BR112016009324B1

BR112016009324B1 - Microrganismo, e método de produção de l-lisina

Info

Publication number: BR112016009324B1
Application number: BR112016009324-0A
Authority: BR
Inventors: Sang Hee Park; Jun Ok Moon; Hyun Won Bae; Kwang Ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2023-03-28
Also published as: BR112016009324A2; MY181203A; JP6286571B2; CN105849249B; KR101498630B1; JP2016533771A; CN105849249A; RU2667425C2; EP3064569A1; WO2015064917A1; US9758801B2; EP3064569A4; US20160251687A1; RU2016114418A

Abstract

MICRORGANISMO, E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L-LISINA. É proporcionado um microrganismo de Corynebacterium sp., que é modificado para sobre-expressar um gene NCg10862 de Corynebacterium glutamicum, de modo a ter produtibilidade intensificada de L-lisina, e um método de produção de L-lisina por uso do microrganismo.

Description

ÁREA TÉCNICA

[001] A presente invenção se relaciona com um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium tendo produtibilidade intensificada de L-lisina e um método de produção de L-lisina por uso do microrganismo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] A L-lisina é um tipo de um aminoácido essencial, e é usada nas áreas de rações, medicina e alimentos. A L-lisina é principalmente produzida por fermentação direta usando um microrganismo tal como Escherichia coli ou Corynebacterium, e, a este respeito, melhorias da produtibilidade de L-lisina por desenvolvimentos em estirpes de produção tendo rendimentos melhorados ou melhorias em processos de fermentação podem resultar em efeitos econômicos significativos.

[003] No que diz respeito a um método de melhoria da eficácia de produção de lisina foi usado um método de amplificação de um gene envolvido em uma via biossintética de lisina ou modificação de um promotor do gene para aumentar a atividade de enzimas envolvidas em uma via biossintética de lisina. Adicionalmente, investigação sobre genes, sem ser genes envolvidos em uma via biossintética de lisina, tem sido continuamente conduzida para aumentar a produtibilidade de lisina.

[004] Os inventores da presente invenção tentaram preparar e explorar uma biblioteca de DNA de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum para rastrear traços relacionados com a produtibilidade de lisina. Consequentemente, com a expressão intensificada do gene NCgl0862, se confirmou que era produzida lisina eficazmente, completando deste modo a presente invenção. Até agora não haviam ainda sido relatados estudos de microrganismos pertencendo ao gênero Corynebacterium capazes de produzir L- lisina por introdução adicional neles do gene NCgl0862 derivado de Corynebacterium.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[005] A presente invenção proporciona um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium no qual a expressão de um polinucleotídeo codificando uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é intensificada.

[006] A presente invenção proporciona um método de produção de L-lisina por uso do microrganismo.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[007] Um aspeto da presente invenção proporciona um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium no qual a expressão de um polinucleotídeo codificando uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é intensificada.

[008] O polinucleotídeo pode codificar uma sequência de aminoácidos tendo cerca de 70 % ou mais elevada, cerca de 75 % ou mais elevada, cerca de 80 % ou mais elevada, cerca de 85 % ou mais elevada, cerca de 90 % ou mais elevada, cerca de 92 % ou mais elevada, cerca de 95 % ou mais elevada, cerca de 97 % ou mais elevada, cerca de 98 % ou mais elevada, ou cerca de 99 % ou mais elevada de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. O termo “homologia”, como usado aqui, se refere à percentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou duas frações de polipeptídeos. Uma homologia de sequência entre uma fração e outra fração pode ser determinada por uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma tal homologia de sequência pode ser determinada por um algoritmo BLAST como divulgado na literatura [referência a Karlin e Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (publicado em 1993)] ou pelo algoritmo FASTA de Pearson [referência a Methods Enzymol., 183, 63 (publicado em 1990)]. Com base no algoritmo BLAST são também desenvolvidos programas chamados BLASTN ou BLASTX [referência a www.ncbi.nlm.nih.gov].

[009] A expressão do polinucleotídeo pode ser intensificada por uma modificação de uma sequência reguladora da expressão por substituição ou mutação, uma mutação introduzida na sequência de polinucleotídeos, uma mudança em um códon de iniciação, um aumento no número de cópias do polinucleotídeo por introdução através de inserção cromossômica ou um vetor, ou suas combinações.

