CN114807198B - 带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。通过将抗生素筛选标记和可视化蛋白进行融合，由同一个启动子驱动，成功构建了一种载体大小更小、转化率更高的新的带有可视化蛋白标记的CRISPR/Cas9载体，并成功将该CRISPR/Cas9载体用于构建了番茄SlD14基因的基因编辑载体，最终培育出表型与野生番茄表型明显不同的转基因番茄植株，证明了该CRISPR/Cas9载体的有效性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的 CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统作为细菌的获得性免疫系统，已经被人们研究改造成了一种快速、高效的基因编辑技术，无论在动物还是植物中均取得了较为可观的成果。CRISPR/Cas9技术已经成为了人们探究基因功能，改造基因的主要的分子工具。特别是将其应用到植物领域，使我们能够更加快速地、准确地改良农作物得到我们想要的性状。
目前，世界上已经开发出许多适用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9系统。但是目前在作物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑育种，大部分作物仍然需要通过组培转化将CRISPR/Cas9组件插入植物基因组，在转化过程中需要加入抗生素(卡那霉素、潮霉素、除草剂等)进行筛选，获得稳定的转基因株系后，CRISPR/Cas9组件可对目的基因进行突变。在获得再生植株后，筛选阳性转基因植株主要通过提取组培转化的再生植株DNA，通过扩增CRISPR/Cas9组件中的核苷酸序列来实现，存在工作量大而繁琐，后期筛选基因突变体周期长而困难等问题。
研究人员尝试了利用基因枪和纳米颗粒将Cas9蛋白和gRNA直接导入植物细胞中或利用农杆菌介导的转基因瞬时表达Cas9蛋白和gRNA等方法，来避免Cas9基因等原件整合至基因组中，从而获得非转基因的基因编辑植株。但上述方法发生基因编辑的效率较低，且需要使用高通量的方法来鉴定编辑植株，成本非常高。研究人员也尝试在CRISPR/Cas9 组件中除了抗生素筛选标记外，还插入可视化的标记蛋白如GFP、GUS、mCherry、花青素等筛选阳性转基因植株，从而不用通过提取DNA后的PCR，就可鉴定阳性植株，达到减少筛选工作量的目的。由于植物的抗性筛选标记和可视化的标记蛋白基因由不同启动子驱动，使转化载体过大，因此可能会影响转化效率。
发明内容
本发明将抗生素筛选标记和可视化蛋白标记进行融合，由同一个启动子驱动，从而减小了载体大小，有益于提高转化效率；并通过对番茄SlD14基因进行突变，成功获得了SlD14基因突变体，证明了载体的有效性，因此，本发明提供的可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体，在CRISPR/Cas9基因编辑中具有很好的应用前景。
为了达到上述目的，本发明中提供了一种制备带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的 CRISPR/Cas9载体的方法，包括以下步骤：
S1、以含有可视化蛋白的编码基因和抗生素抗性基因的第一载体为模板，设计第一对引物，扩增所述可视化蛋白和抗生素抗性基因的核苷酸序列；以含有Cas9蛋白、Ubi启动子和Nos终止子的核苷酸序列的第二载体为模板，设计第二对引物，扩增Ubi-Cas9-Nos核苷酸序列；
S2、使用第一限制性内切酶对第三载体进行酶切，去除抗生素抗性基因，使其线性化并回收片段，将回收的片段与步骤S1中扩增后的可视化蛋白和抗生素抗性基因的核苷酸序列进行Infusion连接，将连接产物转化到第一感受态细胞中，挑取单克隆培养后进行测序，得到第四载体；
S3、使用第二限制性内切酶对所述第四载体进行酶切，使其线性化并回收片段，将回收的片段与步骤S1中扩增的Ubi-Cas9-Nos核苷酸序列进行Infusion连接，将连接产物转化到第二感受态细胞中，挑取单克隆培养后进行测序，得到所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体。
根据本发明的技术方案，步骤S1中，所述第一载体中只要同时含有可视化蛋白的编码基因和抗生素的抗性基因序列即可用于本发明的技术方案中。在一些可选的实施方案中，可视化蛋白选自β-葡萄糖苷酸酶(GUS蛋白)、GFP(绿色荧光蛋白)、DsRed(红色荧光蛋白)、mCherry红色荧光蛋白、YFP(黄色荧光蛋白)等中的一种；抗生素抗性基因选自抗卡那霉素(KanR)的基因、抗氨苄青霉素(Ampr)的基因、抗四环素(Tetr)的基因、抗链霉素(Strr)的基因、抗氯霉素(Cmlr)的基因等中的一种；优选可视化蛋白为β- 葡萄糖苷酸酶，抗生素抗性基因为新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因。所述第二载体中只要同时含有Cas9蛋白、Ubi启动子和Nos终止子的核苷酸序列即可用于本发明的技术方案中。在一些可选的实施方案中，所述第二载体选自pYLCRISPR-Cas9Pubi-H、 pYLCRISPR-Cas9Pubi-B、pYLCRISPR-Cas9Pubi-N等载体中的一种；当所述第二载体为pYLCRISPR-Cas9Pubi-H载体时，所述第二对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
在可选的实施方案中，所述第一载体为0380-GN载体，所述第一对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
在可选的实施方案中，步骤S2中，所述第三载体的种类不同，其携带的抗生素抗性基因可能相同可能不同，相对应地，所使用的第一限制性内切酶的种类也可能相同可能不同；进而制备出的第四载体的核苷酸序列也不相同。所述第二限制性内切酶的种类与所述第四载体相对应，所述第四载体的核苷酸序列不同时，使用的第二限制性内切酶的种类也不同。当所述第三载体为pCAMBIA2300载体时，所述第一限制性内切酶为Xho I，去除的是NeoR/KanR抗性基因；所述第二限制性内切酶为KpnI和EcoRI。
根据本发明的技术方案，所述第一感受态细胞和所述第二感受态细胞可以相同也可以不同。在一些可选的实施方案中，所述第一感受态细胞和所述第二感受态细胞均为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
本发明还提供了根据上述技术方案制备的带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的 CRISPR/Cas9载体，在可选的实施方案中，所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
根据本发明中的技术方案制备的带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9 载体，经过验证，可用于构建基因编辑载体。在可选的实施方案中，已成功构建了番茄SlD14 基因的基因编辑载体。
使用本发明中制备的带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体构建番茄SlD14基因的基因编辑载体的方法，包括以下步骤：
P1、在SlD14基因的外显子上设计如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的2个靶序列；
P2、合成如SEQ ID No.9所示的sgRNA序列，将其插入到所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到所述番茄SlD14基因的基因编辑载体；所述sgRNA序列包含AtU3d和AtU3b启动子以及2个所述靶序列。
