CN109055382A - 可特异性结合6x组氨酸标签的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体及其应用，涉及核酸适配体。可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体，命名为AptHis‑C。6X组氨酸标签的核酸适配体AptHis‑C的衍生物，与核酸适配体AptHis‑C具有同源核心序列，相同功能用途的核酸适配体AptHis‑1、AptHis‑2、AptHis‑3。可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体对核酸适配体进行切短，延长，部分碱基替换，转录为RNA，偶联蛋白、药物或报告基团等，得与核酸适配体AptHis‑C有相同功能的核酸适体衍生物。6X组氨酸标签的核酸适配体的5’端带有生物素，利用重复使用的链霉亲和素磁珠，通过磁性分离方式纯化6X组氨酸融合蛋白。

Description

可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及核酸适配体，尤其是涉及可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体及其应用。
背景技术
重组蛋白或多肽在生物医药和科研领域中占有重要的地位。多种纯化技术被用于从原核或真核表达系统中富集获取高纯度的重组目的蛋白。为提高效率与纯度，亲和层析技术在重组蛋白的制备和鉴定过程中会引入特异性亲和标签，如组氨酸(His)标签、GST和Fc等，其中以6个组氨酸组成的标签(6xHis)最为常用。6X组氨酸标签结合在重组蛋白的C末端或N末端，可与多种金属离子发生特异亲和作用，其中以镍离子使用最为广泛。固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)利用镍离子树脂选择性的吸附6X组氨酸标签融合蛋白，通过改变缓冲液的浓度，洗脱分离得到目的蛋白。与其他亲和标签相比，6X组氨酸标签具有以下优势：1)与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白的表达；2)组氨酸标签非常小，常用的6X组氨酸标签仅有2.5kDa，不影响目的蛋白的生物学活性和可溶性；3)免疫原性低，其融合蛋白可直接作为抗原使用；4)可与其它亲和标签构建成双亲和标签，并应用于多种表达系统；5)其融合蛋白的适用范围广，可在变性剂或去污剂存在的条件下进行纯化。此外，抗6X组氨酸标签的抗体也被用于替代昂贵的蛋白特异性抗体或探针，用于鉴定和检测重组蛋白，或研究蛋白质相互作用的体外实验中(1.Porath J,Carlsson J,Olsson I et al.Metal chelate affinity chromatography,anew approach to protein fractionation.Nature1975,258(5536):598-9；2.ChagaGS.Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography:past,present and future.J BiochemBiophys Methods 2001,49(1-3):313-34；)。
高效的蛋白纯化与简便的鉴定方法对重组蛋白的研究与应用有重要意义。然而6X组氨酸标签的亲和纯化过程复杂耗时、成本高，包括一系列基于蛋白质沉淀、过柱、连续洗脱、深层过滤、超滤或浓缩的步骤。其中，菌液裂解方法、树脂种类与密度、缓冲液条件需根据蛋白的特性反复试验选择，以达到最佳纯化效果。当菌体裂解液中不可避免地含有一定浓度的螯合剂和还原剂时，金属离子易从柱上脱落，影响目的蛋白质量。而一些易被氧化的蛋白如激酶，在连接6X组氨酸标签后，易在亲和层析的过程中形成沉淀，不易浓缩。其次，当杂蛋白中带有组氨酸，色氨酸，半胱氨酸时，蛋白折叠会导致多个这样的氨基酸临近，增加对离子树脂的非特异性亲和，降低目的蛋白的纯度。另一方面，检测组氨酸标签的蛋白抗体制备昂贵，检测耗时，在一定程度上限制了对组氨酸融合蛋白的检测(3.AudurMagnusdottir,Ida Johansson,Dahlgren et al.Enabling IMaCpurification of low abundance recombinant proteins from E.coli lysates.NatureMethods 2009,6(7):477-478；4.Loughran S T,Walls D.Purification of Poly-Histidine-Tagged Proteins.Protein Chromatography 2017:311-335)。
