CN114457067A - 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 - Google Patents
一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114457067A CN114457067A CN202210115298.5A CN202210115298A CN114457067A CN 114457067 A CN114457067 A CN 114457067A CN 202210115298 A CN202210115298 A CN 202210115298A CN 114457067 A CN114457067 A CN 114457067A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- cellulose
- magnetic beads
- fusion protein
- taqmuts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 title abstract description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 59
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 35
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 55
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 7
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229940044631 ferric chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims description 5
- NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K iron trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].Cl[Fe+]Cl NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 91
- 102000010645 MutS Proteins Human genes 0.000 description 32
- 108010038272 MutS Proteins Proteins 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 101710099953 DNA mismatch repair protein msh3 Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- -1 phosphoramidite triester Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000219929 Onagraceae Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000012943 hotmelt Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
Abstract
本发明提供了一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。本发明将纤维素包被磁珠与错配结合蛋白二者进行组合，建立一种可用于DNA合成中有错DNA高效去除的方法。在该方法中，磁珠制备简单，材料成本低，错配结合蛋白的结合快速简便，对于有错DNA的去除快速有效。
Description
技术领域
本发明涉及到生物技术领域。具体地，涉及通过构建一种纤维素包被的磁珠，快速结合错配结合蛋白(MutS)-纤维素结合域融合蛋白，去除与MutS结合的有错配的DNA。本发明可用于降低DNA合成中的错误，提高DNA合成效率，降低DNA合成成本。
背景技术
随着合成生物学的发展，对DNA从头合成的需求越来越大。DNA的从头合成通常先合成寡核苷酸，再将寡核苷酸组装成1Kb左右的DNA片段。需要更长的DNA时，可以通过将1Kb的DNA进一步组装获得。传统的寡核苷酸的合成方法采用的是在多空玻璃柱或其他材料上的固相亚磷酰胺三酯法合成，技术比较成熟，产量相对较大，但电使得成本较高。新型的基于芯片的高通量原位寡核苷酸合成技术是一类高通量并行合成寡核苷酸的技术，该技术可以在一张芯片上合成数千，甚至数万种不同的寡核苷酸，可以极大的降低单种寡核苷酸的合成成本(王冬梅et al.，2012)。但是由于寡核苷酸合成过程中难免会有错误，而芯片合成的寡核苷酸错误率更高，DNA合成中的错误去除或纠正就尤为重要。
