JP5214633B2 - Ｌ−アルギニン生産コリネバクテリウムグルタミカム変異株およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−アルギニンを高収率で生産することができるため、医薬および薬学産業に有用に使用することができるＬ−アルギニン生産変異株およびその製造方法に関する。具体的には、本発明は、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のアルギニン生合成に関与するアセチルオルチニンアミノ基転移酵素の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子（Ｎｃｇ１２３５５）を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターをＬ−アルギニン生産宿主微生物に導入してａｒｇＤ２遺伝子を過発現させて高収率でＬ−アルギニンを生産することが可能な形質転換体、および前記形質転換体を培養してＬ−アルギニンを製造する方法に関する。

Ｌ−アルギニンは、植物種子または大蒜の中に遊離状態で含有されたアミノ酸であり、 有効な添加材として医薬品、食品などに広く用いられている。Ｌ−アルギニンは、肝機能促進剤、脳機能促進剤、男性不妊治療剤、総合アミノ酸製剤などとして有用である。また、Ｌ−アルギニンは、魚肉団子添加剤、健康飲料添加剤として使用されており、高血圧患者の食塩代替用としても最近脚光を浴びている。

従来の公知の生物学的発酵法によるＬ−アルギニンの製造方法は、炭素源、窒素源から直接Ｌ−アルギニンを生産する方法を基本としている。たとえば、Ｌ−アルギニンは、グルタミン酸生産菌株であるブレビバクテリウム(Brevibacterium)またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物から誘導された変異株（特開昭５７−１６３４８７、同昭６０−８３５９３、同昭６２−２６５９８８）、または細胞融合によって生育改善されたアミノ酸生産菌株（特開昭５９−１５８１８５）を用いて生産することができる。最近は、アルギニン生合成オペロンの発現を抑える遺伝子ａｒｇＲを不活性化させた遺伝子組み換え菌株を用いる方法（米国特許出願第２００２／００４５２２３Ａ１号）とアルギニンオペロンのａｒｇＦを過発現させる方法（韓国特許出願第１０−２００４−１０７２１５号）などが報告されている。

微生物からのＬ−アルギニンの生合成は、線形経路と環形経路の相異なる２つの経路を介して、Ｌ−グルタメートから８段階の酵素系を経て行われる。

コリネバクテリウム属微生物は、環形経路を経てアルギニンの生合成が行われる。環形経路において、Ｌ−アルギニンは、Ｌ−グルタメートからＮ−アセチルグルタメート(N-acetylglutamate)、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート(N-acetylglutamyl phosphate)、Ｎ−アセチルグルタメートセミアルデヒド(N-acetylglutamate semialdehyde)、Ｎ−アセチルオルニチン(N-acetylornithine)、オルニチン(ornithine)、シトルリン(citrulline)、およびアルギニノサクシネート(arginiosuccinate)を経て合成される。これらの中間物質は、それぞれグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ(glutamate N-acetyltransferase)、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ(glutamate N-acetyltransferase)、アセチルグルタメートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(acetylglutamate semialdehyde dehydrogenase)、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(acetylornithine aminotransferase)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyltransferase)、アルギノサクシネートシンターゼ(arginosuccinate synthase)、およびアルギノサクシネートリアーゼ(arginosuccinate lyase)の連続的な酵素反応によって合成される。これらの酵素はそれぞれａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨ遺伝子によってコードされる。

本発明者らは、Ｌ−アルギニンを高収率で生産するために、Ｌ−アルギニンの生合成に関与する前記酵素に対して長期間研究を行ったところ、アルギニン生合成の中間段階であるＮ−アセチルグルタメートセミアルデヒド(N-acetylglutamate semialdehyde)がＮ−アセチルオルニチン(N-acetylornithine)に転換される酵素反応を増幅させる場合、Ｌ−アルギニン生合成フラックス(flux)が強化されてＬ−アルギニンの生産性を向上させることができることを見出した。

細胞には様々なアミノ基転移酵素(aminotransferase)が存在し、これらの酵素はそれらの相互構造的関係性(mutual structural relatedness)によって４つのグループに分類される。これらのグループは、アスパルチルオルニチン(aspartylornithine)、アラニン(alanine)、チロシン(tyrosine)、ヒスチジオルホスフェート(histidiolphosphate)、およびフェニルアラニン(phenylalanine)アミノ基転移酵素を含むグループI、アセチルオルニチン、オルニチン、ω−アミノ酸、アミノ酪酸塩(aminobutyrate)およびフェニルアラニンアミノ基転移酵素を含むグループII、Ｄ−アラニンおよび枝分かれしたアミノ酸アミノ基転移酵素を含むグループIII、並びにセリンおよびホスホセリン(phosphoserine)アミノ基転移酵素を含むグループIVに分けられる(Perdeep K. MEHTA, et al, Eur.J.Biochem., 214, 549-561, 1993)。

