ES2364881T3 - Variedad de corynebacterium glutamicum que produce l-arginina y método para fabricar la misma. - Google Patents

Variedad de corynebacterium glutamicum que produce l-arginina y método para fabricar la misma. Download PDF

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Abstract

Un método para producir L-arginina, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo que contiene un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido argD2, en donde el polipéptido argD2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 1.

Description

Campo técnico
La presente invención se refiere a una cepa mutante productora de L-arginina, que produce L-arginina con un alto
5 rendimiento para ser usada en las industrias medicinales y farmacéuticas, y a un método para fabricar la misma. En particular, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicada en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum, un polipéptido codificado por el polinucleótido, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, un transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento, que se prepara introduciendo el vector recombinante en un microorganismo hospedante productor de L-arginina para sobre-expresar el gen argD2 y a un método para producir L-arginina cultivando el transformante.
Fundamento técnico
La L-arginina es un aminoácido que en su forma libre se encuentra en semillas de plantas o en el ajo. La L-arginina ha sido ampliamente usada como un aditivo eficiente en medicamentos, alimentos o similares. La L-arginina es útil
15 como fármaco para mejorar la función hepática y la función cerebral y para tratar la esterilidad masculina, y como un ingrediente de de suplementos de múltiples aminoácidos. Además, la L-arginina se ha usado como aditivo alimenticio en croquetas de pescado y bebidas dietéticas, y recientemente ha ganado interés como sustituto de la sal común para pacientes hipertensos.
Los métodos convencionales para la producción de L-arginina por fermentación biológica se basan en la producción de L-arginina directamente a partir de fuentes carbonadas y nitrogenadas. Por ejemplo, la L-arginina puede ser producida usando una cepa mutante derivada de un microorganismo productor de ácido glutámico que pertenece al género Brevibacterium o Corynebacterium (Publicaciones de patentes japonesas no examinadas Nº Sho57-163487, Sho60-83593 y Sho62-265988) o usando un microorganismo productor del aminoácido, cuyas propiedades de crecimiento son mejoradas mediante la fusión celular (Publicación de patente japonesa no publicada Nº Sho59
25 158185). Recientemente se ha descrito que la L-arginina se puede producir usando una cepa recombinante, en la cual está inactivado su gen argR que participa en la regulación de la biosíntesis de arginina (Solicitud de patente de EE.UU. Nº 2002/0045223A1) y usando un método para sobre-expresar un gen argF del operón de arginina (Solicitud de patente coreana Nº 10-2004-107215).
En los microorganismos, la biosíntesis de L-arginina transcurre en ocho etapas enzimáticas que parten del precursor L-glutamato y sigue dos vías diferentes, la vía lineal y la vía cíclica.
En microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium, la L-arginina se sintetiza a través de la vía cíclica a partir de L-glutamato vía N-acetilglutamato, fosfato de N-acetilglutamilo, N-acetilglutamato-semialdehído, Nacetilornitina, ornitina, citrulina y argininosuccinato. Estos productos intermedios se sintetizan a través de reacciones consecutivas catalizadas por enzimas tales como glutamato N-acetiltransferasa, N-acetilglutamato-quinasa,
35 acetilglutamato-semialdehído-deshidrogenasa, acetilornitina-aminotransferasa, ornitina-carbamoiltransferasa, argininosuccinato-sintasa y argininosuccinato-liasa. Estas enzimas están codificadas por los genes argJ, argB, argC, argD, argF, argG y argH, respectivamente.
Para producir L-arginina con alto rendimiento, las autores de la presente invención han realizado estudios sobre las enzimas implicadas en la biosíntesis de L-arginina durante un largo periodo de tiempo. Encontraron que en la etapa intermedia de la biosíntesis de arginina, se amplifica la reacción enzimática implicaba la conversión de Nacetilglutamato-semialdehído en N-acetilornitina para aumentar el flujo de L-arginina, mejorando de este modo la productividad de L-arginina.