核酸适配体(Aptamer)是利用体外筛选技术—基于指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从核酸分子文库中筛选得到的一段以较高特异性结合靶物质DNA或RNA寡核苷酸序列。核酸适配体在亲和力和特异性方面可媲美抗体，并具有一些抗体没有具备的优势：由于其小分子核酸的理化性质，核酸适配体免疫原性低，可快速的组织穿透和细胞内化能力、具有较高的热/化学稳定性；并且核酸适配体的筛选周期短，易于化学修饰或偶联不同的基团，合成技术简单，重复性强。因此核酸适配体在基础研究与临床应用中具有重要的研究意义与良好的前景(5.Sun H,Zu Y.A Highlight of Recent Advances in Aptamer Technology and ItsApplication.Molecules 2015,20(7):11959-80；6. O,Walter J G,Shoham Y,etal.Aptamer-based downstream processing of his-tagged proteins utilizingmagnetic beads[J].Biotechnology&Bioengineering 2011,108(10):2371-9)。
发明内容
本发明的目的在于提供可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体。
本发明的另一目的在于提供可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的应用。
所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体，命名为AptHis-C，其序列如下：
5’-TGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAG-3’。
所述6X组氨酸标签的核酸适配体AptHis-C的衍生物，与核酸适配体AptHis-C具有同源核心序列，相同功能用途的核酸适配体AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3，其序列分别为：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAACATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-1
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-2
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-3
所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体对核酸适配体进行切短，延长，部分碱基替换，转录为RNA，偶联蛋白、药物或报告基团等，得到与核酸适配体AptHis-C具有相同功能的核酸适体衍生物。
所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的应用如下：所述6X组氨酸标签的核酸适配体的5’端带有生物素，利用重复使用的链霉亲和素磁珠，可通过磁性分离方式纯化6X组氨酸融合蛋白，在短时间内便能简单高效地获得高产量和高纯度的重组蛋白。
所述6X组氨酸标签的核酸适配体的5’端带有生物素，替代组氨酸蛋白抗体直接对细菌裂解液中的6X组氨酸融合蛋白的表达进行快速的检测与分析。
本发明的有益效果如下：
对比传统的亲和层析纯化，所述核酸适配体以高亲和性与高特异性结合6X组氨酸标签，利用可重复使用的链霉亲和素磁珠，通过磁性分离方式纯化6X组氨酸融合蛋白，无需对粗蛋白样品进行多次离心、过滤步骤，无需昂贵的柱层析设备与过柱层析，在短时间内便能简单高效地获得高产量和高纯度的重组蛋白。此外，可识别6X组氨酸标签的核酸适配体还可替代昂贵的组氨酸蛋白抗体直接对细菌裂解液中的6X组氨酸融合蛋白的表达进行快速的检测与分析，大大简化了操作方法与成本。本发明所述的核酸适配体在蛋白纯化领域具有很高的应用价值。
附图说明
图1为SELEX筛选中核酸适配体富集情况的流式实验结果图。图a为第2、4、5轮正向筛选的ssDNA产物、随机文库与6X组氨酸多肽偶联琼脂糖镍珠的结合情况；图b(阴性对照组)为第2、4、5轮正向筛选的ssDNA产物、随机文库与无偶联琼脂糖镍珠的结合情况。在图1中，曲线a、b、c分别为第5、4、2轮ssDNA文库，曲线d为随机文库，曲线e为空琼脂糖镍珠。
图2为核酸适配体的二级结构预测图。黑色方框内为AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3的碱基差异，圆形虚线内为AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3的共有序列部分，AptHis-C为上述共有序列的预测二级结构。
图3为核酸适配体与6X组氨酸标签多肽偶联的琼脂糖镍珠的结合情况。阴性对照为无偶联的琼脂糖镍珠。
图4为AptHis-C与6X组氨酸标签重组蛋白的Dot blot实验结果图。Fc标签重组蛋白为阴性对照组，分别检测了AptHis-C、随机文库与6X组氨酸标签重组蛋白、Fc标签重组蛋白的结合情况。
图5为AptHis-C与6X组氨酸标签重组蛋白的流式实验结果图。图a为AptHis-C、随机文库与6X组氨酸标签重组蛋白的结合情况；图b(阴性对照组)为AptHis-C、随机文库与Fc标签重组蛋白的结合情况。在图5中，曲线a、b、c分别为GDF15-His、PDL1-His、PD1-His与随机文库结合，曲线d、e、f分别为GDF15-His、PDL1-His、PD1-Hi与AptHis-C结合，曲线g为空琼脂糖镍珠。
图6为AptHis-C-linker鉴定菌液中6X组氨酸标签蛋白的Dot blot实验结果图。AptHis-C、随机文库分别对IPTG诱导表达组、非诱导对照组的菌液进行鉴定。