将通过上述方法构建的番茄SlD14基因的基因编辑载体进行测序，将经过测序确认为正确的SlD14基因编辑载体转染到宿主细胞根癌农杆菌EHA105中，得到宿主细胞工程菌。使用该宿主细胞工程菌侵染番茄品种Micro-Tom的子叶外植体，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用GUS染色，筛选出阳性转基因番茄植株。将筛选出的阳性转基因番茄株系自交，种植自交后代，经PCR检测SlD14基因的突变情况，证实阳性转基因番茄植株中确实存在基因突变的靶点；播种八周后，对番茄表型进行分析，显示阳性转基因番茄植株与野生型番茄相比，表现出明显矮化表型和分枝增多的表型。这说明本发明构建的带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体能够成功构建基因编辑载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明构建了一种带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体，将抗生素筛选标记和可视化蛋白标记进行融合，由同一个启动子驱动，从而减小了CRISPR/Cas9载体大小，有益于提高转化效率，并且可简单地鉴定阳性植株，为筛选突变株系减少了工作量。本发明还使用该CRISPR/Cas9载体构建了番茄SlD14基因编辑载体，成功培育了番茄SlD14基因敲除的植株，通过基因测序和表型观察，结果表明本发明提供的带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体能够有效对番茄基因进行编辑，为基因编辑技术提供了一个新的CRISPR/Cas9载体。
附图说明
图1为本发明实施例1中SlD14基因敲除的靶点1(Taget1)和靶点2(Taget2)的序列图；
图2为本发明实施例1中合成的sgRNA序列图；
图3为本发明实施例1中对再生植株进行GUS染色的结果图；
图4为本发明实施例1中番茄纯合突变株系SlD14基因突变靶点的测序结果图；
图5为本发明实施例1中野生型番茄与SlD14基因突变体(sld14-1和sld14-2)的番茄矮化多分枝表型番茄植株。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例提供了一种构建带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体的方法，并将该载体用于构建番茄SlD14基因的基因编辑载体，最终成功培育出了番茄SlD14 基因敲除的植株。
1、构建带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体
S1、人工合成如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列，以0380-GN载体(由美国康涅狄格大学李义老师赠送)为模板，采用 Max Super-Fidelity DNAPolymerase 试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对GUS::NPTII核苷酸序列进行扩增；人工合成如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物序列，以pYLCRISPR-Cas9Pubi-H载体(由华南农业大学刘耀光老师赠送)为模板，采用/> Max Super-Fidelity DNAPolymerase试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)扩增UBI-Cas9-Nos核苷酸序列；扩增反应体系如下：2μL模板DNA，25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP Mix(10mMeach)，2μL上游引物(10μM)，2μL下游引物(10μM)，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，用ddH2O补至总体积为50μL；将前述反应体系涡旋混匀，进行PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性30s，随后按照95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3-7min，循环数35次，最后72℃彻底延伸3-5min；
S2、按照NEB公司XhoI内切酶试剂盒(购自南京伟沃生物科技有限公司)的说明书中的操作方法，使用限制性内切酶Xho I对pCAMBIA2300载体(由美国康涅狄格大学李义老师赠送)进行酶切，去除NeoR/KanR抗性筛选标记，使其线性化并采用AXYGEN DNA 凝胶回收试剂盒(购自南京寿德生物科技有限公司)回收约7.8kb片段；按照ClonExpress II OneStep Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的说明书中的操作方法，将回收的片段与步骤S1中扩增后的GUS::NPTII核苷酸序列进行Infusion连接，将连接产物转到大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中，挑取单克隆培养后通过测序验证，得2300GN载体；测序工作由南京擎科生物科技有限公司完成；
S3、按照NEB公司的KpnI和EcoRI内切酶试剂盒的说明书中的操作方法，使用限制性内切酶KpnI和EcoRI对步骤S2中得到的2300GN载体进行酶切，使其线性化并采用 AXYGENDNA凝胶回收试剂盒(购自南京寿德生物科技有限公司)回收约7.8kb片段；按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的说明书中的操作方法，将回收的片段与步骤S1中扩增后的UBI-Cas9-Nos核苷酸序列进行Infusion连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中，挑取单克隆培养后通过测序验证，得到核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的pCRISPR/Pubi-Cas9-GN载体；测序工作由南京擎科生物科技有限公司完成。
2、利用pCRISPR/Pubi-Cas9-GN载体构建番茄SlD14基因的基因编辑载体并培育转基因番茄
2-1、利用pCRISPR/Pubi-Cas9-GN载体构建番茄SlD14基因的基因编辑载体
P1、利用CRISPR-P网站，在番茄SlD14基因(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)的外显子上设计2个靶序列，2个所述靶序列的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示(见图1)；
P2、将AtU3d启动子和AtU3b启动子连同包含2个所述靶序列的sgRNA序列 AtU3d-sgRNA1-AtU3b-sgRNA2(见图2，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)进行基因合成后，插入到pCRISPR/Pubi-Cas9-GN载体的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到SlD14基因编辑载体；所述sgRNA序列及其相应的启动子片段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；所述SlD14基因编辑载体由南京擎科生物科技有限公司测序确认。
2-2、构建番茄SlD14基因突变材料并培育转基因番茄
将上述经测序确认正确的SlD14基因编辑载体转染到宿主细胞根癌农杆菌EHA105中，得到宿主细胞工程菌。将所述宿主细胞工程菌侵染番茄品种Micro-Tom的子叶外植体，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用GUS染色，筛选出阳性转基因番茄植株(即图3中从左往右数第一至第五个离心管中被染成蓝色的组培苗)。将筛选出来的阳性转基因番茄株系自交，种植自交后代。提取转基因番茄的DNA作为模板DNA，以如SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增包含靶点的序列，PCR扩增反应体系如下：2μL模板DNA，25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP Mix(10mMeach)，2μL上游引物(10μM)，2μL下游引物(10μM)，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，用ddH2O补至总体积为50μL；将前述反应体系涡旋混匀，进行PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性30s，随后按照95℃变性15s，55℃退火15s， 72℃延伸1min，循环数35次，最后72℃彻底延伸3-5min；将PCR扩增产物交由南京擎科生物科技有限公司测序后，分析SlD14基因的突变情况，突变番茄植株中sld14-1突变体在靶点1处有44bp的缺失和2bp替换，而在靶点2处具有1bp的缺失，突变体sld14-2 在靶点1处具有1bp的插入，靶点2处无变化(见图4所示)。将筛选出的dls14-1、dls14-2 突变体播种，八周后对表型进行比较分析，显示突变体sld14-1和sld14-2与野生型相比，表现出明显矮化表型和分枝增多的表型，如图5所示，图5中WT表示野生型番茄植株， sld14-1表示突变体sld14-1植株，sld14-2表示突变体sld14-2植株。