En las células está presente una variedad de aminotransferasas, y se dividen en cuatro subgrupos sobre la base de su relación estructural mutua. El subgrupo I comprende aspartilornitina, alanina, tirosina, histidiolfosfato y fenilalanina
45 -aminotransferasas, el subgrupo II comprende acetilornitina, ornitina, ω-aminoácido, aminobutirato y fenilalaninaaminotransferasas, el subgrupo III comprende D-alanina y aminoácido de cadena ramificada-aminotransferasas, y el subgrupo IV comprende serina y fosfoserina-aminotransferasas (Perdeep K. MEHTA, et al., Eur. J. Biochem., 214, 549-561, 1993).
Se sabe que en Corynebacterium glutamicum, existe un gen argCJBDF implicado en la biosíntesis de arginina en forma de un operón, y está regulado por inhibición por retroalimentación debida a arginina (Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142:9-108, 1996). Por tanto, hay un límite en producir L-arginina con alto rendimiento.
Descripción de la invención
Problema técnico
Por consiguiente, los autores de la presente invención se han esforzado en desarrollar estas cepas capaces de producir L-arginina con alto rendimiento. Encontraron que un microorganismo transformado con un gen argD2, que es un supuesto gen que tiene la misma función que un gen argD que codifica acetilornitina-aminotransferasas, sobre-expresa el gen argD2 y produce L-arginina con mayor rendimiento que una cepa parental, completando de este modo la presente invención.
Solución técnica
Es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido codificado por ungen argD2 (NcgI2355) que es un supuesto gen de acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar a vector recombinante que comprende a secuencia de bases que codifica el polipéptido.
Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento, que se prepara introduciendo el vector recombinante.
Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un método para producir L-arginina cultivando el transformante. Sin embargo, en particular, la presente invención se refiere a un método de producir L-arginina según se reivindica más adelante. Las realizaciones preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la construcción de un plásmido recombinante pHC131T-argD2, que comprende un gen argD2, el promotor CJ1 y el terminador rrnB1B2.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
En una realización la presente invención proporciona un polipéptido codificado por un gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum. Preferiblemente la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede estar representada por la SEQ ID NO. 1.
El gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum es una aminotransferasa clasificada en el subgrupo II de acuerdo con el análisis basado en el genoma (Alice C. McHardy, et al., J. Biotechnology, 104, 229-240, 2003). Sin embargo, la función de la proteína codificada por el gen argD2 no ha sido claramente identificada. Hay poca homología de secuencia entre los genes argD y argD2, sin embargo, ambos genes tienen el mismo resto, subgrupo II de aminotransferasa. Por tanto se deduce, que proteína codificada por el gen argD2 tiene una función similar a la acetilornitina-aminotransferasa que es codificada por el gen argD y requerida para la biosíntesis de arginina (www.genome,jp/kegg/).
Puede verse que la cepa que produce L-arginina transformada con un vector recombinante que comprende el gen argD2 produce L-arginina con un rendimiento superior al de la cepa parental.
