cas9注射母体后的卵巢解剖图。

图中，绿色荧光表示已进入卵巢的VgNPP-GFP-Cas9融合蛋白。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“生物分子”是指存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒或小分子化合物中的任意一种，或者是任意多种的复合物。

术语“Cas9(CRISPR-associated 9)蛋白”指来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA的核酸内切酶。

术语“多肽”通常是指11个以上的氨基酸组成的肽。术语“蛋白质”通常是指含有50个以上的氨基酸残基的多肽链。

此次实施例中所用的引物均为杭州擎科生物科技公司合成，pET-28a购自Invitrogen^TM公司，Pmal-C5X购自New England Biolabs^TM，PCR所用Premix Ex Taq酶购自大连宝生物公司，pEASY-T3载体购自全式金公司，同源重组构建载体试剂盒购自南京诺唯赞生物公司，蛋白marker购自Thermo Fisher Scientific，酚、氯仿、异戊醇等各类有机试剂和戊唑醇等无机试剂购置国药集团化学试剂有限公司。本发明中使用的野生型褐飞虱采于杭州。

褐飞虱卵巢靶向的生物分子运载技术及其制备的示例性操作，包括如下步骤：

(1)表达载体构建和转化

按照常规的操作方式，将褐飞虱Vg关键序列与绿色荧光蛋白gfp序列和Cas9序列构建至Pmal-C5X载体。该过程中所用引物分别为：

载体1：Pmal-C5X-Vg-gfp：

1C5X-P2B+C-S-forGFP-F:

atcgtcgacggatccgaattcATGAATGCCACCCTTGTCTCC(SEQ ID NO：2)

2C5X-P2B+C-S-forGFP-R:

ttgctcaccatCTGCCTGGTGTAGTGGCTAGATC(SEQ ID NO：3)

3C5X-P2B+C-S-GFP-F:

accaggcagATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ ID NO：4)

4C5X-P2B+C-S-GFP-R:

ttaattacctgcagggaattcTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：5)

载体2：Pmal-C5X-Vg-gfp-Cas9：

1C5X-VgGFP-for-Cas9-F:

atcgtcgacggatccgaattcAACTTTAGCAACTGTGATAACCCAGT(SEQ ID NO：6)

2C5X-VgGFP-for-Cas9-R:

ttggagccatCTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：7)

3C5X-Vg-GFP-Cas9-F:

gctgtacaagATGGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGGTAGACTACAAAGA(SEQ ID NO：8)

4C5X-Vg-GFP-Cas9-R:

ttaattacctgcagggaattcTCATACCTTACGCTTCTTCTTTGGGTCACCTCCTAGCTG (SEQ IDNO：9)

PCR体系：

PCR反应条件为:95℃预变性5min，进入循环(95℃，20s、58℃，30s、72℃，20s 共30个循环)，然后72℃，10min，胶回收纯化。

同源重组体系：

50℃反应30min后，转化至Rosseta表达感受态。

表达载体构建和转化的具体操作属本领域技术人员熟练掌握的技能，本发明不再赘述。

(2)诱导表达

对于已成功导入重组表达载体的表达菌，取单菌落，摇菌过夜

a)在5ml液体培养基中，加入100ul菌液，摇至OD600 0.4；

b)加入IPTG，终浓度为1mM可设置梯度，200rpm，20℃诱导过夜；

c)取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清；

d)加入200ul 1×PBS，重悬菌液制样；

d)SDS-PAGE检验蛋白表达情况。

图2和图4中的第二泳道和第三泳道分别为，Vg、GFP两者的融合重组蛋白表达情况及Vg、GFP、Cas9三者的融合重组蛋白表达情况，其中箭头指示的为目的蛋白条带。

(3)重组蛋白的显微注射

将诱导表达后的2ml菌液用PBS磷酸缓冲液重悬洗涤2次后，超生破碎，诶次5s，共10次至澄清，14000rpm离心后，将上清注射至初羽化2天的褐飞虱雌虫中。

(4)激光共聚焦显微镜观察蛋白运输情况

注射3天后，将褐飞虱雌虫的卵巢解剖，制片，放至激光共聚焦显微镜下，使用激发光488nm波长，在褐飞虱卵巢正在发的卵中发现大量的GFP蛋白绿色荧光信号(图 3和图5)。说明褐飞虱VgNPP肽段成功将GFP，以及GFP-Cas9融合蛋白运送至褐飞虱卵巢中。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段及其用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Ser His Ala Ser Ser Gly Ser Pro

1 5 10 15

Gln Ser Val Gln Asn Pro Gln Lys Ile Asn Asp Leu Val Tyr Glu Phe

20 25 30

Asn Pro Ala Ser Asn Ser Glu Ser Asn Gln Arg Ser Ser His Tyr Thr

35 40 45

Arg Gln

50

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgtcgacg gatccgaatt catgaatgcc acccttgtct cc 42

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgctcacca tctgcctggt gtagtggcta gatc 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accaggcaga tggtgagcaa gggcgagg 28

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaattacct gcagggaatt cttacttgta cagctcgtcc atgcc 45

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgtcgacg gatccgaatt caactttagc aactgtgata acccagt 47

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttggagccat cttgtacagc tcgtccatgc c 31

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgtacaag atggctccaa agaagaagcg taaggtagac tacaaaga 48

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaattacct gcagggaatt ctcatacctt acgcttcttc tttgggtcac ctcctagctg 60

Claims

1.一种具有卵巢靶向功能的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段，其特征在于，该肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种多肽，其特征在于，该多肽包括所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段；或者具有与所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段相比同源性高于30％的肽段。

3.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白含有权利要求1所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段，该肽段与目的蛋白直接连接或者通过接头与其连接以用于荧光标记或基因编辑。

4.权利要求1至3所述的褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段、多肽或融合蛋白，其特征在于，所述肽段、多肽或融合蛋白通过人工合成或重组表达获得。

5.用于编码权利要求1所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或权利要求3所述融合蛋白的编码基因核酸。

6.含有权利要求5所述编码基因核酸的真核表达载体或原核表达载体。

7.含有权利要求5所述的编码基因核酸或权利要求6所述载体的宿主细胞或重组表达细菌。

8.权利要求1所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段作为褐飞虱卵巢靶向生物分子转运载体的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，是以所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段携带生物分子通过褐飞虱母体血淋巴靶向进入卵中；所述生物分子是核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒或小分子化合物中的任意一种，或者是任意多种的复合物。

10.权利要求1所述褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或权利要求3所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养宿主细胞或重组表达细菌，从培养物中回收褐飞虱卵黄原蛋白N端肽段或者融合蛋白。