現在まで知られている事実によれば、コリネバクテリウムグルタミカムは、アルギニンの生合成に関与するａｒｇＣＪＢＤＦ遺伝子がオペロンとして存在しており、細胞内のアルギニンによってフィードバック阻害(feedback-inhibition)を受けるものと知られている(Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142:9-108, 1996)。よって、高収率のＬ−アルギニンを生産するには限界がある。

そこで、本発明者らは、Ｌ−アルギニンの生産収率をさらに高めることが可能な菌株を開発するために努力した結果、アセチルオルニチンアミノ基転移酵素をコードするａｒｇＤ遺伝子と同一の機能を果たすものと推定されるａｒｇＤ２遺伝子に形質転換された微生物がａｒｇＤ２遺伝子を過発現させてＬ−アルギニン生産母菌株に比べて高収率でＬ−アルギニンを生産することができることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のアルギニン生合成に関与するアセチルオルニチンアミノ基転移酵素の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子（Ｎｃｇｌ２３５５）がコードするポリペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を含む組み換えベクターを提供することにある。

本発明の別の目的は、前記組み換えベクターを導入してＬ−アルギニンを高収率で生産することが可能な形質転換体を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養してＬ−アルギニンを製造する方法を提供することにある。

図１はａｒｇＤ２遺伝子、ＣＪ１プロモーター、およびｒｒｎＢ_１Ｂ₂タミネーターを含む、本発明に係る組み換えプラスミドｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２の製作図である。

一様態において、本発明は、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のアルギニン生合成に関与するアセチルオルニチンアミノ基転移酵素(acetylornithine aminotrasferase)の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子（Ｎｃｇｌ２３５５）がコードするポリペプチドを提供する。好ましくは、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１で表示できる。

コリネバクテリウムグルタミカムのアルギニン生合成に関与するアセチルオルニチンアミノ基転移酵素の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子（Ｎｃｇｌ２３５５）は、ゲノム基盤分析(genome based analysis)によれば、ａｒｇＤ遺伝子と同じアミノ基転移酵素グループII に属するアミノ基転移酵素に分類できるが(Alice C. McHardy, et al, J. Biotechnology, 104, 229-240, 2003)、現在までもａｒｇＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質の明確な機能が定義されていない。但し、ａｒｇＤとａｒｇＤ２遺伝子の塩基配列の相同性は低いが、２つの遺伝子はアミノ基転移酵素グループIII(aminotransferase class III)という同一のモチーフを持っているため、ａｒｇＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質はａｒｇＤ遺伝子によってコードされるアルギニン生合成過程に必要なアセチルオルニチンアミノ基転移酵素と類似の機能を持つものと推定される(www.genome.jp/kegg/)。

本発明の具体的実施例では、ａｒｇＤ２遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換されたＬ−アルギニン生産菌株が母菌株に比べて向上したＬ−アルギニン生産収率を持つことを確認した。

本発明の他の様態において、本発明は、前記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドの塩基配列が配列番号２で表示できる。また、本発明は、前記配列番号２の塩基配列と７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、前記配列番号２の塩基配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

本発明の別の様態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供する。好ましくは、前記組み換えベクターは、配列番号２で表示されるポリヌクレオチドを含むもので、本発明の具体的な実施例によって製造された組み換えベクターｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２であってもよい。

前記組み換えベクターは、ＤＮＡ組み換え技術を用いた任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。具体的な例として、本発明の実施例では、Ｌ−アルギニン生産菌株からゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型としてＰＣＲによってａｒｇＤ２遺伝子のＯＲＦ部位を増幅した。過発現のための組み換えベクターの製作のために、ｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１とＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２を鋳型としてそれぞれＣＪ１プロモーター（韓国登録特許第１０−０６２００９２号）およびｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーター部位を増幅した。コリネバクテリウムアンモニアゲネスＨｓｐ６０の上端部位であってコリネバクテリウムグルタミカムで強く発現するものと知られているＣＪ１プロモーターと、一般に常用されるｒｒｎＢ１Ｂ２タミネーターをそれぞれプロモーターとタミネーターとして使用した。この際、得られたａｒｇＤ２遺伝子の塩基配列を通常のシーケンシング方法によって分析した。前記得られたプロモーター部位、タミネーター部位およびａｒｇＤ２遺伝子を適合なプラスミドまたはその他のクローニングベクター内にクローニングして適切なコンピテント細胞(competent cell)に形質転換し、それから組み換えベクターを製造した（図１）。