DNA合成中错误去除的方法有两大类，即核酸酶切除法和错配结合蛋白(MutS)结合法(王冬梅et al.，2012)。当将DNA进行变性退火以后，正确和错误的DNA之间会形成错配，以上两种方法都可以将有错配的DNA去除。核酸酶法是通过一类能识别错配的核酸酶，找到DNA错配部分，并将其切断一条链，再切去错配的碱基，处理过的DNA可以通过DNA组装和扩增获得错误率大幅度降低的DNA片段。而错配结合蛋白方法，一般采用MutS结合有错配的DNA，再将MutS和有错配DNA复合物去除，获得无错DNA。上述两种方法，由于技术原因都不可能完全去除有错DNA。
错配结合蛋白结合法只需一种蛋白，而核酸酶法常常需要两种以上酶，因此，错配结合蛋白法更简单一些。错配结合蛋白结合错配DNA后与无错DNA的分离可以通过电泳分离(Carr et al.，2004)或固定化MutS的分离，并且已有报道证明通过MutS的方法，获得完全正确的DNA的比例比其他方法高(Lubock et al.，2017)。电泳方法相对麻烦，步骤多，而固定化法相对快捷、简便。固定MutS也有报道采用磁珠法，但是磁珠法中的磁珠需要进行链霉亲和素交联，价格昂贵，蛋白需要生物素标记，整个固定化过程繁琐(Geschwind et al.，1996)。本发明人前期建立了与纤维素结合域融合重组表达MutS蛋白，可以快速简便地将MutS融合蛋白固定到纤维素上，填充成纤维素柱进行DNA合成错误去除的方法，可大幅度降低成本(Wan et al.，2014；Wan et al.，2017)。该方法已经在大规模芯片合成的寡核苷酸的错误去除中证明有效，但是该方法不足之处是需要的DNA量相对较大，而且操作进行的体积较大(0.5mL)。
本发明将利用纤维素结合域在纤维素上的固定化的便利性，同时依据多糖包被磁珠制作方法，制作多糖包被的磁珠，然后将两者结合起来，建立一种小体积的快速DNA错误去除方法，并且以从头合成GFP基因DNA过程中的错误去除为例进行验证。
发明内容
本发明的目的是建立一种低成本、简便、快速的方法去除DNA合成中的错误，降低DNA合成成本，减小反应体积，为将来在自动化设备上应用做准备。
本发明的技术内容：
本发明中将栖热水生菌的错配结合蛋白MutS(TaqMutS)或大肠杆菌的错配结合蛋白MutS(EcoMutS)与纤维素结合域3(CBM3)融合表达；而需要纠错的DNA样本通过变性退火从而将合成错误的碱基展示为错配碱基；再利用融合蛋白中的MutS蛋白特异性识别并结合含有错配碱基对的双链DNA的能力，可以将这些有错误碱基的DNA双链结合到融合蛋白中的MutS上；再通过纤维素包被的磁珠与融合蛋白中的纤维素结合域3结合，从而与结合有错配DNA的MutS融合蛋白结合，在移除磁珠的同时将有错配DNA和MutS融合蛋白同时除去，从而实现去除含有错误的DNA的目标(其原理参见图1)。在本发明的方法中，先进行了含有错配的59bp的双链DNA的测试，意外发现并非所有融合蛋白均有效，其中仅TaqMutS融合蛋白有效，而EcoMutS融合蛋白无效。在此基础上通过合成绿色荧光蛋白的基因(GFP)进行了测试，证明EcoMutS融合蛋白有效，使错误率从3.01个/Kb降到了0.62个/Kb.
本发明涉及以下技术方案：
1、用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。
2、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。
3、根据项目2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。
4、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。
5、根据项目1所述的方法，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
6、根据项目1所述的方法，其中所述纤维素包被的磁珠的制备方法包括：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
7、一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的试剂盒，其包括TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白，和纤维素包被的磁珠。
8、根据项目7所述的试剂盒，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
9、根据项目7所述的试剂盒，其中，所述纤维素包被的磁珠是通过以下制备的：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
具体地，本发明包括以下内容：
1)将TaqMutS和EcoMutS的大肠杆菌重组表达菌株(专利ZL201410023235.2)活化，蛋白表达纯化后进行错配DNA结合能力的测试，确定有结合能力后用于本发明。
