BR112014016748B1

BR112014016748B1 - Microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico e um método para a produção de ácido quinolínico utilizando o mesmo

Info

Publication number: BR112014016748B1
Application number: BR112014016748-6A
Authority: BR
Inventors: Yong Uk Shin; So Young Kim; In Kyung Heo; Ju Eun Kim; Sung Kwang Son; Jae Hee Lee; Ji Hyun Lee; Chang Gyeom Kim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-03
Publication date: 2022-04-19
Also published as: ES2656892T3; CN104160015B; WO2013103246A3; KR20130080944A; EP2801612B1; MY171877A; US9534240B2; US20150037850A1; CN104160015A; KR101359844B1; BR112014016748A2; WO2013103246A2; EP2801612A2; EP2801612A4

Abstract

MICRORGANISMO RECOMBINANTE PRODUTOR DE ÁCIDO QUINOLÍNICO E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO QUINOLÍNICO UTILIZANDO O MESMO. A presente invenção diz respeito a um microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico, o qual expressa uma proteína de fusão de L- aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador, e diz respeito também a um método para a produção de ácido quinolínico em que aquele é utilizado.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da invenção

[001] A presente invenção diz respeito a um microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico e a um método para a produção de ácido quinolínico utilizando o mesmo.

Descrição da técnica afim

[002] O ácido quinolínico, também designado por ácido 2,3-piridina- dicarboxílico, tem uma grande variedade de aplicações como precursor de compostos químicos sintéticos para a produção de produtos químicos medicinais ou agrícolas, corantes e não só.

[003] O ácido quinolínico pode ser preparado por métodos de síntese químicos ou biológicos. Devido à utilização de materiais não renováveis, provenientes do petróleo, enquanto matéria-prima, os métodos de síntese química são bastante influenciados por problemas ambientais, pelos preços do petróleo ou pelos custos unitários da extração do petróleo.

[004] Como exemplo de um método representativo da síntese biológica descreve-se um método para a produção de ácido quinolínico em uma estirpe de E.coli em que a expressão de genes que codificam L-aspartato-oxidase (NadB) e quinolinato-sintase (NadA) é reforçada pela clonagem de um plasmídeo que tem diferentes números de cópias dos dois genes em E.coli, cuja atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase é eliminada (Eur. J. Biochem. 175, 221-228 (1988), DE3826041). Nestas circunstâncias, a concentração do ácido quinolínico produzido é pequena, sendo de 500 mg/L ou inferior. A primeira razão para esta fraca produção de ácido quinolínico é a supressão transcricional pelo NadR, que é um repressor transcricional conotado com nAD, de nadB, que codifica L-aspartato-oxidase, e de nadA, que codifica quinolinato-sintase. A segunda razão é a inibição da autorregulação de L-aspartato-oxidase, a proteína NadB, pelo NAD. E a terceira razão é um circuito fraco de biossíntese, a partir de fontes de carbono, de ácido L-aspártico em E.coli.

[005] Para a resolução da primeira razão, na patente de invenção coreana n° 10-2012-0082673 aberta à discussão pública, utilizou-se uma estripe de um microrganismo para aumentar a orodução de ácido quinolínico até 5,5 g/L, em que as regiões promotoras de L-aspartato-oxidase (NadB) e de quinolinato- sintase (NadA), que são os genes da síntese de quinolinato suprimidos ao nível transcricional, foram substituídas por um promotor constitutivo, tendo sido reforçado o circuito de biossíntese do ácido L-aspártico.

[006] O circuito de biossíntese de ácido quinolínico a partir de ácido L- aspártico por um método biológico de síntese é o que está indicado no esquema de reação seguinte: 1) L-aspartato-oxidase (NadB) ácido L-aspártico + oxigênio <=> peróxido de hidrogênio + a- iminossuccinato + H+ 2) quinolinato-sintase (NadA) a-iminossuccinato + fosfato de di-hidroxiacetona <=> ácido quinolínico + fosfato + 2H2G

[007] O composto a-iminossuccinato, enquanto intermediário do circuito de biossíntese do ácido quinolínico, é uma substância instável, sendo convertido em oxaloacetato por meio de uma reação de desaminação natural nas células (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 257, No. 2, edição de 25 de Janeiro, pp. 626-632, 1982). Em geral, quando se utiliza como substrato um metabolito intermediário instável, a baixa frequência de colisão entre 0 substrato e a enzima produz uma grande quantidade de subprodutos. No entanto, até ao momento presente, não houve nenhuma tentativa para resolver 0 problema mencionado supra, relacionado com a produção do ácido quinolínico.

[008] Por outro lado, foi já utilizada uma tecnologia com proteínas de fusão, que consiste em ligar enzimas ou proteínas heterogéneas por meio de um ligador aminoácido, para expressão sob a forma de uma proteína única, com o intuito de se alcançar diversos fins, por exemplo, aumentar o nível de expressão de proteínas, mediante a ligação de uma proteína que manifeste um fraco nível de expressão com uma proteína que manifeste um elevado nível de expressão, aumentar o rendimento de purificação de proteínas, mediante a preparação de uma proteína de fusão associada a um identificador, ou para outros efeitos.

[009] Sabe-se que a concepção do ligador é importante para a preparação de proteínas de fusão. Em geral, tem sido utilizado, frequentemente, um ligador helicoidal que apresente uma estrutura em forma de hélice a, ou um ligador flexível que manifeste flexibilidade estrutural, sendo possível conceber e utilizar, por exemplo, diversos ligadores, mediante a combinação dos dois ligadores em conformidade com as características da proteína de fusão que se pretenda obter.

[010] Os inventores da presente invenção tentaram resolver o problema da reação fraca devida aos metabolitos instáveis, mediante a expressão de uma proteína de fusão de NadB e de NadA ligadas por meio de diversos tipos de ligadores aminoácidos, tendo concluído depois que é possível produzir ácido quinolínico, com um rendimento elevado, mediante a expressão da proteína de fusão, comparativamente com o rendimento do método de produção biológica convencional, completando assim a presente invenção.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO

[011] Constitui um objetivo da presente invenção proporcionar um microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico, o qual expressa uma proteína de fusão constituída por L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador.

[012] Constitui um outro objetivo da presente invenção proporcionar um método para a produção de ácido quinolínico, o qual compreende os passos que consistem em criar em cultura um microrganismo recombinante e em recuperar o ácido quinolínico produzido durante o período de cultura.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS

[013] A figura 1 ilustra uma estrutura de uma proteína de fusào de L- aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, de acordo com uma forma de realização específica da presente invenção; a figura 2 ilustra uma estrutura de um plasmídeo pPro-NBA, pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A ou pNBFL4A; e a figura 3 ilustra uma estrutura de pCPA que é um plasmídeo que expressa os genes que codificam fosfoenolpiruvato-carboxilase e L-aspartato- aminotransferase.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS V

[014] De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico, o qual expressa uma proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato- sintase ligadas por meio de um ligador.