前記組み換えベクターの製造方法において、クローニングベクターは、原核または眞核細胞で発現可能な任意のベクターを使用することができる。本発明の具体的な実施例では、プラスミドｐＥＣＣＧ１１７（Han J.K., et al, Biotechnology letters, 13(10):721-726, 1991または韓国特許公告第９２−７４０１号）を使用した。また、前記Ｌ−アルギニン生産菌株は、原核および真核を含んだＬ−アルギニンを生成することが可能な全ての微生物であってもよく、好ましくはＬ−アルギニンを生産することが可能な大腸菌、コリネ型細菌、バシラス属細菌、さらに好ましくはＬ−アルギニンを生産することが可能なコリネバクテリウムグルタミカムであってもよい。

本発明の別の様態においては、ａｒｇＤ２遺伝子を含む前記組み換えベクターをＬ−アルギニン生産宿主微生物に導入してａｒｇＤ２遺伝子を過発現させることにより高収率でＬ−アルギニンを生産することが可能な形質転換体を提供する。

具体的には、前記宿主微生物は、ＤＮＡの導入効率が高くかつ導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常使用され、原核および真核を含んだＬ−アルギニンを生成することが可能な全ての微生物であってもよい。好ましくは、エシェリキア(Escherichia)、アエロバクター(Aerobacter)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ピチア(Pichia)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ケカビ(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、サルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、マグネトスピリルム(Magnetospirillum)およびコリネバクテリウム(Corynebacterium)属よりなる群から選ばれるいずれか一つ、さらに好ましくはＬ−アルギニン類似体に対する耐性を有し、Ｌ−アルギニンを生産することが可能なコリネバクテリウム属に属する微生物、最も好ましくはコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１４９３またはコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１８３１であってもよい。Ｌ−アルギニン類似体としては、タチナタマネに入っているα−アミノ酸の一つであるカナバニン(canavanine)およびアルギニンヒドロキサメート(arginine hydroxamate)が含まれる。

本発明の特定の実現例では、前記組み換えベクターｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２を、Ｌ−アルギニン類似体に対する耐性を有しかつＬ−アルギニンを生産することが可能なコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１４９３とコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１８３１に導入して形質転換させた微生物ＣＡ０６−００１２およびＣＡ０６−００１３を製造し、２００６年１２月１３日付で前記菌株をそれぞれ韓国微生物保存センター(Korean Culture center of Microorganism、以下「ＫＣＣＭ」という)に受託番号ＫＣＣＭ１０８２０ＰおよびＫＣＣＭ１０８２１Ｐとして寄託した。

前記形質転換体は、任意の形質転換方法によって当業者が容易に製造することができる。本発明の「形質転換(transformation)」は、ＤＮＡを宿主として導入し、ＤＮＡが染色体の因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能なものになることであって、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝子的な変化を生じさせる現象を意味する。一般に、形質転換方法には、ＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２方法にＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)という還元物質を使用することにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、硫酸デキストラン、リポフェクタミンおよび乾燥／抑制媒介形質転換方法などがある。本発明の実施例では、エレクトロポレーション法を用いて前記組み換えベクターｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２を宿主微生物に導入して形質転換体を製造し、抗生剤の耐性を用いて組み換えベクター含有菌株を分離した。

本発明によって製造された形質転換体のＬ−アルギニン生成能をさらに増大させるために、通常の遺伝子組み換え技術によって、前記形質転換体の染色体に存在するａｒｇＤ２遺伝子を発現または欠損させる方法をさらに行うことができ、これらの遺伝子塩基配列が蛍光物質を活用したシーケンシング方法によって分析できることは本発明の技術分野における公知の事実である。

