KR101925930B1

KR101925930B1 - Ｌ-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법

Info

Publication number: KR101925930B1
Application number: KR1020170093698A
Authority: KR
Inventors: 최향; 변효정; 문준옥; 김효진; 배현원; 이선영
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2019-02-26
Also published as: WO2019022375A1

Abstract

L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된, L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

Ｌ-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법 {Microorganisms producing L-lysine and process for producing L-lysine using the same}

본 출원은 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 형질전환된, L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아미노산을 생산하는 산업용 미생물의 경우, 탄소원의 유입부터 해당경로(glycolysis)를 거쳐 생합성 경로에 이르는 각 대사과정에서 목적으로 하는 L-아미노산 이외에 다양한 부산물이 생성하게 된다. 상기 경로 상에서 주요 분지점에 위치한 유전자 또는 부산물의 생성을 유발하는 유전자의 발현을 저해함으로써, 부산물의 생산을 줄여 L-아미노산의 생산을 증대시킬 수 있다.

L-라이신 생산의 경우, 해당경로에서는 DHA(1,3-dihydroxyacetone) 생성에 관여하는 DHAP(dihydroxyacetone phosphate) 포스파타아제 유전자 (hdpA), 글리세롤 생성에 관여하는 글리세롤 포스파타제 유전자 (gpp), 젖산 생성에 관여하는 락테이트 디하이드로게나제 유전자 (ldh), 초산 생성에 관여하는 피루베이트 디하이드로게나제 유전자 (poxB), 쓰레오닌 생성에 관여하는 호모세린 키나아제 유전자 (thrB), 분지쇄 아미노산의 전구체 생성에 관여하는 아세토하이드록산 신세이즈 유전자 (ilvBN) 등의 발현을 저해하여 부산물 생산을 줄일 수 있다. 또한, 피루베이트를 아세틸코에이로 전환하는데 관련된 피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1 유전자 (aceE), 아스파테이트로부터 호모세린을 생성하게 하는 호모세린 디하이드로게나제 유전자 (hom), 및 라이신의 전구체인 메조-2,6-디아미노피머레이트를 균체 합성에 이용하게 하는 유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가제 유전자 (murE)의 발현을 저해함으로써 라이신 생산을 증대시킬 수 있다 (도 2). 또한 피루베이트로부터 알라닌 생성에 관여하는 유전자의 발현을 저해함으로써 L-라이신 생산량을 증대시킬 수 있는데 이 중 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 유전자 (alaT)는 코리네박테리움 속 미생물에서 결손되었을 때 미생물의 생장을 약화시키는 것으로 보고되어 있다 (J.Marienhagen et al., AEM, p7457-7462, Dec. 2008).

일반적으로 미생물을 이용한 발효 공정 시 균체를 확보하는 생장기부터 목적 대사산물 및 부산물을 포함하는 생산물이 축적되기 시작하나, 생장이 멈춘 정지기에 상기 목적 대사산물 및 부산물이 본격적으로 생산되게 된다. 이러한 배경하에 본 발명자들은 부산물 생산은 감소시키되 미생물의 생장에 미치는 영향은 최소화하는, 향상된 L-라이신 생산 생산방법을 지속적으로 연구하여 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은 L-라이신 유도성 프로모터를 이용하여 목적 유전자의 전사가 저해되도록 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 일 양태는 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하는, L-라이신을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어 "프로모터"란 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상단(upstream)의 비해독된 핵산서열을 의미한다. 즉, 프로모터란 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.

본 출원에서 용어, "L-라이신 유도성 프로모터"는 라이신 농도에 의해 발현량이 조절되는 프로모터를 의미하는 것으로, 구체적으로 L-라이신의 농도가 증가할 때, 발현유도활성이 증가하는 프로모터를 의미한다. 구체적으로 L-라이신에 의해 유전자의 발현 활성이 증가되는 프로모터라면 본 출원의 L-라이신 유도성 프로모터에 제한없이 포함될 수 있다. 예를 들면 상기 L-라이신 유도성 프로모터는 NCgl1182 유전자의 프로모터 또는 NCgl1504 유전자의 프로모터일 수 있다. 상기 'NCgl1182' 및 'NCgl1504'는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현되고 아직까지 기능이 명확히 규명되지 않았다. 다만, 'NCgl1182'는 전자 전달 플라보단백질 베타-서브유닛(Electron transfer flavoprotein beta-subunit)의 기능이 추정되고 있고, 'NCgl1504'는 세포 내 철 대사(iron metabolism) 관련 유전자들의 전사를 조절하는데 관여한다고 추정되고 있다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"란 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid)나 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미한다.

본 출원에서 용어, "L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드"는 상기 L-라이신 유도성 프로모터의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 구체적으로, 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 프로모터의 하류의 서열 일부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 프로모터의 뉴클레오티드 서열에 추가적으로 해당 프로모터와 작동가능하게 연결된 오픈리딩프레임의 상류의 서열 일부가 포함될 수 있다. 상기 오픈리딩프레임의 상류의 서열 일부는 오픈리딩프레임의 N-말단으로부터 100개 이하의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 90개 이하의 뉴클레오티드 서열, 80개 이하의 뉴클레오티드 서열, 70개 이하의 뉴클레오티드 서열, 60개 이하의 뉴클레오티드 서열, 50개 이하의 뉴클레오티드 서열, 40개 이하의 뉴클레오티드 서열, 또는 30개 이하의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 구체적으로 상기 "L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드"는 NCgl1182 유전자의 프로모터 또는 NCgl1182 유전자의 프로모터와 이의 오픈리딩 프레임의 상류의 서열 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 NCgl1504 유전자의 프로모터 또는 NCgl1182 유전자의 프로모터와 이의 오픈리딩 프레임의 상류의 서열 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 75% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열이면서, L-라이신의 농도가 증가하는 경우, 증가된 발현유도활성을 가질 수 있다. 또한 이에 제한되지 않고 본 출원과 같이 목적 유전자의 하단에 역방향으로 도입되어 L-라이신의 농도가 증가할 때 목적 유전자의 발현을 약화시키는 뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

