BR112016028527B1

BR112016028527B1 - Micro-organismo produtor de o-acetil-homoserina e método para produção de o-acetil homoserina usando o mesmo

Info

Publication number: BR112016028527B1
Application number: BR112016028527-1A
Authority: BR
Inventors: Jee Yeon Bae; Hyun Ah Kim; Yong Uk Shin; So Young Kim; Sang Kyoum Kim; Kwang Ho Na; Ju Hee Seo; Sung Kwang Son; Hye Ryun Yoo; Jin Geun Choi
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2023-11-14
Also published as: SG10201806655TA; US10501763B2; JP2017516485A; BR112016028527A2; CN106574237B; KR101825777B1; KR20150140507A; JP6375391B2; AU2015269041B2; SG11201610171VA; US20170137853A1; AU2015269041A1; CN106574237A; RU2710323C2; RU2018132244A3; EP3153574A1; RU2016149077A3; RU2016149077A; RU2676137C2; WO2015186990A1

Abstract

MICRO-ORGANISMO PRODUTOR DE O - ACETIL-HOMOSERINA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE O-ACETIL HOMOSERINA USANDO O MESMO A presente descrição refere-se a um micro-organismo produtor de O-acetil homoserina de elevada eficiência e a um método para produzir Oacetil homoserina e L-metionina usando o micro-organismo. A presente descrição fornece um microorganismo produtor de O-acetil homoserina que tem uma atividade aumentada de uma proteína a qual é prevista como exportando O-acetil homoserina e um método para produção der O-acetil homoserina e L-metionina usando o micro-organismo.

Description

[01] Campo Técnico

[02] A presente descrição se refere a um micro-organismo produtor de O- acetil-homoserina com elevado rendimento e a um método para a produção de O-acetil-homoserina usando o micro-organismo.

[03] Técnica Antecedente

[04] A O-acetil-homoserina atua como um precursor da metionina, o qual é um tipo de aminoácido essencial no corpo. A metionina é usada não apenas como aditivo para alimentos e rações, mas também como matéria-prima para soluções de infusão e fármacos.

[05] A metionina é produzida por meio de sínteses químicas e biológicas. Recentemente, foi publicado um processo em duas etapas para produzir L- metionina a partir de um precursor de L-metionina, o qual foi produzido através de fermentação, por meio de conversão enzimática (Publicação Internacional N° WO 2008/013432).

[06] O processo em duas etapas emprega O-succinil-homoserina e O- acetil-homoserina como precursores e é muito importante produzir O-acetil- homoserina com elevado rendimento com o objetivo de produção em massa econômica.

[07] Descrição

[08] Problema Técnico

[09] Sob as circunstâncias, os presentes inventores desenvolveram esforços para melhorar a produção de O-acetil-homoserina e, como um resultado, descobriram uma proteína capaz de exportar O-acetil-homoserina, deste modo, concluindo a presente descrição.

[10] Solução Técnica

[11] Um objetivo da presente descrição é fornecer um micro-organismo com uma produtividade otimizada de O-acetil-homoserina.

[12] Outro objetivo da presente descrição é fornecer um método para a produção eficiente de O-acetil-homoserina usando o micro-organismo que tem uma produtividade otimizada de O-acetil-homoserina.

[13] Efeitos Vantajosos da Invenção

[14] O micro-organismo da presente descrição com uma atividade otimizada de YjeH, isto é, uma proteína da membrana interna, tem uma capacidade aprimorada de exportar O-acetil-homoserina e, assim, a eficiência da produção de O-acetil-homoserina pode ser aumentada. Deste modo, o microorganismo da presente descrição pode ser amplamente usado para a produção de O-acetil-homoserina.

[15] Descrição dos Desenhos

[16] A Figura 1 mostra um mapa de clivagem do vetor yjeH (vetor pBAC- yjeH) de acordo com a presente descrição.

[17] Melhor Modo

[18] Um aspecto da presente descrição fornece um micro-organismo que tem produtividade de O-acetil-homoserina, em que a atividade de YjeH, isto é, uma proteína da membrana interna, é otimizada comparado com um microorganismonão modificado.

[19] Conforme usado aqui, o termo "O-acetil-homoserina" se refere a um derivado de acetila de L-homoserina, o qual é um material intermediário específico na via biossintética de metionina em micro-organismos. Sabe-se que a O-acetil-homoserina é produzida por uma reação entre homoserina e acetil- CoA catalisada por homoserina acetiltransferase. Ela tem uma fórmula química de C6H11NO4.

[20] Conforme usado aqui, o termo "um micro-organismo que tem produtividade de O-acetil-homoserina" se refere a um micro-organismo o qual, quando cultivado em um meio de cultura, pode produzir O-acetil-homoserina dentro de um bio-organismo e secretá-la no meio de cultura. A produtividade de O-acetil-homoserina pode ser conferida ou otimizada por meio de melhoramento de espécies. Especificamente, o micro-organismo que tem produtividade de O- acetil-homoserina pode ser um micro-organismo do gênero Escherichia que tem produtividade de O-acetil-homoserina e, mais especificamente, E. coli. Por exemplo, o micro-organismo pode ser E. coli que tem produtividade de lisina, treonina, isoleucina ou metionina, porém sem limitações aos mesmos. Conforme usado aqui, o termo "YjeH"é conhecido como uma proteína a qual, sendo um membro da família de Aminoácidos-Poliamina-Organocátions (Acid-Polyamine- Organocation - APC) para transportadores de aminoácidos, está presente em uma membrana interna. Espera-se que a YjeH atue como um transportador de aminoácidos, mas sua função exata ainda não é conhecida. Como tal, os presentes inventores confirmaram primeiro que YjeH exporta especificamente O- acetil-homoserina.

[21] Especificamente, YjeH pode ser derivado a partir de um microorganismo do gênero Escherichia e, mais especificamente, E. coli. Em particular, YjeH pode ser uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia de 70 % ou mais, especificamente 80 % ou mais ou, mais especificamente 90 % ou mais, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Adicionalmente, é evidente que qualquer sequência de aminoácidos que tenha a mesma sequência de aminoácidos conforme aquela de SEQ ID NO: 1 ou qualquer sequência de aminoácidos que tem atividade de exportação de O-acetil-homoserina pode pertencer ao âmbito da presente descrição, embora a sequência possa ter uma eliminação, modificação, substituição ou adição parcial na mesma. Adicionalmente, com base na degenerescência do códon genético, as sequências de nucleotídeos que codificam o mesmo aminoácido e variantes das mesmas pertencem ao âmbito da presente descrição, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2, porém sem limitações à mesma.

[22] Conforme usado aqui, o termo "homologia" se refere a um grau de identidade entre duas sequências diferentes de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos em uma região de comparação particular das sequências de nucleotídeos ou aminoácidos de um gene que codifica uma proteína, após alinhamento de ambas as sequências para uma correspondência máxima. Quando a homologia é suficientemente elevada, os produtos de expressão do gene correspondente podem ter a mesma atividade ou atividade similar. A homologia pode ser determinada usando um programa de comparação de sequências conhecido na técnica, por exemplo, BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc.), etc.