[0010] A sequência reguladora da expressão do polinucleotídeo pode ser modificada. A sequência reguladora da expressão controla a expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado a ela, e, por exemplo, pode incluir um promotor, um terminador, um intensificador, um silenciador, e uma sequência de Shine-Dalgarno. O polinucleotídeo pode ter uma mudança em um códon de iniciação. O códon de iniciação consistindo em TTG ou GTG pode ser substituído por ATG tal que a atividade enzimática de um gene correspondente possa ser aumentada. O polinucleotídeo pode ser inserido em um local particular de cromossomos para deste modo aumentar o número de cópias. Aqui, o local particular pode incluir, por exemplo, um local de transposão ou um local intergênico. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser inserido em um vetor de expressão, que é introduzido em uma célula hospedeira, para deste modo aumentar o número de cópias.

[0011] O polinucleotídeo pode incluir, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[0012] O termo “operacionalmente ligado”, como usado aqui, se refere a uma ligação funcional entre a sequência reguladora e a sequência de polinucleotídeos, por meio da qual a sequência reguladora controla a transcrição e/ou tradução da sequência de polinucleotídeos. A sequência reguladora pode ser um promotor forte que pode aumentar um nível de expressão do polinucleotídeo. A sequência reguladora pode ser um promotor derivado de um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium ou pode ser um promotor derivado de outros microrganismos. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor trc, um promotor gap, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac, um promotor trp, um promotor araBAD, ou um promotor cj7. A sequência reguladora pode ser modificada tal que, por exemplo, uma sequência promotora de um gene principal envolvido em uma via biossintética de lisina exiba atividade promotora mais intensificada em um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium. A sequência reguladora pode ser, por exemplo, um promotor lysCP1. O termo “promotor lysCP1”, como usado aqui, se refere a um promotor forte do qual a atividade enzimática é melhorada aproximadamente 5 vezes mais do que aquela de um tipo selvagem por aumento do nível de expressão de um gene codificando o gene da aspartato cinase, em que o nível de expressão é aumentado por substituição de sequências em um local de promotor de genes codificando cada um aspartato cinase e aspartato semialdeído desidrogenase (Patente Coreana No. 10-0930203).

[0013] O termo “vetor”, como usado aqui, se refere a um constructo de polinucleotídeo contendo uma sequência reguladora de um gene e uma sequência de um gene e configurado para expressar um gene alvo em uma célula hospedeira adequada. Alternativamente, o vetor pode também se referir a um constructo de polinucleotídeo contendo sequências disponíveis para recombinação homóloga, tal que, devido ao vetor introduzido em uma célula hospedeira, uma sequência reguladora de um gene endógeno em um genoma da célula hospedeira possa ser mudada, ou um gene alvo que pode ser expresso pode ser inserido em um local particular de um genoma do hospedeiro. A este respeito, o vetor usado na presente invenção pode adicionalmente incluir um marcador de seleção para determinar a introdução do vetor na célula hospedeira ou inserção do vetor em um cromossomo da célula hospedeira. O marcador de seleção pode incluir um marcador conferindo um fenótipo selecionável, tal como resistência a fármacos, auxotrofia, resistência contra um agente citotóxico, ou expressão de uma proteína da superfície. No ambiente tratado com um tal agente de seleção, uma vez que somente as células expressando o marcador de seleção conseguem sobreviver ou mostrar diferentes traços fenotípicos, as células transformadas podem ser selecionadas.

[0014] O vetor usado na presente invenção pode ser, por exemplo, um vetor pECCG122 que consegue se autorreplicar em ambas as direções em bactérias do tipo E. coli e Coryne (Patente Coreana No. 10-0057684), ou um vetor pDZ usado para transformar uma célula hospedeira para permitir inserção de um gene codificando uma proteína alvo em cromossomos da célula hospedeira, em que e o vetor pDZ não é replicável em Corynebacterium glutamicum (Patente Coreana No. 10-0924065). Adicionalmente, o vetor usado aqui pode ser, por exemplo, um vetor pDZTn derivado do vetor pDZ e disponível para inserção de um gene em um local de transposão em cromossomo de estirpes de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Patente Coreana No. 10-1126041), mas o vetor não está limitado a estes.

