CN111718885B

CN111718885B - 一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统

Info

Publication number: CN111718885B
Application number: CN202010725236.7A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 崔文璟; 陈巧青; 刘中美; 周丽; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN111718885A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统，属于基因工程领域。本发明构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化，并且能够通过通过外源添加相应的诱导剂，诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定，以枯草芽孢杆菌为宿主，得到的产物安全无致病性，适用于多种生产场景。

Description

一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统，属于基因工程领域。

背景技术

质粒是一种共价闭合环状的DNA且具有自我复制和表达外源基因的功能。由于其在不同的宿主中具有良好的自我复制能力，所以在基因工程及分子生物学领域中常被作为载体用于表达目的基因。在进行基因工程的改造和研究中通常一个宿主菌中只转化一种质粒，这是因为质粒具有不相容性，即同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内。目前也有转化同一种质粒到大肠杆菌中构建形成双质粒系统进行双酶的表达。通过添加抗生素作为外部选择压力使双质粒保持稳定，但表达得到的酶产量及效果都不太理想。

目前已经报道的在微生物中关于基因震荡器的内容，主要是通过单一诱导剂对其中的抑制蛋白进行表达调控，从而对对应需要激活剂激活表达的启动子产生抑制效果。该可抑制启动子分别启动报告基因和激活剂的转录表达。而且构建所用的宿主菌多为大肠杆菌，但大肠杆菌是领域公知的致病菌，影响了蛋白的安全性，并且若重组表达的外源蛋白中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或翻译提前终止，目标蛋白质容易形成包涵体而不可溶。

因此，需要提供一种能够便于调控、并有效表达蛋白、又具有安全性能的表达系统。

发明内容

为解决上述存在的问题，本发明构建了一种适用于双质粒转化的载体。将pHT01和pBSG03穿梭载体，通过删除复制起点Ori(pHT01和pBSG03同为穿梭载体，在大肠杆菌中的复制子是相同的，如果不进行删除就转化双质粒会造成两个质粒上由于有相同基因序列而发生交换，造成质粒的不稳定)，改造成了只能在枯草芽孢杆菌中复制的pHTminP43-sfGFP和pBminP43-mcherry双质粒，从而使得在枯草芽孢杆菌中构建双质粒得方法更加简便有效(省去了先在枯草芽孢杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化)。

本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：

第一质粒：含有诱导型启动子A、目的蛋白A和诱导型启动子B的抑制蛋白；

第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导型启动子A或B包括乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子A和启动子B为不同的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述第一质粒以pHT01载体为出发载体，所述第二质粒以pBSG03载体为出发载体。

在本发明的一种实施方式中，pBSG03载体的构建方法记载于文献Guan C,Cui W,Cheng J,et al.Construction and development of an auto-regulatory geneexpression system in Bacillus subtilis[J].Microbial Cell Factories,2015,14(1):150。

在本发明的一种实施方式中，所述第一质粒和第二质粒均切除了大肠杆菌转录复制子。

在本发明的一种实施方式中，目的蛋白A或目的蛋白B包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶。

本发明提供了一种生产目的蛋白的方法，将所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，发酵生产蛋白。

在本发明的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第一质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第一质粒上目的蛋白的表达，并抑制第二质粒上的目的蛋白的表达。

在本发明的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第二质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第二质粒上目的蛋白的表达，并抑制第一质粒上的目的蛋白的表达。

在本发明的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第一质粒和第二质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，同时诱导第一质粒和第二质粒上目的蛋白的表达。

本发明提供了一种调控目的蛋白表达的方法，将所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，通过添加相应诱导剂，诱导或抑制目的蛋白的表达。

本发明还保护所述重组枯草芽孢杆菌，或所述方法在生产目的蛋白中的应用。

有益效果：

本发明构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化，并且能够通过外源添加相应的诱导剂，诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定，以枯草芽孢杆菌为宿主，得到的产物安全无致病性，适用于多种生产场景。

