CN111676217B - 一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系 - Google Patents
一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明首先提供了一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，包括使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液后，使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物。本发明同时提供了一种用于提高核酸得率并兼容后续反应的体系，包括适用于上述提高核酸得率并兼容后续反应的方法的固相载体和洗脱溶液。本发明提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系，既能够保持核酸分子在体系中的活性提到纯化得率，又能无缝兼容后续连接反应，在针对短链核酸或单链核酸的纯化与连接应用方向上，具有显著的经济意义和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系。
背景技术
亲和素Avidin或链霉亲和素Streptavidin与生物素Biotin的结合被认为是已知最强的非共价生物相互作用之一，亲和素和链霉亲和素通过其结构中的色氨酸残基与生物素非共价结合，该结合形成非常迅速，并且在广范围的pH、温度和其它变性条件下相当稳定，亲和常数高达1015mol/L，故biotin-avidin/streptavidin在分子生物学中有着广泛和多样的应用。比如将亲和素或链霉亲和素直接或间接预包被在酶标板上，稳定性高，易于保存。又如现今更广泛应用的链霉亲和素包被磁珠，由磁微粒与高纯度链霉亲和素共价结合而成，可用于捕获生物素标记的底物，包括生物素标记的抗原、抗体和核酸。生物素-链霉亲和素的相互作用强，非特异性结合率低，提供了良好的产率并且易于自动化。
然而，由于亲和素或链霉亲和素与生物素的结合能力太强，又非常稳定，所以结合后的再分离比较困难，现有的分离方式为多为用有机溶剂洗脱，比如常见的Tris-HCl和EDTA的组合。然而，有机溶剂往往会使得目标分子比如核酸的活性基团变性，不利于标记分子的后续应用。
Holmberg等在US2004077024A1中提出，与先前的发现相反，使用无离子的纯水在受控温度条件比如70℃以上条件下孵育生物素-亲和素/链霉亲和素结合的化合物，可以实现生物素-亲和素/链霉亲和素非共价键的可逆破坏。但是，当生物素-亲和素/链霉亲和素标记的目标分子是核酸尤其是短链核酸或单链核酸时，其在纯水中稳定性差，容易降解。当纯化的后续反应是单链连接反应时，纯水洗脱的DNA在连接过程中稳定性极差，损失率高达90％以上，使得下游的连接反应效率极低。再者，纯化体系使用纯水会显著增加后续连接反应体系的体积。故而开发一种能够保持核酸分子活性，又能高效洗脱生物素-亲和素/链霉亲和素且兼容后续反应的洗脱方式和体系具有很高的应用价值。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，包括：
(1)使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液；
(2)使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物。
本发明另一方面提供一种用于提高核酸得率并兼容后续反应的体系，包括适用于所述的提高核酸得率并兼容后续反应的方法的固相载体和洗脱溶液。
一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，其包括以下步骤：
步骤1)使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液；
步骤2)使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物。
所述标记分子是生物素，所述配体分子是蛋白分子；
和/或，所述结合位点是两个以上；
优选的，所述结合位点是四个。
所述蛋白分子是糖蛋白分子或不含糖基的蛋白分子；
优选的，所述蛋白分子是亲和素或链霉亲和素。
所述固相载体是磁性微球；
和/或，所述两亲性聚合物是两亲性聚醚；
优选的，所述两亲性聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醚或吐温20(Tween20)；
和/或，所述洗脱溶液不含离子。
所述核酸是片段化的双链DNA、单链DNA或RNA；
和/或，所述核酸的长度在25～200bp。
所述步骤2)还包括对加入所述洗脱溶液的固相载体进行振荡重悬；
优选的，所述振荡重悬是多次振荡重悬；
和/或，所述振荡重悬在常温下，所述洗脱在高温下进行；
优选的，所述洗脱在70℃以上进行。
所述两亲性聚合物的分子量在4000～12000；
优选的，所述两亲性聚合物的分子量在6000～8000之间；
和/或，所述两亲性聚合物在所述洗脱溶液中的质量百分比为1～50％；