[23] Conforme usado aqui, o termo "um micro-organismo não modificado" se refere a um micro-organismo o qual não é introduzido com uma modificação na atividade da proteína correspondente e o micro-organismo se refere a uma cepa de base a ser introduzida com a modificação na atividade da proteína correspondente, o qual pode ser um micro-organismo nativo ou modificado.

[24] Conforme usado aqui, o termo "otimização"de uma atividade de proteína se refere ao aprimoramento do estado de atividade de proteínas possuídas por um micro-organismo. A otimização de uma atividade de proteína não está limitada, contanto que a atividade de cada proteína possa ser otimizada comparado com aquela de um micro-organismo não modificado, como é o caso com a otimização de atividade de uma proteína alvo. Por exemplo, a otimização pode ser obtida por meio de métodos selecionados do grupo que consiste em i) aumentar o número de cópias de um polinucleotídeo que codifica cada proteína, ii) modificar a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, iii) modificar a sequência de polinucleotídeo no cromossoma para otimizar a atividade de cada proteína; e iv) uma combinação dos mesmos. Especificamente, a otimização de uma atividade de proteína pode ser obtida por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em um método de introdução de uma sequência de nucleotídeos que codifica cada proteína no cromossoma, um método de introdução da sequência de nucleotídeos em um micro-organismo após sua introdução em um vetor, um método de introdução de um promotor que exibe uma atividade aprimorada a montante da sequência de nucleotídeos que codifica cada proteína ou introdução de cada proteína com uma modificação no promotor, um método de modificação da sequência de nucleotídeos da região 5'-UTR e um método de introdução de uma variante da sequência de nucleotídeos que codifica cada proteína, porém, o método não se limita aos mesmos.

[25] Em uma concretização específica da presente descrição, a atividade de YjeH pode ser otimizada comparado com aquela de um micro-organismo não modificado, ao aumentar o número de cópias ou otimizar a atividade de um determinado promotor. Especificamente, a atividade de YjeH pode ser otimizada ao introduzir um promotor que exibe uma atividade aprimorada para YjeH, a qual é uma membrana interna. Em uma concretização específica da presente descrição, o promotor com uma atividade aprimorada pode incluir, sem limitação, qualquer promotor que tenha uma atividade aprimorada comparado com aquela do autopromotor de yjeH. Exemplos de tal promotor podem incluir, sem limitação, qualquer promotor de um gene que tem uma atividade mais elevada de expressão gênica comparado com aquela do autopromotor de yjeH ou um promotor modificado com uma atividade aprimorada em virtude de modificação do gene no autopromotor de yjeH, etc. Especificamente, o promotor da presente descrição que exibe uma atividade aprimorada pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor icd, um promotor pro e um promotor cysk. Especificamente, o promotor icd pode consistir na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 51; o promotor pro pode consistir na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 52; e o promotor cysk pode consistir na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 53, mas cada um dos promotores pode consistir em uma sequência de nucleotídeos que tem uma homologia de 70 % ou mais, especificamente 80 % ou mais e, mais especificamente, 90 % ou mais, com cada uma das sequências de nucleotídeos acima.

[26] Em um aspecto específico da presente descrição, o micro-organismo do gênero Escherichia que tem produtividade de O-acetil-homoserina pode ser aquele no qual a atividade da cistationina sintase está mais enfraquecida ou inativada. Especificamente, o micro-organismo pode ser aquele no qual a atividade da cistationina sintase está enfraquecida ou inativada comparado com aquela de um micro-organismo não modificado e, especificamente o gene metB, o qual codifica a cistationina sintase, é eliminado, porém sem limitações ao mesmo. A sequência de aminoácidos de metB pode ser obtida a partir de um banco de dados conhecido e qualquer sequência de aminoácidos que tem a atividade de cistationina sintase pode ser incluída sem limitação, por exemplo, ela pode se referir a uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. A proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 pode ser uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, porém sem limitações à mesma. Adicionalmente, em outro aspecto da presente descrição, o micro-organismo do gênero Escherichia pode ser um no qual a atividade de homoserina quinase seja mais enfraquecida ou inativada. Especificamente, o micro-organismo pode ser aquele no qual a atividade de homoserina quinase é enfraquecida ou inativada comparado com a atividade endógena de um micro-organismo não modificado e, especificamente, um no qual o gene thrB, o qual codifica a homoserina quinase, é eliminado, porém sem limitações ao mesmo. A sequência de aminoácidos de thrB pode ser obtida a partir de um banco de dados conhecido e qualquer sequência de aminoácidos que tem a atividade de homoserina quinase pode ser incluída sem limitação, por exemplo, ela pode se referir a uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. A proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 pode ser uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, porém sem limitações à mesma.

[27] Na presente descrição, o "enfraquecimento" da atividade da proteína pode ser realizado por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em i) eliminar uma parte ou totalidade do gene que codifica cada proteína, ii) modificar a sequência de controle de expressão para diminuir a expressão do gene, iii) modificar a sequência do gene no cromossoma para enfraquecimento de atividade da proteína; e iv) uma combinação deste, porém sem limitações aos mesmos.

[28] Especificamente, o termo "enfraquecimento de uma atividade de proteína"se refere a uma diminuição na atividade de uma enzima comparado com a atividade endógena da enzima possuída por um micro-organismo em seu estado de cepa de base ou natural. O enfraquecimento é um conceito que inclui um caso onde há uma diminuição na atividade de uma enzima em um microorganismo comparado com aquela originalmente possuída pela enzima em si em virtude de uma modificação do gene que codifica a enzima, etc., um caso quando o nível da atividade enzimática global em uma célula é menor do que aquela da cepa de tipo selvagem em virtude de inibição de expressão ou inibição de tradução do gene que codifica a enzima ou um caso combinado destes, porém sem limitações aos mesmos.

[29] A "inativação"se refere a um caso quando o gene que codifica a enzima em um micro-organismo não é expresso de forma alguma e a um caso quando o gene é expresso, porém, não exibe atividade comparado com aquela da cepa de tipo selvagem.

[30] A inativação de uma enzima pode ser obtida ao aplicar vários métodos conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos podem incluir um método de substituição do gene que codifica a enzima no cromossoma por um gene com mutação para reduzir a atividade da enzima, incluindo o caso quando a atividade enzimática é eliminada; um método de introdução de uma modificação na sequência de controle de expressão do gene que codifica a enzima no cromossoma; um método para substituir a sequência de controle de expressão do gene que codifica a enzima por uma sequência com atividade fraca ou nula; um método de eliminação da totalidade ou de uma parte do gene que codifica a enzima no cromossoma; um método de introdução de um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, ARN antissenso) que se liga de forma complementar a um transcrito do gene no cromossoma, deste modo, inibindo a tradução do ARNm a partir da enzima; um método de incorporação artificial de uma sequência complementar à sequência SD a montante da sequência SD do gene que codifica a enzima, formando uma estrutura secundária, deste modo, tornando impossível a fixação de ribossomo à mesma; um método de incorporação de um promotor na extremidade 3' do quadro de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF) da sequência correspondente para induzir a uma transcrição reversa (engenharia de transcrição reversa (Reverse Transcription Engineering - RTE), etc., e também uma combinação destes, porém sem limitações aos mesmos.