[015] A L-aspartato-oxidase (doravante aqui designada por ‘NadB’) é uma enzima que possui uma atividade para oxidar o ácido L-aspártico e transformá- lo em ácido iminossuccínico, podendo ter uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 42, ou uma sequência de aminoácidos que possua uma elevada homologia com esta. [Atividade de L-aspartato-oxidase] ácido L-aspártico + fumarato <=> a-iminossuccinato + succinato + H+, ou ácido L-aspártico + oxigênio <=> peróxido de hidrogênio + a- iminossuccinato + H+

[016] A sequência do gene nadB que codifica esta enzima pode ser obtida a partir da sequência do genoma de Escherichia coli (Gl: 89109380), tal como publicada na literatura (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21), ou como consta do banco de dados da instituição 'National Center for Biotechnology Information (NCBI)' ou do banco de dados de DNA do Japão (DDBJ).

[017] A quinolinato-sintase (doravante aqui designada por ‘NadA’) é uma enzima que possui uma atividade para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido iminossuccínico, podendo ter uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 43, ou uma sequência de aminoácidos que possua uma elevada homologia com esta. [Atividade de quinolinato-sintase] a-iminossuccinato + fosfato de di-hidroxiacetona <=> ácido quinolínico + fosfato + 2H2O

[018] A sequência do gene nadA que codifica esta enzima pode ser obtida a partir da sequência do genoma de Escherichia coli (gi: Gl: 89109380) tal como publicada na literatura (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21), ou nos bancos de dados disponíveis em NCBI ou DDBJ.

[019] Se as atividades de NadB e NadA forem reforçadas, é possível aumentar nas células a acumulação de a-iminossuccinato, enquanto precursor do ácido quinolínico, e também a biossíntese de ácido quinolínico a partir de a- iminossuccinato, sendo assim aumentada a produção de ácido quinolínico. No entanto, apesar de serem aumentadas a atividades e os níveis de expressão das duas enzimas (NadB e NadA), a baixa frequência de colisão entre o substrato e a enzima produz uma grande quantidade de subprodutos, uma vez que o a-iminossuccinato ó um metabolito instável. Em consequência, é difícil produzir eficientemente ácido quinolínico, conforme esperado. Com a finalidade de se resolver este problema, na presente invenção as enzimas NadB e NadA são ligadas entre si por meio de um ligador e expressas em uma estirpe sob a forma de uma proteína de fusão, sendo assim produzido ácido quinolínico com um rendimento elevado.

[020] As enzimas NadB e NadA podem ter as sequências de aminoácidos representadas respectivamente pelas SEQ ID NOs. 42 e 43. No entanto, consoante a espécie ou a estirpe dos microrganismos, assim poderá haver diferenças nas sequências de aminoácidos das proteínas que manifestam a atividade e por esse motivo as sequências indicadas nào constituem uma limitação. Significa isto que as enzimas NadB e NadA, na medida em que sejam fornecidas sob a forma de uma proteína de fusão preparada mediante a ligação de uma à outra por meio de um ligador, de modo a que contribuam para um aumento da produtividade na produção de ácido quinolínico, então podem ser mutantes ou variantes artificiais que possuam sequências modificadas de aminoácidos resultantes de substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários aminoácidos em uma ou várias posições nas sequências de aminoácidos representadas pelas sequências SEQ ID NOs. 42 e 43. No presente contexto, o termo 'vários' pode significar um número diferente, consoante o tipo ou as posições dos resíduos aminoácidos na estrutura tridimensional da proteína, podendo ser, em pormenor, um número entre 2 e 20, concretamente entre 2 e 10 e mais concretamente entre 2 e 5. Além disso, as substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de aminoácidos podem compreender mutantes que ocorram naturalmente ou variantes artificiais, tomando por base as diferenças individuais e/ou as diferenças entre espécies dos microrganismos em que tem lugar a expressão do polipeptido.

[021] Os polinucleotídeos que codificam as enzimas NadB e NadA podem ser polinucleotídeos que codificam as proteínas que tenham com as sequências de aminoácidos representadas pelas sequências SEQ ID NOs. 42 e 43 uma homologia igual a 80% ou superior, concretamente uma homologia igual a 90% ou superior, mais concretamente uma homologia igual a 95% ou superior e muito mais concretamente uma homologia igual a 97% ou superior, desde que tenham atividades enzimáticas de NadB e NadA, conforme ilustrado no esquema de reação apresentado supra. Mais concretamente, os polinucleotídeos podem ter sequências polinucleotídicas representadas respectivamente pela SEQ ID NO. 27 e pela SEQ ID NO. 28.

[022] Conforme aqui utilizado, o termo "homologia" refere-se à identidade entre duas sequências de aminoácidos, podendo ser determinada por um método vulgarmente conhecido pelos especialistas na matéria, por exemplo, 'BLAST 2.0', que permite calcular parâmetros tais como ordem, identidade e similaridade.

[023] A sequência polinucleotídica que codifica as enzimas NadB ou NadA pode ser a sequência polinucleotídica representada por SEQ ID NO. 27 ou SEQ ID NO. 28 ou pode ser hibridada com uma sonda hibridante que pode ser preparada a partir da sequência polinucleotídica em 'condições rigorosas', podendo ser uma variante que codifique uma proteína que funcione normalmente.

[024] Tal como aqui utilizado, o termo "condições rigorosas" designa as condições que permitem uma hibridação específica entre polinucleotídeos. Há uma descrição minuciosa descrita na obra 'Molecular Cloning1 (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2a Edição, imprensa de Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) ou 'Current Protocols in Molecular Biology' (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York), e também, por exemplo, a hibridação em um tampão de hibridação (SSC 3,5X, 0,02% de Ficoll, 0,02.% de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina do soro de bovino, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), 0,5% de SDS, EDTA 2 mM) a 65°C. SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M a pH 7. Após a hibridação, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada com SSC 2X à temperatura ambiente e depois é lavada com SSC 0,1 a 0,5 X /SDS 0,1 X a 68°C.

[025] A proteína de fusão da presente invenção é um polipeptido em que L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, que possuem atividades diferentes, estão ligadas entre si por meio de um ligador aminoácido, possuindo um atividade de biossíntese de ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico, em conformidade com o esquema de reação seguinte: [Atividade da proteína de fusão] ácido L-aspártico + oxigênio + fosfato de di-hidroxiacetona <=> ácido quinolínico + fosfato + 2H2O + peróxido de hidrogênio

[026] No caso de a atividade da proteína de fusão ser reforçada, melhora a taxa de conversão de ácido quinolínico a partir do metabolite intermediário a- iminossuccinato, sendo assim produzido ácido quinolínico com uma produtividade mais elevada do que a produtividade conseguida com o reforço independente das atividades de NadB e NadA.