2)将FeCl3，乙二醇和微晶纤维素混合后在200℃保温12h制备获得纤维素包被的磁珠，然后用磁铁在离心管外吸附磁珠，用纯水洗涤两次，最后加20％乙醇重悬，保存。
3)将第一项中的TaqMutS或EcoMutS与有错配的DNA结合，并用磁珠拉去MutS和结合的DNA，检测错配DNA去除情况，显示TaqMutS可有效去除错配DNA，而EcoMutS无效。
4)将可用于合成EGFP的20根寡核苷酸进行组装合成GFP基因全长DNA，并在100℃开始，缓慢降温，退火，使有错的DNA之间以及有错和无错的DNA之间形成错配。
5)将第1项中纯化的TaqMutS与第4项中的组装成的GFP基因DNA混合结合有错配的DNA，然后加入纤维素磁珠，通过磁铁吸附磁珠同时拉下MutS及结合的DNA。
6)上清经过PCR扩增，并连接到表达载体pET22b，转化大肠杆菌BL21(DE3)，随机挑选克隆进行测序，对GFP基因DNA序列比对，分析错误率，发现以没有纠错的GFP DNA序列为对照，错误率由3.1个/Kb，降低到0.62个/kb。
在本发明中，所述“错配”是指在DNA合成中出现的碱基的缺失、插入、替换等错误合成。
在本发明中，所述“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”可简称为“TaqMutS融合蛋白”，二者在本文中可互换使用；在本发明中，所述“EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”可简称为“EcoMutS融合蛋白”，二者在本文中可互换使用。
技术效果
首先，商业化的磁珠，虽然不同厂家和不同类型，价格不同，但是售价都很高，本发明利用乙二醇，FeCl3和纤维素制备的磁珠价格低廉(3.12元/g)，而每个纠错反应仅需0.4mg，换算成本约1分人民币；
其次，在现有技术中，将蛋白与磁珠的偶联，通常需要各种理化方法修饰，链接，周期长，步骤繁琐。比如磁珠表面的链霉亲和素修饰，需要将蛋白进行生物素标记；还有磁珠通过表面固定化抗体和其他蛋白，通过蛋白间相互作用来固定目标蛋白；还有些磁珠需要用修饰过琼脂糖进行包埋，有些磁珠需要先制备四氧化三铁磁核，再在四氧化三铁磁核上进行化学修饰，步骤多，而本发明方法简洁。
再次，本发明利用融合蛋白中所包含的纤维素结合域与包被有纤维素的磁珠结合，由于磁珠包被了纤维素，而纤维素结合域融合蛋白能够在常见的缓冲液中和纤维素快速结合(10分钟以内)，避免了其他结合蛋白磁珠的长时间孵育，本发明过程快速简便；
此外，磁珠还需要特异的固定MutS融合蛋白，且不能对DNA有明显的非特异的吸附。现有技术中的磁珠不仅可用于结合蛋白，也可结合核酸，而本发明的磁珠对DNA没有明显非特异性吸附，纠错效果更优(参见图3，完全配对的DNA(58bp)没有明显损失，表明本发明的磁珠对DNA没有明显非特异性吸附)。
最后，纠错过程快捷，使用MutS蛋白少。之前使用的MutS纠错过程中，需要的蛋白量较多，体积较大，不适合将来的自动化高通量错误去除，本发明的方法将纠错反应体积控制到10μl，可以减少材料成本同时便于自动化方面的应用，同时还能在很短的时间内完成纠错。
另外，发明人意外地发现，“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”和“EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”均能结合错配的DNA，但是使用纤维素包被的磁珠仅能去除“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”所结合的错配DNA，而不能去除EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”所结合的错配DNA。即，仅TaqMutS融合蛋白与磁珠结合并有效去除错配DNA，而EcoMutS融合蛋白无效，表明了并非所有错配蛋白均可用于本发明的方法中，而本发明通过一系列的研究，发现了仅TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白可用于本发明的方法中。其可能的原因是，在融合蛋白与磁珠结合时，可能由于磁珠表面的电荷等原因导致了MutS的结构发生改变，影响了MutS结合有错配DNA的能力。而TaqMuts结构稳定，不易改变，保持了结合有错配DNA的能力。
附图说明
图1显示了新型磁珠与错配结合蛋白MutS相结合去除有错DNA的原理。
图2显示了纯化的MutS融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；其中，A为EcoMutS融合蛋白，B为TaqMutS融合蛋白。
图3显示了MutS融合蛋白结合错配DNA的测试。其中，图3A显示了TaqMutS融合蛋白的结果；其中，1.TaqMutS，2. 59和54bp DNA，其中59bp DNA有T/-错配，3.TaqMutS+DNA，4.TaqMuts+DNA+磁珠，M，DNA分子量标准。图3B显示了EcoMutS融合蛋白的结果；其中，1.EcoMutS，2. 59和54bp DNA，其中59bp DNA有T/-错配，3.EcoMutS+DNA，4.EcoMuts+DNA+磁珠，M，DNA分子量标准。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