[0015] O termo “transformação”, como usado aqui, se refere à introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira tal que o polinucleotídeo possa ser replicável como um elemento extragenômico ou como sendo inserido em um genoma da célula hospedeira. Um método de transformação do vetor usado na presente invenção pode incluir um método de introdução de um ácido nucleico em uma célula. Adicionalmente, como divulgado na técnica relacionada, um método de pulsos elétricos pode ser levado a cabo dependendo em uma célula hospedeira.

[0016] O microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode ser, por exemplo, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium diphtheriae, ou Corynebacterium ammoniagenes.

[0017] O microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode ter produtibilidade de L-lisina. O microrganismo pode ter produtibilidade melhorada de L-lisina por introdução do polinucleotídeo descrito acima no microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium e tendo produtibilidade de L-lisina.

[0018] O termo “tendo produtibilidade de L- lisina”, como usado aqui, se refere a ter a capacidade de produzir e secretar L-lisina em um meio de cultura quando se cultiva o microrganismo aí. O microrganismo pode ser capaz de produzir e acumular L-lisina no meio de cultura em maiores quantidades em comparação com uma estirpe de tipo selvagem ou genitora.

[0019] O microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium e tendo produtibilidade de L-lisina pode ter expressão intensificada ou reduzida de um gene relacionado com a produção de NADPH e/ou um gene relacionado com a biossíntese ou secreção de L-lisina, ou pode ter um gene substituído por um gene estranho. O gene relacionado com a produção de NADPH pode incluir, por exemplo, um gene codificando glucose desidrogenase, um gene codificando gluconato cinase, um gene codificando gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um gene codificando glucose 6-fosfato desidrogenase, ou um gene codificando 6-fosfogluconato desidrogenase. O gene relacionado com a biossíntese de L- lisina pode incluir, por exemplo, um gene codificando aspartato aminotransferase, um gene codificando aspartato cinase, um gene codificando aspartato semialdeído desidrogenase, um gene codificando diidrodipicolinato sintase, um gene codificando diidrodipicolinato reductase, um gene codificando meso-diaminopimelato desidrogenase, ou um gene codificando diaminodipimelato descarboxilase. O gene relacionado com a secreção de L-lisina pode incluir lysE, que é um gene transportador de exportação da lisina. O microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium e tendo produtibilidade de L-lisina pode também obter tal produtibilidade de L-lisina por uso de xilose como uma fonte de carbono.

[0020] Em uma forma de realização, o microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (KFCC10881) (Patente Coreana No. 10-0159812).

[0021] Em outra forma de realização pode ser introduzido no microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium um polinucleotídeo codificando aspartato aminotransferase, um polinucleotídeo codificando aspartato cinase, um polinucleotídeo codificando aspartato semialdeído desidrogenase, um polinucleotídeo codificando diidrodipicolinato sintase, um polinucleotídeo codificando diidrodipicolinato reductase, e um polinucleotídeo codificando diaminodipimelato descarboxilase. Por exemplo, o microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana No. 10-0924065).

[0022] Em outra forma de realização, o microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (KFCC10750).

[0023] Em outra forma de realização, o microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium pode obter produtibilidade de lisina por introdução de um mutante de um polinucleotídeo codificando piruvato carboxilase (pyc), um mutante de um polinucleotídeo codficando homosserina desidrogenase (hom), e um mutante de um polinucleotídeo codificando aspartato cinase (lysC) (Binder et al., Genome Biology, 2012, 13: R40). O microrganismo pode ser, por exemplo, Corynebacterium glutamicum CJ3P.

[0024] Outro aspeto da presente invenção proporciona um método de produção de L-lisina, compreendendo o método: cultivo do microrganismo; e obtenção de L-lisina a partir da cultura.

[0025] O microrganismo é o mesmo como descrito acima.

[0026] O cultivo do microrganismo pode ser realizado em um meio apropriado sob condições de cultura que são conhecidas na técnica. Um tal processo de cultivo pode ser prontamente ajustado dependendo de um microrganismo a ser selecionado. O método de cultivo pode incluir uma ou mais selecionadas do grupo consistindo em cultura descontínua, cultura contínua, e cultura descontínua alimentada.

[0027] O meio usado no cultivo pode cumprir os requisitos de um microrganismo particular. O meio pode ser selecionado do grupo consistindo em fontes de carbono, fontes de nitrogênio, elementos vestigiais, e suas combinações.