[027] A proteína de fusão pode ser um polipeptido preparado unindo o terminal N de L-aspartato-oxidase e 0 terminal C de quinolinato-sintase por meio de um ligador, ou pode ser um polipeptido preparado unindo o terminal C de L- aspartato-oxidase e 0 terminal N de quinolinato-sintase por meio de um ligador, podendo a proteína de fusão possuir concretamente uma sequência de aminoácidos selecionada entre 0 conjunto constituído pelas SEQ ID NOs. 47, 48, 49, 50, 51,52 e 53.

[028] O ligador é colocado entre os polipeptidos NadB e NadA ou entre os genes que os codificam e pode ser um ligador helicoidal ou flexível. Além disso, o referido ligador helicoidal ou flexível pode ser utilizado individualmente ou em combinação. Como exemplos de ligadores helicoidais refere-se que é possível utilizar “EAAAK” ou “EAAAR” e como exemplos de ligadores flexíveis refere-se que é possível utilizar “GGSGGS”, “GGGS", “GGSG” ou “GS”, mas isto não constitui nenhuma limitação.

[029] O ligador pode ser constituído por sequências de 5 a 30 aminoácidos, podendo 0 ligador helicoidal ou flexível ser utilizado individualmente ou repetidas vezes.

[030] De acordo com uma forma de realização concreta, um ligador que contenha 0 ligador helicoidal pode ser LA(EAAAK)nAAA, e um ligador que contenha o ligador flexível pode ser L(GGGS)nAAA. De preferência, n pode ser um inteiro entre 1 e 5. •» ■ ■

[031] De acordo com uma forma de realização concreta, o ligador pode ter uma sequência de aminoácidos selecionada entre 0 conjunto constituído pelas SEQ ID NOs. 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60, ou uma sequência de aminoácidos que possua uma elevada homologia com estas, mas isso não constitui qualquer limitação.

[032] O “microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico" da presente invenção é um microrganismo que consegue produzir e acumular ácido quinolínico a partir de uma fonte de carbono em um meio, e expressa a proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador, produzindo assim ácido quinolínico com elevada produtividade.

[033] O microrganismo recombinante da presente invenção pode ser preparado para expressar uma proteína de fusão, mediante a introdução de um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão.

[034] De acordo com uma forma de realização concreta, um microrganismo recombinante da presente invenção pode ser preparado por transformação, utilizando um vetor recombinante que compreenda o polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão.

[035] Tal como aqui utilizado, o termo "transformação" significa que é introduzido um gene em uma célula hospedeira, de modo a poder ser expresso na célula hospedeira. O gene transformado pode estar localizado em qualquer lugar, sem nenhuma limitação, quer esteja inserido no cromossoma da célula hospedeira quer esteja localizado fora do cromossoma, desde que possa ser expresso na célula hospedeira. Além disso, o gene pode ser introduzido sob qualquer forma, desde que possa ser introduzido e expresso em uma célula hospedeira. Por exemplo, o gene pode ser introduzido uma célula hospedeira sob a forma de uma cassete de expressão que seja uma estrutura polinucleotídica que inclua todos os elementos necessários para a autoexpressão. A cassete de expressão compreende, de um modo geral, um promotor funcionalmente ligado ao gene, um sinal de terminação da transcrição, um local de ligação ribossômica e um sinal de terminação da tradução. A cassete de expressão pode estar sob a forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o gene pode ser introduzido em uma célula hospedeira sob a forma de uma estrutura polinucleotídica, ou ele próprio, e pode estar funcionalmente ligado a uma sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[036] O vetor recombinante é um meio para a expressão da proteína de fusão, mediante introdução de um DNA em uma célula hospedeira para preparar um microrganismo em que tenha lugar a expressão da proteína de fusão da presente invenção, podendo ser utilizado um vetor de expressão conhecido, tal como um vetor plasmídico, um vetor cosmídico ou um vetor bacteriofágico. O vetor pode ser facilmente preparado pelos especialistas na matéria, em conformidade com qualquer método conhecido, recorrendo à tecnologia de recombinação de DNA.

[037] De uma forma concreta, o vetor recombinante pode ser um vetor plasmídico pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A ou pNBFL4A que possua um mapa de clivagem ilustrado na figura 2 e, mais concretamente, o vetor plasmídico pode conter uma sequência nucleotídica selecionada respectivamente entre SEQ ID NO. 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40.

[038] De acordo com uma forma de realização concreta, o microrganismo produtor de ácido quinolínico pode ser um microrganismo selecionado entre Enterbacter sp., Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. ou Brevibacterium sp.. Concretamente, pode ser um microrganismo pertencente à espécie Escherichia sp., e mais concretamente E.coli, mas sem que isso constitua qualquer limitação.

[039] O microrganismo da presente invenção ainda pode ser modificado para diminuir a atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase, comparativamente com a sua atividade endógena. No presente contexto, o termo "atividade endógena" designa a atividade de quinolinato- fosforribosiltransferase em um microrganismo natural.

[040] A enzima NadC tem uma atividade que lhe permite converter ácido quinolínico em mononucleotídeo nicotinate e pode possuir uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 44, ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma elevada homologia com esta. A sequência do gene nadC que codifica esta enzima pode ser obtida a partir da sequência do genoma de Escherichia coli (Gl: 89106990), conforme publicado na literatura (Mol Syst Biol. 2006;2:2006-0007. Epub 2006 Feb 21.), ou conforme disponível nos bancos de dados das instituições NCBI ou DDBJ. [Atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase] 5-fosfo-a-D-ribose 1-difosfato + ácido quinolínico + 2H+ <=> CO2 + difosfato + mononucleotídeo nicotinato

[041] É possível fazer acumular nas células ácido quinolínico, enfraquecendo a atividade de NadC. O enfraquecimento da atividade da enzima pode ser conseguido por um método selecionado entre 0 conjunto constituído por: 1) deleção parcial ou total do gene que codifica a enzima, 2) modificação da sequência de controle da expressão para reduzir a expressão do gene (y.g., substituição do promotor endógeno do gene por um promotor fraco), 3) modificação da sequência do gene no cromossoma para enfraquecer a atividade da enzima, e 4) uma combinação destes casos. De acordo co muam exemplo concreto da presente invenção, removeu-se o gene nadC para fora do genoma do microrganismo por meio de recombinação homóloga.

[042] Por outro lado, 0 microrganismo da presente invenção ainda pode ser modificado para reforçar as atividades de uma ou várias proteínas selecionadas entre 0 conjunto constituído por fosfoenolpiruvato-carboxilase, L-aspartato- aminotransferase e a proteína de fusão da presente invenção, com a finalidade de se reforçar 0 circuito de biossíntese do ácido L-aspártico a partir de fosfoenolpiruvato.