Ｌ−アルギニンを生合成する経路において、オルニチンは、アルギニン代謝経路の中間体であって、尿素回路と共に窒素代謝に重要な物質である。本発明の方法で形質転換されたＣＡ０６−００１２およびＣＡ０６−００１３菌株は、Ｌ−アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１８３１の染色体からＰＣＲによって得た、アセチルオルニチンアミノ基転移酵素機能を果たすものと推定されるタンパク質をコードするａｒｇＤ２遺伝子をベクターに挿入し、これをＬ−アルギニン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１４９３およびコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１８３１にそれぞれ導入することにより、ａｒｇＤ２遺伝子の発現を増加させた形質転換体である。本発明に係る方法で形質転換された前記ＣＡ０６−００１２およびＣＡ０６−００１３菌株は、ａｒｇＤ２遺伝子の過発現によって、Ｎ−アセチルオルニチンの合成が増加してアルギニン生合成経路が活性化されることにより、Ｌ−アルギニンを高収率で生産することができることを確認した。

したがって、本発明は、別の様態において、前記形質転換体、好ましくは受託番号ＫＣＣＭ１０８２０Ｐまたは受託番号ＫＣＣＭ１０８２１Ｐで表示される形質転換体を培養することを含むＬ−アルギニンの製造方法を提供する。

本発明のＬ−アルギニンを製造する方法において、前記形質転換されたＬ−アルギニン過発現微生物の培養過程は、当業界における公知の適当な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式培養(batch culture)、連続式培養(continuous culture)および流加式培養(fed-batch culture)が含まれるが、これに限定されない。様々な培養方法は、例えば、“Biochemical Engineering”(James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991)などに開示されている。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑えることができる。また、培養物の好気状態(aerobic condition)を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（たとえば、空気）を注入する。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養期間は、所望のＬ−アルギニンの生産量が得られるまでであり、好ましくは１０〜１６０時間である。培養物からのＬ−アルギニンの分離は、当業界における公知の通常の方法によって行うことができる。このような分離方法には、遠心分離、濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび結晶化などの方法が利用できる。たとえば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。

以下、下記実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。ところが、これらの実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。

実施例１．ａｒｇＤ２遺伝子、ＣＪ１プロモーターおよびｒｒｎＢ _１ Ｂ _２ タミネーターの製作
コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のアルギニン生合成に関与するアセチルオルニチンアミノ基転移酵素の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子、コリネバクテリウムグルタミカムで強く発現するＣＪ１プロモーターおよびｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーターを含む組み換えベクターｐＨＣ１３１Ｔの製作のために、Ｌ−アルギニン生産菌株ＡＴＣＣ２１８３１のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から、ａｒｇＤ２遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」と略する）を含むＤＮＡ断片１．３７１Ｋｂを得、ＣＪ１プロモーターはｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１（韓国特許出願第１０−２００４−１０７２１５号）を鋳型としてＰＣＲを行ってＣＪ１プロモーター(０．３Ｋｂ)を得、ｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーターはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ Ｗ３１１０のゲノムを鋳型としてＰＣＲを行って０．４Ｋｂの断片を得た。

実施例１−１．ａｒｇＤ２遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片の増幅
ゲノミック−チップシステム(Genomic-tip system)（ＱＩＡＧＥＮ社製、以下同一）を用いてＬ−アルギニン生産菌株ＡＴＣＣ２１８３１のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ａｒｇＤ２遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片１．３７１Ｋｂを増幅するために、前記ｇＤＮＡを鋳型としてＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、ＵＳＡ、以下同一）を用いて連鎖重合反応（polymerase chain reaction、以下「ＰＣＲ」と略する）を行った。この際、ａｒｇＤ２遺伝子のＯＲＦ部位の増幅に使用されたプライマーは次のとおりである：配列番号７；５’−ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｔｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｔｔａｃ−３’、および配列番号８；５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｃｔｔａｇａａｃａａｃｇｃｃｃｃａｇｃ−３’。ＰＣＲ反応は変性(denaturation)９４℃で３０秒、アニーリング(annealing)５５℃で３０秒および延長(elongation)７２℃で１分を１サイクルとして２５サイクル繰り返し行った。前記ＰＣＲ結果物は１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．３Ｋｂサイズのバンドを溶出して得た。

実施例１−２．ＣＪ１プロモーターの増幅
ＣＪ１プロモーターを増幅するために、ｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１（韓国特許出願第１０−２００４−１０７２１５号）を鋳型としてＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてＰＣＲを行った。この際、ＣＪ１プロモーターの増幅に使用されたプライマーは次のとおりである：配列番号３；５’−ｃｇｇｇｔａｃｃａｃｃｇｃｇｇｇｃｔｔａｔｔｃｃａｔｔａｃａｔ−３’および配列番号４；５’−ａｃｇｃｇａｔａｔｃｔｔａａｔｃｔｃｃｔａｇａｔｔｇｇｇｔｔｔｃ−３’。ＰＣＲ反応は変性９４℃で３０秒、アニーリング５５℃で３０秒および延長６８℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル繰り返し行った。前記ＰＣＲ結果物は１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、０．３Ｋｂサイズのバンドを溶出して得た。