[31] Especificamente, o método de eliminação da totalidade ou de uma parte de um gene que codifica uma enzima pode ser realizado ao substituir o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena dentro do cromossoma por um polinucleotídeo ou um gene marcador com uma eliminação parcial na sequência de ácido nucleico usando um vetor para inserção cromossômica dentro de uma cepa. Em uma concretização exemplificativa do método de eliminação de uma parte ou totalidade de um gene, pode ser usado um método para eliminação de um gene por meio de recombinação homóloga, porém sem limitação ao mesmo.

[32] Conforme usado aqui, o termo "uma parte" pode variar dependendo dos tipos de polinucleotídeos e pode se referir especificamente a 1 a 300, mais especificamente a 1 a 100 e, ainda mais especificamente, 1 a 50, porém sem limitação aos mesmos.

[33] Conforme usado aqui, o termo "recombinação homóloga"se refere à recombinação genética que ocorre através de cruzamento em um locus de uma cadeia de genes que tem uma homologia mútua.

[34] Especificamente, a sequência reguladora de expressão pode ser modificada por meio de indução de uma modificação da sequência de controle de expressão através de eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservativa ou uma combinação dos mesmos para enfraquecer ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão; ou através de substituição por um promotor que tem atividade muito mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica uma região de ligação ao ribossomo e sequências que controlam o término de transcrição e tradução, porém sem limitações aos mesmos.

[35] Além disso, a sequência gênica no cromossoma pode ser modificada por meio de indução de uma modificação na sequência através de eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservativa ou uma combinação dos mesmos na sequência gênica para enfraquecimento adicional da atividade enzimática; ou através de substituição por uma sequência gênica a qual foi aprimorada para ter uma atividade mais fraca ou uma sequência gênica a qual foi aprimorada para não ter atividade, porém sem limitações aos mesmos.

[36] Em uma concretização específica da presente descrição, a atividade de cada proteína foi enfraquecida ao eliminar o gene metB que codifica a cistationina sintase e/ou o gene thrB por meio de recombinação homóloga.

[37] Além disso, em uma concretização específica da presente descrição, o micro-organismo do gênero Escherichia pode ser um no qual, adicionalmente, a atividade de homoserina acetiltransferase é otimizada comparado com aquela de um micro-organismo não modificado. Especificamente, o micro-organismo pode ser aquele no qual a atividade de homoserina acetiltransferase é aumentada comparado com aquela de um micro-organismo não modificado e, em particular, o micro-organismo pode ser um no qual é introduzido um gene metA modificado que codifica a homoserina acetiltransferase que tem uma atividade otimizada. O gene metA modificado pode ser um gene que codifica a homoserina acetiltransferase no qual o 111° aminoácido da homoserina acetiltransferase é substituído por ácido glutâmico e o 112° aminoácido é substituído por histidina e, em particular, um gene que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8, porém sem limitações ao mesmo. O gene metA modificado pode incluir, sem limitação, qualquer aminoácido no qual a atividade de homoserina acetiltransferase é otimizada comparado com aquela do tipo selvagem, por exemplo, uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Uma concretização exemplificativa em relação à preparação, uso do gene metA modificado, uma cepa com uma atividade otimizada de homoserina acetiltransferase, etc., é descrita na Patente Coreana N° 10- 1335841, e a totalidade da Patente Coreana pode ser incluída como uma referência à presente descrição.

[38] Adicionalmente, em um aspecto específico da presente descrição, o micro-organismo do gênero Escherichia pode ser um no qual a atividade de aspartato quinase (EC 2.7.2.4) é otimizada comparado com aquela de um microorganismonão modificado. Especificamente, o micro-organismo pode ser um no qual a atividade de aspartato quinase é aumentada comparado com a atividade endógena do micro-organismo, porém sem limitações ao mesmo.

[39] Em uma concretização específica da presente descrição, a via biossintética foi otimizada ainda mais com a finalidade de maximizar a produtividade de O-acetil-homoserina. Especificamente, a aspartato quinase e a homoserina O-acetiltransferase foram introduzidas usando um plasmídeo e a alteração na produtividade de O-acetil-homoserina foi medida após otimizar ainda mais a YjeH na cepa com uma via biossintética otimizada para homoserina. Como um resultado da otimização simultânea da via biossintética e de yjeH, confirmou-se que a produtividade de O-acetil-homoserina foi ainda mais aprimorada. Em particular, confirmou-se que, quando a atividade de YjeH foi otimizada usando o promotor cysk, a produtividade de YjeH aumentou cerca de 93 % (2,8 g/L ^ 5,4 g/L) (Tabela 5).

[40] Adicionalmente, em uma concretização específica da presente descrição, foi examinado se a otimização da atividade de YjeH em uma cepa existente que tem produtividade de O-acetil-homoserina de elevado rendimento pode aumentar ainda mais sua produtividade de O-acetil-homoserina. Mais especificamente, a quantidade de produção de O-acetil-homoserina foi examinada usando uma cepa KCCM11146P (Publicação Internacional N° WO2012/087039) produtora de O-acetil-homoserina preparada a partir da cepa que tem produtividade de treonina por meio de mutação NTG, a qual é uma derivada de W3110 de tipo selvagem após substituição do promotor do gene yjeH endógeno por um promotor com elevada atividade indutora da expressão. Como um resultado, confirmou-se que a cepa, a qual já tem produtividade de O- acetil-homoserina de elevado rendimento, pode aumentar ainda mais a atividade de produção de O-acetil-homoserina ao otimizar a atividade de YjeH em cerca de 14 % (14,2 g/L ^ 18,2 g/L) e, em particular, ao otimizar a atividade de YjeH usando o promotor cysk (Tabela 7).

[41] A informação sobre os genes usados na presente descrição, as sequências das proteínas codificadas pelos genes e as sequências promotoras pode ser obtida a partir de um banco de dados conhecido, por exemplo, o NCBI GenBank, porém sem limitações ao mesmo.

[42] Os genes que codificam cada uma das proteínas e promotores da presente descrição incluem não apenas as sequências de nucleotídeos representadas por cada uma das SEQ ID NOS., mas também incluem, sem limitação, qualquer sequência gênica que tenha uma homologia de 80 % ou mais, especificamente 90 % ou mais, mais especificamente 95 % ou mais, ainda mais especificamente 98 % ou mais e, mais especificamente 99 % ou mais, contanto que a sequência gênica codifique uma enzima a qual exibe substancialmente o mesmo efeito que ou que corresponde àquele de cada uma das enzimas descritas acima. Adicionalmente, é óbvio que qualquer sequência de nucleotídeos que tem a homologia de sequência acima também deve pertencer ao âmbito da presente descrição, embora o aminoácido possa ter eliminação, modificação, substituição ou adição em uma parte da sequência.

[43] Adicionalmente, é óbvio que qualquer aminoácido que constitui cada uma das proteínas acima da presente descrição também deve pertencer ao âmbito da presente descrição, embora o aminoácido possa ter eliminação, modificação, substituição ou adição em parte da sequência, contanto que o aminoácido tenha a mesma sequência representada por cada uma das SEQ ID NOS. ou tenha uma homologia com as mesmas, enquanto tem substancialmente o mesmo efeito que ou que corresponde àquele de cada uma das proteínas.