[043] As enzimas fosfoenolpiruvato-carboxilase (PPG) e L-aspartato- aminotransferase (AspC) possuem uma atividade que permite sintetizar ácido L-aspártico a partir de fosfoenolpiruvato, e podem ter uma sequência de aminoácidos representada respectivamente pelas SEQ ID NO. 45 ou 46, ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma elevada homologia com estas. A sequência do gene ppc ou aspC que codifica a enzima pode ser obtida a partir da sequência do genoma de Escherichia coli (gi: Gl:89110074, Gl:89107778), conforme publicado na literatura (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.), ou conforme disponível nos bancos das instituições NCBI ou DDBJ. [Atividade de fosfoenolpiruvato-carboxilase] fosfoenolpiruvato + CO2 -» oxaloacetato + fosfato [Atividade de L-aspartato-aminotransferase] oxaloacetato + glutamato <=> ácido L-aspártico + 2-cetoglutamato

[044] Assim sendo, se as atividades de PPC e AspC forem reforçadas, é possível melhorar nas células a produção de ácido L-aspártico, enquanto precursor de ácido quinolínico, sendo assim aumentada a produção de ácido quinolínico.

[045] O reforço da atividade da enzima pode ser conseguido por meio de um método selecionado entre 0 conjunto constituído por: 1) um método para aumentar 0 número de cópias do gene que codifica a enzima, 2) um método para modificar a sequência de controle da expressão, para aumentar a expressão do gene, 3) um método para modificar a sequência do gene no cromossoma, para reforçauH atividade da enzima, e 4) uma combinação destes casos. De acordo com um exemplo concreto da presente invenção, construiu- se um plasmídeo que compreende um gene que codifica a enzima e introduziu- se em um microrganismo produtor de ácido quinolínico, sendo assim aumentado 0 número de cópias do gene e sendo assim induzido 0 reforço de atividade.

[046] Com a finalidade de se reforçar a atividade da proteína de fusão, o promotor endógeno do gene que codifica a proteína de fusão pode ser substituído por um promotor forte, ou é possível introduzir uma mutação nos promotores para os tornar mais fortes ou é possível aumentar 0 número de cópias do gene. Como promotor forte é possível utilizar, de um modo geral, pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJ1, pCysK, etc..

[047] De acordo com um exemplo concreto da presente invenção, os promotores de nadB e nadA foram substituídos por um promotor constitutivo pPro (SEQ ID NO. 32) para se construir os genes nadB e nadA expressáveis constitutivos que não são suprimidos por NadR, como o repressor transcricional para suprimir as expressões de nadB e nadA com nível de NAD intracelular, sob a forma de um plasmídeo, tendo sido então os plasmídeos introduzidos nos microrganismos para induzir a sobreexpressão de aspartato- oxidase e quinolinato-sintase. Além disso, de acordo com um exemplo concreto da presente invenção, o promotor do gene que codifica NadB-L-NadA foi substituído pelo promotor pPro para induzir a sobreexpressão de NadB-L- NadA. A propósito disto, o promotor pPro é um exemplo apenas para a resistência à inibição da autorregulação e para o aumento da expressão, não havendo por isso qualquer limitação para o promotor da presente invenção.

[048] Ainda de acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir ácido quinolínico, o qual compreende os passos seguintes: (a) criar em cultura um microrganismo recombinante em que tenha lugar a expressão de uma proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador em um meio de cultura que contenha uma fonte de carbono; e (b) recuperar o ácido quinolínico produzido durante o período de cultura.

[049] O microrganismo recombinante pode ser criado em cultura em um meio de cultura adequado, em condições de cultura adequadas, conhecidas na especialidade. Tais procedimentos de cultura podem ser utilizados por um especialista na matéria e são facilmente ajustados, consoante o microrganismo selecionado. Os métodos de cultura compreendem, mas sem qualquer limitação, as culturas por lotes, as culturas contínuas e as culturas com enriquecimento progressivo. Há diversos métodos de cultura de microrganismos, descritos, por exemplo, na obra “Biochemical Engineering” por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.

[050] O meio de cultura utilizado deve satisfazer as necessidades das estirpes particulares, de uma maneira conveniente. Os meios de cultura para diversos microrganismos estão publicados na literatura (“Manual of Methods for General Bacteriology” da 'American Society for Bacteriology', Washington D.C., E.U.A., 1981). O meio de cultura pode conter diversas fontes de carbono, fontes de azoto e microelementos.

[051] A fonte de carbono existente no meio de cultura para os microrganismos pode conter hidratos de carbono, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco, ácidos gordos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, tais como glicerol e etanol, e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, mas sem que isso constitua qualquer limitação. Tais fontes de carbono podem ser utilizadas individualmente ou em combinação.

[052] A fonte de azoto existente no meio de cultura para os microrganismos pode conter fontes orgânicas de azoto, tais como peptonas, extratos de leveduras, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho (CSL), farinha de soja e ureia, ou fontes inorgânicas de azoto, tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio, mas sem que isso constitua qualquer limitação. As fontes de azoto podem ser utilizadas individualmente ou em combinação.

[053] A fonte de fosforo existente no meio de cultura para os microrganismos pode compreender di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio ou os correspondentes sais que contenham sódio. O meio de cultura também pode conter sais de metais, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. No meio mencionado supra também podem estar contidos aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. O meio de cultura para os microrganismos ou os seus componentes individuais podem ser acrescentados a um lote ou a um sistema de produção contínua, mas isso não constitui qualquer limitação.

[054] Além do mais, é possível acrescentar ao meio de cultura dos microrganismos, de uma maneira conveniente, compostos tais como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, amónia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico para regular o valor do pH do caldo de cultura. É possível utilizar, durante o período de cultura, agentes antiespumíferos, tais como os ésteres poliglicólicos de ácidos gordos, para suprimir a formação de espuma. Com a finalidade de se manter condições aeróbias é possível introduzir oxigênio, ou um gás que contenha oxigênio (v.g., o ar), no caldo de cultura. A temperatura do caldo de cultura está compreendida, normalmente, entre 20°C e 45°C, e concretamente entre 25°C e 40°C. A cultura pode prosseguir até se ter produzido a quantidade esperada de ácido quinolínico, durando preferencial e concretamente entre 10 horas e 160 horas.

[055] De acordo com um exemplo concreto da presente invenção, utilizou- se a estirpe W311θΔnadC, na qual foi eliminada a atividade de quinolinato- fosforribosiltransferase, que foi transformada com plasmídeos de expressão que continham os genes que codificam as proteínas de fusão NadB-L-NadA correspondentemente ligadas por meio de diversos ligadores e depois fez-se um exame das aptidões das estirpes para produzirem ácido quinolínico a partir de ácido aspártico. Em consequência, quando L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase foram expressas como uma proteína de fusão, foi possível produzir ácido quinolínico com um rendimento elevado, comparativamente com as expressões individuais destas enzimas (quadro 2).