突变番茄植株的sld14-1突变体和sld14-2突变体中碱基序列的改变，以及最终成功种植出明显矮化和分枝增多的番茄植株，说明本发明中构建的pCRISPR/Pubi-Cas9-GN载体能够成功用于构建基因编辑载体，因而为基因编辑技术提供了一种新的更小的载体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta 60
ataaacgctc ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt 120
aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt 180
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 240
ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 300
acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg 360
atccccgggt acctctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc 420
gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa 480
aacccacctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt 540
caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact 600
ttattgccaa atgtttgaac gatcgggagg atcctacttc tttttcttag cctgtccggc 660
ctttttggtg gcagcaggac gcttatcacc accaagctgg gaaaggtcga tacgagtctc 720
gtaaagaccg gtgatggact ggtggatgag agtagcgtcg agaacctcct tggtggacgt 780
gtaacgcttc ctgtcgatgg tggtgtcgaa gtacttgaaa gcagcagggg cgccgaggtt 840
cgtgagcgtg aagaggtgga tgatgttctc ggcctgctcg cggatgggct tgtcgcggtg 900
cttgttgtag gcggagagga ccttgtcgag gttagcgtca gcgaggatga cgcgcttgga 960
gaactcggag atctgctcga tgatctcgtc gaggtagtgc ttgtgctgct ccacgaagag 1020
ctgcttctgc tcgttatcct caggggaacc cttgagcttc tcgtagtggg aggcgaggta 1080
gaggaagttc acgtacttgg aaggaagagc aagctcgtta cccttctgga gctcaccagc 1140
ggaagccagc atcctcttac gaccgttctc gagctcgaaa agagagtact tggggagctt 1200
gatgatgagg tccttcttga cctccttgta gcccttggcc tcgaggaagt cgatcgggtt 1260
cttctcgaag gaggagcgct ccatgatggt gatgccgagg agctccttga cggacttgag 1320
cttcttcgac ttacccttct ccaccttggc gaccacgagg acggagtagg cgacagtagg 1380
ggagtcgaaa ccaccgtact tcttagggtc ccaatccttc ttcctagcga tgagcttgtc 1440
cgagtttctc tttggaagga tagactcctt ggagaagcca ccggtctgga cctcggtctt 1500
cttgacgatg ttaacctgag gcatagaaag gaccttgcga acagtagcga agtcgcgacc 1560
cttgtcccaa acgatctcac cagtctcacc gttcgtctcg ataagagggc gcttgcggat 1620
ctcgccgttg gcgagggtga tctcggtctt gaagaagttc atgatgttgg agtagaagaa 1680
gtacttggcg gtggccttgc cgatctcctg ctcggacttg gcgatcatct tacgaacgtc 1740
gtagaccttg tagtcaccgt agacgaactc ggactcaagc ttagggtact tcttgataag 1800
agcggtacca acgacagcgt taaggtaagc atcgtgagcg tggtggtagt tgttgatctc 1860
gcggaccttg tagaactgga agtccttgcg gaagtcggag acgagcttgg acttgagggt 1920
gatcaccttg acctcgcgga tgagcttgtc gttctcgtcg tacttggtgt tcatcctaga 1980
atcgaggatc tgagcaacgt gcttggtaat ctgcctcgtc tcaacaagct gcctcttgat 2040
gaaaccagcc ttgtcaagct cggaaaggcc acccctctca gccttcgtga ggttgtcgaa 2100
cttcctctgg gtaatgagct tagcgttgag aagctgcctc cagtagttct tcatcttctt 2160
gacaacctcc tcggaaggga cgttgtccga cttacccctg ttcttgtcgg acctcgtgag 2220
gaccttgttg tcgatggagt catccttaag gaaagactga ggaacaatgt ggtcgacgtc 2280
gtagtcagaa agcctgttga tgtcgagctc ctggtcaacg tacatatccc taccgttctg 2340
gaggtagtag aggtagagct tctcgttctg gagctgggtg ttctcgacag ggtgctcctt 2400
aaggatctga gaaccaagct ccttgatacc ctcctcaatc ctcttcatgc gctccctcga 2460
gttcttctga cccttctggg tagtctggtt ctcacgagcc atctcgatga cgatgttctc 2520
aggcttgtga cgacccataa ccttgacaag ctcatcgaca accttaacag tctgaaggat 2580
gcccttcttg atagcagggg aaccagcaag gttagcaatg tgctcgtgga gagagtcgcc 2640
ctgaccggac acctgagcct tctgaatatc ctccttgaag gtaagagagt catcgtggat 2700