[44] O efeito de aumentar uniformemente a produtividade de O-acetil- homoserina por meio de otimização da atividade de YjeH foi confirmado com base em micro-organismos que têm vários antecedentes genéticos e produtividades de O-acetil-homoserina. Isto pode ocorrer ao promover a produção de um material intermediário específico por YjeH na via biossintética. No entanto, considerando as características de YjeH, a qual é uma membrana interna e um tipo de família de transportadores de aminoácidos, acredita-se que o aumento da produtividade de O-acetil-homoserina seja alcançado ao aumentar a capacidade de exportar O-acetil-homoserina, a qual é um produto final e um tipo de aminoácido, deste modo, promovendo reações intracelulares.

[45] Em ainda outro aspecto da presente descrição, a presente descrição fornece um método para produzir O-succinil-homoserina que inclui cultura de um micro-organismo do gênero Escherichia produtor de O-acetil-homoserina da presente descrição e a recuperação do meio de cultura.

[46] O meio usado para cultivar o micro-organismo da presente descrição e outras condições de cultura não estão particularmente limitados, porém, pode ser usado qualquer meio empregado para a cultura convencional do microorganismo do gênero Escherichia. Especificamente, o micro-organismo da presente descrição pode ser cultivado em um meio convencional que contém fontes de carbono, fontes de nitrogênio, fontes de fósforo, compostos inorgânicos, aminoácidos e/ou vitaminas apropriados, etc., em uma condição aeróbia, enquanto se ajusta a temperatura, pH, etc.

[47] Na presente descrição, as fontes de carbono podem incluir carboidratos (por exemplo, glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol, etc.); álcoois (por exemplo, álcool de açúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido cítrico, etc.); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico, metionina, lisina, etc.); etc., porém sem limitações aos mesmos. Adicionalmente, as fontes de carbono podem incluir nutrientes orgânicos naturais, tais como hidrolisado de amido, melaço, melaço "blackstrap", farelo de arroz, mandioca, melaço de cana-de-açúcar, licor da maceração de milho, etc. Especificamente, carboidratos, tais como glicose e melaços pré-tratados esterilizados (isto é, melaços convertidos para reduzir o açúcar) podem ser usados e, além disso, podem ser usadas várias outras fontes de carbono em uma quantidade apropriada sem limitações. Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente ou em combinação de pelo menos dois tipos.

[48] Exemplos das fontes de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio inorgânicas (por exemplo, amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, carbonato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, etc.); aminoácidos (ácido glutâmico, metionina, glutamina, etc.); e fontes de nitrogênio orgânicas (por exemplo, peptona, amina N-Z, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor da maceração de milho, hidrolisado de caseína, peixe ou produto da decomposição do mesmo, bolo de soja sem gordura ou produto da decomposição do mesmo, etc.). Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou em combinação de pelo menos dois tipos, porém sem limitações aos mesmos.

[49] Exemplos das fontes de fósforo podem incluir fosfato monopotássico, fosfato dipotássico e sais correspondentes que contêm sódio. Exemplos de compostos inorgânicos a serem usados podem incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês, carbonato de cálcio, etc. Adicionalmente, podem ser incluídos aminoácidos, vitaminas e/ou precursores apropriados. Estes meios ou precursores podem ser adicionados em um processo de cultura descontínua ou em um processo de cultura contínua a uma cultura, porém sem limitações aos mesmos.

[50] Na presente descrição, o pH de uma cultura pode ser ajustado durante a cultura por meio da adição de um composto, tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, à cultura de uma maneira apropriada. Durante a cultura, também pode ser adicionado um agente antiespuma, tal como éster de poliglicol de ácido graxo, para evitar a produção de espuma. Adicionalmente, oxigênio ou um gás que contém oxigênio pode ser injetado na cultura de modo a manter um estado aeróbico da cultura; ou nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono gasoso podem ser injetados sem a injeção de um gás de modo a manter um estado anaeróbico ou microaeróbico da cultura.

[51] A temperatura da cultura pode, em geral, estar em uma faixa a partir de 27 °C a 37 °C e, mais especificamente, a partir de 30 °C a 35 °C, porém sem limitações à mesma. A cultura pode ser continuada até se obter a quantidade desejada de materiais úteis e, especificamente, durante a partir de 10 horas a 100 horas, porém sem limitações ao mesmo.

[52] O método de produção de O-acetil-homoserina da presente descrição pode ainda incluir um método de recuperação de O-acetil-homoserina a partir do micro-organismo cultivado ou do meio de cultura.

[53] Especificamente, a recuperação de O-acetil-homoserina pode ser realizada por meio de um método de cultura de micro-organismos da presente descrição, por exemplo, um método apropriado conhecido na técnica, tal como um processo descontínuo, um processo descontínuo contínuo ou um processo em batelada alimentada.

[54] A recuperação pode incluir um processo de purificação.

[55] A O-acetil-homoserina assim recuperada pode ser usada para produzir metionina por meio de um processo em duas etapas desenvolvido pelos presentes inventores (Patente Coreana N° 10-0905381), isto é, um processo em duas etapas.

[56] O processo em duas etapas inclui um processo para a produção de L-metionina e ácidos orgânicos através de uma reação enzimática usando uma enzima que tem a atividade de O-acetil-homoserina sulfidrilase ou uma cepa que contém a enzima usando O-acetil-homoserina produzida por uma cepa produtora do precursor L-metionina e metil mercaptano como substratos.

[57] Mais especificamente, a presente descrição fornece um método para produzir L-metionina por meio de uma reação enzimática usando uma enzima tal como O-acetil-homoserina sulfidrilase ao empregar a O-acetil-homoserina acumulada pelo método acima como substrato.

[58] No processo em duas etapas, quando a O-acetil-homoserina é usada como um precursor de L-metionina, especificamente, a O-acetil-homoserina sulfidrilase derivada a partir de uma cepa de micro-organismo pertencente ao gênero Leptospira, ao gênero Chromobacterium e ao gênero Hyphomonas e, mais especificamente, a partir de uma cepa de micro-organismo pertencente a Leptospira meyeri, Pseudomonas aurogenosa, Hyphomonas neptunium e Chromobacterium violaceum, pode ser usada.

[59] A reação é mostrada abaixo.

[60] CH3SH + O-acetil-L-homoserina ? acetato + metionina

[61] Tal processo adicional de produção de metionina é descrito na Patente Coreana N° 10-0905381, e todo o relatório descrito da Patente Coreana acima pode ser incluído como uma referência à presente descrição.

[62] Modo para a Invenção

[63] Daqui em diante, a presente descrição será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos e a descrição não se destina a estar limitada por estes Exemplos.

[64] Exemplo 1: Preparação de cepas que têm produtividade de O- acetil-homoserina

[65] 1-1. Eliminação do gene metB em E. coli de tipo selvagem

[66] Para a preparação de uma cepa produtora de O-acetil-homoserina, E. coli, um micro-organismo representativo do gênero Escherichia, foi usado. Para esta finalidade, uma E. coli de tipo selvagem (K12) W3110 (ATCC27325) foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e usada. Primeiro, para bloqueio da via de produção de cistationina a partir de O-succinil-L- homoserina, o gene metB (SEQ ID NO: 4) que codifica cistationina sintase foi eliminado.