実施例１−３．ｒｒｎＢ _１ Ｂ _２ タミネーターの増幅
ゲノミック−チップシステムを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーターを増幅するために、前記ｇＤＮＡを鋳型としてＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてＰＣＲを行った。この際、ｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーターの増幅に使用したプライマーは次のとおりである：配列番号５；５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｃｔｇｔｔｔｔｇｇｃｇｇａｔｇａｇａ−３’および配列番号６；５’−ａｔａａｇａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃａａａａａｇｇｃｃａｔｃｃｇｔｃａｇ−３’。ＰＣＲ反応は前記ＣＪ１プロモーターの増幅のための条件と同様に行った。前記ＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、４１１ｂｐ断片を溶出して得た。

実施例２．組み換えプラスミドの製作

実施例２−１．組み換えプラスミドｐＨＣ１３１Ｔの製作
大腸菌／Ｃ．グルタミカムシャトルベクター(E.coli/C.glutamicum shuttle vector)（Han J.K., et al, Biotechnology letters, 13(10):721-726, 1991または韓国特許公告第９２−７４０１号）を制限酵素ＥｃｏＲVとＫｐｎIで処理した後、これを０．８％アガロースゲルで約５．９Ｋｂサイズのバンドを溶出した。また、実施例１−２で製作したＣＪ１プロモーターを制限酵素ＫｐｎIとＥｃｏＲVで処理した後、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、以下同一）を用いて分離した。

Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮＥＢ社製、以下同一）を用いて、前記２つのＤＮＡ断片を連結させて組み換えプラスミドｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１を製作した後、これに制限酵素ＸｂａIとＮｏｔIを処理し、これを０．８％アガロースゲルで電気泳動して約６．２Ｋｂサイズのバンドを溶出した。Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、前記で得たｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１と実施例１−３で得たｒｒｎＢ_１Ｂ_２タミネーター断片とを連結させて約６．６Ｋｂの組み換えプラスミドｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１−ｒｒｎＢ_１Ｂ_２を得た。これを本発明では「ｐＨＣ１３１Ｔ」と命名した。

前記製作したｐＨＣ１３１ＴプラスミドをＥｃｏＲVとＸｂａIで処理した後、１％アガロースゲルで約６．６Ｋｂサイズのバンドを溶出して得た。

実施例２−２．ｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２プラスミドの製作
実施例１−１で得たａｒｇＤ２遺伝子のＰＣＲ結果物を制限酵素ｓｍａIとＸｂａIで処理した後、これを０．８％アガロースゲルで約１．３Ｋｂサイズのバンドを溶出した。これを、Ｑｕｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、実施例２−１で製作したｐＨＣ１３１Ｔと連結させて約７．４Ｋｂの組み換えプラスミドを製作し（図１）、これを本発明では「ｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２」と命名した。

実施例３．ａｒｇ２Ｄ遺伝子の塩基配列分析
実施例２−２で製作したｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２の塩基配列分析のために、ｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２のＤＮＡ０．１μｇを鋳型としてＰＣＲを行った。この際、プライマーはそれぞれ２ｍＭの配列番号３および配列番号６のプライマーを使用し、反応液はＢｉｇＤｙｅ^ＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃlｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｖ２．０ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１μＬを使用した。ＰＣＲ反応条件は、変性９５℃で３０秒、アニーリング５５℃で３０秒、延長７２℃で２分を１サイクルとして２５サイクルを行った。その後、ＰＣＲ反応液を４℃に冷却して反応を終了させた。前記ＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、２ＫｂサイズのＤＮＡ断片を溶出して分離した。

前記ＤＮＡ断片と前記配列番号３のプライマーを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で塩基配列を確認した。本発明のａｒｇＤ２遺伝子がコードするアミノ酸配列とその塩基配列をそれぞれ配列番号１および２に示した。

