KR20140095850A - 코리네박테리움과 대장균용 셔틀벡터 - Google Patents

Abstract

코리네박테리움 및 대장균에서 복제되며, 다양한 클로닝을 용이하게 하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터를 이용하여 코리네박테리움에서 프로모터의 전사유도 활성을 측정하거나, 목적 유전자의 산물을 생산할 수 있다.

Description

코리네박테리움과 대장균용 셔틀벡터{Shuttle vector for Escherichia coli and Corynebacteria}

코리네박테리움과 대장균에서 사용할 수 있는 셔틀벡터 및 이를 이용한 프로모터 스크리닝, 유전자 산물의 생산에 관한 것이다.

코리네박테리움은 그람 양성 균주로서, 글루타메이트, 라이신, 트레오닌과 같은 아미노산 및 이노신산과 같은 퓨린 계열의 핵산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 용이하며, 대장균에 비해 4배 가량 고농도 배양이 가능하고, 유전체 구조가 안정적이어서 돌연변이 발생 확률이 낮다. 또한, 비병원성 균주이고 포자를 만들지 않아 환경에 유해한 영향을 미치지 않는 등 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다.

클로닝 벡터는 세균 내에서 주염색체와 독립적으로 복제될 수 있는 환상의 DNA이다. 클로닝 벡터는 균주 내에서 플라스미드 형태로 유지되기 위한 복제원점 (origin of replication), 벡터를 보유한 균주를 선별하기 위한 선발 표지 유전자 (selectable marker gene), 및 외래 유전자의 클로닝을 위한 다중클로닝부위 (multi-cloning site, MCS)를 포함한다.

셔틀벡터는 일반적으로 복수의 균주에서 유지 가능한 벡터를 포함한다. 코리네박테리움-대장균 셔틀벡터는 코리네박테리움의 복제원점 및 대장균의 복제원점을 모두 포함하고 있다. 셔틀벡터를 사용함으로써 대상 균주에 원하는 형질을 용이하게 도입할 수 있다. 예를 들면, 대장균에서 외래유전자 또는 돌연변이를 유발시킨 유전자를 셔틀벡터에 클로닝 한 후, 코리네박테리움에 셔틀벡터를 도입함으로써 원하는 형질을 유도할 수 있다.

코리네박테리움과 대장균에서 모두 유지 및 증식이 가능하며, 다중클로닝부위를 개선하여 다양한 클로닝을 용이하게 수행할 수 있도록 하는 셔틀벡터가 요구되고 있다.

일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위(MCS) 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

다른 양상은 상기 벡터를 이용하여 코리네박테리움에서 프로모터 활성을 확인하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 벡터를 이용하여 코리네박테리움에서 유전자 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 벡터를 갖는 대장균 및 코리네박테리움을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 서열번호 1은 도 1 (A)의 D로 표시된 부위 (pMB1 ori 내지 CGL ori)에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들면, 상기 벡터는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 3은 도 2의 pGSK+ 벡터의 전체에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

상기 벡터는 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 용어 “작동 가능하게 연결되어 있는(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 상기 리포터 유전자 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터에 의해 상기 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 리포터 유전자는 상기 프로모터의 전사유도 활성을 용이하게 측정할 수 있는 어떠한 리포터 유전자도 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 유전자는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 유전자일 수 있다. 상기 전사종결자는 예를 들면, 내재적 전사종결자(intrinsic transcription terminator)일 수 있다. 상기 내재적 전사종결자는 예를 들면, rrnB terminator일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 4는 도 3의 pGSP1 벡터의 전체에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

상기 벡터는 상기 다중클로닝부위에 유전자 발현 안정화를 유도하는 3'UTR(3'-untranslated region) 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터-유전자의 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR은 예를 들면, 코리네박테리움 gltA 유전자의 3'UTR일 수 있다. 상기 전사종결자는 예를 들면, 내재적 전사종결자일 수 있다. 상기 내재적 전사종결자는 예를 들면, rrnB terminator일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 5는 도 4의 pGT1 벡터의 전체에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

상기 벡터는 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터(constitutive promoter), 유전자 발현 안정화를 유도하는 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 "구성적 프로모터(constitutive promoter)"는 성장 조건에 관계없이 일정한 수준으로 전사적으로 활성인 프로모터를 포함한다. 상기 구성적 프로모터는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA (NCgl1526) 유전자의 프로모터일 수 있다. 상기 구성적 프로모터는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자를 코리네박테리움의 성장 조건에 관계없이 일정한 수준으로 발현시킬 수 있도록 상기 유전자에 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR은 예를 들면, 코리네박테리움 gltA 유전자의 3'UTR일 수 있다. 상기 전사종결자는 예를 들면, 내재적 전사종결자일 수 있다. 상기 내재적 전사종결자는 예를 들면, rrnB terminator일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 6은 도 5의 pGSX1 벡터의 전체에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

다른 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하고 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터 내 다중클로닝부위에 프로모터가 삽입된 벡터가 도입된 코리네박테리움을 배지 중에 배양하는 단계; 상기 배양물에서 상기 리포터 유전자 산물을 측정하는 단계; 및 상기 측정결과로부터 상기 프로모터의 전사유도 활성을 확인하는 단계를 포함하는, 프로모터 활성을 확인하는 방법을 제공한다.