[0028] A fonte de carbono pode ser selecionada do grupo consistindo em carboidratos, lípidos, ácidos graxos, álcoois, ácidos orgânicos, e suas combinações. O carboidrato pode ser glucose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose, ou uma sua combinação. O lípido pode ser óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, óleo de coco, ou uma sua combinação. O ácido graxo pode ser ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ou uma sua combinação. O álcool pode ser glicerol ou etanol. O ácido orgânico pode ser ácido acético.

[0029] A fonte de nitrogênio pode incluir uma fonte de nitrogênio orgânico, uma fonte de nitrogênio inorgânico, ou uma sua combinação. A fonte de nitrogênio orgânico pode ser selecionada do grupo consistindo em peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina (CSL), farinha de soja, e suas combinações. A fonte de nitrogênio inorgânico pode ser selecionada do grupo consistindo em ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, e suas combinações.

[0030] O meio pode incluir um selecionado do grupo consistindo em fósforo, sais de metal, aminoácidos, vitaminas, percursores, e suas combinações. A fonte de fósforo pode incluir diidrogenofosfato de potássio, fosfato de dipotássio, um sal contendo sódio correspondendo a ele. O sal de metal pode ser sulfato de magnésio e sulfato de ferro.

[0031] O meio ou seus componentes individuais podem ser adicionados ao meio de cultura em um modo descontínuo, um modo contínuo, ou um modo descontínuo alimentado.

[0032] No método de cultivo, o pH da cultura pode ser ajustado. O ajuste de pH pode ser realizado por adição de hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico, ou ácido sulfúrico à cultura. Adicionalmente, o método de cultivo pode incluir prevenção da geração de bolhas de ar. A prevenção da geração de bolhas de ar pode ser realizada por uso de um agente antiespumante. O agente antiespumante pode incluir éster de poliglicol de ácidos graxos. Adicionalmente, o método de cultivo pode incluir injeção de gás na cultura. O gás pode incluir qualquer gás capaz de manter a condição aeróbica da cultura. O gás pode ser oxigênio ou gás contendo oxigênio. O gás contendo oxigênio pode incluir ar. No cultivo, a temperatura da cultura pode ser 20 a 45 °C, por exemplo, 22 a 42 °C, ou 25 a 40 °C. O cultivo pode ser continuado até a produção de L-lisina alcançar um nível desejado.

[0033] A L-lisina produzida pode ser, por exemplo, recuperada da cultura por tratamento da cultura com ácido sulfúrico ou ácido clorídrico, seguido por realização de uma combinação de processos tais como cromatografia de permuta aniónica, concentração, cristalização, e precipitação com ponto isoelétrico.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0034] A produtibilidade de L-lisina pode ser aumentada por uso de um microrganismo de acordo com um aspeto da presente invenção.

[0035] A produtibilidade de L-lisina pode ser aumentada por uso de um método de produção de L-lisina de acordo com outro aspeto da presente invenção.

MODO DA INVENÇÃO

[0036] Doravante, o presente pedido será descrito em mais detalhe com referência aos Exemplos. No entanto, estes Exemplos são somente para propósitos ilustrativos, e o escopo do presente pedido não se destina a ser limitado por estes Exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE DNA GENÔMICO DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM DE TIPO SELVAGEM

[0037] O DNA genômico da estirpe de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi preparado, e, depois, tratado com uma enzima de restrição Sau3AI, de modo a se obterem fragmentos parciais de 6 a 8 kb. O fragmento foi ligado a um vetor vai-vem pECCG122 para transformações de E. coli e Corynebacterium, incluindo o vetor vai-vem extremidades para uma enzima de restrição BamHI. Depois, E. coli DH5a foi transformada com o vetor resultante e espalhada em meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/L). As colónias transformadas com o vetor no qual os fragmentos foram inseridos foram selecionadas por PCR (usando iniciadores de SEQ ID NOs: 3 e 4) e sujeitas a uma cultura mista, e foram obtidos plasmídeos delas por um método de extração de plasmídeos geralmente conhecido.

[0038] SEQ ID NO: 3: TCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTAT.

[0039] SEQ ID NO: 4: CCGCGCGTAATACGACTCACTATA. EXEMPLO 2 : INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA E SELEÇÃO DE ESTIRPE TENDO PRODUTIBILIDADE MELHORADA DE LISINA

[0040] A estirpe de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que produz lisina, foi transformada com o vetor recombinante preparado no Exemplo 1 usando um método de pulsos elétricos, e, depois, foi espalhada em uma placa com meio complexo descrito em baixo.