También se proporciona polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Preferiblemente, la secuencia de bases del polinucleótido puede estar representada por la SEQ ID NO. 2. Además, se describe también un polinucleótido que tiene 70% o más de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO. 2, preferiblemente 90% o más de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO. 2. También se describe un vector recombinante que comprende el polinucleótido. Preferiblemente, el vector recombinante puede comprender el polinucleótido representado por la SEQ ID NO. 2 puede ser un vector recombinante pHC131T-argD2 preparado como se describe en la presente memoria. El vector recombinante puede ser preparado fácilmente por los expertos en la técnica de acuerdo con cualquier método conocido usando la técnica del DNA recombinante. Por ejemplo, el DNA genómico se aísla de la cepa productora de L-arginina y se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente en lo sucesivo PCR, por sus iniciales en inglés) usando el DNA genómico como molde para amplificar la región del marco de lectura abierto (abreviadamente en lo sucesivo ORF por sus iniciales en inglés) del gen argD2. Para preparar un vector recombinante para la sobre-expresión, se amplifican el promotor CJ1 (Patente coreana Nº 10-0620092) y las regiones del terminador rrnB1B2 usando pECCG117-CJ1 y E. coli K-12 como molde, respectivamente. El promotor CJ1 que es conocido como la región situada en dirección 5' de Corynebacterium ammoniagenes Hsp60 y fuertemente expresada en Corynebacterium glutamicum y el terminador rrnB1B2 comercialmente disponible se usan como promotor y terminador, respectivamente. A este respecto, la secuencia de bases del gen argD2 se analiza por un método de secuenciación convencional. La región del promotor, la región del terminador y el gen argD2 se clonan en un plásmido adecuado u otros vectores de clonación, y se transforman en células competentes adecuadas para preparar un vector recombinante (Fig. 1).
En la preparación del vector recombinante, cualquier vector expresado en células procariotas o eucariotas puede ser usado como vector de clonación, y en una realización específica de la presente invención se usa un plásmido pECCG117 (Han J.K., et al., Biotechnology Letters, 13(10):721-726, 1991 o la Publicación de patente coreana Nº 927401). Además, la cepa productora de L-arginina abarca todos los microorganismos capaces de producir L-arginina, incluyendo células procariotas o eucariotas, preferiblemente Escherichia coli, bacterias corineformes y especies de Bacillus capaces de producir L-arginina, y más preferiblemente Corynebacterium glutamicum capaz de producir Larginina.
La presente invención proporciona un transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento, que se prepara introduciendo el vector recombinante en un microorganismo hospedante productor de L-arginina para sobre-expresar el gen argD2.
Específicamente, el microorganismo hospedante tiene elevadas eficiencia de introducción del DNA y eficiencia de expresión, y puede ser cualquier microorganismo capaz de producir L-arginina, incluyendo células procariotas o eucariotas. Los Ejemplos preferidos de los mismos incluyen uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en las especies Escherichia, Aerobacter, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Zygosaccharomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Salmonella, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Brevibacterium, Magnetospirillum y Corynebacterium, más preferiblemente microorganismos que pertenecen al género Corynebactrium, que tienen resistencia a análogos de L-arginina y producen L-arginina, y más preferiblemente Corynebacterium glutamicum ATCC21493 o ATCC21831. Ejemplos de análogos de L-arginina incluyen el alfa-aminoácido canavanina, encontrado en Canavalia ensiformis, e hidroxamato de arginina.
En una realización específica de la presente invención, el vector recombinante pHC131T-argD2 se introduce en Corynebacterium glutamicum ATCC21493 y Corynebacterium glutamicum ATCC21831, que tienen resistencia a L-análogos de arginina y producen L-arginina, de modo que se preparan los microorganismos transformados CA060012 y CA06-0013. Los microorganismos transformados CA06-0012 y CA06-0013 se depositaron en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (Korean Culture Center de Microorganisms, abreviadamente en lo sucesivo "KCCM") el 13 de diciembre de 2006 con los números de acceso KCMM 10820P y KCMM 10821 P, respectivamente.
Los microorganismos transformados pueden ser preparados fácilmente por los expertos en la técnica de acuerdo con cualquier método conocido. El término "transformación" como se usa en la presente memoria significa introducir DNA en una célula hospedante de modo que el DNA sea replicable, bien sea como un elemento extracromosómico
o por integración cromosómica, es decir, una alteración genética artificial introduciendo un DNA extraño en una célula hospedante. Ejemplos de dichos métodos incluyen una precipitación con CaCl2, un método de Hanahan que es un método con CaCl2 mejorado usando DMSO (dimetilsulfóxido) como material reductor, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, fusión de protoplastos, agitación usando fibra de carburo de silicona, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por PEG, sulfato de dextrano y lipofectamina. En una realización de la presente invención, el vector recombinante pHC131T-argD2 se introdujo en células hospedantes por electroporación para preparar transformantes y se seleccionó una cepa que aloja el vector recombinante usando su resistencia a antibióticos.