본 출원에서, 용어 "종결코돈(stop codon)"은 mRNA 상의 코돈 중 아미노산을 지정하지 않고 단백질 합성 과정이 끝났음을 알리는 신호로 작용하는 코돈으로, 예를 들어, UAA, UAG, UGA의 3가지가 일반적인 종결코돈으로 사용된다.

본 출원에서, 용어 "상단(또는 상류, upstream)"은 5' 방향을 말하며, 상기 용어 "하단(또는 하류, downstream))"은 3' 방향을 말한다.

상기 종결코돈 하단은 목적 유전자의 종결코돈의 3' 방향에 존재하는 유전체 서열을 의미할 수 있다. 예를 들면 상기 종결코돈 하단은 목적 유전자의 종결코돈과 목적 유전자의 3' 방향에서 가장 가깝게 존재하는 다른 유전자 사이일 수 있다. 또한 구체적으로 상기 종결코돈 하단은 목적 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이일 수 있다. 보다 구체적으로는 목적 유전자의 종결코돈 바로 뒤에 위치할 수 있다. 종결코돈은 3가지 DNA 서열(TAG, TAA, TGA) 중 하나일 수 있으며 종결코돈 하단의 프로모터 삽입 위치는 통상의 기술자라면 목적유전자의 종결코돈 하단에 해당하는 적절한 위치를 선택할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "전사종결자(transcription terminator)"는 GC 염기가 많이 존재하는 역반복 서열(inverted repeat sequence)을 말하며, 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성함으로써 유전자의 전사를 종결시킨다. 한편, 통상의 기술자는 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 종결코돈의 하단으로서 목적 유전자의 발현을 약화시키지만 다른 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않는 적절한 위치를 선택할 수 있다.

상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하는 L-라이신을 생산하는 미생물은 구체적으로, 상기 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적유전자의 종결코돈 하단에 도입되어 형질전환된 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 상기 세포 내로 본 출원의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서, 상기 미생물은 L-라이신 유도성 프로모터가 유전체 내 목적 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 것일 수 있다. 즉, 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 미생물의 염색체 내 목적 유전자의 종결코돈 하단에 도입되도록 형질전환될 때, 프로모터의 전사가 목적 유전자의 전사방향과 역방향으로 작동하도록 도입될 수 있다. 이로써 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 염색체로 도입되어 발현을 약화시키기 위한 목적 유전자의 전사 방향과 반대방향으로 전사를 개시 또는 매개하게 된다. 따라서 L-라이신의 농도가 높아졌을 때, 목적유전자의 전사방향으로 진행되는 RNA 폴리머라제 복합체와, 본 출원의 L-라이신 유도성 프로모터 유래의 RNA 폴리머라아제 복합체(RNA polymerase complex)가 역방향으로 진행되어, 전사과정 중 서로 충돌을 일으키게 됨에 따라 목표 유전자 발현이 약화될 수 있다. 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 유전체 내 도입은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다.

본 출원에서, 용어 '목적 유전자'는 탄소원으로부터 L-라이신을 생합성하는 경로의 분지점에 위치하는 유전자 또는 부산물 생성을 유발하는 유전자일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는, 라이신을 생합성하는 경로에서 탄소흐름이 분할되는 분지점에 위치하는 유전자 또는 라이신 이외의 부산물을 생합성하는 경로의 유전자일 수 있다. 예를 들면, 탄소원이 공급되어 포도당을 생성하고, 해당과정 및 TCA 회로 경로를 거쳐 최종적으로 라이신을 생성하는 경로에서, 탄소흐름이 분할되는 분지점 위치에 관련된 효소를 코딩하는 유전자, 부산물인 유기산 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 유전자, 기타 부산물의 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 목적 유전자는 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase: hom), DHAP 포스파타아제 (dihydroxy acetone phosphate phosphatase: hdpA), 글리세롤 포스파타제(glycerol phosphatase: gpp), 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: ldh), 피루베이트 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase: poxB), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (alanine aminotransferase: alaT), 피루베이트 디하이드로게나제 서브유닛 E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1: aceE), 유디피-엔-아세틸무라모일알라닐-디-글루타메이트-2,6-디아미노피머레이트 리가제(UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase: murE) 또는 아세토하이드록산 신세이즈(acetohydroxyacid synthase: ilvBN)를 코딩하는 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 출원에서 용어, "미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물일 수 있다.

본 출원의 미생물은 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium), 아쓰로박터 (Arthrobacter) 속 및 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속에 해당하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) 및 이들로부터 제조된 돌연변이체 또는 균주 등일 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 에스케리키아속, 코리네박테리움속에 속하는 미생물 일 수 있으며, 가장 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원본 출원본 출원의 L-라이신을 생산하는 미생물은 천연형 균주 자체 또는 외부 라이신 생산 기작과 관련된 유전자가 도입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 라이신 생산능을 가지게 된 미생물을 의미한다.