附图说明

图1为pHTP43-sfGFP质粒图谱。

图2为pHTminP43-sfGFP质粒图谱。

图3为pBP43-mCherry质粒图谱。

图4为pBminP43-mCherry质粒图谱。

图5为穿梭版双质粒系统以及精简版的双质粒系统在枯草芽孢杆菌中的蛋白表达情况对比图。

图6为乳糖诱导型启动子其质粒上还构建有木糖阻遏蛋白pHTPgrac-sfGFP-xylR。

图7为木糖诱导型启动子带有乳糖阻遏蛋白pBPXylA-mCherry-lacI。

图8为两种相互具有抑制效果的双质粒系统图。

图9为含有双质粒系统的枯草芽孢杆菌在不同条件下蛋白表达情况图。

具体实施方式

1、sfGFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测荧光。激发光485nm，吸收光528nm，检测荧光。

2、mcherry荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测荧光。激发光587nm，吸收光610nm，检测荧光。

3、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落枯草芽孢杆菌168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD₆₀₀。当OD₆₀₀约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min^-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA溶液，于37℃、100r·min^-1摇床中培养10min后，每l.5mL离心管分装500μL；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min^-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃培养12-14h。

4、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶(购自Takara，货号：R045Q)。

5、2×GenRec重组试剂盒购自通用生物系统(安徽)有限公司，货号：CL08050。

SPI培养基(20mL):

表1 SPI培养基组分表

6、SP-A Salts Solution(500mL)：2g(NH₄)₂SO₄、14g K₂HPO₄.3H₂O、6g KH₂PO₄、1g二水柠檬酸钠加去离子水定容至500mL，121℃20min灭菌

7、SP-B Salts Solution(500mL)：0.2g MgSO₄.7H₂O加去离子水定容至500mL，121℃20min灭菌。

8、100×CAYE Solution(100mL)：2g酪蛋白水解物、10g酵母抽提物加去离子水定容至100mL，121℃20min灭菌。

9、100×EGTA Solution(pH 8.0)(100mL)：0.38g EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，用NaOH调pH至8.0，121℃20min灭菌。

10、50％葡萄糖溶液(100mL)：50g无水葡萄糖，加去离子水定容至100mL，115℃15min灭菌

11、50mM CaCl₂溶液(100mL)：0.555g无水CaCl₂，加去离子水定容至100mL，115℃20min灭菌。

12、250mM MgCl₂溶液(100mL)：5.08g MgCl₂·6H₂O，加去离子水定容至100mL，115℃20min灭菌。SPII培养基(6mL)：

表2 SPII培养基组分表

13、全质粒PCR：用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶进行，PCR程序为：预变性98℃1min，循环为变性98℃30s，退火50℃30s，延伸72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

表3实施例中所用引物

实施例1：精简版的pHTmin-sfGFP和pBmin-mCherry重组菌的构建

(1)pHTOriP43-sfGFP菌株的构建

将sfGFP片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)以及组成型启动子P43(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)与pHT01载体通过Infusion法进行同源臂组装连接后，转入大肠杆菌JM109宿主，涂布到100μg/mL氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素抗性液体培养基中并送测序；测序正确后提取质粒，并转化到枯草芽孢杆菌B.S168宿主，验证得到含有质粒pHTOriP43-sfGFP的重组菌株。

(2)pBOriP43-mCherry菌株的构建

将mCherry片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)以及组成型启动子P43与pBSG03(构建方法见Guan C,Cui W,Cheng J,et al.Construction and development of anauto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis[J].Microbial CellFactories,2015,14(1):150)载体通过Infusion法进行同源臂组装连接后，转入大肠杆菌JM109宿主，涂布到100μg/mL氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素抗性液体培养基中37℃，200rpm培养并送测序。测序正确后提取质粒，并转化到枯草芽孢杆菌B.S168宿主，验证得到含有质粒pBOriP43-mCherry的重组菌株。

(3)精简版的pHTminP43-sfGFP菌株的构建

将步骤(1)构建得到的pHTOriP43-sfGFP质粒上的大肠杆菌中的复制起始位点Ori通过设计的引物pHT-Oridel-1和pHT-Oridel-2进行全质粒PCR删除，转入枯草芽孢杆菌168宿主，进行测序验证，得到含有质粒pHTminP43-sfGFP的重组菌株。

(4)精简版的pBminP43-mCherry菌株的构建

将步骤(2)构建得到的pHTOriP43-mCherry质粒上的大肠杆菌中的复制起始位点Ori通过设计的引物pB-delOri-1和pB-delOri-2进行全质粒PCR删除，转入枯草芽孢杆菌168宿主，进行测序验证，得到含有质粒pBminP43-mCherry的重组菌株。