実施例４．形質転換体の製作
実施例２−２で製作した組み換えプラスミドｐＨＣ１３１Ｔ−ａｒｇＤ２をＬ−アルギニン生産菌株ＡＴＣＣ２１４９３およびＡＴＣＣ２１８３１にエレクトロポレーション法で流入させ、ａｒｇＤ２遺伝子が過発現した形質転換体を製作した。これらの形質転換体を、本発明では、母菌株がＡＴＣＣ２１４９３の形質転換体はＣＡ０６−００１２と命名し、母菌株がＡＴＣＣ２１８３１の形質転換体はＣＡ０６−００１３と命名した。これらの形質転換体を韓国微生物保存センターに２００６年１２月１３日付で寄託し、寄託番号はそれぞれＫＣＣＭ１０８２０ＰおよびＫＣＣＭ１０８２１Ｐである。

前記菌株および前記形質転換体をカナマイシン(Kanamycin)２５ｍｇ／Ｌ入りの固体培地（組成；牛肉エキス３．０ｇ／Ｌ、ペプトン５．０ｇ／Ｌ、以下同一）に塗抹して３０℃で１６時間培養し、選抜したコロニーに対して実施例５と同様のプラスコ力価確認実験を行った結果、本発明に係るａｒｇＤ２遺伝子の過発現した形質転換体がＬ−アルギニンを高収率で生産していることを確認することができた。

実施例５．三角プラスコにおけるアルギニン生産力価比較実験
実施例４で製作した形質転換体と母菌株としてのＡＴＣＣ２１８３１およびＡＣＣ２１４９３菌株を抗生剤としてのカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ含有固体培地に塗抹して３０℃、１６時間培養した後、選別された各菌株からコロニー１０株ずつを選別した。これを表１に示したＬ−アルギニン種培地で培養した後、さらにこれを表１に示した力価培地を用いて三角プラスコでＬ−アルギニン生産性を平均値で比較した。

選別したコロニーを種培地に接種した後、３０℃の培養器で１６時間培養した後、培養液を２４ｍＬの力価培地で１ｍＬずつ接種して３０℃、２２０ｒｐｍの培養器で７２時間培養し、ＡＴＣＣ２１８３１、ＡＴＣＣ２１４９３および形質転換体のＬ−アルギニン生産力価実験結果を表２に示した。

表２に示すように、アルギニン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ２１４９３およびＡＴＣＣ２１８３１菌株のＬ−アルギニン生産量はそれぞれ０．９ｇ／Ｌと４．４ｇ／Ｌであるが、本発明のａｒｇＤ遺伝子が過発現した組み換え菌株ＣＡ０６−００１２およびＣＡ０６−００１３のＬ−アルギニン生産量はそれぞれ１．１ｇ／Ｌおよび４．９ｇ／Ｌである。よって、本発明の組み換え菌株ＣＡ０６−００１２およびＣＡ０６−００１３は、母菌株に比べてそれぞれ０．２ｇ／Ｌ（２２．２％）および０．５ｇ／Ｌ（１１．４％）の向上した収率でＬ−アルギニンを生産することを確認することができた。

以上の説明より、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想または必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解することができる。これに関連し、上述した実施例および実験例は全ての面で例示的なもので、制限的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は前述した詳細な説明よりは特許請求の範囲によって定められ、そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形形態も本発明の範囲に属するものと理解すべきである。

本発明は、コリネバクテリウムグルタミカムのアルギニン生合成に関与するアセチルオルニチンアミノ基転移酵素の遺伝子と推定されるａｒｇＤ２遺伝子（Ｎｃｇｌ２３５５）を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターをＬ−アルギニン生産宿主微生物に導入してａｒｇＤ２遺伝子を過発現させることにより高収率でＬ−アルギニンを生産することが可能な形質転換体、前記形質転換体を培養してＬ−アルギニンを製造する方法を提供するという効果がある。本発明の形質転換体は、ａｒｇＤ２遺伝子を過発現させて高収率でＬ−アルギニンを生産することができるため、ヒト医薬および薬学産業と飼料産業に有用に使用することができる。

Claims (4)

1. 受託番号ＫＣＣＭ１０８２０Ｐまたは受託番号ＫＣＣＭ１０８２１Ｐにより同定され、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有するａｒｇＤ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された、コリネバクテリウム微生物。
2. ａｒｇＤ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換されたコリネバクテリウム微生物を培養する段階を含み、該ａｒｇＤ２ポリペプチドが配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有する、Ｌ−アルギニンの製造方法。
3. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２で表示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２記載の製造方法。
4. 前記コリネバクテリウム微生物が、受託番号ＫＣＣＭ１０８２０Ｐまたは受託番号ＫＣＣＭ１０８２１Ｐにより同定されるものである、請求項２記載の製造方法。
   

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