gagctgcatg aagttcctgt tagcgaaacc atcagacttg aggaagtcga ggatagtctt 2760
gccgctctgc ttatccctga taccgttgat gagcttgcgg gagagcctac cccaaccggt 2820
gtaacggcga cgcttgagct gcttcataac cttgtcatcg aagagatgag cgtaagtctt 2880
gagcctctcc tcgatcatct ccctatcctc gaagagagta agagtgagga cgatgtcctc 2940
gaggatgtcc tcgttctcct cgttgtcgag gaagtccttg tccttgatga tcttgaggag 3000
atcgtggtag gtaccgagag aagcgttgaa acggtcctca acgccgctga tctcgacgga 3060
gtcgaagcac tcgatcttct tgaagtagtc ctccttgagc tgcttgacgg tgaccttgcg 3120
gttggtcttg aagaggaggt caacgatagc cttcttctgc tcgccggaga ggaaggcagg 3180
cttgcgcata ccctcggtga cgtacttgac cttggtgagc tcgttgtaga ccgtgaagta 3240
ctcgtagagg agggagtgct tggggaggac cttctcgttg gggaggttct tgtcgaagtt 3300
ggtcatgcgc tcgatgaagg actgggcgga agcacccttg tcaacaacct cctcgaagtt 3360
ccaaggggtg atagtctcct cggacttcct agtcatccaa gcgaaacggg agttaccacg 3420
agcaagagga ccaacgtagt aaggaatacg gaaagtaagg atcttctcga tcttctcacg 3480
gttgtccttg aggaaagggt agaagtcctc ctgcctacga aggatggcgt gaagctcacc 3540
aaggtggatc tggtgaggga tagagccgtt atcgaaagtc ctctgcttcc taaggaggtc 3600
ctcacggtta agcttaacga gaagctcctc agtaccatcc atcttctcaa ggattggctt 3660
gatgaacttg tagaactcct cctggctagc tccaccgtca atgtaaccgg cgtagccgtt 3720
cttggactgg tcgaagaaga tctccttgta cttctcgggg agctgctgac gaacaagagc 3780
cttgaggagg gtgaggtcct ggtggtgctc gtcgtagcgc ttgatcatgg aagcagaaag 3840
aggagcctta gtgatctcag tgttaaccct aaggatatcc gaaaggagga tagcatcgga 3900
gaggttctta gcagcaagga agagatcagc gtactgatct ccaatctgag cgaggaggtt 3960
gtcgagatca tcgtcgtagg tatccttgga gagctgaagc ttagcgtcct cagcgaggtc 4020
gaagttggac ttgaagttag gggtcagacc gagggagaga gcgatgaggt taccgaaaag 4080
accgttcttc ttctcaccag ggagctgggc gatgaggttc tcgagacgcc tggacttgga 4140
gagcctagcg gaaaggatcg ccttagcgtc gacaccggaa gcgttgatag ggttctcctc 4200
gaagagctgg ttgtaggtct ggacgagctg gatgaagagc ttgtccacgt cggagttatc 4260
agggttaagg tcaccctcga taaggaagtg accacggaac ttgatcatgt gagcgagagc 4320
aaggtagatg agacgaagat cagccttatc agtagagtca acaagcttct tacgaaggtg 4380
gtagatagtg gggtacttct cgtggtaggc gacctcgtcg acgatgttgc cgaagatggg 4440
gtggcgctcg tgcttcttgt cctcctccac gaggaaggac tcctcgaggc ggtggaagaa 4500
ggagtcgtcg accttcgcca tctcgttgga gaagatctcc tggaggtagc agatgcggtt 4560
cttgcggcgg gtgtagcggc ggcgggcggt gcgcttgagg cgggtcgcct ccgccgtctc 4620
gccggagtcg aagaggaggg cgccgatgag gttcttcttg atggagtggc ggtcggtgtt 4680
gcccaggacc ttgaacttct tggacgggac cttgtactcg tcggtgatca ccgcccagcc 4740
gacgctgttg gtgccgatgt cgaggccgat ggagtacttc ttgtcagccg caggcacccc 4800
gtgaatacca accttccgct tcttcttagg agccatctgc agaagtaaca ccaaacaaca 4860
gggtgagcat cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct 4920
aaaaaaatcc acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata 4980
attataaaac atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata 5040
gatgctgcat atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta 5100
tcctagatcg atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaagatgta tgacacacac 5160
atacagttcc aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa acagtattct actccgatct 5220
agaacgaatg aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac aaccaagcga acaaaaagca 5280
tctctgtata tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat acctatccta gatcgatatt 5340
tccatccatc atcttcaatt cgtaactatg aatatgtatg gcacacacat acagatccaa 5400
aattaataaa tccaccaggt agtttgaaac agaattctac tccgatctag aacgaccgcc 5460
caaccagacc acatcatcac aaccaagaca aaaaaaagca tgaaaagatg acccgacaaa 5520
caagtgcacg gcatatattg aaataaagga aaagggcaaa ccaaacccta tgcaacgaaa 5580
caaaaaaaat catgaaatcg atcccgtctg cggaacggct agagccatcc caggattccc 5640
caaagagaaa cactggcaag ttagcaatca gaacgtgtct gacgtacagg tcgcatccgt 5700