[056] Além disso, a estirpe de E.coli que possui maiores atividades de fosfoenolpiruvato-carboxilase e L-aspartato-aminotransferase e em que foi eliminada a atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase foi transformada com o plasmídeo de expressão que compreende o gene que codifica a proteína de fusão e depois examinou-se as produtividades, respeitantes ao ácido quinolínico, destas estirpes CV01-0600, CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 e CV01-0607. Como resultado disso concluiu-se que o ácido quinolínico pode ser produzido com um rendimento elevado, mediante a expressão da proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, e que o ácido quinolínico pode ser produzido com um rendimento superior ao da estirpe convencional, através da eliminação da atividade de quinolinato- fosforribosiltransferase e com reforço das expressões de fosfoenolpiruvato- carboxilase e L-aspartato-aminotransferase, com expressão da proteína de fusão (quadro 5).

[057] As estirpes produtoras de ácido quinolínico, Escherichia coli CV010604 e CV01-0605, foram depositadas, ao abrigo do Tratado de Budapeste, no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM, localizado em Hongjae 1-Dong, Seodaemun-Gu, Seul, Coreia) em 21 de Dezembro de 2011, respectivamente com os números KCCM11235P e KCCM11236P de admissão. Significa isto que este depósito está reconhecido por uma Autoridade Depositária Internacional, ao abrigo do Tratado de Budapeste.

[058] A presente invenção será descrita adiante de uma forma mais minuciosa, tomando como referência os exemplos e também os exemplos experimentais. No entanto, tais exemplos têm apenas fins ilustrativos, não se pretendendo com os referidos exemplos limitar a invenção.

Exemplo 1. Preparação da estirpe produtora de ácido quinolínico <1-1 > Construção do plasmídeo que expressa L-aspartato-oxidase

[059] O gene nadB que codifica L-aspartato-oxidase foi obtido por PCR, utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110. Com base na sequência nucleotídica para o gene nadB (número “Gl:89109380” de registo em NCBI) de SEQ ID NO. 27 obtida no "GenBank" do Instituto Nacional de Saúde norte-americano (NIH GenBank), foi possível amplificar a região ORF que continha desde ATG até TAA no gene nadB, tendo sido sintetizados os iniciadores de SEQ ID NOs. 1 e 2 que possuem os locais de reconhecimento das enzimas de restrição Ndel e BamHI.

[060] Efetuou-se a PCR utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NO. 1 e 2. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado com cerca de 1,9 kb, que contém o gene nadB e os locais de reconhecimento das enzimas de restrição Ndel e BamHI.

[061] O gene nadB, obtido por meio dos procedimentos de PCR, foi tratado com as enzimas de restrição Ndel e BamHI e depois foi clonado, mediante ligação, no vetor pProLar (CloneTech) tratado com as enzimas de restrição Ndel e BamHI para se construir, em ultima instância, um vetor recombinante pPro-nadB no qual foi clonado o gene nadB cuja expressão foi controlada sob ação do promotor pPro enquanto promotor constitutivo.

<1-2> Construção do plasmídeo que expressa L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase

[062] O gene nadA que codifica quinolinato-sintase foi obtido por PCR, utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110. Partindo da sequência de base para o gene nadA (número “Gl: 89107601” de registo em NCBI) de SEQ ID NO. 28 obtida no "GenBank" do Instituto Nacional de Saúde norte-americano (NIH GenBank), foi possível amplificar a região ORF contendo desde ATG até TAA no gene nadA, tendo sido sintetizados os iniciadores de SEQ ID NOs. 3 e 4 que possuem os locais de reconhecimento das enzimas de restrição Apal e Notl.

[063] A PCR foi efetuada utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 3 e 4. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado com cerca de 1,0 kb, que contém o gene nadA e os locais de reconhecimento das enzimas de restrição Apal e Notl.

[064] Além disso, obteve-se o promotor Pro por meio de PCR, utilizando como matriz DNA cromosjômicc dü vetor pProLar (CloneTech). Partindo da sequência de base (SEQ ID NO. 32) para o promotor Pro proveniente de CloneTech efetuou-se a síntese dos iniciadores de SEQ ID NOs. 5 e 6 que possuem os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI e Apal, com a finalidade de ligar o promotor pPro e o gene nadA amplificado.

[065] A PCR foi efetuada utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 5 e 6. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado com cerca de 0,135 kb, que contém o promotor pPro e os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI e Apal.

[066] O gene nadA, obtido por meio dos procedimentos de PCR, foi tratado com as enzimas dç. restrição Apal e Notl e o fragmento do promotor pPro amplificado foi tratado com Apal e BamHI. Os fragmentos de nadA e do promotor pPro, tratados com as enzimas de restrição, foram clonados, mediante ligação, no vetor pPro-nadB tratado com Notl e BamHI preparado no Exemplo 1-1, para se construir, em última instância, um vetor recombinante pPro-NBA de 5,7 Kb no qual foi clonado o gene nadB cuja expressão foi controlada pela ação do promotor pPro, enquanto promotor constitutivo, tendo sido a expressão do gene nadA controlada pelo promotor pPro. O vetor recombinante pPro-NBA, assim construído, tem a sequência designada por SEQ ID NO. 33. A figura 2 ilustra a construção do vetor pPro-NBA enquanto plasm ideo que expressa os genes que codif icam L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase.

<1-3> Construção do plasmídeo que expressa NadB-L-NadA

[067] Com a finalidade de se construir um plasmídeo que expressa NadB-L- NadA, contendo um ligador, efetuou-se a PCR utilizando como matriz pPro-NBA (SEQ ID NO. 33) preparado no exemplo 1-2 e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 7 e 8. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltraTM (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado com cerca de 1,8 kb, que contém o promotor pPro, o local da enzima de restrição Xhol e o ligador na extremidade do gene nadB.

[068] Além disso, efetuou-se a PCR utilizando como matriz pPro-NBA e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 15 e 16, com a finalidade de amplificar o fragmento do gene nadA que tem a sequência homóloga à da extremidade do gene amplificado com cerca de 1,8 kb, o qual contém o local da enzima de restrição Xhol, o promotor pPro e o ligador na extremidade do gene nadB, e o local da enzima de restrição Notl na extremidade do gene nadA. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado, com cerca de 1,1 kb, o qual pode ser ligado com o ligador por meio de uma ligação homóloga e o qual contém o local da enzima de restrição Notl na extremidade do gene nadA.

[069] Misturou-se o gene amplificado, que tem cerca de 1,8 kb e que contém o promotor pPro, o local da enzima de restrição Xhol e o ligador na extremidade do gene nadB, com o fragmento do gene nadA que possui a sequência homóloga à da extremidade do gene amplificado que tem cerca de 1,8 kb e o local da enzima de restrição Notl e a extremidade do gene nadA assim preparado e efetuou-se uma PCR de Sewing. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 10 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 60 segundos, com recombinação a 50°C durante 60 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 1 minuto. A PCR foi também efetuada acrescentando oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 7 e 16 à mistura de reação de PCR. Como polimerase utilizou- se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 20 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 3 minutos. Obteve-se finalmente o gene da proteína de fusão amplificado, com cerca de 2,9 kb, contendo “Xhol da enzima de restrição_promotor pPro_nadB_ligador_nadA_Notl da enzima de restrição”.