[0041] 20 g de glucose, 50 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 5 g de KH2PO4, 10 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 µg de biotina, 1.000 µg de tiamina HCl, 2.000 µg de pantotenato de cálcio, 2.000 µg de nicotinamida, 20 g de ágar, e 25 mg de canamicina (com base em 1 L de água destilada).

[0042] Cerca de 2.000 colónias foram inoculadas em cada poço de uma placa com 96 poços profundos (fabricada pela Bioneer Company) contendo 200 uL de um meio líquido complexo descrito em baixo, e, depois, cultivadas por agitação a 200 rpm e 30 °C durante 24 horas. De acordo com o método de lisina oxidase, 50 uL de cada cultura foram adicionados a uma placa de 96 poços na qual foi distribuída uma mistura reacional contendo lisina oxidase (contendo 200 uL de fosfato de potássio (pH 7,5), 0,04 uL de lisina oxidase (0,1 unidades/uL), 0,04 uL de peroxidase (1 unidade/uL), e 0,4 mg de ABTS). Após uma reação durante 30 minutos, a absorvância a OD405 nm foi medida e o grau de formação de cor foi comparado. Entre eles foram selecionados 7 tipos de grupos experimentais, tendo cada um absorvância mais elevada do que um grupo de controle (KCCM11016P/pECCG122).

[0043] 20 g de glucose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 100 µg de biotina, 1.000 µg de tiamina HCl, 2.000 µg de pantotenato de cálcio, e 2.000 µg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada).

[0044] As estirpes individuais foram inoculadas em frasco com defletores nos cantos de 250 mL contendo 25 mL de um meio de inoculação descrito em baixo, e, depois, cultivadas por agitação a 200 rpm e 30 °C durante 20 horas. Depois, 1 mL da cultura de inoculação foi inoculado em frasco com defletores nos cantos de 250 mL contendo 24 mL de um meio de produção descrito em baixo, e, depois, cultivado por agitação a 200 rpm e 37 C durante 96 horas. Após completação do cultivo, as concentrações de L-lisina foram analisadas por HPLC, e os resultados da análise são mostrados na Tabela 1.

[0045] 20 g de glucose, 10 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 100 µg de biotina, 1.000 µg de tiamina HCl, 2.000 µg de pantotenato de cálcio, e 2.000 µg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada).

[0046] 100 g de glucose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de concentrado de água de lavagem do milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 100 µg de biotina, 1.000 µg de tiamina HCl, 2.000 µg de pantotenato de cálcio, 3.000 µg de nicotinamida, e 30 g de CaCO3 (com base em 1 L de água destilada). [TABELA 1]

[0047] Com base nos resultados acima, KCCM11016P/M2 e KCCM11016P/L52 mostrando produtibilidade elevada de lisina em comparação com aquela do grupo de controle foram selecionadas, e, depois, plasmídeos foram extraídos delas, seguido por análise de sequenciação usando iniciadores de SEQ ID NOs: 3 e 4. O plasmídeo derivado de KCCM11016P/M2 foi denominado pEC-L1, e o plasmídeo derivado de KCCM11016P/L52 foi denominado pEC-L2. O plasmídeo pEC-L1 inclui de cerca de 200 pares de bases (pb) a montante de um códon de iniciação de grelha de leitura aberta (ORF) do gene NCgl0857 a cerca de 200 pb a jusante de um códon de paragem de ORF do gene NCgl0862. O plasmídeo pEC-L2 inclui de cerca de 250 pb a jusante de um códon de paragem de ORF do gene NCgl0861 a cerca de 300 pb a montante de um códon de iniciação de ORF do gene NCgl0865. Conformemente foi confirmado que os dois tipos de plasmídeo incluíam ambos o gene NCgl0862 em comum.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA SUBSTITUIÇÃO DO PROMOTOR DO GENE NCGL0862

[0048] Com base nos resultados obtidos no Exemplo 2, para confirmar se a sobre-expressão do gene NCgl0862 induz praticamente a melhoria da produtibilidade de lisina, foi preparado um vetor configurado para substituir um promotor do gene NCgl0862 em cromossomo. Para a substituição do promotor, um promotor de tipo selvagem (lysCP) e um promotor modificado lysCP1 foram usados como promotores do gene lysC.

[0049] É proporcionada uma descrição detalhada como se segue.