实施例2：含双质粒的重组菌及其蛋白表达效果验证

(1)含穿梭版双质粒重组菌的构建

将实施例1的步骤(1)构建得到的pHTOriP43-sfGFP重组菌制备成感受态细胞，将pBOriP43-mCherry转化到pHTOriP43-sfGFP重组菌中，在含有5μg/mL卡那霉素抗性的平板上进行筛选，并测序验证，得到含有双质粒(pHTOriP43-sfGFP+pBOriP43-mCherry)的枯草芽孢杆菌。

(2)含精简版双质粒重组菌的构建

将pHTminP43-sfGFP重组菌制备成感受态细胞，将pBminP43-mCherry转化到pHTminP43-sfGFP重组菌中，在含有5μg/mL卡那霉素抗性的平板上进行筛选，并测序验证，得到含有精简版双质粒(pHTminP43-sfGFP+pHTminP43-sfGFP)的枯草芽孢杆菌。

(3)重组菌荧光蛋白表达效果验证

对步骤(1)和(2)构建的重组菌分别检测其荧光蛋白表达效果。

将步骤(1)和(2)构建得到的重组菌分别在含有10μg/mL氯霉素抗性和5μg/mL卡那霉素抗性固体培养基上划线培养14h后接种到含有10μg/mL氯霉素抗性和5μg/mL卡那霉素抗性5mLLB液体培养基中进行培养，至OD₆₀₀为2.5时，以1mL/100mL的接种量接种到含有10μg/mL氯霉素抗性和5μg/mL卡那霉素抗性LB培养基的5mL试管，同时添加1g/mL的乳糖或者1g/mL的木糖作为诱导剂在37℃进行诱导，将诱导24h后的菌液分别在激发光485nm，吸收光528nm下检测绿色荧光，在激发光587nm，吸收光610nm下检测红色荧光。

最终检测到的荧光表达效果如图5，pHTOriP43-sfGFP+pBOriP43-mCherry重组菌和pHTminP43-sfGFP+pBminP43-mCherry重组菌表达绿色荧光的效果没有明显差异，但红色荧光的表达效果有所下降，在一定程度上和红色荧光蛋白的成熟时间较绿色荧光蛋白晚有关。同时，由于枯草芽孢杆菌中质粒的拷贝数会相较于大肠杆菌有所下降，没有经过多拷贝而直接转化枯草会对表达量有一定影响。但是考虑到双质粒系统的稳定性，为了避免以后传代过程中质粒的交换插入等变化产生，我们删除pHT01和pBSG03上相同的大肠杆菌复制起始位点序列，是之后利用双质粒系统所进行的必要操作步骤。

实施例3：基于双质粒和诱导型启动子的基因震荡器

(1)pHTminPgrac-sfGFP-XylR质粒的构建

将pHTminP43-sfGFP的启动子替换为乳糖诱导型启动子：将乳糖诱导型启动子Pgrac-i(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，再将其与引物pHTPgrac-sfGFP-v1/v2(以pHTminP43-sfGFP为模板)扩增得到的pHTPgrac-sfGFP-v通过同源臂连接，再利用Infusion酶，将两个片段进行组装，得到含有乳糖诱导型启动子的质粒pHTminPgrac-sfGFP。

在质粒pHTminPgrac-sfGFP整合表达木糖诱导型启动子阻遏蛋白：将木糖阻遏蛋白xylR-i片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，再将其与引物pHTPgrac-xylR-v1/v2(以pHTminPgrac-sfGFP为模板)扩增得到的pHTPgrac-sfGFP-v通过同源臂连接，用相同的酶组装，得到质粒pHTminPgrac-sfGFP-XylR。

(2)pBminPXylA-mcherry-lacI质粒的构建

将pBminP43-mcherry的启动子替换为木糖诱导型启动子：将木糖诱导型启动子片段PXylA-i(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，通过同源臂连接到引物pBPXylA-mCh-v1/v2(以pBminP43-mcherry为模板)扩增得到的pBPXylA-mCh-v载体片段通过同源臂连接，再利用Infusion酶，将两个片段进行组装，得到含有木糖诱导型启动子的重组质粒pBminPXylA-mCherry。