상기 배양하는 단계는 코리네박테리움이 성장 및 증식할 수 있는 배지 상에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 프로모터는 그와 작동가능하게 연결되는 상기 리포터 유전자가 발현되도록 상기 다중클로닝부위에 삽입된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들면, 코리네박테리움에서 전사유도 활성을 확인하고자 하는 대상 프로모터일 수 있다. 상기 전사종결자는 예를 들면, 내재적 전사종결자일 수 있다. 상기 내재적 전사종결자는 예를 들면, rrnB terminator일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 리포터 유전자 산물은 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제일 수 있다.

상기 리포터 유전자 산물의 측정은 예를 들면, 상기 코리네박테리움의 세포 용해물, 방사성 동위원소가 표지된 클로람페니콜, 및 아세틸-CoA를 37℃에서 배양한 후 크로마토그래피 및 방사선자기사진법에 의해 표지된 아세틸클로람페니콜을 확인하는 방법으로 수행되는 것일 수 있다. 또는 클로람페니콜을 함유한 배지상에서 형성된 콜로니의 크기를 측정하는 방법으로 수행되는 것일 수 있다.

상기 전사유도 활성의 확인은 예를 들면, 대조군에서 생성된 아세틸클로람페니콜과 비교하여 수행될 수 있다. 이때, 상기 대조군은 프로모터가 삽입되지 않은 상기 벡터가 도입된 코리네박테리움의 세포 용해물, 방사성 동위원소가 표지된 클로람페니콜, 및 아세틸-CoA를 37℃에서 배양한 것일 수 있다. 또는 상기 확인은 대조군보다 크기가 큰 콜로니가 형성되는지를 확인함으로써 수행될 수 있다. 이때, 상기 대조군은 프로모터가 삽입되지 않은 상기 벡터가 도입된 코리네박테리움을 클로람페니콜을 함유한 배지상에서 배양한 것일 수 있다.

다른 양상은, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하고 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터 내 다중클로닝부위에 유전자가 삽입된 벡터가 도입된 코리네박테리움을 배지 중에 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 상기 유전자 산물을 분리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움으로부터 유전자 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양하는 단계는 코리네박테리움이 성장 및 증식할 수 있는 배지 상에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 예를 들면, 코리네박테리움에서 유전자 산물이 생성되는지를 확인하고자 하는 대상 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 예를 들면, 상기 구성적 프로모터에 의해 발현이 유도되도록 다중클로닝부위에 삽입된 것일 수 있다. 상기 구성적 프로모터는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA 유전자의 프로모터일 수 있다. 상기 3'UTR은 예를 들면, 코리네박테리움 gltA 유전자의 3'UTR일 수 있다. 상기 전사종결자는 예를 들면, 내재적 전사종결자일 수 있다. 상기 내재적 전사종결자는 예를 들면, rrnB terminator일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

상기 배양물로부터 상기 유전자 산물의 분리는 예를 들면, 배양된 세포를 수확하고 상기 세포를 파괴한 후 얻어진 세포 추출물로부터 크로마토그래피, 전기영동 등 통상적인 방법으로 단백질을 분리해 내는 것일 수 있다. 상기 분리된 유전자 산물은 예를 들면, 추가의 정제과정을 거칠 수 있다.

다른 양상은, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터를 갖는 대장균을 제공한다. 상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 리포터 유전자 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터에 의해 상기 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 리포터 유전자는 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자일 수 있다. 상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 3'UTR 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 3'UTR 및 전사종결자에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 3'UTR 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터-유전자의 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 대장균은 예를 들면, 상기 벡터를 유지하고 증식하는 숙주세포로 사용될 수 있다. 상기 숙주세포의 집합은 예를 들면, genomic DNA 라이브러리를 구성하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 유전체의 각 단편을 포함할 수 있다.

상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 구성적 프로모터는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자를 코리네박테리움의 성장 조건에 관계없이 일정한 수준으로 발현시킬 수 있도록 상기 유전자에 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR은 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 대장균은 예를 들면, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터를 갖는 코리네박테리움을 제공한다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 리포터 유전자 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터에 의해 상기 리포터 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 리포터 유전자는 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 3'UTR 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 3'UTR 및 전사종결자에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 3'UTR 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 프로모터-유전자의 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다.