[070] O fragmento do gene “Xhol da enzima de restriçãopromotor pPro_nadB_ligador_nadA_Notl da enzima de restrição”, obtido por meio de PCR, foi tratado com as enzimas de restrição Xhol e Notl. O “fragmento do gene promotor pPro_nadB_ligador_nadA”, tratado com as enzimas de restrição, foi clonado, mediante ligação, no vetor pProLar (CloneTech) tratado com as enzimas e restrição Xhol e Notl, para assim se construir, em última instância, um vetor recombinante pNBHLIA cuja expressão foi controlada pela ação do promotor pPro enquanto promotor constitutivo, e dentro do qual foi clonada a proteína de fusão única de nadB e nadA ligada por meio do ligador. Os ligadores utilizados neste exemplo são constituídos por 5 a 30 aminoácidos e têm sequências de aminoácidos representadas respectivamente pelas SEQ ID NOs. 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60.

[071] O fragmento do gene nadB foi amplificado trocando o oligonucleotídeo de SEQ ID NO. 8, que contém o ligador, pelos oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, de modo a amplificar diversos genes que contêm diversos ligadores, contendo cada um deles o promotor pPro e o ligador na extremidade de nadB. De modo semelhante ao descrito supra, foram preparados os vetores recombinantes pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A e pNBFL4A. Os vetores assim preparados pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A e pNBFL4A possuem as sequências nucleotídicas designadas respectivamente por SEQ ID NOs. 34, 35, 36, 37, 38, 39 e 40. As proteínas de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, assim preparadas, possuem respectivamente as sequências de aminoácidos designadas por SEQ ID NOs. 47, 48, 49, 50, 51, 52 e 53. A figura 2 ilustra a construção de pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A ou pNBFL4A, que sào plasmídeos em que cada um deles expressa o gene que codifica as proteínas de fusào de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de diversos ligadores.

<1-4> Construção do plasmídeo que expressa fosfoenolpiruvato- carboxilase e L-as parta to-transaminase

[072] O gene ppc quer codifica fosfoenolpiruvato-carboxilase foi obtido por meio de PCR, utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110. A partir da sequência base para o gene ppc (número “Gl: 89110074” de registo no NCBI) de SEQ ID NO. 29, obtido no "GenBank" do Instituto Nacional de Saúde norte-americano (NIH GenBank), foi possível amplificar a região desde o promotor ao terminador no gene ppc, tendo sido sintetizados os iniciadores de SEQ ID NOs. 17 e 18 que possuem os locais de reconhecimento das enzimas restrição Hindlll e BamHI.

[073] Efetuou-se a PCR utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 17 e 18. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 4 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado, com cerca de 3,1 kb, o qual contém o gene ppc e os locais das enzimas de restrição Hindlll e BamHI.

[074] O gene de ppc obtido por meio de procedimentos de PCR foi tratado com as enzimas de restrição Hindlll e BamHI e depois foi clonado, mediante ligação, no vetor pCL1920(AB236930) tratado com as enzimas de restrição Hindlll e BamHI para se construir, em última instância, um vetor recombinante pCP dentro do qual foi clonado o gene ppc.

[075] Para a clonagem do gene aspC no vetor recombinante pCP dentro o qual o gene ppc foi clonado, obteve-se o gene aspC, que codifica L-aspartato- transaminase, por meio de PCR, utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110. A partir da sequência base para o gene aspC (número “Gl: 89107778” de registo no NCBI) de SEQ ID NO. 30, obtido no "GenBank" do Instituto Nacional de Saúde norte-americano (NIH GenBank), foi possível amplificar a região desde α promotor ao terminador no gene aspC, tendo sido sintetizados os iniciadores de SEQ ID NOs. 19 e 20 que possuem os locais de reconhecimento das enzimas restrição BamHI e Kpnl.

[076] Efetuou-se a PCR utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 19 e 20. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 50°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 2 minutos. Deste modo, obteve-se o gene amplificado, com cerca de 1,5 kb, o qual contém o gene aspC e os locais das enzimas de restrição BamHI e Kpnl.

[077] O gene de aspC obtido por meio de procedimentos de PCR foi tratado com as enzimas xle restrição BamHI e Kpnl e depois foi clonado, mediante ligação, no vetor pCP tratado com as enzimas de restrição BamHI e Kpnl para se construir, em última instância, um vetor recombinante pCPA dentro do qual foram clonados ao mesmo tempo os genes aspC e ppc. O vetor pCPA assim construído possui a SEQ ID NO. 41. A figura 3 mostra o esquema estrutural do pCPA que é um plasmídeo que expressa os genes que codificam fosfoenolpiruvato-carboxilase e L-aspartato-transaminase.

<1-5> Construção de uma estripe deficiente em quinolinato- fosforribosiltransferase

[078] Neste exemplo, o gene nadC implicado no circuito de decomposição do ácido quinolínico foi obtido por meio de PCR, utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110. A partir da informação da sequência de base do gene nadC (número “GI:89106990” de registo no NCBI), obtido no "GenBank" do Instituto Nacional de Saúde norte-americano (NIH GenBank) foram sintetizados os iniciadores de SEQ ID NOs. 21 e 22 para amplificar a região a jusante do gene nadC, os iniciadores de SEQ ID NOs. 23 e 24 para amplificar as regiões a montante e a jusante do gene nadC e loxpCm, e ainda os iniciadores de SEQ ID NOs. 25 e 26 para amplificar a região a montante do gene nadC.

[079] Efetuou-se a PCR utilizando como matriz DNA cromossômico de E.coli W3110 e os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 21 e 22 e 25 e 26 como iniciadores para amplificar as regiões a montante e a jusante do gene nadC, respectivamente com 0,5 kb e 0,3 kb. Além disso, efetuou-se a PCR utilizando como matriz o vetor plasmídico pLoxpCat2 que contém loxpCm e utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos de SEQ ID NOs. 23 e 24 para amplificar o gene loxpCm de 1,0 kb, o qual possui a sequência homóloga para o gene nadC em ambas as extremidades. Como polimerase utilizou-se polimerase de DNA PfuUltra™ (Stratagene) e efetuou-se a PCR repetindo o ciclo 30 vezes, incluindo a desnaturação a 96°C durante 30 segundos, com recombinação a 53°C durante 30 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 1 minuto. Depois utilizou-se como matriz o fragmento a montante de nadC, o fragmento a jusante de nadC e o fragmento de loxpCm, obtidos a partir de reacções de PCR, para se efetuar um procedimento de PCR em condições de PCR, compreendendo 10 repetições do ciclo com desnaturação a 96°C durante 60 segundos, recombinação a 50°C durante 60 segundos e prolongamento das cadeias a 72°C durante 1 minuto, e 20 repetições do ciclo após adição dos iniciadores de SEQ ID NOs. 21 e 26. Obteve-se deste modo um cassete deficiente em nadC, com 1,8 kb, que contém a região de montante do gene nadC-loxpCm-região de jusante do gene nadC.