优选的，所述两亲性聚合物在所述洗脱溶液中的质量百分比为20～30％。
一种提高核酸得率并兼容后续反应的纯化体系，
包括适用于如权利要求1-7中任一权利要求所述的提高核酸得率并兼容后续反应的方法的固相载体和洗脱溶液。
一种核酸纯化及连接体系，其包括所述的纯化体系，
所述连接体系还包括连接酶，所述连接酶用于核酸纯化产物的后续连接反应；
优选的，所述连接酶是单链连接酶；
更优选的，所述连接酶是T4 RNA连接酶、热稳定性RNA连接酶或环化连接酶；
和/或，所述连接体系也不含离子；
所述连接体系也包含所述纯化体系的洗脱溶液中包含的两亲性聚合物；
优选的，所述连接体系中的两亲性聚合物。
还包括接头寡核苷酸；
优选的，所述接头寡核苷酸是接头DNA；
更优选的，所述接头DNA是单链或双链DNA；
更优选的，所述双链DNA具有黏性末端或在连接反应温度下为单链；
和/或，所述接头DNA还包含测序通用序列或PCR引物序列；
和/或，所述接头DNA的5′末端核苷酸被修饰；
优选的，所述修饰是磷酸化或腺苷酸化修饰。
本发明的有益效果是：
本发明首先提供了一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，包括使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液后，使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物。本发明同时提供了一种用于提高核酸得率并兼容后续反应的体系，包括适用于上述提高核酸得率并兼容后续反应的方法的固相载体和洗脱溶液。本发明提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系，既能够保持核酸分子在体系中的活性提到纯化得率，又能无缝兼容后续连接反应，在针对短链核酸或单链核酸的纯化与连接应用方向上，具有显著的经济意义和实用价值。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索性研究，提供了一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，所述方法操作简单、结果可靠、效果明显，尤其对于后续连接反应具有良好的兼容效应，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，包括：
(1)使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液；
(2)使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物。
本发明所提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法中，所述的标记分子可以包括生物素，所述配体分子可以是蛋白分子，比如可以是以亲和素为代表的糖蛋白分子，或者可以是以链霉亲和素为代表的不含糖基的蛋白分子。所述标记分子和配体分子的结合位点可以是两个以上，比如可以是四个。亲和素主要包括卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素及类亲和素等。后两种因其特异性亲和力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。亲和素又称卵白素或抗生物素，分子量为68kDa，等电点在10～10.5，在pH9～13缓冲液中性质均稳定，偏碱性，耐热并耐多种蛋白水解酶的作用。天然亲和素为碱性蛋白，由四个相同的亚单位构成四聚体，每个亲和素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环(I环)结合。因此，一个亲和素分子存在四个与生物素分子结合位点，其结合常数(Ka)达到1015mol/L。通常，亲和素的活性单位是以亲和素结合生物素的量来表示的，即以能结合1ug生物素所需要的亲和素量为1个亲和素活性单位。一般1ug亲和素约含13～15个活性单位。链霉亲和素(streptavidin，SA)是从链霉菌streptomycesavidinii培养物中提取的一种分泌性蛋白质，分子量为65kDa，等电点在6.0附近，pH6.0，偏酸性。链霉亲和素分子是由四条相同的肽链组成的四聚体蛋白，不含糖基，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基。链霉亲和素的生物素结合位点较亲和素深，位阻效应强，特异性更高。现在应用中更广泛使用在固相载体上的用于结合生物素的为链霉亲和素。
本发明所提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法中，所述固相载体是磁性微球，比如可以是现在广泛应用的纳米磁珠。所述洗脱溶液中的两亲性聚合物可以是两亲性聚醚，常见的比如可以是是聚乙二醇、聚乙烯醚或吐温20(Tween 20)，这类组分在高温条件下，比如70℃以上时，比纯水更能保持核酸分子，比如可以是片段化的双链DNA、单链DNA或RNA，尤其是较短的，比如长度在25～200bp之间的核酸分子结构的稳定性。优选的洗脱条件下，所述洗脱溶液不含离子。