본 출원의 다른 양태는 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하는, L-라이신 생산능을 가진 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물 및 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법을 제공한다.

본 출원의 L-라이신의 생산방법에서 상기 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하는, L-라이신 생산능을 가진 미생물은 상기한 바와 같다.

상기 미생물의 배양은 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 있다. 배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다.　배양기간은 원하는 목적 물질의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

본 출원의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 출원에서, 상기 용어 "배양 단계"는 배지 조제 시기 및 배양 중 시기 모두 포함될 수 있다.

본 출원의 방법은 미생물 및 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 미생물 및 배지로부터 L-라이신을 회수하는 방법은, 본 출원의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용할 수 있다. 또한 상기 미생물 및 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계 방법은, 추가적으로 정제방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 및 이들의 방법을 조합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법을 사용하여 숙주 세포 또는 배지로부터 생산된 L-라이신을 수집, 회수 또는 분리할 수 있다.

본 출원의 다른 양태는 L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하여, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법을 제공한다.

본 출원에서 용어, 유전자 발현의 "약화"는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우, 일부 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우, 또는 발현이 되더라도 발현의 세기가 약화되어 활성이 약화된 경우를 의미한다.

본 출원의 재조합 미생물에 도입된 L-라이신 유도성 프로모터는 L-라이신의 농도에 따라 목적 유전자의 발현을 자율적으로 조절할 수 있다. 이에 따라, 본 출원의 재조합 미생물은 L-라이신이 고농도로 축적하기 전까지 생장에 탄소원을 효율적으로 활용하여 균체량을 증가시킬 수 있고, L-라이신 농도가 증가함에 따라 탄소원을 L-라이신 생산 증가에 활용할 수 있으므로, L-라이신의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 라이신 유도성 프로모터가 목적 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이에 목적 유전자의 전사방향과 역방향으로 작동하도록 도입되어 목적 유전자의 발현을 저해하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 코리네형 미생물의 라이신 생합성 경로를 나타낸다.
도 3은 라이신 농도별 각 유전자의 프로모터 세기를 비교하여 나타낸 그래프이다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이신 유도성 프로모터의 탐색 및 선정

1.1. 라이신 유도성 프로모터 탐색을 위한 균주의 배양 및 RNA 준비

라이신 농도에 의해 발현량이 조절되는 프로모터를 탐색하기 위해, KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받은, 대한민국 등록특허 제10-0159812호) 균주를 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이후 하기 조성을 갖는 종배지 또는 라이신 농도별 실험배지를 각각 13 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 13 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 다음 샘플1 (종배지)과 샘플2 (실험배지, 라이신 각 농도별 3세트) 로서 25 ml씩 표본을 채취하였다. 채취한 표본은 FastRNA®Pro(Mp bio) 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<실험배지 (pH 7.0)>

라이신-HCl 20~200g, 포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

1.2. 마이크로어레이 분석

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 약 3,000개의 유전자의 프로브를 제작하였고, 이를 Sephades G 50 컬럼을 이용해 정제하였다. 그 다음 Robotic Pin spotter(GeneMahines) 기기로 건조된 프로브를 슬라이드에 집적하여 마이크로어레이 칩을 제작하였다.

실시예 1.1.에서 준비한 샘플1과 샘플2 (라이신 농도별 3세트)의 RNA로부터 cDNA synthesis kit (PhileKorea)를 이용하여 cDNA를 제작하였다. 그 다음 Bioprime labeling Kit (Invitrogen)를 이용하여 샘플1의 cDNA는 Cy3로 표지하고, 샘플2의 cDNA는 Cy5로 표지하였다. Cy3 또는 Cy5로 표지된 cDNA를 혼성화 용액 (5X SSC, 0.1% SDS, 50% 포름아미드, 10 ㎍ 연어 정자(salmon sperm) DNA) 80 ㎕과 혼합하여 100℃에서 3분 동안 반응시켰다. 반응물을 상기 제작된 마이크로어레이 칩에 도포하여 42℃에서 16시간 동안 혼성화를 진행하였다. 혼성화가 완료된 마이크로어레이 칩은 세척 과정(1X SSC/0.2% SDS 4분, 0.1X SSC/0.2% SDS 5분, 및 0.1X SSC)을 수행한 다음, 즉시 건조시켰다.

Axon GenePix 4000B scanner (Axon Instruments)를 이용하여 마이크로어레이 슬라이드의 혼성화 사진을 찍고 GenePix Pro 6.0 프로그램 (Axon Instruments)을 이용하여 얻은 이미지를 분석하였다.

1.3. 라이신 유도성 프로모터의 선정

상기 실시예 1.2의 마이크로어레이 슬라이드의 혼성화 이미지 분석을 통해, 샘플1(종배지)과 비교했을 때 샘플2(라이신을 포함한 실험배지)에서 얻은 값이 2배 이상 높은 유전자 92종을 선별하였다. 92종 가운데 저해시키고자 하는 목적 유전자를 찾은 다음, 그 중 발현량이 가장 많은 유전자인 hom을 기준으로 했을 때, 샘플2에서 hom 보다 신호 세기가 높은 유전자 중에서 가장 높은 신호 세기를 가진 2종의 유전자를 최종적으로 선별하였다.