[080] Utilizou-se a estirpe de E.coli W3110 contendo pKD46, enquanto vetor de expressão da recombinase À vermelha que foi transformada com a cassete deficiente em nadC por meio de electroporação, tendo depois a estirpe sido espalhada sobre meio de cultura LB (Luria-Bertani) (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCI e ágar na concentração de 1,5%/L), contendo cloranfenicol como marcador seletivo, e depois manteve-se tudo a incubar a 37°C de um dia para o outro para selecionar as estirpes de microrganismo que manifestaram uma resistência contra o cloranfenicol.

[081] As estirpes selecionadas como matrizes foram submetidas diretamente a PCR utilizando os iniciadores de SEQ ID NO. 21 e 26 as mesmas condições, tendo sido depois confirmada a deleção do gene nadC mediante identificação do tamanho do gene na estirpe de fenótipo natural e na estirpe deficiente em nadC, correspondendo respectivamente a 1,0 kb e 1,8 kb, sobre gel de agarose a 1,0%. Além disso, o gene nadC foi também removido da estirpe de fenótipo natural E. coli W3110, praticando o mesmo método referido supra.

Exemplo 2. Preparação e avaliação da estirpe que expressa a proteína de fusão <2-1 > Preparação da estirpe que expressa a proteína de fusão

[082] Foram utilizados os plasmídeos pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A e pNBFL4A e pPro-NBA, que expressam genes que codificam as proteínas de fusão únicas, os quais foram preparados ligando L- aspartato-oxidase e quinolinato-sintase por meio de diversos ligadores do <Exemplo 1-3> através do método de CaCI2 para transformar a estirpe W311θΔnadC tal como construída no <Exemplo 1-5>, tendo sido depois espalhados de modo a cobrirem um meio de cultura LB-Km (extrato de levedura 10 g/L, NaCI 5 g/L, triptona 10 g/L, canamicina 25 μg/L), tendo ficado tudo a incubar a 37°C de um dia para o outro. A seguir efetuou-se a seleção das colônias resistentes à canamicina. Deste modo, foram obtidas estirpes que expressam L- aspartato-oxidase e quinolinato-sintase sob a forma de uma proteína de fusão única.

<2-2> Comparação da produtividade, na preparação de ácido quinolínico a partir de ácido aspártico, entre proteínas de fusão que têm diversos ligadores

[083] Com o intuito de se comparar a aptidão para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido aspártico, entre proteínas de fusão que têm diversos ligadores, utilizou-se cada uma das estirpes que expressam proteínas de fusão, obtidas no <Exemplo 2-1 >, que serviram para inocular 5 ml_ de meio de cultura líquido LB- Km-IPTG (extrato de levedura 10 g/L, NaCI 5 g/L, triptona 10 g/L, canamicina 25 μg/L, IPTG 10 mM), em uma incubadora a 37°C, tendo a cultura prosseguido a 37°C e a 250 rpm, de um dia para o outro, para se obter um caldo de cultura. O caldo de cultura assim obtido foi centrifugado a 4000 rpm durante 10 minutos para se obter apenas a estirpe que expressa a proteína de fusão que foi recolocada em suspensão em 500 μL em tampão Tris a pH 7,0, com subsequente desmembramento por tratamento com ultra-sons.

[084] Os lisados de células inteiras, contendo a proteína de fusão expressa, obtida pelo método mencionado supra, foram utilizados para comparar a aptidão para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico, por reação enzimática. O quadro 1 mostra a composição da mistura da reação enzimática para comparação da aptidão para sintetizar ácido quinolínico a partir de ácido L- aspártico. [Quadro 1]

[085] Deixou-se a mistura de reação reagir a 37°C durante 30 minutos. Analisou-se por HPLC o ácido L-aspártico e o ácido quinolínico no caldo de cultura. Os resultados da análise estão agrupados no quadro 2 e indicam a aptidão de cada proteína de fusão para produzir ácido quinolínico a partir de ácido L-aspártico. [Quadro 2]

taxa de conversão molar (%) = ácido quinolínico produzido (M) / ácido L- aspártico acrescentado (M)

[086] A pPro-NBA, que expressa L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, produziu ácido quinolínico na concentração de 1,5 g/L a partir de ácido L- aspártico, o que corresponde a um rendimento de conversão enzimática igual a 44,9% na transformação de ácido L-aspártico em ácido quinolínico, ao passo que pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A e pNBFL4A, produtores de proteínas de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de diversos ligadores, produziram ácido quinolínico em uma concentração entre 2,2 ~ 3,2 g/L, correspondendo respectivamente a um rendimento de conversão enzimática entre 65,9 ~ 95,8% na transformação de ácido L-aspártico em ácido quinolínico.

[087] Este resultado indica que a expressão de uma proteína de fusão única de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase proporciona um rendimento superior na conversão em ácido quinolínico, comparativamente com as expressões das enzimas individuais por si sós. Além disso, todas as estirpes introduzidas com diversos tipos de ligadores proporcionaram elevadas taxas de conversão enzimática, indicando isso que a expressão da proteína de fusão única de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, ligada por meio do ligador, é mais eficiente na biossíntese do ácido quinolínico a partir do ácido L- aspártico. As proteínas pNBHL4A e pNBHL5A, introduzidas com o ligador de LA(EAAAK)4~5AAA, proporcionaram a mais elevada taxa de conversão em ácido quinolínico, indicando isso que LA(EAAAK)4~sAAA são os mais eficientes ligadores das proteínas de fusão para a produção de ácido quinolínico.

Exemplo 3. Preparação e avaliação da estirpe produtora de ácido quinolínico <3-1 > Preparação da estirpe produtora de ácido quinolínico

[088] Com o intuito de se comparar a aptidão para sintetizar ácido quinolínico a partir de glicose, entre proteínas de fusão que possuem diversos ligadores, utilizou-se o plasmídeo pCPA, construído no <Exemplo 1 -4>, por meio do método de CaCh para transformar a estirpe W311θΔnadC, tal como construída no <Exemplo 1 -5>, as quais foram depois espalhadas de modo a cobrirem um meio de cultura LB-SP (extrato de levedura 10 g/L, NaCI 5 g/L, triptona 10 g/L, espectinomicina 50 pg/L), e depois manteve-se tudo a incubar a 37°C de um dia para o outro. A seguir efetuou-se a seleção das colônias resistentes à espectinomicina.