图7为AptHis-C-linker纯化菌液中6X组氨酸标签蛋白SDS-PAGE实验结果图。条带1、4:超声后的GPC3+BL21(DE3)菌液上清液；条带2：结合AptHis-C-linker磁珠后的菌液上清液；条带3：2.5M NaCl洗脱的GPC3蛋白；条带M：蛋白分子量标志物；条带5：与琼脂糖镍珠结合的洗脱相；条带6：500mM咪唑洗脱的GPC3蛋白。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
所述利用SELEX技术筛选获得能与6X组氨酸融合蛋白高特异性结合的核酸适配体的具体方法为：
SELEX正向筛选过程：将10μL琼脂糖镍珠(Ni-Sepharose beads)用WashingBuffer(DPBS+0.1％Tween-20)洗涤三次后，用Binding BufferⅠ(DPBS+1％BSA+0.1％Tween-20+0.2mg/mL tRNA)重悬，加入10μg 6X组氨酸多肽室温孵育30min，使其偶联到琼脂糖镍珠上，洗涤除去未结合物，以此为正向筛选的靶标。将10OD(约14nmol)随机文库95℃变性，并缓慢冷却至室温后，加入上述制备好的6X组氨酸多肽偶联的琼脂糖镍珠中室温孵育1h。将琼脂糖镍珠洗涤后用DEPC水重悬，95℃变性10min，离心后收集上清作为模板进行PCR扩增(使用Cy3标记的上游引物和biotin标记的下游引物，95℃30s；56.3℃30s；72℃30s)。PCR产物通过3％琼脂糖电泳鉴定，选择没有非特异条带的最高扩增循环数作为大量制备PCR产物的条件，以此对每轮筛选中的PCR循环数进行具体优化。将biotin化的PCR产物偶联到链霉亲和素琼脂糖珠(Streptavidin Agarose Beads)上，用200mM NaOH解离上游单链，经NAP-5柱脱盐纯化，即为第一轮筛选的ssDNA文库。以此文库为模板进行下一轮筛选，并逐渐降低6X组氨酸多肽、琼脂糖镍珠的用量以及ssDNA文库浓度，并缩短筛选时间。正向筛选过程重复了5轮。
SELEX负向筛选过程：负向筛选和正向筛选过程基本相同，所不同的是，以未偶联6X组氨酸多肽的琼脂糖镍珠作为筛选靶标，所用文库为上一轮正向筛选制备的ssDNA文库，并在筛选过程中逐渐降低ssDNA文库的浓度、增加琼脂糖镍珠的用量，并延长孵育时间。负向筛选在第1、3、4轮正向筛选后进行，重复了3轮。
实施例2
所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的流式检测分析的具体方法为：
取1μL洗涤重悬后的琼脂糖镍珠与1μg 6X组氨酸多肽室温孵育30min，洗涤除去未结合物。将Cy3标记的ssDNA文库(或核酸适配体)95℃变性冷却至室温后，加入上述制备好的6X组氨酸多肽偶联的琼脂糖镍珠中(调整终浓度为200nM)，室温孵育1h。洗涤后使用流式细胞仪(BD bioscience,FACS Verse)检测ssDNA文库(或核酸适配体)的富集程度。
图1的流式结果为SELEX筛选中各轮核酸适配体的富集情况。结果显示第4轮与第5轮正向筛选得到的ssDNA文库已明显富集，且各文库均不与空白琼脂糖镍珠反应。
实施例3
所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的克隆与测序的具体方法为：
将第5轮正向筛选富集的ssDNA文库分别用不带标签的上下游引物扩增(PCR条件同上)，PCR产物送上海生工生物进行高通量测序(NGS)，分析文库中特异核酸适配体序列。Top10特异核酸适配体的核心区序列信息如表1所示：
表1.NGS测序结果
如表1所示，Top1-3核酸适配体的核心区序列具有高度同源性，仅5’端有三个碱基差异(见表1下划线)，三者丰度之和高达24.45％。
Top1-3核酸适配体的完整序列与命名分别如下：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAACATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-1
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-2
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-3
用Mfold软件预测核酸适配体序列的二级结构，预测结果如图2所示，三条核酸适配体序列的二级结构完全相同。
实施例4
以下给出三条核酸适配体和6X组氨酸多肽的亲和力(Kds)测定方法：
5’端Cy3标记的AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3以及SELEX初始文库(阴性对照)由上海生工生物工程公司合成，用于测定三条核酸适配体和6X组氨酸多肽的亲和力(Kd)，方法同流式检测分析，将三条核酸适配体的最终工作浓度调整为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125(nM)，测定三条核酸适配体在不同浓度下和6X组氨酸多肽的平均荧光密度(MFI)，并用公式Y＝Bmax X/(Kd+X)计算Kds。图3为不同浓度下核酸适配体与6X组氨酸多肽结合的流式结果，表2为计算得到的Kds值。结果显示，AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3与6X组氨酸多肽的Kds非常接近，均在15nM左右，结合其二级结构又完全一致，预测其与6X组氨酸结合的位点可能在其共有序列部分，因此又合成了5’端Cy3标记的截短序列(5’-TGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAG-3’)，并命名为AptHis-C，其二级结构预测见图2。同时通过流式检测分析AptHis-C能否与6X组氨酸多肽结合，结果显示AptHis-C与6X组氨酸多肽同样具有高亲和力(Kds值为20.8nM)，因此后续的检测分析均用AptHis-C。