상기 선별된 높은 신호 세기를 나타내는 2종의 유전자는 염기서열 분석을 통하여 각각 NCgl1504, 및 NCgl1182인 것을 확인하였고, 이로써 선별된 유전자 NCgl1504 및 NCgl1182의 프로모터가 라이신 농도에 의해 발현이 증가하는 프로모터임을 알 수 있었다. 또한 통상 프로모터 영역에 해당하는 부위를 확인한 결과, 해당 프로모터의 염기서열은 서열번호 1과 2임을 확인하였다.

실시예 2. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 hdpA 유전자 발현 저해 균주 제작 및 도입된 프로모터 구조에 따른 라이신 생산 효과 확인

2.1. 라이신 유도성 프로모터를 포함하는 hdpA 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 균주의 염색체 상의 hdpA 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위한 기본 벡터로서 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)를 사용하였다. 보고된 염기서열에 근거하여 hdpA 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 5 내지 8)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 하여 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 1차 PCR 및 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용한 2차 PCR을 수행하여, hdpA가 포함된 오픈 리딩 프레임의 마지막 유전자인 NCgl1356의 하단부위를 약 600bp로 증폭하고, 증폭부위 중간에 SpeI 인식부위를 삽입하였다. 이 때, PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편 양쪽 말단을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 삽입하였다. 이를 대장균 DH5α에 도입한 후, 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체 배지에 도말하였다. 서열번호 5와 서열번호 8을 이용한 PCR 법을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 그 다음 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 획득된 플라스미드를 pDZ-hdpA-downstream이라 명명하였다.

NCgl1182 유전자의 프로모터 또는 NCgl1504 유전자의 프로모터의 삽입과 관련하여, 프로모터만 포함하는 형태와 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부를 포함하는 형태로 제작하여 비교하였다. NCgl1182 프로모터 (서열번호 9 및 10), NCgl1182 프로모터와 오픈 리딩 프레임 상단 57개의 뉴클레오티드 (서열번호 9 및 11), NCgl1504 프로모터 (서열번호 12 및 13), 및 NCgl1504 프로모터와 오픈 리딩 프레임 상단 39개의 뉴클레오티드 (서열번호 12 및 14) 영역을 각각 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 9 내지 14)를 합성한 다음, 이들을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해 각 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.

상기에서 PCR에 의해 증폭된 폴리뉴클레오티드들을 제한효소 SpeI으로 각각 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI으로 처리된 염색체 도입용 pDZ-hdpA-downstream 벡터에 삽입하였다. 그 다음 이를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환시키고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (NCgl1182 프로모터 부위는 서열번호 5와 9의 프라이머 사용, NCgl1504 프로모터 부위는 서열번호 5와 12의 프라이머 사용)을 통해 목적한 DNA 절편이 삽입된 벡터로 형질전환된 각 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 수득하였다. 수득된 플라스미드를 각각 pDZ-hdpA-LiCTS1-1, pDZ-hdpA-LiCTS1-2, pDZ-hdpA-LiCTS2-1, 및 pDZ-hdpA-LiCTS2-2이라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 hdpA 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터, NCgl1182 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부, NCgl1504 프로모터, NCgl1504 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부가 hdpA 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태로 제작된 것이다.

2.2. hdpA 유전자의 발현이 저해된 균주 제작

상기 제작된 플라스미드(pDZ-hdpA-LiCTS1-1, pDZ-hdpA-LiCTS1-2, pDZ-hdpA-LiCTS2-1 및 pDZ-hdpA-LiCTS2-2)의 효과를 확인하기 위해 상기 4종의 플라스미드를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. 그 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 hdpA 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 포함하는 DNA 절편이 도입된 총 4종의 재조합 균주를 얻었다. LiCTS1-1 또는 LiCTS1-2가 도입된 균주는 서열번호 15와 9의 프라이머, LiCTS2-1 또는 LiCTS2-2가 도입된 균주는 서열번호 15와 12의 프라이머를 이용하여 PCR 법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, 이들을 각각 KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-1, KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-2, KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-1 및 KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-2라고 명명하였다.

2.3. hdpA 유전자의 발현이 저해된 균주의 라이신 배양능 확인

제작된 4종의 균주 KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-1, KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-2, KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-1, 및 KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-2의 배양 특성을 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 각 균주를 배양한 후, 라이신 생산능과 배양액 성분을 분석하였다. 25 ㎖의 종 배지를 함유하는 250 ㎖의 코너-바플 플라스크에 대조군으로 사용된 KCCM11016P 균주 및 상기 제작된 4종의 균주를 각각 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양에 사용한 종배지 및 생산배지의 조성은 하기와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, 스펙티노마이신 200 mg (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g, 스펙티노마이신 200mg (증류수 1리터 기준)

배양 종료 후 HPLC에 의해 각 균주의 L-라이신 생산량 및 부산물을 측정하였다. KCCM11016P와 상기 4종의 균주에 대한 배양물 중의 L-라이신 및 부산물 측정 결과는 아래 표 1과 같다.