gtacgaacgc tagcagcacg gatctaacac aaacacggat ctaacacaaa catgaacaga 5760
agtagaacta ccgggcccta accatggacc ggaacgccga tctagagaag gtagagaggg 5820
gggggggggg aggacgagcg gcgtaccttg aagcggaggt gccgacgggt ggatttgggg 5880
gagatctggt tgtgtgtgtg tgcgctccga acaacacgag gttggggaaa gagggtgtgg 5940
agggggtgtc tatttattac ggcgggcgag gaagggaaag cgaaggagcg gtgggaaagg 6000
aatcccccgt agctgccgtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac 6060
gtctgccgct ccgccacgca atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc aacggtggag 6120
cggaactctc gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc tgcttcgctt 6180
ggcccgacgc gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc gacggcgttt 6240
aacaggctgg cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt tttaatttct 6300
taaagggtat ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt ctattttata tctaaattat 6360
taaataaaaa aactaaaata gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa aatagaataa 6420
aatagatgta ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc taaatggatg 6480
tactaataaa atggatgaag tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa aaaggagaac 6540
acatgcacac taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc aattgtcctt 6600
tagaccatgt ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa cactgatatt attgtagtac 6660
tatagattat attattcgta gagtaaagtt taaatatatg tataaagata gataaactgc 6720
acttcaaaca agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta gacatgcaat 6780
gctcattatc tctagagagg ggcacgacga attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 6840
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 6900
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 6960
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 7020
gaggcggttt gcgtattggc tagagcagct tgccaacatg gtggagcacg acactctcgt 7080
ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca 7140
acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat 7200
caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 7260
ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 7320
gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 7380
taacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga 7440
agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt 7500
ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta 7560
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 7620
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 7680
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 7740
ccactatcct tcgcaagacc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca 7800
cgctgaaatc accagtctct ctctacaaat ctatctctct cgagatgtta cgtcctgtag 7860
aaaccccaac ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg 7920
aaaactgtgg aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg 7980
ctgtgccagg cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca 8040
acgtctggta tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc 8100
tgcgtttcga tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg 8160
agcatcaggg cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga 8220
aaagtgtacg tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg 8280
gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta 8340
actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg 8400
atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg 8460
tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa 8520
ctggacaagg cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg 8580
aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc 8640
cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca 8700
aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat 8760
tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct 8820
accgtacctc gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca 8880
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aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc 9000
aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg 9060
tgatgtggag tattgccaac gaaccggata cccgtccgca agtgcacggg aatatttcgc 9120
cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa 9180
tgttctgcga cgctcacacc gataccatca gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc 9240
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aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg 9360
tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt 9420
gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac 9480
aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca 9540
agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac 9600
gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac cgcgcaggga ggcaaacaat gaatcaacaa 9660
ctctcctggc gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt gctaccgagc tcgagcttgg 9720
atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 9780
cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 9840
cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag 9900
cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 9960
ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 10020
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 10080
cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 10140
gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 10200
tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgtat gcccgacggc gaggatctcg 10260
tcgtgaccca cggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 10320
gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 10380
cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 10440
gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 10500
gactcgagtt tctccataat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttcct 10560
atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta 10620
aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccag 10680
atcccccgaa ttaattcggc gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta 10740
agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag 10800
ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagtccgg 10860
gacggcgtca gcgggagagc cgttgtaagg cggcagactt tgctcatgtt accgatgcta 10920
ttcggaagaa cggcaactaa gctgccgggt ttgaaacacg gatgatctcg cggagggtag 10980
catgttgatt gtaacgatga cagagcgttg ctgcctgtga tcaccgcggt ttcaaaatcg 11040
gctccgtcga tactatgtta tacgccaact ttgaaaacaa ctttgaaaaa gctgttttct 11100
ggtatttaag gttttagaat gcaaggaaca gtgaattgga gttcgtcttg ttataattag 11160
cttcttgggg tatctttaaa tactgtagaa aagaggaagg aaataataaa tggctaaaat 11220
gagaatatca ccggaattga aaaaactgat cgaaaaatac cgctgcgtaa aagatacgga 11280
aggaatgtct cctgctaagg tatataagct ggtgggagaa aatgaaaacc tatatttaaa 11340
aatgacggac agccggtata aagggaccac ctatgatgtg gaacgggaaa aggacatgat 11400
gctatggctg gaaggaaagc tgcctgttcc aaaggtcctg cactttgaac ggcatgatgg 11460
ctggagcaat ctgctcatga gtgaggccga tggcgtcctt tgctcggaag agtatgaaga 11520
tgaacaaagc cctgaaaaga ttatcgagct gtatgcggag tgcatcaggc tctttcactc 11580
catcgacata tcggattgtc cctatacgaa tagcttagac agccgcttag ccgaattgga 11640
ttacttactg aataacgatc tggccgatgt ggattgcgaa aactgggaag aagacactcc 11700
atttaaagat ccgcgcgagc tgtatgattt tttaaagacg gaaaagcccg aagaggaact 11760
tgtcttttcc cacggcgacc tgggagacag caacatcttt gtgaaagatg gcaaagtaag 11820
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actggggatc aagcctgatt gggagaaaat aaaatattat attttactgg atgaattgtt 12000
ttagtaccta gaatgcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 12060