材料与试剂：
本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。微晶纤维素Avicel PH105购自FMC Co(Philadelphia，PA)；大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)购自擎科，用于表达重组蛋白质；包含1μmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作表达培养基；FeCl3·6H2O，乙二醇，NaAc·3H2O，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
磁珠制作方法：
按现有技术文献(Huang et al.，2009)中所述的方法，将磁珠通过热熔剂的方法进行修改调整后(即将文献中的葡聚糖，壳聚糖和聚丙烯酸换成纤维素)进行合成，具体的步骤是：
1)将0.338g的六水氯化铁(FeCl3·6H2O，1.25mmol)溶于10ml的乙二醇中产生清澈的黄色溶液；
2)然后加入1.36g的醋酸钠(NaAc·3H2O，10mmol)和0.125g的微晶纤维素，将混合物剧烈搅拌30分钟，将混合物密封在压力容器中；
3)加热到200摄氏度，12个小时，室温冷却，用磁铁收集产物，使用50mL水清洗两遍，再用10mL 20％乙醇重悬，获得纤维素包被的词组。
EcoMutS和TaqMutS融合蛋白的制备：
上述两种融合蛋白的制备方法及序列与专利申请ZL 201410023235.2中相同，因此可参考现有技术ZL 201410023235.2制备两种融合蛋白，具体的制备方法可如下所述。
1)分别将包含质粒pEcoMutS-CBM-EGFP和pCBM-EGFP-TaqMutS的大肠杆菌BL21(DE3)细胞接种到含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中(其中，所述质粒pEcoMutS-CBM-EGFP和pCBM-EGFP-TaqMutS的制备方法参见ZL201410023235.2)，37℃，250rpm前培养至OD为0.6～0.8。然后加入终浓度为1μM的IPTG诱导目标蛋白的表达。对于TaqMutS，在37℃诱导表达4小时之后，离心回收(8000×g，10分钟，4℃)细胞用于TaqMutS纯化。对于EcoMutS，在16℃诱导表达16小时之后，离心(8000×g，10分钟，4℃)回收细胞用于纯化。
2)重组蛋白的纯化
将离心回收的细胞，重悬在细胞破碎缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，300mM KCl，5mM咪唑)中，通过超声破碎仪(Sonics Ultra-cell VCX 130)进行细胞破碎，设置为30％强度，破碎时间3分钟，破碎1秒停3s。离心(14000×g，15分钟，4℃)收集上清，获得的上清使用Ni柱(金斯瑞生物科技公司)按照使用说明书进行目的蛋白的纯化；简言之，首先将上清上样到Ni柱上，由于目的蛋白C端含有6×His纯化标签，可以结合到Ni柱上，然后使用清洗缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.6，300mM KCl，40mM咪唑)洗去非特异性结合的蛋白，最后使用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.6)，300mM KCl，250mM咪唑，1mMDTT)，于4℃透析置换缓冲体系。目标蛋白使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)测定蛋白浓度，以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，图2为纯化后的目标蛋白的SDS-PAGE分析结果，从图中可以看出，MutS纯度较高，但有少量降解带。从1L培养的细胞，经过纯化能够获得约30mg(～0.05μmol)且纯度高于90％的目标蛋白。
实施例1EcoMutS和TaqMutS融合蛋白与纤维素磁珠结合去除有错DNA。
1)首先对EcoMutS和TaqMutS融合蛋白的功能进行验证。
将6μl 10×退火缓冲液(100mN Tris-HCl，pH 7.6，500mM NaCl，10mM EDTA)，6μl寡核苷酸1(10μM，SEQ ID NO：1)和6μl寡核苷酸2(10μM，SEQ ID NO：2)混合，在100℃变性，缓慢退火，形成有腺嘌呤缺失错配(-/T)的双链DNA(59bp)。同样的将寡核苷酸3(SEQ IDNO：3)和寡核苷酸4(SEQ ID NO：4)进行退火，形成无错配的双链DNA(54bp)。然后取上述退火的双链DNA各0.5μl，5μM的MutS融合蛋白(TaqMutS或EcoMutS融合蛋白)4.5μl，10×结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.6，100mM KCl，5mM MgCl2)1μl，加入3.5μl水，混合后室温放置10分钟，通过5％的PAGE自然胶进行电泳。结果如图3所示，TaqMutS和EcoMutS融合蛋白都能结合错配DNA，说明两种蛋白都有功能(图3A和B中第3道)。