균주	부산물		라이신
균주	목록	평균 ^* (g/L)	평균 ^* (g/L)
KCCM11016P	DHA	0.40	43.1
KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-1		0.38	43.2
KCCM11016P::hdpA-LiCTS1-2		0.35	43.4
KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-1		0.32	43.5
KCCM11016P::hdpA-LiCTS2-2		0.30	43.5

* 3 batch 평균값

표 1에서 나타낸 바와 같이, 제작된 4종의 균주들은 대조군(KCCM11016P)과 비교하였을 때 L-라이신의 생산 수율이 0.1~0.3g/L 증가하고, 부산물 생산량이 5~14% 감소하였다. 이를 통해 목적 유전자인 hdpA의 발현억제를 통한 라이신 농도 증가를 확인할 수 있었다. 한편 프로모터 또는 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부를 포함한 단편을 도입하여 목적 유전자 발현을 억제한 경우를 서로 비교해보면, 프로모터의 서열만을 도입한 경우 보다 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부를 모두 포함한 서열의 폴리뉴클레오티드를 도입한 경우가 배양액 중 라이신의 농도가 높았고, 부산물인 DHA 감소량도 더 큰 것을 확인하였다. 따라서 라이신 생합성에 관련된 다른 목적 유전자 발현 억제 벡터도 프로모터와 오픈 리딩 프레임 일부의 서열을 포함한 형태로 제작하였다. 이하, 하기 실시예에서 기재된 "NCgl1182 프로모터" 또는 "NCgl1504 프로모터"는 달리 지시하지 않는 한 각각 "NCgl1182의 프로모터와 오픈 리딩 프레임 상단의 상단 57개의 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드"와 "NCgl1504의 프로모터와 오픈 리딩 프레임 상단 39개의 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드"를 가리킨다.

실시예 3. 라이신 유도성 프로모터를 이용하여 다양한 유전자의 발현이 저해된 균주 제작 및 이의 생산능 확인

3.1. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 gpp 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 gpp 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 프라이머 (서열번호 16 내지 19)를 합성하여 gpp 유전자의 하단부위를 약 800bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편 양쪽 말단을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결해 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 서열번호 16과 서열번호 19를 이용한 PCR법을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-gpp-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1.과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-gpp-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 16과 서열번호 9 및 서열번호 16과 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 각각 pDZ-gpp-LiCTS1 및 pDZ-gpp-LiCTS2 라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 gpp 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 gpp 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.2. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 ldh 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 ldh 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, pDZ 벡터를 기본 벡터로 사용하였다. 보고된 염기서열에 근거하여 ldh 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 20 내지 23)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 ldh 유전자의 하단부위를 약 800bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 20 및 23)을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-ldh-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-ldh-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 20와 서열번호 9 및 서열번호 20와 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ldh-LiCTS1 및 pDZ-ldh-LiCTS2라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 ldh 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 ldh 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.3. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 poxB 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 poxB 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 poxB 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 24 내지 서열번호 27)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 poxB 유전자의 하단부위를 약 600bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 24 및 27)을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-poxB-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-poxB-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 24와 서열번호 9, 및 서열번호 24와 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-poxB-LiCTS1 및 pDZ-poxB-LiCTS2 라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 poxB 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 poxB 유전자의 전사방향의 역방향으로 도입된 형태이다.

3.4. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 alaT 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 alaT 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 alaT 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 28 내지 서열번호 31)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 alaT 유전자의 하단부위를 약 700bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 28 및 31)을 통해 목적한 alaT 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-alaT-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-alaT-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 28와 서열번호 9, 및 서열번호 28와 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 이로부터 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-alaT-LiCTS1 및 pDZ-alaT-LiCTS2 라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 alaT 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 alaT 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.5. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 aceE 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 aceE 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 aceE 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 32 내지 서열번호 35)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 aceE 유전자의 하단부위를 약 700bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SalI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SalI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 32 및 35)을 통해 목적한 aceE 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-aceE-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-aceE-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR(서열번호 32와 서열번호 9 및 서열번호 32와 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-aceE-LiCTS1 및 pDZ-aceE-LiCTS2라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 aceE 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 aceE 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.6. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 thrB 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 thrB 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 thrB 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 36 내지 서열번호 39)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 thrB 유전자의 하단부위를 약 700bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 EcoRI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 EcoRI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결해 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 36 및 39)을 통해 thrB 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-thrB-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-thrB-downstream 벡터에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 36와 서열번호 9, 및 서열번호 36와 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-thrB-LiCTS1 및 pDZ-thrB-LiCTS2이라 각각 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 thrB 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 상기 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.7. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 murE 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 murE 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 murE 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 40 내지 서열번호 43)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 murE 유전자의 하단부위를 약 800bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 XbaI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 XbaI말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 40 및 43)을 통해 murE 유전자 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-murE-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-murE-downstream 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR(서열번호 40과 서열번호 9 및 서열번호 40과 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-murE-LiCTS1 및 pDZ-murE-LiCTS2 라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 murE 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 상기 유전자의 전사방향의 역방향으로 작동하도록 도입된 형태이다.

3.8. 라이신 유도성 프로모터를 이용한 ilvBN 유전자 발현 저해 벡터 제작

코리네박테리움 염색체 상에서 ilvBN 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 삽입하기 위해, 보고된 염기서열에 근거하여 ilvBN 하단 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 44 내지 서열번호 47)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기 프라이머를 이용해 1차 PCR 및 2차 PCR을 수행하여 ilvBN 유전자의 하단부위를 약 800bp로 증폭하였다. PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 EcoRI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 EcoRI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 44 및 47)을 통해 ilvBN 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ilvBN-downstream라 명명하였다.

실시예 2.1과 같이 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터를 pDZ-ilvBN-downstream 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 44과 서열번호 9 및 서열번호 44과 서열번호 12)을 통해 상기 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ilvBN-LiCTS1 및 pDZ- ilvBN -LiCTS2 라 명명하였다. 상기 플라스미드는 각각 ilvBN 유전자의 하단에 NCgl1182 프로모터와 NCgl1504 프로모터가 상기 유전자의 전사방향의 역방향으로 도입된 형태이다.