Para aumentar la productividad de L-arginina del transformante preparado de acuerdo con la presente invención, el gen argD2 presente en el cromosoma del transformante puede ser sometido adicionalmente a expresión o deleción mediante una técnica recombinante usual. Se sabe en la técnica relacionada que su secuencia de bases puede ser analizada mediante un método de secuenciación usando fluorescencia.
En la vía biosintética de la L-arginina, la ornitina es un producto intermedio de la vía metabólica de la arginina y es un material importante en el metabolismo del nitrógeno junto con el ciclo de la urea. Las cepas CA06-0012 y CA060013 transformadas por el método de la presente invención son transformantes que sobre-expresan el gen argD2, preparados por el método siguiente. El gen argD2 que codifica una supuesta proteína que tiene una función de acetilornitina-aminotransferasa, que se obtiene por PCR a partir del cromosoma de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC21831 productora de L-arginina se inserta en un vector y se introduce en las cepas productoras de L-arginina, Corynebacterium glutamicum ATCC21493 y ATCC21831. Se encontró que las cepas CA06-0012 y CA060013 transformadas de acuerdo con la presente invención sobre-expresan el gen argD2 aumentando la síntesis de N-acetilornitina, activando con ello la ruta biosintética de la arginina para producir L-arginina con alto rendimiento.
Por consiguiente, en otra realización, la presente invención proporciona un método para producir L-arginina, que comprende las etapas de cultivar el transformante, preferiblemente el transformante representado por el número de acceso KCCM10820P o KCCM10821P.
En el método de producción de L-arginina de acuerdo con la presente invención, el cultivo de los microorganismos transformados que sobre-expresan L-arginina puede ser realizado en medios adecuados y en condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Los métodos de cultivo pueden ser ajustados fácilmente por los expertos en la técnica de acuerdo con la cepa seleccionada. Ejemplos de de los métodos de cultivo incluyen, pero sin limitación, los modos de tipo por lotes, los de tipo continuo y los mixtos de alimentación continua-por lotes. En la bibliografía se describen diversos métodos de cultivo, por ejemplo, en "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991).
Durante el cultivo, se pueden añadir adecuadamente hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico, y ácido sulfúrico para ajustar el pH de los cultivos. Se pueden añadir adecuadamente agentes antiespumantes, tales como éster poliglicólico de ácidos grasos para reducir la formación de espumas en los cultivos. Además, para mantener los cultivos en estado aerobio, se les puede inyectar oxígeno gaseoso o gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire). Los cultivos se mantienen a 20 a 45ºC y preferiblemente a 25 a 40ºC. El cultivo puede ser continuado hasta que se obtiene una cantidad deseada de L-arginina, y preferiblemente durante 10 a 160 horas. El aislamiento de L-arginina a partir del caldo de cultivo se puede realizar por un método usual conocido en la técnica. Ejemplos de dichos métodos de aislamiento incluyen centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico y cristalización. Por ejemplo, los cultivos se pueden someter a una centrifugación a baja velocidad para separar la biomasa y el líquido sobrenadante puede ser separado por cromatografía de intercambio iónico.
Modo para la invención
En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solamente con fines ilustrativos, y no se pretende que la invención sea limitada por estos Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación de argD2, el promotor CJ1 y el terminador rrnB1B2
Para construir un vector recombinante pHC131T que comprende un gen argD2 que es un supuesto gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum, el promotor CJ1 que se expresa fuertemente en Corynebacterium glutamicum, y el terminador rrnB1B2, un fragmento de DNA (1,371 Kb) que incluyen el marco de lectura abierto (ORF) del gen argD2 se obtuvo a partir del DNA genómico (gDNA) de la cepa productora de L-arginina ATCC21831, y la PCR se realizó usando pECCG117-CJ1 (Solicitud de patente coreana Nº 10-2004-107215) y el genoma de E. coli K-12 W3110 como molde para obtener el promotor CJ1 (0,3 kb) y el terminador rrnB1B2 (0,4 Kb), respectivamente.
Ejemplo 1-1. Amplificación del fragmento de DNA incluyendo el ORF del gen argD2
El DNA genómico (gDNA) se extrajo de la cepa productora de L-arginina ATCC21831 usando un sistema Genomictip (QIAGEN, igual en lo sucesivo). Para amplificar el fragmento de DNA (1,371 Kb) que incluye el ORF del gen argD2, se usó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el gDNA como molde y a un dispositivo de ciclo térmico Peltier PTC-200 (MJ Research, USA, igual en lo sucesivo). En este momento, los cebadores usados en la amplificación de región ORF del gen argD2 fueron como sigue: SEQ ID NO. 7; 5'-tcccccgggggattggcatgaagggttac-3' y SEQ ID NO. 8; 5'-gctctagagcttagaacaacgccccagc-3'. Las condiciones de la PCR incluyeron 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, reasociación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 1 minuto. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%, y luego se eluyó del gel una banda de 1,3 kb.
Ejemplo 1-2. Amplificación del promotor CJ1
Para amplificar el promotor CJ1, se realizó la PCR usando pECCG117-CJ1 (solicitud de patente coreana Nº 102004-107215) como molde y un dispositivo de ciclo térmico Peltier PTC-200. En este momento los cebadores usados en la amplificación del promotor CJ1 fueron como sigue: SEQ ID NO. 3; 5'-cgggtaccaccgcgggcttattccattacat3' y SEQ ID NO. 4; 5'-acgcgatatcttaatctcctagattgggtttc-3'. Las condiciones de la PCR incluyeron 25 ciclos de des-naturalización a 94ºC durante 30 segundos, reasociación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 68ºC durante 30 segundos. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%, y luego se eluyó del gel una banda de 0,3 kb.
Ejemplo 1-3. Amplificación del terminador rrnB1B2
El DNA genómico (gDNA) se extrajo de E.coli K-12 W3110 usando un sistema Genomic-tip. Para amplificar el terminador rrnB1B2, la PCR se realizó usando el gDNA como molde y un dispositivo de ciclo térmico Peltier PTC-200. En este momento, los cebadores usados en la amplificación del terminador rrnB1B2 fueron como sigue: SEQ ID NO. 5; 5'-gctctagagctgttttggcggatgaga-3' y SEQ ID NO. 6; 5'-ataagaatgcggccgccgcaaaaaggccatccgtcag-3'. Las condiciones de la PCR son las mismas que en la amplificación del promotor CJ1. . El producto de la PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%, y luego se eluyó del gel una banda de 411 pb.
Ejemplo 2. Construcción de un plásmido recombinante
Ejemplo 2-1. Construcción del plásmido recombinante pHC131T
Se trató un plásmido pECCG-117 (Han J.K., et al., Biotechnology Letters, 13(10):721-726, 1991 o Publicación de patente coreana Nº 92-7401), que es un vector lanzadera de E. coli/C. glutamicum, con las enzimas de restricción, EcoRV y KpnI, y luego se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% para eluir una banda de aproximadamente 5,9 kb. Además, el promotor CJ1 preparado en el Ejemplo 1-2 se trató con las enzimas de restricción, KpnI y EcoRV, y luego se aisló usando un kit de purificación Quiaquick PCR (Qiagen, igual en lo sucesivo).
Dos fragmentos de DNA se ligaron usando el kit de ligación Quick (NEB, igual en lo sucesivo) para preparar un plásmido recombinante pECCG117-CJ1. El plásmido recombinante pECCG117-CJ1 se trató con las enzimas de restricción, Xbal y Notl, y luego se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir una banda de aproximadamente 6,2 Kb. El plásmido pECCG117-CJ1 preparado y el terminador rrnB1B2 preparado en el Ejemplo 1-3 se ligaron usando un kit de ligación Quick para obtener el plásmido recombinante pECCG117-CJ1-rrnB1B2 (aproximadamente 6,6 Kb), que se denominó "pHC131T" en la presente invención.
El plásmido preparado pHC131T se trató con EcoRV y Xbal, y luego se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% para eluir del gel una banda de aproximadamente 6,6 kb.
Ejemplo 2-2. Construcción de plásmido pHC131T-argD2
El producto de la PCR del gen argD2 preparado en el Ejemplo 1-1 se trató con las enzimas de restricción, Smal y Xbal, y luego se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para eluir del gel una banda de aproximadamente 1,3 kb. El producto resultante se ligó con pHC131T preparado en el Ejemplo 2-1 usando un kit de ligación Quick, de modo que se construyó un plasmado recombinante de aproximadamente 7,4 Kb (Fig. 1), que se denominó "pHC131T-argD2" en la presente invención.
Ejemplo 3. Análisis de secuenciación del gen argD2
Para analizar la secuencia de bases de pHC131T-argD2 preparado en el Ejemplo 2-2, se realizó la PCR usando 0,1 µg de DNA de pHC131T-argD2 como molde con 2 mM de un par de cebadores de las SEQ ID NO. 3 y 6 y 1 ¿ de un BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (PE Biosystems). Las condiciones de la PCR incluyeron 25 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, reasociación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 2 minutos, seguido por enfriamiento brusco a 4ºC para terminar la reacción. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, y luego se eluyó del gel un fragmento de DNA de 2 kb.
Este fragmento de DNA se sometió a análisis de secuenciación usando el cebador de SEQ ID NO. 3 en un analizador genético ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Una secuencia de aminoácidos codificada por el gen argD2 de la presente invención y una secuencia de bases para la misma se muestran en las SEQ ID NO. 1 y 2, respectivamente.
Ejemplo 4. Preparación de transformantes
El plásmido recombinante pHC131T-argD2 preparado en el Ejemplo 2-2 se introdujo en las cepas productoras de Larginina, ATCC 21493 y ATCC 21831 por electroporación para preparar transformantes que sobre-expresan el gen argD2, que se denominaron CA06-0012 y CA06-0013, respectivamente. Los microorganismos transformados CA060012 y CA06-0013 se depositaron en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) el 13 de diciembre de 2006 con los números de acceso KCMM 10820P y KCMM 10821 P, respectivamente.
Las cepas y transformantes se extendieron sobre medios sólidos que contienen 25 mg/L de kanamicina (composición: 3,0 g/L de extracto de vacuno, 5,0 g/L de peptona), y se cultivó a 30ºC durante 16 horas. Las colonias seleccionadas se sometieron a un ensayo de titulación en matraz como en el Ejemplo 5 siguiente. Como resultado, se encontró que el transformante que sobre-expresa el argD2 de acuerdo con la presente invención produjo Larginina con alto rendimiento.
Ejemplo 5. Comparación del título de la producción de arginina en matraz Erlenmeyer
Los transformantes preparados en el Ejemplo 4 y las cepas parentales, ATCC21831 y ATCC21493 se extendieron sobre medios sólidos que contenían 25 mg/L de kanamicina, y se cultivaron a 30ºC durante 16 horas para seleccionar 10 colonias individuales de cada cepa. Las colonias seleccionadas se cultivaron en los medios de siembra de L-arginina indicados en la Tabla 1, y luego se evaluaron en cuanto a la productividad de L-arginina en un matraz Erlenmeyer usando los medios de titulación indicados en la Tabla 1. Se calcularon y compararon los valores medios de la productividad de L-arginina.
Tabla 1
Ingredientes
Medios de siembra de L-arginina Medios de titulación de L-arginina
Glucosa
5% 4%
Bactopeptona
1% -
Cloruro sódico (NaCl)
0,25% -
Extracto de levadura
1% -
Biotina
3 µg/L 200 µg/L
Urea
0,4% 0.3%
pH
7,0 7,2
Sulfato amónico ((NH4)2SO4)
- 3%
Dihidrógeno-fosfato de potasio (KH2PO4)
- 0,1%
Hidrógeno-fosfato de potasio (K2HPO4)
- 0,1%
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
- 0,025%
Líquido de maceración de maíz (LCM)
- 2,0%
Las colonias seleccionadas se inocularon en los medios de siembra y se cultivaron en una incubadora a 30ºC durante 16 horas. 1 ml de del cultivo de siembra se inoculó en 24 ml de los medios de títulos, y el cultivo se llevó a 5 cabo a 30ºC y 220 rpm durante 72 horas. Los resultados del ensayo de titulación de la producción de L-arginina para ATCC21831, ATCC21493 y los transformantes se indican en la Tabla 2.
Como se muestra en la Tabla 2, las cepas productoras de arginina Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 y ATCC 21831 exhibieron una productividad de L-arginina de 0,9 g/L y 4,4 g/ L, respectivamente. Mientras tanto las cepas recombinantes que sobre-expresan el gen argD2, CA06-0012 y CA06-0013 de la presente invención
10 exhibieron una productividad de L-arginina de 1,1 g/L y 4,9 g/L, respectivamente. Puede verse que la productividad de las cepas recombinantes CA06-0012 y CA06-0013 fue aumentada en 0,2 g/L (22,2%) y 0,5 g/L (11,4%), en comparación con cada cepa parental.
Tabla 2
Productividad
Cepa
Cepa parental (ATCC21493)
Transformante (CA06-0012) Cepa parental (ATCC21831) Transformante (CA06-0013)
L-arginina (g/L)
0,9 1,1 4,4 4,9
15 Debe entenderse que los Ejemplos y los Ejemplos experimentales anteriores no son limitativos, sino ilustrativos en todos los aspectos.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto
gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum, un 20 polipéptido codificado por el polinucleótido, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, un
transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento que se prepara introduciendo el vector
recombinante en un microorganismo hospedante productor de L-arginina para sobre-expresar el gen argD2, y un
método para producir L-arginina cultivando el transformante. El transformante de la presente invención sobre-
expresa el gen argD2 para producir L-arginina con alto rendimiento, tras lo cual se usa en las industrias de 25 medicamentos y farmacéutica y en la industria alimentaria.
<110> CJ cheiljedang Corporation
<120> Variedad de Corynebacterium glutamicum que produce L-arginina y método para fabricar la misma.
<130> OPA08001/PCT
<150> KR10-2007-0005831 5 <151> 2007-01-18
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 456 10 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de amino ácidos de ArgD2
<400> 1
imagen1
imagen1
<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de amino ácidos de ArgD2
<400> 2
imagen1
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia delante para PCR del promotor CJ1
<400> 3
imagen1
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia atrás para PCR del promotor CJ1
<400> 4
imagen1
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia delante para PCR del terminador rrnB1B2
<400> 5 gctctagagc tgttttggcg gatgaga
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia atrás para PCR del terminador rrnB1B2
<400> 6
imagen1
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia delante para PCR de la ORF del gen argD2
<400> 7 <210> 8
imagen1
<211> 28
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador hacia atrás para PCR de la ORF del gen argD2
<400> 8
imagen1

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para producir L-arginina, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo que contiene un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido argD2, en donde el polipéptido argD2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 1.
  2. 2.
    El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido consiste en la SEQ ID NO.2.
  3. 3.
    El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo pertenece al género Corynebacterium.
  4. 4.
    El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo se identifica por el número de acceso KCCM10820P o KCCM10821P.
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