[67] Especificamente, um método de eliminação por PCR em uma etapa FRT foi usado para a eliminação do gene metB (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000). Uma cassete de eliminação foi preparada ao executar a PCR com base no vetor pKD3 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) como um modelo usando os iniciadores TKd de SEQ ID NOS: 13 e 14. Em particular, a PCR foi realizada durante um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 1 min.

[68] O produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 1,2 kb foi purificado. O fragmento de ADN recuperado foi introduzido na cepa (K12) W3110 de E. coli, a qual já foi transformada com o vetor pKD46 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) através de eletroporação. A cepa W3110 transformada com pKD46 foi cultivada usando meio LB que contém ampicilina (100 µg/L) e L-arabinose (5 mM) até que a cultura atingisse uma OD600 = 0,6 a 30°C e usada após lavagem duas vezes com agua destilada estéril e uma vez com glicerol a 10 %. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi espalhada sobre um meio de placa LB que contém cloranfenicol (25 µg/L), cultivada durante a noite a 37 °C e as cepas resistentes foram selecionadas.

[69] A PCR foi realizada usando a cepa assim selecionada como um modelo juntamente com os mesmos iniciadores (SEQ ID NOS: 13 e 14) e a eliminação do gene metB foi confirmada pela observação da presença de uma banda gênica de 1,2 kb sobre um gel de agarose a 1,0 %. A cepa, na qual a eliminação do gene metB foi confirmada, foi transformada com o vetor pCP20 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) e cultivada no mesmo meio LB. Em seguida, PCR foi realizada sob as mesmas condições, seguido por eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % para observar a presença de uma banda gênica de 1,2 kb, assim, confirmando a eliminação do gene metB. A cepa, após confirmação da eliminação, foi transformada com vetor pCP20 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) e cultivada no mesmo meio LB. Em seguida, PCR foi realizada sob as mesmas condições, seguido por eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % para selecionar a cepa final com a eliminação do gene metB representada pela banda gênica, a qual foi reduzida para um tamanho de 150 pb, deste modo, confirmando a remoção do marcador cloranfenicol da cepa.

[70] A cepa assim preparada e selecionada, com a eliminação do gene metB, que codifica a cistationina sintase foi denominada "W3-B".

[71] 1-2. Eliminação do gene thrB

[72] Para aumentar a quantidade de síntese de O-succinil-homoserina a partir da cepa W3-B preparada no Exemplo 1-1, o gene thrB (SEQ ID NO: 6) que codifica a homoserina quinase foi eliminado da cepa. Para a eliminação do gene thrB, o mesmo método de eliminação por PCR em uma etapa FRT, o qual foi usado na eliminação do gene metB no Exemplo 1-1, foi empregado.

[73] Primeiro, para a preparação de uma cassete de eliminação de thrB, a PCR foi realizada usando o vetor pKD4 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) como um modelo e, deste modo, uma cassete de eliminação foi preparada. Especificamente, a PCR foi realizada usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16 para um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 1 min.

[74] O produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 1,6 kb foi purificado. O fragmento de ADN recuperado foi introduzido na cepa W3-B, a qual já foi transformada com o vetor pKD46 por meio de eletroporação. A cepa recuperada foi espalhada em meio de placa LB que contém canamicina (50 µg/L), cultivada durante a noite a 37 °C e as cepas resistentes foram selecionadas.

[75] A PCR foi realizada sob as mesmas condições usando a cepa selecionada através do processo acima como um modelo juntamente com iniciadores (SEQ ID NOS: 15 e 16) e a eliminação do gene thrB foi confirmada ao observar a presença de um gene de 1,6 kb sobre um gel de agarose a 1,0 %. A cepa confirmada foi novamente transformada com o vetor pCP20 e foi cultivada em meio LB e, em seguida, a PCR foi realizada sob as mesmas condições, seguido por eletroforese em um gel de agarose a 1,0 %, para selecionar a cepa final com a eliminação do gene thrB representada pela banda gênica, a qual foi reduzida para um tamanho de 150 pb, deste modo, confirmando a remoção do marcador canamicina da cepa. A cepa assim preparada e selecionada, com a eliminação do gene thrB, que codifica a homoserina quinase foi designada "W3-BT".

[76] Concretizações exemplificativas com relação às cepas com a eliminação do gene metB e do gene thrB, etc., são descritas na Patente Coreana N° 10-0905381 ou Publicação Internacional N° WO 2008/013432, e todo o relatório descritivo da Patente Coreana ou a Publicação de Patente Internacional pode ser incluída aqui como uma referência à presente descrição.

[77] 1-3. Preparação de uma cepa com gene metA modificado que tem uma atividade de homoserina acetiltransferase

[78] Para otimizar a atividade de homoserina acetiltransferase na cepa preparada no Exemplo 1-2, foi feita uma tentativa para introduzir um gene metA modificado (SEQ ID NO: 8), o qual codifica a homoserina acetiltransferase, com uma atividade otimizada na cepa.

[79] A este respeito, para a preparação de um gene metA modificado com uma atividade otimizada, o gene metA foi primeiro amplificado e obtido por meio de PCR usando o cromossomo da cepa W3110 como modelo juntamente com iniciadores (SEQ ID NOS: 17 e 18). Os iniciadores (SEQ ID NOS: 17 e 18) usados na PCR foram preparados para incluir um sítio de restrição EcoRV e um sítio de restrição HindIII, respectivamente, com base na sequência de nucleotídeos do cromossomo de E. coli de NC_000913 registrada no NIH GenBank.

[80] O produto de PCR assim obtido e o plasmídeo pCL1920 que inclui pcj1 foram tratados com EcoRV e HindIII e clonados. E. coli DH5a foi transformada com o plasmídeo clonado e cultivada em meio de placa LB que contém espectinomicina (50 µg/L) e a E. coli DH5a transformada foi selecionada e, deste modo, o plasmídeo foi obtido. O plasmídeo assim obtido foi denominado como "pCL_Pcj1_metA".

[81] Um gene metA modificado foi preparado usando o kit de mutagênese sítio dirigida (Stratagene, EUA) com base no pCL_Pcj1_metA obtido acima. Especificamente, o 111° aminoácido (Gly) de homoserina acetiltransferase foi substituído por ácido glutâmico (Glu) (G111E). O plasmídeo assim preparado foi denominado "pCL_Pcj1_metA(EL)".

[82] Adicionalmente, o 111° aminoácido (Gly) da homoserina acetiltransferase foi substituído por ácido glutâmico (Glu) e, adicionalmente, o 112° aminoácido (Leu) foi substituído por histidina (His) usando os iniciadores (SEQ ID NOS: 21 e 22). Consequentemente, o plasmídeo que inclui o gene metA, no qual o 111° aminoácido foi trocado de glicina para ácido glutâmico e o 112° aminoácido foi trocado de leucina para histidina, foi designado como "pCL_Pcj1_metA(EH)".