3.9. 다양한 목적 유전자의 발현 저해 균주 제작

실시예 3.1. 내지 3.8.에서 제작한 벡터 16종(pDZ-gpp-LiCTS1, pDZ-gpp-LiCTS2, pDZ-ldh-LiCTS1, pDZ-ldh-LiCTS2, pDZ-poxB-LiCTS1, pDZ-poxB-LiCTS2, pDZ-alaT-LiCTS1, pDZ-alaT-LiCTS2, pDZ-aceE-LiCTS1, pDZ-aceE-LiCTS2, pDZ-thrB-LiCTS1, pDZ-thrB-LiCTS2, pDZ-murE-LiCTS1, pDZ-murE-LiCTS2, pDZ-ilvBN-LiCTS1, 및 pDZ-ilvBN-LiCTS2)을 각각 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질 전환하였다. 그 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 각 목적 유전자 하단에 NCgl1182 프로모터 또는 NCgl1504 프로모터가 도입된 총 16종의 재조합 균주를 얻었다. LiCTS1 균주 (NCgl1182 프로모터가 도입된 균주)는 서열번호 48 내지 55와 서열번호 9를, LiCTS2 균주 (NCgl1504 프로모터가 도입된 균주)는 서열번호 48 내지 55와 서열번호 12을 이용하여 PCR 법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, 분리된 균주를 각각 KCCM11016P::gpp-LiCTS1, KCCM11016P::gpp-LiCTS2, KCCM11016P::ldh-LiCTS1, KCCM11016P::ldh-LiCTS2, KCCM11016P::poxB-LiCTS1, KCCM11016P::poxB-LiCTS2, KCCM11016P::alaT-LiCTS1, KCCM11016P::alaT-LiCTS2, KCCM11016P::aceE-LiCTS1, KCCM11016P::aceE-LiCTS2, KCCM11016P::thrB-LiCTS1, KCCM11016P::thrB-LiCTS2, KCCM11016P::murE-LiCTS1, KCCM11016P::murE-LiCTS2, KCCM11016P::ilvBN-LiCTS1, 및 KCCM11016P::ilvBN-LiCTS2라 명명하였다.

3.10. 목적 유전자가 발현 저해된 균주들의 라이신 생산능 분석

KCCM11016P (대조군)와 실시예 3.9.에서 제작된 16종의 KCCM11016P::gpp-LiCTS1, KCCM11016P::gpp-LiCTS2, KCCM11016P::ldh-LiCTS1, KCCM11016P::ldh-LiCTS2, KCCM11016P::poxB-LiCTS1, KCCM11016P::poxB-LiCTS2, KCCM11016P::alaT-LiCTS1, KCCM11016P::alaT-LiCTS2, KCCM11016P::aceE-LiCTS1, KCCM11016P::aceE-LiCTS2, KCCM11016P::thrB-LiCTS1, KCCM11016P::thrB-LiCTS2, KCCM11016P::murE-LiCTS1, KCCM11016P::murE-LiCTS2, KCCM11016P::ilvBN-LiCTS1, 및 KCCM11016P::ilvBN-LiCTS2의 라이신 생산능 특성을 확인하기 위해 실시예 2.3과 동일한 방법으로 균주들을 각각 배양하고, 각 균주들의 라이신 생산능과 배양액 성분을 분석하였다.

균주	부산물		라이신
균주	목록	평균 ^* (g/L)	평균 ^* (g/L)
KCCM11016P	글리세롤	0.50	43.1
KCCM11016P::gpp-LiCTS1		0.40	43.5
KCCM11016P::gpp-LiCTS2		0.30	43.6
KCCM11016P	락테이트	1.80	43.1
KCCM11016P::ldh-LiCTS1		1.20	43.9
KCCM11016P::ldh-LiCTS2		1.20	44.0
KCCM11016P	아세테이트	1.50	43.1
KCCM11016P::poxB-LiCTS1		0.80	43.8
KCCM11016P::poxB-LiCTS2		0.70	43.9
KCCM11016P	알라닌	2.00	43.1
KCCM11016P::alaT-LiCTS1		0.80	44.5
KCCM11016P::alaT-LiCTS2		0.41	44.7
KCCM11016P	아세틸-CoA	0.50	43.1
KCCM11016P::aceE-LiCTS1		0.30	43.8
KCCM11016P::aceE-LiCTS2		0.20	44.0
KCCM11016P	쓰레오닌	1.00	43.1
KCCM11016P::thrB-LiCTS1		0.80	43.8
KCCM11016P::thrB-LiCTS2		0.45	44.1
KCCM11016P	무람산( Muramic acid)	0.30	43.1
KCCM11016P::murE-LiCTS1		0.10	43.8
KCCM11016P::murE-LiCTS2		0.10	44.0
KCCM11016P	발린	0.40	43.1
KCCM11016P::ilvBN-LiCTS1		0.22	43.5
KCCM11016P::ilvBN-LiCTS2		0.15	43.8

* 3 batch 평균값

표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 3.9.에서 제작된 16종의 신규 균주들은 대조군(KCCM11016P) 균주와 비교하였을 때, L-라이신 생산 수율이 최대 4% 증가하였고, 부산물 각각의 생산량은 최대 80% 감소하였다. 또한 각 목적 유전자 하단에 NCgl1504 프로모터가 도입된 LiCTS2 균주가 NCgl1182 프로모터가 도입된 LiCTS1 균주보다 라이신 수율이 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 다양한 라이신 생산 균주로부터 라이신 유도성 프로모터를 이용한 목적 유전자들의 발현이 저해된 통합 균주 제작 및 라이신 생산능 확인