[089] Foram utilizados os plasmídeos pPro-NBA, pNBHLIA, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A e pNBFL4A, construídos nos <Exemplo 1-2> e <Exemplor1-3>, através do método do CaCh, para transformar a estirpe W311θΔnadC, que contém o pCPA construído conforme descrito supra, que foram depois espalhados de modo a cobrir um meio de cultura LB- Km-Sp (extrato de levedura 10 g/L, NaCI 5 g/L, triptona 10 g/L, espectinomicina 50 μg/L, canamicina 25 μg/L) e depois manteve-se tudo a incubar a 37°C de um dia para o outro. A seguir efetuou-se a seleção de cada 10 colônias resistentes à canamicina e à espectinomicina. As estirpes produtoras de ácido quinolínico assim preparadas receberam as designações respectivas de CV01-0600, CV010601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 e CV015 0607. O quadro 3 indica o genótipo da estirpe hospedeira, o plasmídeo contido e a sequência de aminoácidos do ligador da proteína de fusào constituída por L- aspartato-oxidase e quinolinato-sintase. [Quadro 3]

<3-2> Avaliação da estirpe produtora de ácido quinolínico

[090] Com o intuito de se confirmar a aptidão para produzir ácido quinolínico a partir de glicose efetuou-se a titulação do ácido quinolínico de acordo com a experiência a seguir descrita. Utilizou-se a estirpe produtora de ácido quinolínico preparada no <Exemplo 3-1 >, que foi criada em cultura em meio de cultura LB-SP-Km em uma incubadora a 37°C, de um dia para o outro, 15 para se obter uma colônia singular que foi depois utilizada para inocular 25 ml_ de meio titulado com ácido quinolínico, utilizando uma ansa de platina, tendo ficado tudo a incubar a 250 r.p.m. a 37°C durante um período entre 24 e 72 horas. O quadro 4 mostra a composição do meio de produção para o ácido quinolínico. [Quadro 4]

[091] Analisou-se por HPLC o ácido quinolínico no caldo de cultura. Os resultados das análises estão agrupados no quadro 5 e indicam a aptidão da estirpe para produzir ácido quinolínico a partir de glicose. [Quadro 5]

[092] Rendimento (%) = ácido quinolínico produzido (g) / glicose acrescentada (g)

[093] A estirpe CV01-0600, que foi preparada eliminando quinolinato- fosforribosiltransferase da estirpe E.coli W3110 para suprimir a decomposição 10 do ácido quinolínico intracelular pela ação de quinolinato- fosforribosiltransferase, e depois aumentando as expressões de fosfoenolpiruvato-carboxilase, L-aspartato-aminotransferase e L-aspartato- oxidase e também quinolinato-sintase, produziu ácido quinolínico com uma concentração de 5,5 g/L, ao passo que as estirpes CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 e CV01-0607, que expressam as proteínas de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase, ligadas por meio de diversos ligadores, produziram ácido quinolínico respectivamente em concentrações entre 6,0 ~ 10,3 g/L.

[094] Este resultado é consistente com o resultado da conversão enzimática a partir de ácido L-aspártico em ácido quinolínico no <Exemplo 2> e indica também que a expressão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase sob a forma de uma proteína de fusão única minimiza a reação secundária de conversão de □-iminossuccinato em oxaloacetato por aumentar a reação de um metabolito intermediário instável α-iminossuccinato com quinolinato-sintase, aumentando assim a produção de ácido quinolínico. Além disso, todas as estirpes introduzidas com diversos tipos de ligadores revelaram uma produtividade relativamente elevada na produção de ácido quinolínico, indicando isso que a expressão da proteína de fusão única de L-aspartato- oxidase e quinolinato-sintase, ligada por meio de um ligador, é mais eficiente para a biossíntese do ácido quinolínico.

[095] Além do mais, de forma consistente com o resultado do <Exemplo 2>, os plasmídeos pNBHL4A e pNBHLSA, que foram introduzidos respectivamente com os ligadores de LA(EAAAK)4~5AAA, revelaram o valor mais elevado de produtividade na produção de ácido quinolínico, indicando que LA(EAAAK)4~5AAA são os ligadores mais eficientes das proteínas de fusão para a produção de ácido quinolínico.

[096] Ainda mais, confirmou-se que no caso de se reforçar o circuito de biossíntese do ácido L-aspártico com uma combinação de uma melhor velocidade de reação, por expressão da proteína de fusão de L-aspartato- oxidase e quinolinato-sintase, e com a eliminação da atividade de quinolinato- fosforribosiltransferase e também com o aumento das expressões de fosfoenolpiruvato-carboxilase e L-aspartato-aminotransferase, é possível produzir ácido quinolínico com uma eficiência elevada, comparativamente com a estirpe convencional.

Efeito da invenção

[097] A presente invenção proporciona um microrganismo que expressa uma proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador para minimizar uma reação de decomposição natural de a- iminossuccinato, considerando-se que isto é um problema do processo 10 convencional de produção biológica, sendo assim produzido ácido quinolínico com uma elevada produtividade.

Claims

1. Microrganismo recombinante produtor de ácido quinolínico, caracterizado por expressar uma proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligada por meio de um ligador, em que o microrganismo ser selecionado entre o conjunto constituído por Enterbacter sp., Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. e Brevibacterium sp., em que a L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase possuem respectivamente as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO. 42 e SEQ ID NO. 43, em que o ligador possui uma sequência de aminoácidos LA(EAAAK)nAAA ou L(GGGS)nAAA, em que n representa um número inteiro entre 1 e 5.

2. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ligador possuir entre 5 e 30 aminoácidos.

3. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ligador possuir uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NOs. 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60.

4. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína de fusão possuir uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NOs. 47, 48, 49, 50, 51, 52 e 53.

5. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase ser ainda mais enfraquecida, comparativamente com a atividade endógena em um microrganismo natural, em que a atividade de quinolinato-fosforribosiltransferase é enfraquecida por meio de um método selecionado entre o conjunto constituído por: 1) deleção parcial ou total de um gene que codifica a enzima, 2) modificação de uma sequência de controle da expressão para reduzir a expressão do gene, 3) modificação da sequência do gene no cromossoma para enfraquecer a atividade da proteína e 4) uma sua combinação, em que a quinolinato-fosforribosiltransferase é codificada por um nadC.

6. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por serem ainda mais reforçadas as atividades de uma ou várias proteínas selecionadas entre o conjunto constituído por fosfoenolpiruvato- carboxilase, L-aspartato-aminotransferase e a proteína de fusão, em que a atividade da proteína é reforçada por meio de um método selecionado entre o conjunto constituído por: 1) aumento do número de cópias do gene que codifica a enzima, 2) modificação de uma sequência de controle da expressão para aumentar a expressão do gene, 3) modificação da sequência do gene no cromossoma para aumentar a atividade da enzima e 4) uma sua combinação, em que a fosfoenolpiruvato-carboxilase e a L-aspartato-aminotransferase são codificados por um ppc e aspC, respectivamente.

7. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo ser E.coli.

8. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo estar identificado pelos números de admissão KCCM11235P ou KCCM11236P.

9. Método para a produção de ácido quinolínico, caracterizado por compreender os passos seguintes: (a) criar em cultura um microrganismo recombinante que expresse uma proteína de fusão de L-aspartato-oxidase e quinolinato-sintase ligadas por meio de um ligador em um meio que contenha uma fonte de carbono; e (b) recuperar o ácido quinolínico produzido durante o período de cultura.