本发明所提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法中，所述用洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物的步骤中，还包括对加入所述洗脱溶液的固相载体进行振荡重悬，所述振荡重悬可以是多次，在常温下进行。振荡重悬后的洗脱在高温条件下，比如可以是70℃以上的高温条件下进行。
本发明所提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法中，所述洗脱溶液中的两亲性聚合物的分子量可以在4000～12000之间，优选6000～8000之间；所述两亲性聚合物在所述洗脱溶液中的质量百分比为可以是1～50％；优选的，可以在20～30％之间，最优选的可以是25％。
本发明第二方面提供一种提高核酸得率并兼容后续反应的纯化体系，包括适用于本发明第一方面的提高核酸得率并兼容后续反应的方法的的固相载体和洗脱溶液。所述固相载体和洗脱溶液的主要成分在本发明第一方面已经详细描述，在此不作赘述。
本发明再一方面提供一种核酸纯化及连接体系，本发明第二方面提供的提高核酸得率并兼容后续反应的纯化体系，还包括之后的连接体系，比如可以包括连接酶，用于纯化反应得到的核酸纯化产物的后续连接反应。所述连接酶可以是单链连接酶；在本发明优选的实施例中，所述连接酶可以是T4 RNA连接酶、热稳定性RNA连接酶或环化连接酶。
本发明提供的核酸纯化及连接体系中，所述连接体系也不含离子。在一个优选的实施例中，本发明提供的作为纯化反应的后续反应体系的连接体系中，也包含所述纯化体系的洗脱溶液中包含的两亲性聚合物。
本发明提供的核酸纯化及连接体系中，还包括接头寡核苷酸。所述接头寡核苷酸可以是接头DNA具体的可以是单链或双链DNA。在一个优选的实施例中，所述的接头寡核苷酸是具有黏性末端的双链DNA，连接反应温度下为单链。在优选的实施例中，所述接头DNA还包含测序通用序列或PCR引物序列。在优选的实施例中，所述接头DNA的5′末端核苷酸被修饰，所述修饰比如可以是磷酸化或腺苷酸化修饰。
本发明的有益效果在于，一方面，本发明提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法可以解决目标产物为短链核酸或单链核酸时，其在高温下的纯水中稳定性差，容易降解的问题，使用本发明的纯化方法可以使短链核酸或单链核酸在洗脱溶液和纯化产物中保持结构稳定，显著提高得率；另一方面，当纯化的后续反应是连接反应时，纯化体系使用纯水会显著增加后续连接反应体系的体积，而使用连接体系本就会用到的含有两亲性聚合物的洗脱溶液能显著兼容后续的连接体系控制其体积，节约成本并增加操作便利性。最后，两亲性聚合物诸如聚乙二醇等，是常见的且成本受控的实验材料，故本发明提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系并不会明显增加成本。综上，本发明提供的提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系，既能够保持核酸分子在体系中的活性提到纯化得率，又能无缝兼容后续连接反应，在核酸纯化与连接的应用方向上，特别是针对短链核酸或单链核酸，具有显著的经济意义和实用价值。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式″一个″、″一″和″这个″包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
实验目的：
测试ddH2O和不同质量百分比(10％，20％，30％或50％)PEG水溶液在高温(70℃-100℃)下洗脱纯化Biotin标记的寡聚核苷酸分子的效果，研究用10％，20％，30％或50％PEG代替ddH2O洗脱磁珠的可行性。
实验材料：
Biotin标记的寡聚核苷酸单链分子BSLi由上海百力格生物科技合成，序列见表1；
检测引物FSL1由上海百力格生物科技合成，序列见表1；
检测引物RSL1由上海百力格生物科技合成，序列见表1；
探针MGB-SL1由上海百力格生物科技合成，序列见表1；
Realtime PCR Master Mix试剂购自TOYOBO；
DynabeadsMyOne Streptavidin C1磁珠购自Invitrogen；
BW1缓冲液：10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，2M NaCl；
BW2缓冲液：5mMTris-HCl(pH 8.0)，0.5mM EDTA，1M NaCl；
TE溶液：10mM Tris-HCl+1mM EDTA；
校准品：按照分子克隆常规方法自行构建含有BSL1全长序列的质粒；酶切处理成线性分子后，稀释成不同拷贝数浓度的梯度溶液。
实验设备：
常规PCR仪(Applied Biosystems)，定量PCR仪(Applied Biosystems7300PLUS)，高速离心机，磁力架，旋涡仪。
本实施例所用寡核苷酸序列如表1所示：
表1
＊注：BSL1探针5′端标记biotin；