4.1. hdpA , gpp , ldh , poxB , alaT , aceE , thrB , murE 및 ilvBN 유전자의 발현이 저해된 다양한 라이신 생산 균주 제작

다양한 라이신 생산능을 가지는 균주 KCCM11016P, KCCM10770P (대한민국 등록특허 제10-0924065호), KCCM11347P (상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 대한민국 등록특허 제10-0073610호) 및 CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 실시예 2 내지 10에서 제작한 9종의 벡터(pDZ-hdpA-LiCTS2-2, pDZ-gpp-LiCTS2, pDZ-ldh-LiCTS2, pDZ-poxB-LiCTS2, pDZ-alaT-LiCTS2, pDZ-aceE-LiCTS2, pDZ-thrB-LiCTS2, pDZ-murE-LiCTS2, 및 pDZ-ilvBN-LiCTS2)를 순차적으로 염색체 상에 형질 전환 후, 염색체 상의 각 목적 유전자 하단에 NCgl1504 프로모터가 도입된 4종의 균주를 수득하였다. 실시예 2 및 실시예 3에서 사용한 프라이머 (서열번호 15와 서열번호 48 내지 55)와 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 PCR 법으로 균주의 염색체 상의 9종의 목적 유전자 하단에 NCgl1504 프로모터가 도입된 콜로니를 선별하였다. 최종적으로 9종의 목적 유전자 하단에 NCgl1504 프로모터가 도입된 각 균주들을 KCCM11016P::9g-LiCTS2, KCCM10770P::9g-LiCTS2, KCCM11347P::9g-LiCTS2, 및 CJ3P::9g-LiCTS2 라고 각각 명명하였다.

4.2. 목적 유전자들 발현 저해 균주들의 라이신 생산능 분석

실시예 3.10.과 동일한 방법으로, 대조군 균주(모균주: KCCM11016P, KCCM10770P, KCCM11347P, 및 CJ3P)와 상기 실시예 4.1.에서 제작된 KCCM11016P::9g-LiCTS2, KCCM10770P::9g-LiCTS2, KCCM11347P::9g-LiCTS2, CJ3P::9g-LiCTS2를 각각 접종 및 배양하였다. 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.

* : 3 batch 평균값

표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다양한 라이신 생산 균주를 기반으로 제작된 신규 균주들은 대조군과 비교하여 라이신 생산 수율이 4 ~ 19% 증가하였고, 토탈 부산물 생성량이 14 ~ 64% 감소하였다.

이에 따라, 라이신 농도에 의해 발현이 유도되는 유전자의 프로모터를 목적 유전자의 전사 방향의 역방향으로 작동하도록 삽입하여 배양 중에 대사 경로 상의 주요 분지점에 위치한 목적 유전자의 발현을 선택적으로 저해시킴으로써, 부산물 생산을 줄여 L-라이신 생산을 증대시킬 수 있음을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12042P