表2.核酸适配体与6X组氨酸多肽结合的Kds值
实施例5
为验证AptHis-C是否可以特异识别带6X组氨酸重组蛋白，本发明选用带6X组氨酸标签的GDF15、PD-1及PD-L1重组蛋白，以及带Fc标签的GDF15、PD-1、PD-L1重组蛋白为研究模型，分别用Dot Blot和流式两种方法验进行验证。
Dot blot检测方法：将蛋白分次点样到NC膜上，室温干燥后用Binding buffer Ⅱ(DPBS+3％BSA+0.1％Tween-20+0.2mg/mL tRNA)封闭。将AptHis-C 95℃变性冷却后，用Binding BufferⅠ调整终浓度为200nM，与封闭好的NC膜室温孵育1h。将Streptavidin-HRP与NC膜室温反应45min，洗涤后ECL曝光。
流式检测具体方法详见实施例2的流式检测分析部分。
结果：Dot Blot实验结果(图4)与流式检测实验的结果(图5)均显示AptHis-C可以特异识别带6X组氨酸重组蛋白，而不与Fc标签重组蛋白反应。
实施例6
为减少空间位阻对核酸适配体和靶蛋白结合的影响，在AptHis-C的5’端增加6个胸腺嘧啶核苷(T)作为linker，并偶联biotin分子，命名为AptHis-C-linker(5’-biotin-TTTTTTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAG)。
为验证AptHis-C-linker是否能有效捕获带6X组氨酸标签的重组蛋白，以及捕获后在不同洗脱条件下蛋白的回收率，本实验选用带6X组氨酸标签的GDF15、PD-1、PD-L1(蛋白纯度均>95％)重组蛋白作为实验模型，蛋白浓度经BCA蛋白定量试剂盒精确定量。每个模型蛋白按洗脱条件分为7个实验组，即NaCl洗脱组(0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M和3M组)，以及95℃变性洗脱组。AptHis-C-linker经95℃变性并缓慢降至室温后，与链霉亲和素磁珠(DynabeadsMyOne streptavidin C1)室温孵育30min并清洗。每个实验组使用终浓度为100ug/ml的蛋白与上述制备好的磁珠室温反应30min，用磁力分离架分离磁珠，清洗去除未结合的杂质。NaCl洗脱组：分别用不同浓度的NaCl溶液重悬磁珠，室温孵育10min洗脱结合蛋白，分离磁珠后用灭菌双纯水将上清稀释5倍，减少高浓度NaCl对BCA蛋白定量的干扰，对蛋白进行浓度测定，计算回收率。95℃变性洗脱组：结合蛋白的磁珠加灭菌双纯水重悬磁珠，95℃变性10min，分离磁珠后稀释上清，测定蛋白浓度，计算回收率：
回收率＝(洗脱后蛋白浓度/初始浓度)×100％。
为考察AptHis-C-linker偶联的链霉亲和素磁珠是否能够重复使用，将上述使用过的磁珠清洗后，重新取等量蛋白与其孵育结合，洗脱条件为2.5M NaCl和95℃变性(条件同上)，连续重复3次，分别计算每次实验的回收率，结果如表3和4所示。
表3.不同洗脱条件实验组的蛋白回收率
表4.重复回收实验的蛋白回收率
结果显示：1)AptHis-C可以有效地捕获6X组氨酸标签的重组蛋白；2)高浓度NaCl(≥2.5M)和95℃变性条件均可有效释放捕获的重组蛋白，蛋白回收率>60％，但NaCl洗脱条件可保持蛋白的生物活性。而95℃变性条件下，重组蛋白将会变性，且链霉亲和素磁珠无法进行重复使用；3)NaCl洗脱条件下，同一批次制备的AptHis-C磁珠可至少重复使用4次而不会明显降低回收率。
实施例7
为考察AptHis-C能否在复杂体系中鉴定并纯化带6X组氨酸标签的重组蛋白，一个可溶性表达6X组氨酸标签GPC3蛋白(pET-28a载体)的BL21(DE3)菌株被用作实验模型。过夜培养的细菌按1︰100转接至新鲜LB培养基中继续培养至OD值＝0.4～0.6，将菌液等分为两组：诱导表达组和非诱导对照组。非诱导对照组菌液不加诱导剂继续培养6h，IPTG诱导表达组菌液经IPTG(1mM)诱导表达6h。离心分别收获菌体沉淀，，冰上超声破碎，取离心后上清液。Dot blot鉴定GPC3蛋白表达的步骤同实施例5。不同之处在于NC膜封闭后，用0.1％链霉亲和素(Streptavidin)封闭以消除内源性生物素的背景干扰。AptHis-C工作浓度为200nM。
IPTG诱导表达组剩余的超声破碎上清液等分为两组：AptHis-C-linker磁珠纯化组和琼脂糖镍珠纯化组。AptHis-C-linker磁珠纯化方法同前，NaCl洗脱浓度为2.5M。琼脂糖镍珠纯化组操作方法按照说明书进行，500mM咪唑洗脱。
Dot blot实验的结果(图6)与SDS-PAGE的分析结果(图7)显示：AptHis-C能够在菌液中鉴定并纯化带6X组氨酸标签的重组蛋白，并达到与传统IMAC相同的纯化效果。