2)通过磁珠去除结合错配DNA的MutS及所结合的错配DNA。
在1)中获得的结合了错配DNA的MutS溶液中加入0.4mg纤维素包被的磁珠，混合后，用磁铁吸住磁珠，取上清，按1)中所述进行电泳，发现使用TaqMutS融合蛋白的上清中错配DNA大幅度减少(图3A第4道)，而EcoMutS融合蛋白则无效(图3B第4道)。
实施例2将纤维素包被的磁珠和TaqMutS融合蛋白结合用于以GFP基因为例的基因合成中，证明本发明的方法有效。
1.GFP基因DNA的组装
合成的GFP基因的DNA序列见SEQ ID NO：5，通过软件DNAworks将GFP的DNA序列拆分成20条寡核苷酸(SEQ ID NO：6--SEQ ID NO：25)，通过PCA方法进行GFP基因DNA的组装(Stemmer et al.，1995)。本发明使用的寡核苷酸为从上海生工获得的脱盐处理的寡核苷酸，PCA方法可参考Stemmer et al.，1995，其具体步骤如下：
第一步 重叠PCR
50μl反应体系的组分如下：
| 寡核苷酸P1(SEQ ID NO：6)(10μM) | 0.5ul |
| 寡核苷酸P20(SEQ ID NO：25)(10μM) | 0.5ul |
| 寡核苷酸P2-P19(10μM)(SEQ ID NO：7-24) | 各0.15μl |
| dNTP(2.5mM) | 5ul |
| 25mM MgSO4 | 4μl |
| KOD缓冲液 | 5ul |
| KOD plus DNA聚合酶 | 1μl |
| H<sub>2</sub>O | 31.3μl |
| 总计 | 50ul |
PCR反应条件：
第二步PCR的反应体系如下：
PCR反应条件：
2.有错DNA的错误去除
将上述获得的GFP基因组装第二步的产物，通过琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒(Promega，美国)进行切胶回收，然后取一定量进行加热变性再复性后使用磁珠法去除错误DNA。具体步骤如下：
(1)变性退火：
在1.5mL离心管中加入1μL变性缓冲液(10x变性退火缓冲液：10mM Tris-Cl(pH7.6)，50mM NaCl，1mM EDTA)，再加入终浓度为0.1μ mol的DNA(GFP)，再加水至总体积10μL。95℃水浴5分钟，缓慢降温到室温。
(2)错误DNA去除：
取1μl上述(1)获得的溶液加入1.5mL离心管中，并加入终浓度为5μM MutS(EcoMutS或TaqMutS融合蛋白)混合均匀，常温10分钟后加入终浓度0.4mg纤维素包被的磁珠(体积依据磁珠浓度调整)，混合后，用磁铁吸附磁珠，取上清作为去除的错误DNA。
3.合成的GFP基因序列的测定分析。
将用磁珠分离的去除的错误DNA进行测定分析，具体步骤如下(1)-(3)所示：
(1)载体的构建。
将pET22b(Novagen)(包含Nde I和Xhol I位点)和GFP基因同源重组，从而将错配的DNA进行PCR扩增之后，连接到载体pET22b中。
具体如下：
pET22b载体制备的反应体系如下：
37℃，酶切12h后，使用PCR clean试剂盒(Promega)回收酶切的pET22b载体。
然后将回收的pET22b载体与GFP基因(SEQ ID NO：5)通过重组酶CloneExpressIIone step cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接，反应体系如下：
37℃保温30分钟，获得pET22b与GFP的连接产物。
(2)载体大肠杆菌的转化。
将上述连接产物与大肠杆菌BL21(DE3)感受态(擎科，中国)混合，按说明书转化，涂布到含有10μM氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。
(3)在平板上随机挑取菌落，进行序列测定(上海生工)。将测序结果，与要合成的GFP基因的理论序列进行对比，并分析进行纠错或未纠错的GFP DNA中的错误率。错误率对比见表1，可见通过本发明的方法，错误率由3.01/Kb，下降到了0.62/Kb。
表1纠错与不纠错的合成的GFP基因DNA中错误率比较
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献：
Carr，P.A.，Park，J.S.，Lee，Y.J.，Yu，T.，Zhang，S.G.，Jacobson，J.M.2004.Protein-mediated error correction for de novo DNA synthesis.NucleicAcids Research，32(20)，e162.