20170626

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12043P

20170626

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Microorganisms producing L-lysine and process for producing L-lysine using the same <130> PN112767 <160> 55 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 233 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(233) <223> NCgl1182 <400> 1 gcgcctaaag ccgatgcaaa taaaattgcc ctggaaattg tgcacatcgc gctggattgc 60 ttagtctgtt ctatatagac tggtttgtct gtcagcgcgt gtgtttataa agttgcgtga 120 aaaccgacgg taggtaggcg tcgaaaagca atgggcgaag cccgcgtagt atgggcgggc 180 aacgctaaaa gcgccaaaaa cgccaaaaat cgtgaattga aaggtgagtg tgg 233 <210> 2 <211> 120 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(120) <223> NCgl1504 <400> 2 tgatgatttt tctacgtcta tttgcgctgg taggggggaa gggattggac acgggaatgg 60 aattagggaa cacttgtgtt gtctaaaggt gaaagctaaa tcaagcagga ggtgacacca 120 120 <210> 3 <211> 290 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(290) <223> NCgl1182_ORF <400> 3 gcgcctaaag ccgatgcaaa taaaattgcc ctggaaattg tgcacatcgc gctggattgc 60 ttagtctgtt ctatatagac tggtttgtct gtcagcgcgt gtgtttataa agttgcgtga 120 aaaccgacgg taggtaggcg tcgaaaagca atgggcgaag cccgcgtagt atgggcgggc 180 aacgctaaaa gcgccaaaaa cgccaaaaat cgtgaattga aaggtgagtg tggatgtcca 240 caatcgtggt tctggttaaa aatgttccag acacctggtc taagaggact 290 <210> 4 <211> 159 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(159) <223> NCgl1504_ORF <400> 4 tgatgatttt tctacgtcta tttgcgctgg taggggggaa gggattggac acgggaatgg 60 aattagggaa cacttgtgtt gtctaaaggt gaaagctaaa tcaagcagga ggtgacacca 120 gtgggagatg ttgtaaaagg caacgacgcg cacaccgga 159 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgcgtcgacc gacaccctgg tcatttc 27 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hdpA primer <400> 6 ttaaaaacta gtaatagtgt ttaagacaat gcg 33 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hdpA primer <400> 7 actattacta gtttttaacc actcacgaaa g 31 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hdpA primer <400> 8 cgcgtcgacc ccaagggctc aaaagatt 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1182 primer <400> 9 cgcactagtg cgcctaaagc cgatgcaa 28 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1182 primer <400> 10 cgcactagtc cacactcacc tttcaattca 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1182 ORF primer <400> 11 cgcactagta gtcctcttag accaggtgtc t 31 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1504 primer <400> 12 cgcactagtt gatgattttt ctacgtc 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1504 primer <400> 13 cgcactagtt ggtgtcacct cctgcttgat 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1504 ORF primer <400> 14 cgcactagtt ccggtgtgcg cgtcgtt 27 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 15 cagagacact gcgagat 17 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gpp primer <400> 16 cgcgtcgaca aggccctcga gatcc 25 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gpp primer <400> 17 gtcgaactag tataatttca ctccccca 28 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gpp primer <400> 18 aattatacta gttcgactaa tatcctc 27 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gpp primer <400> 19 cgcgtcgact tggaatctcc acg 23 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldh primer <400> 20 cgcgtcgacc tggacaaaga cccaga 26 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldh primer <400> 21 tgaaacacta ctagttgcgt cgccaactag gcg 33 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldh primer <400> 22 tggcgacgca actagtagtg tttcattgga a 31 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldh primer <400> 23 cgcgtcgacg ggcctgcact gctggt 26 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poxB primer <400> 24 cgcgtcgaca tgctgctggg tgagctt 27 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poxB primer <400> 25 actagtacta gttcatggag taggaata 28 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poxB primer <400> 26 actagtacta gttgattgat acacctgct 29 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poxB primer <400> 27 cgcgtcgact caattctgaa gcagtc 26 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaT primer <400> 28 cgcgtcgact ggcatggacg aaactcaa 28 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaT primer <400> 29 aaatccacta gttgagattc gtggtgaatc c 31 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaT primer <400> 30 atctcaacta gtggattttt gagattcgtg gtg 33 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaT primer <400> 31 cgcgtcgacg acctgacata ccttgattg 29 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE primer <400> 32 cgcgtcgacc gtaacaaggc acagct 26 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE primer <400> 33 actagtacta gttttatctg tcccttg 27 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE primer <400> 34 actagtacta gttcccgccg ccagacgt 28 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceE primer <400> 35 cgcgtcgaca gcgtcaggca ttga 24 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrB primer <400> 36 cgcgaattca cgtgtcccgc gttgcagtga 30 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrB primer <400> 37 agggggccta ctagttcctt gttgggccta aggtt 35 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrB primer <400> 38 aacaaggaaa ctagtaggcc cccttcgaat caaga 35 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrB primer <400> 39 cgcgaattct gggcacacgt catgggcatt a 31 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murE primer <400> 40 cgctctagat gatgagggac aagacttcc 29 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murE primer <400> 41 actagtacta gtctatcctt cttccgta 28 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murE primer <400> 42 actagtacta gtgccacagt catgatcaca 30 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murE primer <400> 43 cgctctagac caagctcatt gttaaacg 28 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvBN primer <400> 44 cgcgaattcc aagctgatcc ccgtgctca 29 <210> 45 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvBN primer <400> 45 acgatggtga tcatggaaat ctcatatgtg caatcagatt aattgctg 48 <210> 46 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvBN primer <400> 46 atggggatcc gccgagcttt tcacatatgc ctgctgcata aatgtgact 49 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvBN primer <400> 47 cgcgaattcc tttgccttct ctgcggact 29 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 48 ccgcctcacc ccggagct 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 49 gacagcggat tcgacggc 18 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 50 gttgctgcaa caatcga 17 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 51 gacaagcgca aaacct 16 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 52 gagatcgcac acctggttc 19 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 53 tggttaaagc tattcgtgct g 21 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 54 tcttccaggt gcgttca 17 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LiCTS1 LiCTS2 primer <400> 55 aatcatgctg gttaaggtct c 21

Claims

L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 종결코돈 하단에 위치하는, L-라이신을 생산하는 미생물로서,
상기 프로모터는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 미생물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 L-라이신 유도성 프로모터가 목적 유전자의 전사방향과 역방향으로 작동하도록 도입된 것인, L-라이신을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 종결코돈 하단은 상기 목적 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이인 것인, L-라이신을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 목적 유전자는 라이신을 생합성하는 경로에서 탄소흐름이 분할되는 분지점에 위치하는 유전자 또는 라이신 이외의 부산물을 생합성하는 경로의 유전자인, L-라이신을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 목적 유전자는 hom, hdpA, gpp, ldh, poxB, alaT, aceE, thrB, murE, 및 ilvBN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, L-라이신을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 것인, L-라이신을 생산하는 미생물.
제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, L-라이신을 생산하는 미생물.
청구항 1 및 4 내지 9 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 미생물 및 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법.
L-라이신 유도성 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 목적 유전자의 종결코돈 하단에 도입하여, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법으로서,
상기 프로모터는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 방법.
삭제
제11항에 있어서, 상기 L-라이신 유도성 프로모터가 목적 유전자의 전사방향과 역방향으로 작동하도록 도입된 것인, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 종결코돈 하단은 상기 목적 유전자의 종결코돈과 전사종결자 상단의 사이인 것인, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 목적 유전자는 라이신을 생합성하는 경로에서 탄소흐름이 분할되는 분지점에 위치하는 유전자 또는 라이신 이외의 부산물을 생합성하는 경로의 유전자인, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 목적 유전자는 hom, hdpA, gpp, ldh, poxB, alaT, aceE, thrB, murE, 및 ilvBN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 목적유전자의 발현을 약화하는 방법.