상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하는 벡터의 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 구성적 프로모터는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자를 코리네박테리움의 성장 조건에 관계없이 일정한 수준으로 발현시킬 수 있도록 상기 유전자에 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 3'UTR은 및 전사종결자는 예를 들면, 상기 다중클로닝부위에 삽입되는 유전자가 발현될 수 있도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 갖는 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움은 예를 들면, 상기 벡터에 삽입된 유전자를 과발현시키는 숙주세포로 사용될 수 있다.

상기 코리네박테리움은 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 셔틀벡터는 코리네박테리움에서 유전자 클로닝, 유전자 또는 프로모터 스크리닝, 유전자 산물의 생산, genomic DNA 라이브러리 제작을 위해 사용될 수 있다.

도 1은 serial deletion을 이용해 제작된 네 가지 pET2 미니 벡터가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유지, 복제됨을 나타내는 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 유전자 클로닝용 셔틀벡터 pGSK+의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 프로모터 스크리닝용 셔틀벡터 pGPS1의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 프로모터-유전자 클로닝용 셔틀벡터 pGT1의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 외래유전자 과발현용 셔틀벡터 pGSX1의 개열지도를 나타낸 것이다.

실시예 1: serial deletion 을 통한 pET2 미니 벡터의 제작

대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀벡터인 pET2 벡터 (GenBank accession number: AJ885178.1, 7513 bp)로부터 A로 표시된 부위로 구성된 미니 벡터 (pET2 mini A, 4911 bp), B로 표시된 부위로 구성된 미니 벡터 (pET2 mini B, 4818 bp), C로 표시된 부위로 구성된 미니 벡터 (pET2 mini C, 4717 bp), 및 D로 표시된 부위로 구성된 미니 벡터 (pET2 mini D, 4647 bp)를 제작하였다.

도 1은 serial deletion을 이용해 제작된 네 가지 pET2 미니 벡터가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유지, 복제됨을 나타내는 실험 결과를 나타낸다. 도 1의 (A)는 pET2 벡터로부터 제작된 각 미니 벡터의 부위를 나타낸다. 도 1의 (B)는 pET2 mini A에 비해 크기가 약 270bp 감소한 pET2 mini D를 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환시켰을 때 더 많은 개수의 콜로니를 얻었음을 나타낸다. 도 1의 (C)는 각각의 미니 벡터가 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 플라스미드 형태로 유지됨을 확인한 결과를 나타낸다. 레인 E는 대장균으로부터 분리한 플라스미드를 확인한 결과이다. 레인 1 내지 3은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리한 플라스미드를 확인한 결과이다.

실시예 2: 대장균- 코리네박테리움 글루타미쿰 클로닝용 셔틀벡터 pGSK +

실시예 1의 pET2 mini D를 기반으로, pET2 유래 카나마이신 내성 유전자인 aph 유전자를 Tn5 유래 카나마이신 내성 유전자인 neo 유전자 (nptII)로 치환하여 제한효소 인식부위를 제거하였다. 또한, rep 유전자 내의 XbaI 제한효소 인식부위를 point mutation을 통해 제거하였다. 그 후, 14개의 제한효소 인식부위를 갖는 pBluescriptII SK(+) phagemid 벡터 유래 다중클로닝부위 (MCS)를 삽입하여, 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 클로닝용 셔틀벡터 pGSK+를 제작하였다.

도 2는 유전자 클로닝용 셔틀벡터 pGSK+의 개열지도를 나타낸 것이다. 제한효소 인식부위와 함께 유전적 조직(genetic organization)이 나타난다. 화살표는 ORF(Open Reading Frame)를 나타내며, 화살표의 방향은 전사 방향을 나타낸다. pMB1 ori는 대장균에서 복제되기 위한 복제원점이고, pBL1 Cgl ori는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되기 위한 복제원점이며, 이것의 일부인 rep은 Cgl replicase 유전자를 나타낸다.

실시예 3: 프로모터 스크리닝용 셔틀벡터 pGPS1

실시예 2의 pGSK+를 기반으로, 다중클로닝부위의 ClaI과 SacI 사이에 pET2 유래 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자-rrnB terminator를 삽입하여 프로모터 스크리닝을 위한 셔틀벡터 pGPS1를 제작하였다.