A1接头5′端以磷酸基团，3′端以C3 spacer基团修饰。
实验方法：
1.磁珠纯化
Biotin标记的寡聚核苷酸DNA单链分子BSL1使用TE缓冲液溶解，使用紫外分光光度计定量后，配制成4000拷贝/ul的样本溶液备用。
每个样本约取15uL磁珠以1mLBW2缓冲液重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；加入1mLBW2缓冲液重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；40ulBW1缓冲液重悬磁珠，加入等体积BSLi样本(40uL)，每种洗脱条件两个重复样本，旋涡仪混匀；在200uL离心管中室温孵育15min后，旋涡仪5min重悬一次；
加入100uLBW2缓冲液，旋涡仪重悬，转入新的200uL离心管置于磁力架，静置2min，弃上清；加入150uLBW2缓冲液，旋涡仪重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；重复洗涤5次，其中第3次需要更换离心管。
加入40uLddH2O/10％/20％PEG/30％PEG/50％PEG水溶液，旋涡仪充分振荡重悬磁珠；置于PCR仪洗脱产物，PCR程序：80℃孵育4min，25℃孵育30s(热盖90℃)；
置于96孔磁力架，静置2min，将上清转移至新的EP管中，4℃保存。
将保存洗脱样本4℃放置24小时后，用TE溶液10倍稀释后检测。评估洗脱后的单链DNA在不同洗脱溶液中的稳定性。
2.PCR检测纯化产物
PCR检测体系如表2所示。
表2
| 组分 | 体积(μL) |
| Realtime PCR Master Mix | 10 |
| FSL1(10uM) | 0.6 |
| RSL1(10uM) | 0.6 |
| MGBSL1(10uM) | 0.2 |
| H<sub>2</sub>O | 6.6 |
| 稀释样本/校准品 | 2 |
| Total | 20 |
PCR检测程序如表3所示。
表3
实验结果：
校准品检测结果如表4所示。
表4
| 拷贝数 | CT1 | CT2 | |
| 校准品S5 | 200000 | 19.78 | 19.77 |
| 校准品S4 | 20000 | 22.74 | 22.66 |
| 校准品S3 | 2000 | 26.5 | 26.43 |
| 校准品S2 | 200 | 29.82 | 29.48 |
| 校准品S1 | 20 | 32.61 | 32.88 |
不同洗脱溶液洗脱纯化产物的结果数据如表5所示。
表5
洗脱样本的稳定性检测结果如表6所示
表6
| 拷贝数 | CT1 | CT2 | |
| 校准品S5 | 200000 | 19.24 | 19.34 |
| 校准品S4 | 20000 | 22.80 | 22.69 |
| 校准品S3 | 2000 | 26.10 | 25.93 |
| 校准品S2 | 200 | 29.41 | 29.42 |
| 校准品S1 | 20 | 32.70 | 32.92 |
洗脱样本的24h稳定性检测结果如表7所示
表7
结论：
磁珠纯化这一步骤，洗脱溶液选用50％PEG的情况下，磁珠和50％PEG难以混匀，且混匀后放置在磁力架上长时间不吸附(超过8分钟)，故放弃在洗脱溶液中使用50％PEG；其结果回收率低，同时检测误差也显著增大。
洗脱溶液选用10％，20％或30％PEG的情况下，磁珠可以用涡旋仪或枪头吹打法混匀，混匀后放置在磁力架上5分钟可以吸附。原液稀释10倍后检测发现，10％，20％和30％PEG跟对照组ddH2O洗脱产物的得率没有显著区别。
在放置24h后，PEG溶液中的洗脱产物相比纯水中的有更好的稳定效果。产物几乎没有降解，而纯水洗脱的产物降解了50％以上。
实施例2
实验目的：
测试质量百分比为25％的不同分子量(4000，6000，8000或10000)的PEG水溶液在高温(70℃-100℃)下洗脱纯化Biotin标记的寡聚核苷酸分子的效果，以及对后续单链连接反应和检测的影响，研究不同分子量的PEG水溶液用于磁珠洗脱溶液的可行性。
实验材料、设备和所用寡核苷酸序列同实施例1.用于单链连接的热稳定性连接酶购自美国Lucigen的CircLigase II。连接所用接头A1序列如表1中所示。
实验方法：
1.磁珠纯化
Biotin标记的寡聚核苷酸DNA单链分子BSL1使用TE缓冲液溶解，使用紫外分光光度计定量后，配制成4000拷贝/ul的样本溶液备用。
每个样本约取15uL磁珠以1mLBW2缓冲液重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；加入1mLBW2缓冲液重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；40ul BW1缓冲液重悬磁珠，加入等体积BSLi样本(40uL)，每种洗脱条件两个重复样本，旋涡仪混匀；在200uL离心管中室温孵育15min后，旋涡仪5min重悬一次；
加入100uLBW2缓冲液，旋涡仪重悬，转入新的200uL离心管置于磁力架，静置2min，弃上清；加入150uL BW2缓冲液，旋涡仪重悬，置于磁力架，静置2min，弃上清；重复洗涤5次，其中第3次需要更换离心管。