[83] Então, para preparar uma cassete de substituição para substituir com o gene metA modificado após sua introdução em uma cepa, PCR foi realizada usando o vetor pKD3 como um modelo juntamente com iniciadores (SEQ ID NOS: 27 e 28) durante um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 2 min. A parte metA(EH) da cassete de substituição foi obtida como um produto de PCR usando pCL-Pcj1-metA(EH) como um modelo juntamente com iniciadores (SEQ ID NOS: 23 e 24) e a parte do metA de tipo selvagem foi obtida usando iniciadores (SEQ ID NOS: 25 e 26), respectivamente. Os três produtos de PCR foram usados para a preparação da cassete de substituição metA(EH), o qual inclui um marcador cloranfenicol, usando iniciadores (SEQ ID NOS: 23 e 26) e o gene metA modificado foi introduzido na cepa W3-BT, a qual já foi transformada com o vetor pKD46, preparado no Exemplo 1-2 por meio de eletroporação. A cepa, na qual a introdução foi confirmada, foi novamente transformada com o vetor pCP20, cultivada em meio LB e a cepa na qual o marcador cloranfenicol foi removido e o gene metA foi substituído por metA(EH) foi designada como "W3-BTA".

[84] Concretizações exemplificativas com relação às cepas com atividade otimizada de homoserina acetiltransferase, etc., são descritas na Patente Coreana N° 10-1335841 ou Publicação Internacional N° WO 2012/087039, e todo o relatório descritivo da Patente Coreana ou a Publicação de Patente Internacional pode ser incluída aqui como uma referência à presente descrição.

[85] 1-4. Preparação de cepas que incluem 2 cópias dos genes ppc, aspC e asd

[86] Para aumentar a produtividade de O-acetil-homoserina de W3-BTA preparada no Exemplo 1-3, a estratégia existente para otimização da via biossintética foi introduzida. Foram realizados esforços para preparar uma cepa, na qual a fosfoenolpiruvato carboxilase, envolvida na biossíntese de oxaloacetato a partir de fosfoenolpiruvato, aspartato aminotransferase, envolvida na biossíntese de aspartato a partir de oxaloacetato, e aspartato-semialdeído desidrogenase, envolvida na biossíntese de homoserina a partir de aspartato- semialdeído desidrogenase, o gene ppc, o gene aspC e o gene asd) foram amplificados em 2 cópias.

[87] Consequentemente, o gene ppc foi amplificado em 2 cópias usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 29, 30, 31 e 32; o gene aspC foi amplificado em 2 cópias usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 33 e 34; e o gene asd foi amplificado em 2 cópias usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 35, 36, 37 e 38, respectivamente.

[88] A cepa, na qual a via biossintética para O-acetil-homoserina foi otimizada com base na cepa W3-BTA por meio do processo supracitado, foi designada como "W3-BTA2PCD (= WCJM)".

[89] Concretizações exemplificativas com relação a cepas com atividade otimizada de homoserina acetiltransferase, etc., são descritas na Patente Coreana N° 10-0905381 ou na Publicação Internacional N° WO 2008/013432, e todo o relatório descritivo da Patente Coreana ou a Publicação de Patente Internacional pode ser incluída aqui como uma referência à presente descrição.

[90] 1-5. Experimento de cultura em frasco

[91] Para o experimento da quantidade de produção de O-acetil- homoserina pelas cepas preparadas nos Exemplos 1-3 e 1-4, foi realizada uma cultura em frasco de Erlenmeyer. As cepas W3110, W3-BTA e WCJM foram inoculadas em meio LB, cultivadas a 33 °C de um dia para o outro. Então, uma única colônia foi inoculada em meio LB (3 mL), cultivada a 33 °C durante 5 horas, novamente diluída 200 vezes em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL que contém 25 mL de meio para produzir O-acetil-homoserina, cultivada a 33 °C em uma velocidade de 200 rpm durante 30 horas e a quantidade de produção de O- acetil-homoserina foi confirmada através de análise por HPLC. A composição de meio usada está resumida na Tabela 1 abaixo.

[92] Tabela 1. Composição para meio de frasco para produção de O-acetil-

[093] As cepas foram cultivadas no meio acima durante 30 horas e as quantidades de produção de O-acetil-homoserina foram confirmadas através de análise por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[94] Tabela 2. Produção de O-acetil-homoserina por meio de cultura em frasco

[95] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 2, a cepa W3110 de tipo selvagem não produziu O-acetil-homoserina, no entanto, a cepa W3-BTA produziu O-acetil-homoserina em uma concentração de 0,9 g/L e a cepa WCJM, na qual a via biossintética é otimizada, produziu O-acetil-homoserina em uma concentração de 1,2 g/L.

[96] Exemplo 2: Identificação de proteínas da membrana que aumentam a produtividade de O- acetil-homoserina

[97] Os presentes inventores aplicaram yjeH (SEQ ID NO: 1), cuja associação com a exportação de O-acetil-homoserina e a produtividade de O- acetil-homoserina nunca foi revelada.

[98] O gene yjeH de uma cepa foi otimizado por meio de clonagem do gene yjeH no vetor bac usando o sítio de restrição HindIII presente no vetor bac. Para o vetor bac, o kit CopyControl BAC Cloning (Cat. N° CCBAC1H-HindIII, Epicentro) foi usado.