[0050] Com base no GenBank dos National Institutes of Health (GenBank do NIH, EUA) foram desenhados pares de iniciadores (SEQ ID NOs: 5 e 6 ou SEQ ID Nos: 7 e 8) a ser configurados para amplificarem respectivamente a montante e a jusante do códon de iniciação de ORF do gene NCgl0862 (SEQ ID NO: 2). Adicionalmente foi desenhado um par de iniciadores (iniciadores de SEQ ID NOs: 9 e 10) para amplificar um local de promotor a partir de sequências a montante do gene lysC. SEQ ID No. e sequências dos iniciadores são mostrados em baixo. As sequências sublinhadas indicam locais reconhecidos por enzimas de restrição.

[0051] Foi realizada PCR por uso do DNA genômico da estirpe de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P como um molde e pares de iniciadores de SEQ ID NOs: 5 e 6 e SEQ ID NOs: 7 e 8, e SEQ ID NOs: 9 e 10 obtendo deste modo fragmentos de DNA de 300 pb tendo cada um sequências flanqueantes à esquerda e à direta do códon de iniciação de ORF do gene NCgl0862 e um fragmento de um promotor de tipo selvagem do gene lysC, desde agora referido como “promotor lysCP”. As condições para a amplificação por PCR incluem desnaturação a 94 °C durante 5 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, emparelhamento a 56 °C durante 30 segundos, e polimerização a 72 C durante 30 segundos, e depois polimerização a 72 C durante 7 minutos. Cada um do produto de 300 pb amplificado por PCR tendo sequência flanqueante à esquerda ou à direta do códon de iniciação de ORF do gene NCgl0862 foi respectivamente tratado com EcoRI e BamHI, e BamHI e SalI, e, depois, ligado a um fragmento de DNA obtido por tratamento de um vetor pDZ para inserção cromossômica de um microrganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium com enzimas de restrição, SalI e EcoRI, obtendo deste modo um vetor.

[0052] Para amplificar o promotor lysCP ou o promotor lysCP1 foi realizada PCR por uso do DNA genômico da estirpe de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ou estirpe KCCM11016P-lysCP1 (Patente Coreana No. 10-0930203) como um molde e um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 9 e 10, obtendo deste modo fragmentos de 300 pb do promotor lysCP e do promotor lysCP1. Os fragmentos de DNA do promotor de tipo selvagem lysC e do promotor lysCP1 foram tratados com BamHI e NdeI. Depois, o vetor obtido acima foi ligado ao fragmento de DNA por tratamento com BamHI e NdeI, preparando os plasmídeos recombinantes pDZ-lysCP_N0862 e pDZ-lysCP1_N0862.

EXEMPLO 4: ANÁLISE DA PRODUTIBILIDADE DE LISINA DE ESTIRPE COM PROMOTOR SUBSTITUÍDO DE NCGL0862 DERIVADO ESTIRPE PRODUZINDO LISINA

[0053] Os plasmídeos recombinantes pDZ- lysCP_N0862 e pDZ-lysCP1_N0862 preparados no Exemplo 3 foram transformados em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P de acordo com um método de pulsos elétricos (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52: 541-545, 1999). De acordo com uma recombinação homóloga cromossômica geralmente conhecida, estirpes nas quais o promotor lysC foi inserido em um local de promotor do gene NCgl0862 foram selecionadas por PCR (iniciadores de SEQ ID NOs: 5 e 8). As estirpes recombinantes selecionadas foram denominadas Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP_N0862 e KCCM11016P::lysCP1_N0862.

[0054] Para identificar a produtibilidade de lisina de tais estirpes produzindo lisina preparadas, KCCM11016P::lysCP_N0862 e KCCM11016P::lysCP1_N0862, as estirpes foram cultivadas em inoculação e produção do mesmo modo como no Exemplo 2, e, depois, as concentrações de lisina em cada cultura foram analisadas como mostrado em baixo (ver Tabela 2). [TABELA 2]

[0055] Como mostrado na Tabela 2 foi confirmado que a produtibilidade de lisina da estirpe KCCM11016P::lysCP_N0862 na qual o promotor foi substituído pelo promotor de tipo selvagem lysC foi aumentada 1 % em média em comparação com aquela da estirpe genitora, KCCM11016P, e que a produtibilidade de lisina da estirpe KCCM11016P::lysCP1_N0862 na qual o promotor foi substituído pelo promotor lysCP1 foi aumentada 4 % em média em comparação com aquela da estirpe genitora. Subsequentemente, a estirpe KCCM11016P::lysCP1_N0862 foi denominada CA01-2269 e depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 12 de junho, 2013 com o No. de Acesso KCCM11430P.