加入20uL分子量分别为4000/6000/8000/10000的质量百分比为25％的PEG水溶液，旋涡仪充分振荡重悬磁珠；置于PCR仪洗脱产物，PCR程序：80℃孵育4min，25℃孵育30s(热盖90℃)；
置于96孔磁力架，静置2min，将上清转移至新的EP管中，4℃保存。洗脱产物用TE溶液10倍稀释后检测。
2.连接纯化产物
连接反应体系如表8所示。配制后将反应体系置于60℃，1小时，90℃，10min。
表8
3.洗脱产物与连接产物的PCR检测。
洗脱产物与连接产物都用TE缓冲液稀释10倍后检测。
PCR检测体系如表9所示。
表9
PCR检测程序如表10所示。
表10
实验结果：
校准品检测结果如表11所示。
表11
| 拷贝数 | CT1 | CT2 | |
| 校准品S5 | 200000 | 19.77 | 19.86 |
| 校准品S4 | 20000 | 22.94 | 23.06 |
| 校准品S3 | 2000 | 26.30 | 26.47 |
| 校准品S2 | 200 | 29.71 | 29.85 |
| 校准品S1 | 20 | 32.98 | 32.85 |
不同洗脱溶液洗脱产物的数据如表12所示。
表12
不同洗脱溶液连接产物的数据如表13所示。
表13
结论：
分子量为4000的PEG溶液洗脱得率最低，分子量为6000/8000/10000的PEG的洗脱效率类似；分子量为10000的PEG溶液对后续连接效率有影响，造成检出值低。综合实验数据来看，质量百分比为25％且分子量为8000PEG溶液纯化效率最好且在后续连接反应中效率最优，是作为磁珠纯化步骤洗脱溶液的最好选择。
序列表
<110> 南京君华基因科技有限公司
上海羿鸣生物科技有限公司
<120> 一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法和体系
<130> APG001
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactggtgaa aacaccgcat cgtgtcaaga tcacagattt tgggcttaaa ctgctgggtg 60
cggaa 65
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tactggtgaa aacaccgca 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttccgcaccc agcagttt 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcaagatc acagattttg ggc 23
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatcgttctc cttactgagt cggagacacg cagggatgag atggcacaac agc 53
Claims (8)
1.一种提高核酸得率并兼容后续反应的方法，其包括以下步骤：
步骤1)使用附着有标记分子结合位点的配体分子的固相载体吸附结合有所述标记分子的核酸形成混合溶液；所述配体分子是亲和素或链霉亲和素；所述标记分子是生物素；
步骤2)使用含有两亲性聚合物的洗脱溶液洗脱所述固相载体得到纯化产物；所述含有两亲性聚合物的洗脱溶液为分子量为6000-8000的10％-30％PEG水溶液；所述洗脱的温度为70-100℃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合位点是两个以上。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体是磁性微球；
和/或，所述洗脱溶液不含离子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述核酸是片段化的双链DNA、单链DNA或RNA；
和/或，所述核酸的长度在25～200bp。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述步骤2)还包括对加入所述洗脱溶液的固相载体进行振荡重悬；
和/或，所述振荡重悬在常温下进行。
6.一种提高核酸得率并兼容后续反应的纯化体系，其特征在于，
包括适用于如权利要求1-5中任一权利要求所述的提高核酸得率并兼容后续反应的方法的固相载体和洗脱溶液。
7.一种核酸纯化及连接体系，其包括权利要求6所述的纯化体系，其特征在于，
所述连接体系还包括连接酶，所述连接酶用于核酸纯化产物的后续连接反应；
和/或，所述连接体系也不含离子；
所述连接体系也包含所述纯化体系的洗脱溶液中包含的两亲性聚合物。
8.如权利要求7所述的核酸纯化及连接体系，其特征在于，
还包括接头寡核苷酸；
和/或，所述接头DNA还包含测序通用序列或PCR引物序列；
和/或，所述接头DNA的5′末端核苷酸被修饰。
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