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 12120
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 12180
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 12240
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 12300
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 12360
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 12420
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 12480
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 12540
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 12600
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 12660
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 12720
ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 12780
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tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 12960
ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 13020
acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 13080
gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 13140
aggcagggtg ccttgatgtg ggcgccggcg gtcgagtggc gacggcgcgg cttgtccgcg 13200
ccctggtaga ttgcctggcc gtaggccagc catttttgag cggccagcgg ccgcgatagg 13260
ccgacgcgaa gcggcggggc gtagggagcg cagcgaccga agggtaggcg ctttttgcag 13320
ctcttcggct gtgcgctggc cagacagtta tgcacaggcc aggcgggttt taagagtttt 13380
aataagtttt aaagagtttt aggcggaaaa atcgcctttt ttctctttta tatcagtcac 13440
ttacatgtgt gaccggttcc caatgtacgg ctttgggttc ccaatgtacg ggttccggtt 13500
cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgtgctatcc acaggaaaga gaccttttcg 13560
acctttttcc cctgctaggg caatttgccc tagcatctgc tccgtacatt aggaaccggc 13620
ggatgcttcg ccctcgatca ggttgcggta gcgcatgact aggatcgggc cagcctgccc 13680
cgcctcctcc ttcaaatcgt actccggcag gtcatttgac ccgatcagct tgcgcacggt 13740
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ccatctggct tctgccttgc ctgcggcgcg gcgtgccagg cggtagagaa aacggccgat 13860
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tgtgatctcg cggtacatcc aatcagctag ctcgatctcg atgtactccg gccgcccggt 13980
ttcgctcttt acgatcttgt agcggctaat caaggcttca ccctcggata ccgtcaccag 14040
gcggccgttc ttggccttct tcgtacgctg catggcaacg tgcgtggtgt ttaaccgaat 14100
gcaggtttct accaggtcgt ctttctgctt tccgccatcg gctcgccggc agaacttgag 14160
tacgtccgca acgtgtggac ggaacacgcg gccgggcttg tctcccttcc cttcccggta 14220
tcggttcatg gattcggtta gatgggaaac cgccatcagt accaggtcgt aatcccacac 14280
actggccatg ccggccggcc ctgcggaaac ctctacgtgc ccgtctggaa gctcgtagcg 14340
gatcacctcg ccagctcgtc ggtcacgctt cgacagacgg aaaacggcca cgtccatgat 14400
gctgcgacta tcgcgggtgc ccacgtcata gagcatcgga acgaaaaaat ctggttgctc 14460
gtcgcccttg ggcggcttcc taatcgacgg cgcaccggct gccggcggtt gccgggattc 14520
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ccgttcctcc acacatgggg cattccacgg cgtcggtgcc tggttgttct tgattttcca 14820
tgccgcctcc tttagccgct aaaattcatc tactcattta ttcatttgct catttactct 14880
ggtagctgcg cgatgtattc agatagcagc tcggtaatgg tcttgccttg gcgtaccgcg 14940
tacatcttca gcttggtgtg atcctccgcc ggcaactgaa agttgacccg cttcatggct 15000
ggcgtgtctg ccaggctggc caacgttgca gccttgctgc tgcgtgcgct cggacggccg 15060
gcacttagcg tgtttgtgct tttgctcatt ttctctttac ctcattaact caaatgagtt 15120
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gctgcaccgg aatcagcacg aagtcggctg ccttgatcgc ggacacagcc aagtccgccg 15480
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caaaccggcc aggatttcat gcagccgcac ggttgagacg tgcgcgggcg gctcgaacac 15960
gtacccggcc gcgatcatct ccgcctcgat ctcttcggta atgaaaaacg gttcgtcctg 16020
gccgtcctgg tgcggtttca tgcttgttcc tcttggcgtt cattctcggc ggccgccagg 16080
gcgtcggcct cggtcaatgc gtcctcacgg aaggcaccgc gccgcctggc ctcggtgggc 16140
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cgcaggcccg cgccggcctc ctggatgcgc tcggcaatgt ccagtaggtc gcgggtgctg 16500