[99] Primeiro, para a obtenção do gene yjeH, PCR foi realizada usando iniciadores (SEQ ID NOS: 9 e 10) durante um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 68 °C durante 1 min. O produto de PCR resultante foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 1,2 kb foi purificado. O ADN purificado foi tratado com HindIII a 37 °C de um dia para o outro, purificado mais uma vez e yjeH e o vetor BAC foram clonados usando T4 ligase. A E. coli DH5a foi transformada com o plasmídeo clonado e a E. coli DH5a transformada foi selecionada a partir de meio de placa LB que contém cloranfenicol a 50 µg/mL. O plasmídeo assim preparado foi introduzido nas cepas W3-BTA e WCJM, as quais produzem O- acetil-homoserina, e a avaliação do frasco quanto à sua produtividade de O- acetil-homoserina foi realizada. [100] O produto de PCR resultante foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 1,2 kb foi purificado. O ADN purificado foi tratado com HindIII a 37 °C de um dia para o outro, purificado mais uma vez e yjeH e o vetor BAC foram clonados usando T4 ligase. E. coli DH5a foi transformada com o plasmídeo clonado e a E. coli DH5a transformada foi selecionada a partir de meio de placa LB que contém cloranfenicol a 50 µg/mL e um plasmídeo foi obtido a partir disso. O plasmídeo assim preparado foi introduzido nas cepas W3-BTA e WCJM, as quais produzem O-acetil-homoserina, e a avaliação do frasco quanto à sua produtividade de O- acetil-homoserina foi realizada. [101] Especificamente, cada cepa foi espalhada em meio LB sólido e cultivada em uma incubadora a 33 °C de um dia para o outro. As colônias individuais para cada cepa cultivada em meio LB sólido de um dia para o outro foram inoculadas em meio LB (3 mL), cultivadas a 33 °C durante 5 horas. Novamente, o produto resultante foi diluído 200 vezes em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL que contém 25 mL de meio para produzir O-acetil- homoserina, cultivado a 33 °C em uma velocidade de 200 rpm durante 30 horas e a quantidade de produção de O-acetil-homoserina foi confirmada através de análise por HPLC. Os resultados são resumidos na Tabela 3 abaixo. [102] Tabela 3. Medição da produção de O-acetil-homoserina através de cultura em frasco [103] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 3, a introdução do plasmídeo yjeH na cepa WCJM resultou em um valor de OD mais elevado comparado com aquele da cepa de controle e também uma taxa mais elevada de consumo de glicose. A cepa WCJM/pBAC-yjeH produziu O-acetil-homoserina em uma concentração de 2,3 g/L, assim, confirmando que a cepa pode ter uma produtividade aumentada de O-acetil-homoserina pela introdução de yjeH. [104] Exemplo 3: Preparação de um plasmídeo com promotor yjeH otimizado e avaliação da produtividade de O- acetil-homoserina [105] 3-1. Preparação de um plasmídeo com promotor yjeH otimizado [106] Foi realizado um experimento para substituir o promotor yjeH endógeno por 3 promotores diferentes que têm fortes atividades indutoras de expressão comparados com aquela do promotor yjeH endógeno, com base no plasmídeo preparado no Exemplo 2. [107] Especificamente, os vetores PCL com promotores que têm uma atividade otimizada foram preparados usando o promotor pro, cysk ou icd. Os vetores PCL foram preparados usando o sítio de restrição SmaI do vetor PCL e o promotor icd (SEQ ID NO: 51) foi preparado através de amplificação por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 39 e 40; o promotor pro (SEQ ID NO: 52) usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 41 e 42; e o promotor cysk (SEQ ID NO: 53) usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 43 e 44. Os plasmídeos assim preparados foram introduzidos na cepa WCJM, respectivamente, e suas produtividades de O-acetil-homoserina foram avaliadas em frascos. [108] Especificamente, cada cepa foi espalhada em meio de placa LB e cultivada em uma incubadora a 33 °C de um dia para o outro. Cada cepa cultivada de um dia para o outro em meio de placa LB foi inoculada no meio em uma titulação de 25 mL e cultivada em uma incubadora a 33 °C a 200 rpm de um dia para o outro. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo. [109] Tabela 4. Medição da produção de O-acetil-homoserina através de cultura em frasco [110] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 4, a cepa introduzida com o plasmídeo pCL-Pcysk-yjeH mostrou uma diminuição do valor de OD comparado com aquele do autopromotor, porém, a cepa mostrou uma taxa mais elevada de consumo de glicose e a maior produção de O-acetil-homoserina (4,4 g/L). [111] 3-2. Preparação de um plasmídeo para otimização de um gene e um promotor em uma via biossintética [112] Para maximizar a produtividade de O-acetil-homoserina, foi preparado um plasmídeo para otimização da via biossintética até homoserina. Para a clonagem de aspartato quinase, homoserina O-acetiltransferase e yjeH no vetor PCL, o plasmídeo pCL-thrA-metX foi usado, o qual já estava preparado. [113] Especificamente, para a obtenção do gene yjeH, a PCR foi realizada usando os iniciadores (SEQ ID NOS: 11 e 12) durante um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 seg e extensão a 68 °C durante 1 min. [114] O produto de PCR resultante foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 1,2 kb foi purificado. O ADN purificado foi tratado com KpnI a 37 °C de um dia para o outro, purificado mais uma vez e yjeH e o vetor BAC foram clonados usando T4 ligase. A E. coli DH5a foi transformada com o plasmídeo clonado e a E. coli DH5a transformada foi selecionada a partir de meio de placa LB que contém espectinomicina a 50 µg/mL e o plasmídeo foi obtido a partir da mesma. O plasmídeo assim preparado foi introduzido na cepa WCJM, a qual produz O-acetil-homoserina, e a avaliação do frasco quanto à sua produtividade de O-acetil-homoserina foi realizada. Os plasmídeos assim preparados eram todos os 3 tipos e foram preparados usando os 3 promotores diferentes preparados no Exemplo 3-1. Os 3 tipos diferentes de plasmídeos foram introduzidos na cepa WCJM e a avaliação do frasco foi realizada da mesma maneira conforme no Exemplo 3-1. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. [115] Tabela 5. Medição da produção de O-acetil-homoserina através de cultura em frasco [116] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 5, quando a via biossintética e yjeH foram simultaneamente otimizados, a produção de O-acetil- homoserina foi ainda mais aprimorada. A ordem do aumento da produção de O- acetil-homoserina foi a seguinte: da mesma maneira conforme descrito acima, a cepa introduzida com o plasmídeo pC2-Pcysk-yjeH mostrou uma diminuição no valor de OD comparado com aquele da cepa na qual o autopromotor foi usado, porém, a cepa introduzida com o plasmídeo pC2-Pcysk-yjeH mostrou a taxa de consumo de glicose mais elevada e também a produção de O-acetil-homoserina mais elevada (5,4 g/L). [117] Exemplo 4: Preparação de uma cepa com promotor yjeH endógeno aprimorado e avaliação da produtividade de O- acetil-homoserina [118] 4-1. Preparação de uma cepa com yjeH endógeno otimizado e sua avaliação [119] Para a preparação de uma cepa com uma atividade otimizada do gene yjeH endógeno da cepa WCJM, a qual produz O-acetil-homoserina, foi realizado um experimento de substituição de um promotor. A cepa WCJM da presente descrição tem uma cópia do gene yjeH e a cepa foi preparada para aumentar o gene yjeH ao otimizar o promotor em vez de aumentar o número de cópias do gene yjeH. [120] Especificamente, como um promotor para a substituição, os promotores icd, cysK e pro (Picd, Pcysk e Ppro) foram usados, cujas atividades foram confirmadas no Exemplo 3 e o método de eliminação de PCR em uma etapa FRT especificado acima foi usado (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000). As cassetes de inserção foram preparados usando o vetor pKD4 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 45 e 46 para o promotor icd, os iniciadores de SEQ ID NOS: 47 e 48 para o promotor cysk e os iniciadores de SEQ ID NOS : 49 e 50 para o promotor pro. A PCR foi realizada durante um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 1 min. [121] O produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % e o ADN obtido a partir de uma banda de 2,5 kb foi purificado. O fragmento de ADN recuperado foi introduzido na cepa WCJM, a qual já foi transformada com o vetor pKD46 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000), por meio de eletroporação. A cepa WCJM transformada com pKD46 foi cultivada usando meio LB que contém ampicilina A 100 µg/L e L-arabinose A 5 mM até a cultura atingir OD6oo = 0,6 a 30 °C e usada após lavagem duas vezes com água destilada estéril e uma vez com glicerol a 10 %. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi espalhada em meio de placa LB que contém cloranfenicol a 25 µg/L, cultivada de um dia para o outro a 37 °C e as cepas resistentes foram selecionadas. [122] PCR foi realizada usando a cepa assim selecionada como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 45 e 46 para o promotor icd, os iniciadores de SEQ ID NOS: 47 e 48 para o promotor cysk e os iniciadores de SEQ ID NOS: 49 e 50 para o promotor pro sob as mesmas condições descritas acima e a substituição do promotor endógeno do gene yjeH por cada um dos promotores estranhos foi confirmada pela observação da presença de um anticorpo de 2,5 kb em um gel de agarose a 1,0 %. As cepas, nas quais a substituição do promotor foi confirmada, foram transformadas com o vetor pCP20 (Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640 - 6645, 2000) e cultivadas em meio LB. Em seguida, PCR foi realizada sob as mesmas condições, seguido por eletroforese em um gel de agarose a 1,0 % para preparar as cepas finais com a substituição do promotor representado pela banda gênica, a qual foi reduzida para um tamanho de 1 kb, assim, confirmando a remoção do marcador canamicina das cepas. As cepas assim preparadas foram nomeadas de acordo com seu respectivo promotor: isto é, "WCJM-PIY" para a cepa com o promotor de icdsubstituído, "WCJM-PCY" para a cepa com o promotor de cysksubstituído e "WCJM- PCY" para a cepa com o promotor de prosubstituído. As produtividades de O-acetil-homoserina das cepas, nas quais o promotor do gene yjeH foi substituído, foram medidas por meio da avaliação da cultura em frasco e os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo. [123] Tabela 6. Medição da produção de O-acetil-homoserina através de cultura em frasco [124] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 6, quando a expressão do gene yjeH da cepa WCJM foi otimizada ao substituir o promotor endógeno do gene yjeH dentro do cromossomo por um promotor com uma forte atividade de expressão, a produtividade de O-acetil-homoserina não foi rapidamente alterada comparado com o resultado do Exemplo 3, no qual a cepa foi transformada através de introdução com um plasmídeo (5 cópias), porém, foi mostrado que a produtividade de O-acetil-homoserina aumentou comparado com aquela da cepa WCJM, a qual é a cepa produtora de O-acetil-homoserina. [125] 4-2. Preparação de uma cepa com um promotor otimizado do gene yjeH em uma cepa com um elevado rendimento de O-acetil-homoserina e avaliação da produtividade de O-acetil-homoserina da cepa [126] O método de preparação de uma cepa produtora de O-acetil- homoserina usando uma cepa derivada de W3110 de tipo selvagem, a qual tem produtividade de treonina por meio de mutação NTG, é conhecido (Publicação Internacional N° WO 2012/087039). Em particular, a cepa produtora de O-acetil- homoserina assim preparada com elevado rendimento foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) com o N° de Acesso KCCM11468P. [127] A cepa com o N° de Acesso KCCM11146P tem produtividade de O- acetil-homoserina de elevado rendimento, a qual consome 40 g/L de glicose e produz cerca de 15 g/L a 16 g/L durante cultura em frasco. A este respeito, os presentes inventores examinaram se as cepas, as quais já têm uma elevada produtividade de O-acetil-homoserina, podem aprimorar ainda mais sua produtividade de O-acetil-homoserina ao otimizar o gene yjeH nas cepas. [128] Especificamente, o promotor do gene yjeH foi substituído por um promotor com uma elevada atividade indutora de expressão e isto foi realizado da mesma maneira conforme no Exemplo 4-1. As cepas assim preparadas, nas quais o promotor do gene yjeH da cepa KCCM11146P foi substituído, foram designadas como "KCCM11146P-PIY" para a cepa com o promotor de icd substituído, "KCCM11146P-PCY" para a cepa com o promotor de cysk substituído e "KCCM11146P-PPY" para a cepa com o promotor de pro substituído, respectivamente. [129] As produtividades de O-acetil-homoserina das cepas, nas quais o promotor do gene yjeH foi substituído, foram medidas por meio de avaliação de cultura em frasco. Especificamente, as cepas KCCM11146P, KCCM11146P- PIY, KCCM11146P- PCY e KCCM11146P- PPY foram inoculadas em meio LB e cultivadas a 33 °C durante a noite. As colônias individuais resultantes foram inoculadas em 3 mL de meio LB, cultivadas a 33 °C durante 5 horas, diluídas 200 vezes em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 25 mL de meio para produzir O-acetil-homoserina, cultivadas a 33 °C em uma taxa de 200 rpm durante 30 horas e a quantidade de produção de O-acetil-homoserina foi analisada por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. [130] Tabela 7. Medição da produção de O-acetil-homoserina através de cultura em frasco [131] Como pode ser confirmado a partir da Tabela 7, a cepa KCCM11146P produziu 14,2 g/L de O-acetil-homoserina enquanto que, nos casos das cepas com um promotor substituído, a cepa PCY mostrou a maior produção (18,2 g/L) e as cepas PIY e PPY mostraram uma produção aumentada de O-acetil- homoserina comparado com aquela da cepa original. [132] Os presentes inventores confirmaram que a cepa com base na cepa KCCM11146P, na qual a atividade do gene yjeHé otimizada, pode aumentar a produção de O-acetil-homoserina. Como um resultado, os inventores designaram a cepa como "CA05-4008" e depositaram a cepa no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), sob o Tratado de Budapeste, em 22 de Novembro de 2013, com o N° de Acesso KCCM11484P. [133] A partir do precedente, aqueles versados na técnica à qual a presente descrição pertence serão capazes de compreender que a presente descrição pode ser concretizada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente descrição. A este respeito, as concretizações exemplificativas descritas aqui são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitando o âmbito da presente descrição. Pelo contrário, a presente descrição se destina a cobrir não apenas as concretizações exemplificativas, mas também diversas alternativas, modificações, equivalentes e outras concretizações que possam ser incluídas no espírito e âmbito da presente descrição, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Micro-organismo do gênero Escherichia produtor de O-acetil homoserina, caracterizado poruma atividade da proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser aprimorada comparado com um micro-organismo do tipo selvagem, em que o aumento da atividade é alcançado por um aumento do número de cópias de um polinucleotídeo que codifica a proteína ou substituindo um promotor por outro promotor com atividade aprimorada, em que uma atividade da cistationina sintase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 é eliminada, em que uma atividade de homoserina quinase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 é eliminada, em que uma atividade de homoserina acetiltransferase é ainda aprimorada comparado com um micro-organismo do tipo selvagem, em que o aumento da atividade é alcançado pela introdução de um gene metA modificado que codifica a homoserina acetiltransferase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com a substituição de Gly111Glu e Leu112His.

2. Micro-organismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro micro-organismo ser Escherichia coli.

3. Micro-organismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora atividade de pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase e aspartato semialdeído desidrogenase ser ainda aprimorada.

4. Micro-organismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poruma atividade de aspartato quinase ser aumentada comparado com um micro-organismo do tipo selvagem.

5. Método para produzir O-acetil homoserina caracterizado por compreender: cultura do micro-organismo do gênero Escherichia produtor de O- acetil homoserina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para se obter um meio de cultura.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender ainda a recuperação de O-acetil homoserina a partir do microorganismo em cultura ou do meio de cultura.

7. Método para produzir L-metionina, caracterizado por compreender: cultivar um microrganismo do gênero Escherichia produtor de O- acetil homoserina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, acumulando assim O-acetil homoserina; e produzir L-metionina a partir da O-acetil homoserina acumulada usando uma reação enzimática.