도 3은 프로모터 스크리닝용 셔틀벡터 pGPS1의 개열 지도를 나타낸 것이다. 제한효소 인식부위와 함께 유전적 조직이 나타난다. 화살표는 ORF를 나타내며, 화살표의 방향은 전사 방향을 나타낸다. pMB1 ori, pBL1 Cgl ori, 및 rep은 실시예 2에 기재한 바와 같다. cat는 chloramphenicol acetyltransferase 유전자를 나타내고, rrnBT는 rrnB terminator를 나타낸다.

실시예 4: 프로모터-외래유전자 클로닝용 셔틀벡터 pGT1

실시예 2의 pGSK+를 기반으로, gltA 유전자의 3'UTR (untranslated region) 및 rrnB terminator를 pGSK+의 SalI 위치에 삽입하여 프로모터-외래유전자 클로닝을 위한 셔틀벡터 pGT1를 제작하였다.

도 4는 프로모터-외래유전자 클로닝용 셔틀벡터 pGT1의 개열 지도를 나타낸 것이다. 제한효소 인식부위와 함께 유전적 조직이 나타난다. 화살표는 ORF를 나타내며, 화살표의 방향은 전사 방향을 나타낸다. pMB1 ori, pBL1 Cgl ori, rep, 및 cat은 실시예 2 및 3에 기재한 바와 같다.

실시예 5: 과발현용 셔틀벡터 pGSX1

실시예 4의 pGT1을 기반으로, 다중클로닝부위의 KpnI과 XhoI 사이에 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA 유전자의 프로모터를 삽입하여 외래유전자 과발현을 위한 셔틀벡터 pGSX1을 제작하였다.

도 5는 외래유전자 과발현용 셔틀벡터 pGSX1의 개열지도를 나타낸 것이다. 제한효소 인식부위와 함께 유전적 조직이 나타난다. 화살표는 ORF를 나타내며, 화살표의 방향은 전사 방향을 나타낸다. pMB1 ori, pBL1 Cgl ori, rep, 및 cat은 실시예 2 및 3에 기재한 바와 같다. PgapA는 gap A 유전자의 프로모터를 나타낸다.

<110> Samsung Electronics co., Ltd. <120> Shuttle vector for Escherichia coli and Corynebacteria <130> PN097848 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGSK+_backbone <400> 1 aacaacaaga cccatcatag tttgcccccg cgacattgac cataaattca tcgcacaaaa 60 tatcgaacgg ggtttatgcc gcttttagtg ggtgcgaaga atagtctgct cattacccgc 120 gaacaccgcc gcattcagat cacgcttagt agcgtcccca tgagtaggca gaaccgcgtc 180 caagtccaca tcatccataa cgatcatgca cggggtggaa tccacaccca gacttgccag 240 cacctcatta gcgacacgtt gcgcagcggc cacgtcctta gccttatcca cgcaatctag 300 gacgtactgc ctaaccgcga aatcagactg aatcagtttc caatcatcgg gcttcaccaa 360 agcaacagca acgcgggttg attcgacccg ttccggtgct tccagaccgg cgagcttgta 420 cagttcttct tccatttcac gacgtacatc agcgtctatg taatcaatgc ccaaagcacg 480 cttagcccca cgtgaccagg acgaacgcag gtttttagaa ccaacctcat actcacgcca 540 ccgagccacc aaaacagcgt ccatatcctc gccggcgtcg ctttgatcgg ccaacatatc 600 caacatctga aacggcgtgt acgacccctt agacgcggtt ttagtagcgg agccagtcag 660 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Claims (14)

1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위(MCS) 서열을 포함하는 벡터.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 벡터.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것인 벡터.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 리포터 유전자는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자인 것인 벡터.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 벡터.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 다중클로닝부위에 3'UTR(3'-untranslated region) 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것인 벡터.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 벡터.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터(constitutive promoter), 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 것인 벡터.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 벡터.
10. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하고 상기 다중클로닝부위에 리포터 유전자 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터 내 다중클로닝부위에 프로모터가 삽입된 벡터가 도입된 코리네박테리움을 배지 중에 배양하는 단계;
    상기 배양물에서 상기 리포터 유전자 산물을 측정하는 단계; 및
    상기 측정결과로부터 상기 프로모터의 전사유도 활성을 확인하는 단계를 포함하는, 프로모터 활성을 확인하는 방법.
11. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 다중클로닝부위 서열을 포함하고 상기 다중클로닝부위에 구성적 프로모터, 3'UTR, 및 전사종결자가 작동 가능하게 연결되어 있는 벡터 내 다중클로닝부위에 유전자가 삽입된 벡터가 도입된 코리네박테리움을 배지 중에 배양하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 상기 유전자 산물을 분리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움으로부터 유전자 산물을 생산하는 방법.
12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 코리네박테리움은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 방법.
13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 벡터를 갖는 대장균.
14. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 벡터를 갖는 코리네박테리움.

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