cgggccaggc ggtctagcct ggtcactgtc acaacgtcgc cagggcgtag gtggtcaagc 16560
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gtgcagccgg ccgcgtgcag ttcggcccgt tggttggtca agtcctggtc gtcggtgctg 16680
acgcgggcat agcccagcag gccagcggcg gcgctcttgt tcatggcgta atgtctccgg 16740
ttctagtcgc aagtattcta ctttatgcga ctaaaacacg cgacaagaaa acgccaggaa 16800
aagggcaggg cggcagcctg tcgcgtaact taggacttgt gcgacatgtc gttttcagaa 16860
gacggctgca ctgaacgtca gaagccgact gcactatagc agcggagggg ttggatcaaa 16920
gtactttgat cccgagggga accctgtggt tggcatg 16957
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaatctat ctctctcgag atgttacgtc ctgtagaaac 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttattatgga gaaactcgag tcagaagaac tcgtcaagaa 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagaggatc cccgggtacc tctagtaaca tagatgacac 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaccatga ttacgaattc gtcgtgcccc tctctagaga 40
<210> 6
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgggtcaga cccttttaga tgctcttaac gttcgggtcg tcggttccgg cgaaagagtt 60
ttggttttag cccatggggt cggtaccgac caatccgctt ggaatcgaat tttacctttt 120
tttctccgag attaccgtgt tgttctgtac gaccttgtct gcgccggcag tgtaaatcct 180
gatttcttcg atttccgacg ttatacgaca cttgaccctt acgttgatga tcttctacat 240
attctcgatg ctcttgcaat cgatcgttgt tcctatgtcg gacactctgt ctccgccatg 300
atcggaattc tcgcttcgat tcgccgccct gaactcttct ctaaactcat cctcatcgga 360
gcttcgccca gattcttgaa tgatgaagac taccatggtg gatttgaact cggagaaata 420
gagaaagtgt tttcagcaat ggaggcaaat tatgaagcat gggtcaatgg ttttgccccg 480
ttagccgtcg gagccgacgt tccggcggct gtacgagaat tcagtagaac attgttcaat 540
atgagaccag acataacatt gtttgtgtca aggacagtat ttaatagtga catgaggggt 600
gttctaggtc ttgtgaaagt accatgtcat atttttcaga cagcaaggga ccactctgta 660
cccgcttcag tcgcgacgta tctaaagaac aaccttggtg ggtggaacac cgtgcattgg 720
ttgaatattg agggacattt gccacatctt agcgccccga atttattggc tcaagaacta 780
aggagggctc ttactcatag gtga 804
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctcatcgg agcttcgccc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcacggtgtt ccacccacca 20
<210> 9
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ataagcttat gatttctttt ttcttacgaa ttttgcgtcc cacatcggta agcgagtgaa 60
gaaataactg ctttatatat ggctacaaag caccattggt catcctcatc ggagcttcgc 120
ccgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 180
gtggcaccga gtcggtgctt ttttttttac tttaaatttt ttcttatgca gcctgtgatg 240
gataactgaa tcaaacaaat ggcgtctggg tttaagaaga tctgttttgg ctatgttgga 300
cgaaacaagt gaacttttag gatcaacttc agtttatata tggagcttat atcgagcaat 360
aagataagtg ggctttttat gtaatttaat gggctatcgt ccatagattc actaataccc 420
atgcccagta cccatgtatg cgtttcatat aagctcctaa tttctcccac atcgctcaaa 480
tctaaacaaa tcttgttgta tatataacac tgagggagca acattggtca gcacggtgtt 540
ccacccacca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 600
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<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttctacatat tctcgatgct c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctatgagtaa gagccctcct t 21
Claims (1)
1.一种带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体在构建矮化和分枝增多表型的番茄植株的应用，其特征在于，将所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体用于构建番茄SlD14基因的基因编辑载体，构建方法包括：
P1、在SlD14基因的外显子上设计如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的2个靶序列；
P2、合成如SEQ ID No.9所示的sgRNA序列，将其插入到所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体的SbfI和SmaI酶切位点之间，得到所述番茄SlD14基因的基因编辑载体；所述sgRNA序列包含AtU3d和AtU3b启动子以及2个所述靶序列；
所述带有可视化蛋白融合抗生素筛选标记的CRISPR/Cas9载体的序列如SEQ ID No.1所示；所述番茄SlD14基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
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