EXEMPLO 5 : PREPARAÇÃO DE VETOR PARA INSERÇÃO CROMOSSÔMICA ADICIONAL DO GENE NCGL0862

[0056] Para permitir inserção de um gene desejado em uma posição de um gene de transposão, o vetor pDZTN desenhado a partir do vetor pDZ foi usado como um vetor básico, desenhando e preparando deste modo um vetor configurado para inserir adicionalmente o gene NCgl0862 do Exemplo 2 em cromossomos.

[0057] Com base nas sequências relatadas foram sintetizados iniciadores (SEQ ID NOs: 7 e 12) para amplificar locais do gene NCgl0862. Foi realizada PCR por uso dos cromossomos de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um molde, amplificando deste modo um local ORF de cerca de 370 pb do gene NCgl0862.

[0058] Adicionalmente foram sintetizados iniciadores (SEQ ID NOs: 10 e 11) para amplificarem locais de um promotor do gene lysC. Foi realizada PCR por uso dos cromossomos da estirpe de introdução Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-lysCP1 como um molde, amplificando deste modo um local de promotor de cerca de 300 pb. Aqui, as condições para a amplificação por PCR incluem desnaturação a 94 °C durante 5 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, emparelhamento a 56 C durante 30 segundos, e polimerização a 72 C durante 30 segundos, e depois polimerização a 72 C durante 7 minutos. SEQ ID NO: 11: TAACTAGTTAGGGAGCCATCTTTTGGGG

[0059] Os fragmentos de gene amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição SpeI e NdeI para obter deste modo seus fragmentos de DNA. Os fragmentos de DNA foram ligados ao vetor pDZTN para inserção cromossômica tendo extremidades de uma enzima de restrição SpeI. Depois, E. coli DH5a foi transformada com o vetor resultante e espalhada em meio sólido LB contendo 25 mg/L de canamicina. As colônias transformadas com o vetor incluindo um gene desejado inserido nele foram selecionadas por PCR (iniciadores de SEQ ID NOs: 12 e 13), e foram obtidos plasmídeos por realização de um método de extração de plasmídeos geralmente conhecido, e, depois, denominados pDZTN-N0862. SEQ ID NO: 12: TAACTAGTATGCTCGGTCCGGGCA SEQ ID NO: 13: GCAGGCGGTGAGCTTGTCAC EXEMPLO 6: ANÁLISE DA PRODUTIBILIDADE DE LISINA DE ESTIRPE INCLUINDO NCGL0862 ADICIONALMENTE INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0060] Com base na recombinação homóloga cromossômica, o vetor pDZTN-N0862 preparado no Exemplo 5 foi usado para transformar uma estirpe produzindo L-lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P. Subsequentemente, as colônias foram seletivamente rastreadas dela por PCR (usando iniciadores de SEQ ID NOs: 12 e 13), e a estirpe resultante foi denominada KCCM11016P::N0862-Tn. KCCM11016P::N0862-Tn e um grupo de controle foram cada um cultivados do mesmo modo como no Exemplo 2, e, depois, as concentrações de L-lisina nas culturas foram analisadas como mostrado em baixo (ver Tabela 3). [TABELA 3]

[0061] Como resultado foi confirmado que a produtibilidade de lisina de KCCM11016P::N0862-Tn, que foi a estirpe tendo gene NCgl0862 adicionalmente inserido no cromossomo, foi aumentada em 8 % em comparação com a estirpe genitora, KCCM11016P.

EXEMPLO 7: PRODUÇÃO DE L-LISINA USANDO MICRORGANISMO DERIVADO DE KCCM10770P INCLUINDO NCGL0862 ADICIONALMENTE INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0062] O vetor pDZTN-N0862 preparado no Exemplo 5 foi usado para transformar Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, que era uma estirpe produzindo lisina na qual 7 tipos de genes envolvidos na via de biossíntese de L-lisina foram adicionalmente adicionados ao seu cromossomo. Subsequentemente, uma estirpe na qual o gene NCgl0862 foi adicionalmente inserido no cromossomo foi selecionada por PCR, e a estirpe resultante foi denominada Corynebacterium glutamicum KCCM10770P::N0862-Tn. A estirpe foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 2, e, depois, as concentrações de L-lisina na cultura foram analisadas como mostrado em baixo (Tabela 4). [TABELA 4]

[0063] Como resultado foi confirmado que a produtibilidade de lisina foi aumentada em 5 % em comparação com a estirpe genitora.