在质粒pBminPXylA-mCherry整合表达乳糖诱导型启动子阻遏蛋白：将乳糖阻遏蛋白lacI-i片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，再将其与引物pBPXylA-lacI-v1/v2(以PBminPxylA-mcherry为模板)扩增得到的pBPXylA-mCh-v通过同源臂连接，用相同的酶组装，得到重组质粒pBminPXylA-mcherry-lacI。

(3)双质粒重组菌的构建

将上述构建得到的质粒pHTminPspac-sfGFP-XylR转化至枯草芽孢杆菌168中，在含有10μg/mL氯霉素抗性的平板上进行筛选，并测序验证，得到阳性转化子pHTminPspac-sfGFP-XylR；将菌株pHTminPspac-sfGFP-XylR制备成感受态细胞，把重组质粒pBminPXylA-mcherry-lacI转化至菌株pHTminPspac-sfGFP-XylR的感受态细胞中，在含有5μg/mL卡那霉素抗性的平板上进行筛选，并测序验证，得到重组菌pHTminPspac-sfGFP-XylR+pBminPXylA-mcherry-lacI。

(4)重组菌蛋白表达效果验证

将重组菌在5mL LB培养基中活化至OD₆₀₀为1.5，以1mL/100mL接种量接种至添加了1g/100mL乳糖或者木糖诱导剂的5mL LB培养基中，培养18h后分别检测绿色荧光和红色荧光的强度，结果如图9所示。

结果显示，当外源添加乳糖时，能激活乳糖诱导型启动子表达下游的报告基因——绿色荧光蛋白，以及其后的木糖启动子阻遏蛋白使得同一宿主内另一质粒的木糖诱导型启动子无法产生功能，此时只能检测到绿色荧光蛋白；而当外源添加木糖作为诱导剂时，木糖诱导型启动子将被激活表达下游的红色荧光蛋白和其后的乳糖诱导型启动子阻遏蛋白，阻遏乳糖启动子功能不表达绿色荧光蛋白，此时检测到的荧光为红色荧光蛋白产生；若外源不添加任何诱导剂，则两种质粒都不表达荧光蛋白，用酶标仪无法检测到任何荧光，但是由于诱导型启动子会有低渗漏表达情况，所以将有若荧光产生；当外源同时添加乳糖和木糖作为诱导剂时，两种质粒上的启动子都被激活，表达对另一启动子有抑制效果的阻遏蛋白，又会抑制对应启动子的活性，使得检测时表现为一段时间的双荧光信号很强，一段时间的双荧光信号都较弱的震荡表达效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtaacataat cggtacgggg gtgaaaaagc taacggaaaa gggagcggaa aagaatgatg 60

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<210> 2

<211> 1167

<212> DNA

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<400> 2

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<212> DNA

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act 1083

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<210> 7

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggcgttgaa gatcctttga tcttttctac gg 32

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcaaaggatc ttcaacgcca gcaacgcg 28

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcaaaggat cttcaacgcc agcaacgcg 29

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggcgttgaa gatcctttga tcttttctac ggg 33

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaaatgacaa atggtttcta aaggcgaag 29

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggataaacaa aggaacctgc cctctgcc 28

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatgaccaaa gtatcctttg tttatccacc gaact 35

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcccgtcac tacctgccct ctgccac 27

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aaaggaggaa ggatcatgag caaaggagaa gaacttttc 39

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agctaattcc ggtgacctgc cctctgccac c 31

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaaggaggaa ggatcatgag caaaggagaa gaacttttc 39

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccctataagt taggcgcaac gcaattaatg t 31

Claims

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：

第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白；

所述诱导型启动子A或启动子B分别为乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种，且启动子A和启动子B为不同的启动子；

所述第一质粒以pHT01载体为出发载体，所述第二质粒以pBSG03载体为出发载体；

所述第一质粒和第二质粒均切除了大肠杆菌复制起始位点序列。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，目的蛋白A或目的蛋白B包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶。

3.一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，发酵生产蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在发酵环境中加入与第一质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第一质粒上目的蛋白的表达，并抑制第二质粒上的目的蛋白的表达。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在发酵环境中加入与第二质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第二质粒上目的蛋白的表达，并抑制第一质粒上的目的蛋白的表达。

6.一种调控目的蛋白表达的方法，其特征在于，将权利要求1~4任一所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，通过添加相应诱导剂，诱导或抑制目的蛋白的表达。

7.权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌，或权利要求3~6任一所述方法在生产目的蛋白中的应用。