Geschwind，D.H.，Rhee，R.，Nelson，S.F.1996.A biotinylated MutS fusionprotein and its use in a rapid mutation screening technique.Genetic Analysis-Biomolecular Engineering，13(4)，105-111.
Huang，X.L.，Zhuang，J.，Chen，D.，Liu，H.Y.，Tang，F.Q.，Yan，X.Y.，Meng，X.W.，Zhang，L.，Ren，J.2009.General Strategy for Designing Functionalized MagneticMicrospheres for Different Bioapplications.Langmuir，25(19)，11657-11663.
Lubock，N.B.，Zhang，D.，Sidore，A.M.，Church，G.M.，Kosuri，S.2017.Asystematic comparison of error correction enzymes by next-generationsequencing.Nucleic Acids Research，45(15)，9206-9217.
Stemmer，W.P.C.，Crameri，A.，Ha，K.D.，Brennan，T.M.，Heyneker，H.L.1995.Single-Step Assembly of a Gene and Entire Plasmid from Large Numbersof Oligodeoxyribonucleotides.Gene，164(1)，49-53.
Wan，W.，Li，L.，Xu，Q.，Wang，Z.，Yao，Y.，Wang，R.，Zhang，J.，Liu，H.，Gao，X.，Hong，J.2014.Error removal in microchip-synthesized DNA using immobilizedMutS.Nucleic Acids Res，42(12)，e102.
Wan，W.，Lu，M.，Wang，D.，Gao，X.，Hong，J.2017.High-fidelity de novosynthesis of pathways using microchip-synthesized oligonucleotides andgeneral molecular biology equipment.Sci Rep，7(1)，6119.
王冬梅，宛雯，洪洞.2012.DNA化学合成中的错误去除.生命的化学，32(1)，34-38.
序列表
Seq ID No.1
Seq ID No.2
Seq ID No.3
Seq ID No.4
Seq ID No.5
Seq ID No.6 P1
Seq ID No.7 P2
Seq ID No.8 P3
Seq ID No.9 P4
Seq ID No.10 P5
Seq ID No.11 P6
Seq ID No.12 P7
Seq ID No.13 P8
Seq ID No.14 P9
Seq ID No.15 P10
Seq ID No.16 P11
Seq ID No.17 P12
Seq ID No.18 P13
Seq ID No.19 P14
Seq ID No.20 P15
Seq ID No.21 P16
Seq ID No.22 P17
Seq ID No.23 P18
Seq ID No.24 P19
Seq ID No.25 P20
重组引物
Seq ID No.26，egfp-recomb-NdeII-F
Seq ID No.27，egfp-recomb-XholI-R
Seq ID No.28，TaqMutS融合蛋白
Claims (9)
1.用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素包被的磁珠的制备方法包括：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
7.一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的试剂盒，其包括TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白，和纤维素包被的磁珠。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述纤维素包被的磁珠是通过以下制备的：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115298.5A CN114457067A (zh) | 2022-02-10 | 2022-02-10 | 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115298.5A CN114457067A (zh) | 2022-02-10 | 2022-02-10 | 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114457067A true CN114457067A (zh) | 2022-05-10 |
Family
ID=81411917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210115298.5A Pending CN114457067A (zh) | 2022-02-10 | 2022-02-10 | 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114457067A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825431A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-05-31 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 寡核苷酸原位组装仪 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995012689A1 (en) * | 1993-11-04 | 1995-05-11 | Gene Check, Inc. | Immobilized mismatch binding protein for detection or purification of mutations or polymorphisms |
| US6120992A (en) * | 1993-11-04 | 2000-09-19 | Valigene Corporation | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human |
| CN1556815A (zh) * | 2000-08-04 | 2004-12-22 | �����ִ��ѧҽѧ���� | 用作神经变性疾病诊断的铁调节蛋白-2 |
| CN1798761A (zh) * | 2003-05-30 | 2006-07-05 | 英特塞尔股份公司 | 肠球菌抗原 |
| CN1898385A (zh) * | 2003-12-19 | 2007-01-17 | 莫道什大学 | 多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白及其诊断和治疗用途 |
| CN102725410A (zh) * | 2009-06-29 | 2012-10-10 | 西澳大学 | 来自檀香属的萜烯合酶 |
| US20130109596A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-05-02 | Life Technologies Corporation | High efficiency, small volume nucleic acid synthesis |