EXEMPLO 8: PRODUÇÃO DE L-LISINA USANDO MICRORGANISMO DERIVADO DE CJ3P INCLUINDO NCGL0862 ADICIONALMENTE INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0064] Para identificar os efeitos em outras estirpes pertencendo a Corynebacterium glutamicum, o vetor pDZTN-N0862 preparado no Exemplo 5 foi usado para transformar Corynebacterium glutamicum CJ3P, que era uma estirpe produzindo lisina tendo 3 tipos de mutações de genes associadas às melhorias da produtibilidade de lisina. Subsequentemente, uma estirpe na qual o gene NCgl0862 foi adicionalmente inserido no cromossomo foi selecionada por PCR, e a estirpe resultante foi denominada CJ3P::N0862-Tn. A estirpe foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 2, e, depois, as concentrações de L-lisina recuperada dela foram analisadas como mostrado em baixo (ver Tabela 5). [TABELA 5]

[0065] Como resultado foi confirmado que a produtibilidade de lisina foi aumentada em 12 % em comparação com a estirpe genitora.

EXEMPLO 9: PRODUÇÃO DE L-LISINA USANDO MICRORGANISMO DERIVADO DE KCCM11347P INCLUINDO NCGL0862 ADICIONALMENTE INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0066] Para identificar os efeitos de outras estirpes pertencendo a Corynebacterium glutamicum, o vetor pDZTN-N0862 foi introduzido em uma estirpe produzindo L- lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Patente Coreana No. 1994-0001307) do mesmo modo como o Exemplo 5, e a estirpe resultante foi denominada KCCM11347P::N0862-Tn. A estirpe foi cultivada do mesmo modo como no Exemplo 2, e, depois, as concentrações de L-lisina recuperada dela foram analisadas como mostrado em baixo (ver Tabela 6). [TABELA 6]

[0067] Como resultado foi confirmado que a produtibilidade de lisina foi aumentada em 6 % em comparação com a estirpe genitora. Nome de Instituição Depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (International) Número de Acesso: KCCM11347P Data de Acesso: 19911210 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA OS PROPÓSITOS DE PROCEDIMENTO DE PATENTES

Se a Regra 6.4.d) se aplica, tal data é a data na qual o estatuto da autoridade depositária internacional foi adquirido; se um depósito efetuado fora do Tratado de Budapeste for convertido em um depósito nos termos do Tratado de Budapeste após aquisição do estatuto da autoridade depositária internacional, esta data deverá ser a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional. Formulário-BP/4 (página única) Nome de Instituição Depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (International) Número de Acesso: KCCM11430P Data de Acesso: 20130612 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA OS PROPÓSITOS DE PROCEDIMENTO DE PATENTES

Seodaemun-gu oficial(ais) autorizado(s) SEUL 120-091 Data: 12 de junho, 2013 República da Coreia 1 Se a Regra 6.4.d) se aplica, tal data é a data na qual o estatuto da autoridade depositária internacional foi adquirido; se um depósito efetuado fora do Tratado de Budapeste for convertido em um depósito nos termos do Tratado de Budapeste após aquisição do estatuto da autoridade depositária internacional, esta data deverá ser a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional. Formulário-BP/4 (página única)

Claims

1. MICRORGANISMO pertencente ao gênero Corynebacterium produzindo L-lisina com produtividade melhorada de L-lisina pela expressão melhorada de um polinucleotídeo caracterizado pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e sequências degeneradas da mesma, codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, em comparação com a linhagem parental, em que a expressão melhorada é alcançada por um aumento no número de cópias do polinucleotídeo ou manipulação de uma sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, em que a manipulação é a substituição de um promotor nativo do polinucleotídeo por um promotor forte.

2. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microrganismo ser Corynebacterium glutamicum.

3. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L-LISINA, caracterizado pelo método compreender: cultivo do microrganismo conforme definido na reivindicação 1 em um meio; e recuperação de L-lisina a partir do microrganismo ou do meio.