本发明所采用的材料如下：
Ni-SepharoseBeads、NAP-5脱盐柱(GE lifescience)；6X组氨酸多肽(中肽生化有限公司，纯度>95％)；tRNA、DPBS、链霉亲和素琼脂糖珠，DynabeadsMyOneStreptavidin C1磁珠，BCA蛋白定量试剂盒，链霉亲和素(ThermofisherScientific)；BSA(Sigma-Aldrich)；Tween-20(碧云天)；氢氧化钠，琼脂糖(上海生工生物)；DEPC水，ECL(碧云天)；Streptavidin-HRP(武汉三鹰生物)；Taq酶(TAKARA)。
带6X组氨酸标签的GDF15、PD-1及PD-L1重组蛋白，以及带Fc标签的GDF15、PD-1、PD-L1重组蛋白均购自义翘神州生物技术公司。SELEX初始文库(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-N(40)-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’)。
上游引物：Cy3-5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA；
下游引物：biotin-5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA；
特异的aptamers序列及其标记均由上海生工生物合成并经HPLC纯化。
序列表
<110> 温州医科大学附属第一医院
<120> 可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcaagagg gtgtgcttaa ggtggacacg gtggcttag 39
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccagagtg acgcagcaac ataaggctgt aagggttggc aagagggtgt gcttaaggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccagagtg acgcagcaaa gtaaggctgt aagggttggc aagagggtgt gcttaaggtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccagagtg acgcagcaca ataaggctgt aagggttggc aagagggtgt gcttaaggtg 60
gacacggtgg cttagt 76

Claims (5)

1.可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体，命名为AptHis-C，其特征在于，其序列如下：
5’-TGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAG-3’。
2.可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体AptHis-C的衍生物，其特征在于与核酸适配体AptHis-C具有同源核心序列，相同功能用途的核酸适配体AptHis-1、AptHis-2、AptHis-3，其序列分别为：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAACATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-1
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-2
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACAATAAGGCTGTAAGGGTTGGCAAGAGGGTGTGCTTAAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’AptHis-3。
3.如权利要求1所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体，其特征在于，对核酸适配体进行切短，延长，部分碱基替换，转录为RNA，偶联蛋白、药物或报告基团等，得到与核酸适配体AptHis-C具有相同功能的核酸适体衍生物。
4.如权利要求1所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的应用，其特征在于，所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的5’端带有生物素，利用重复使用的链霉亲和素磁珠，通过磁性分离方式纯化6X组氨酸融合蛋白，获得重组蛋白。
5.如权利要求1所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的应用，其特征在于，所述可特异性结合6X组氨酸标签的核酸适配体的5’端带有生物素，替代组氨酸蛋白抗体直接对细菌裂解液中的6X组氨酸融合蛋白的表达进行快速的检测与分析。
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