| CN103755815A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 中国科学技术大学 | 一种新型错配结合蛋白与纤维素结合域3的融合蛋白及其高通量去除dna合成中错误的方法 |
-
2022
- 2022-02-10 CN CN202210115298.5A patent/CN114457067A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995012689A1 (en) * | 1993-11-04 | 1995-05-11 | Gene Check, Inc. | Immobilized mismatch binding protein for detection or purification of mutations or polymorphisms |
| US6120992A (en) * | 1993-11-04 | 2000-09-19 | Valigene Corporation | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human |
| CN1556815A (zh) * | 2000-08-04 | 2004-12-22 | �����ִ��ѧҽѧ���� | 用作神经变性疾病诊断的铁调节蛋白-2 |
| CN1798761A (zh) * | 2003-05-30 | 2006-07-05 | 英特塞尔股份公司 | 肠球菌抗原 |
| CN1898385A (zh) * | 2003-12-19 | 2007-01-17 | 莫道什大学 | 多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白及其诊断和治疗用途 |
| CN102725410A (zh) * | 2009-06-29 | 2012-10-10 | 西澳大学 | 来自檀香属的萜烯合酶 |
| US20130109596A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-05-02 | Life Technologies Corporation | High efficiency, small volume nucleic acid synthesis |
| CN103755815A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 中国科学技术大学 | 一种新型错配结合蛋白与纤维素结合域3的融合蛋白及其高通量去除dna合成中错误的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DANIEL H. GESCHWIND ET AL: "A biotinylated MutS fusion protein and its use in a rapid mutation screening technique", 《GENETIC ANALYSIS: BIOMOLECULAR ENGINEERING》, vol. 13, pages 105 - 111, XP002200124, DOI: 10.1016/S1050-3862(95)00160-3 * |
| XINGLU HUANG ET AL: "General Strategy for Designing Functionalized Magnetic Microspheres for Different Bioapplications", 《LANGMUIR》, vol. 25, no. 19, pages 11658 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825431A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-05-31 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 寡核苷酸原位组装仪 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohana et al. | HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells | |
| CN109679932B (zh) | 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用 | |
| CN109937252B (zh) | 重组dna聚合酶 | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| CN113136374B (zh) | 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用 | |
| CN113583996B (zh) | Bst DNA聚合酶重组突变体、其编码DNA及超快磁珠LAMP检测方法 | |
| CN112063643B (zh) | 一种用于检测细菌中膜蛋白相互作用的表达载体及方法 | |
| WO2022227880A1 (zh) | 一种新型磷酸化腺苷酰化酶及其制备方法与应用 | |
| US20220307009A1 (en) | Isolated nucleic acid binding domains | |
| CN114457067A (zh) | 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 | |
| CN114262697B (zh) | 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 | |
| CN108913700B (zh) | gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用 | |
| WO2020124319A1 (zh) | 融合蛋白及其应用 | |
| CN115725675A (zh) | 一种长片段基因的生物合成方法及应用 | |
| CN115896063A (zh) | 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 | |
| CN113717256B (zh) | 一种融合蛋白及其应用 | |
| CN111019922B (zh) | 一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用 | |
| CN111334511B (zh) | 一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白的核酸适配体及其应用 | |
| CN114106196A (zh) | 抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN106318922A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶的制备方法 | |
| CN111676217B (zh) | 一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系 | |
| WO2009130031A9 (en) | Artificial protein scaffolds | |
| CN115896047B (zh) | 重组t4 dna连接酶突变体、融合蛋白及其应用 | |
| CN115820625A (zh) | 去除错配dna的方法、装置及装置的制备方法和试剂盒 | |
| CN111019925B (zh) | 筛选蛋白酶变体的方法以及获得的蛋白酶变体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |