JP3375830B2 - ｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコードするＤＮＡの使用およびペプチドを産生させる新規な方法 - Google Patents
ｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコードするＤＮＡの使用およびペプチドを産生させる新規な方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌における浸透
圧誘発性の転写の開始を可能にする、たとえばｐｒｏＵ
のようなｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコード
するＤＮＡ配列を使用する新規な発現系の作製および使
用に関するものである。本発明の発現系は、蛋白質もし
くはポリペプチドを包含するヘテロロガス遺伝子産物を
効率的に高度発現させるために使用することができる。
本発明はさらにたとえば大腸菌（Escherichia coli）の
ような数種の微生物でヘテロロガス遺伝子産物のＮａＣ
ｌ−誘発高度発現を可能にする組換ＤＮＡ技術および細
菌遺伝学の分野の当業者に利用しうる情報を用い、ベク
ターおよび菌株を作製する方法を提供する。さらに本発
明は、たとえば大腸菌（Escherichia coli）のような各
種の微生物における前記新規な組合せを用い、蛋白質も
しくはポリペプチドを包含するヘテロロガス遺伝子産物
のＮａＣｌ誘発高度発現を行う方法、並びに実験室的規
模もしくは工業規模の生産システムにて興味ある遺伝子
産物を精製する方法をも提供する。
圧誘発性の転写の開始を可能にする、たとえばｐｒｏＵ
のようなｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコード
するＤＮＡ配列を使用する新規な発現系の作製および使
用に関するものである。本発明の発現系は、蛋白質もし
くはポリペプチドを包含するヘテロロガス遺伝子産物を
効率的に高度発現させるために使用することができる。
本発明はさらにたとえば大腸菌（Escherichia coli）の
ような数種の微生物でヘテロロガス遺伝子産物のＮａＣ
ｌ−誘発高度発現を可能にする組換ＤＮＡ技術および細
菌遺伝学の分野の当業者に利用しうる情報を用い、ベク
ターおよび菌株を作製する方法を提供する。さらに本発
明は、たとえば大腸菌（Escherichia coli）のような各
種の微生物における前記新規な組合せを用い、蛋白質も
しくはポリペプチドを包含するヘテロロガス遺伝子産物
のＮａＣｌ誘発高度発現を行う方法、並びに実験室的規
模もしくは工業規模の生産システムにて興味ある遺伝子
産物を精製する方法をも提供する。
【０００２】
大腸菌（Escherichia coli）におけるｐｒｏＵオペロン
およびその転写の浸透圧調節 大腸菌（Escherichia coli）におけるｐｒｏＵ座もしく
はオペロンは浸透圧調節におけるグリシンベタインおよ
びＬ−プロリンの取り込みに関する結合性蛋白質−依存
の輸送系をコードする［ダッタナンダ（Dattananda）お
よびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９８９）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１７１巻、第１９１５〜１９２２頁；クソンカ（Csonk
a）（１９８９）、マイクロバイオロジカル・レビュー
（Microbiol. Rev. ）、第５３巻、第１２１〜１４７
頁］。ｐｒｏＵの転写はＮａＣｌもしくは他の不浸透性
溶質を増殖培地に添加して誘発される［ゴウリスハンカ
ー（Gowrishankar）（１９８５）、ジャーナル・バクテ
リオロジー（J. Bacteriol. ）、第１６４巻、第４３４
〜４４５頁；メイ（May ）等（１９８６）、モレキュラ
・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Gent. ）、第
２０５巻、第２２５〜２３３頁；ダッタナンダ（Dattan
anda）およびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９
８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacterio
l. ）、第１７１巻、第１９１５〜１９２２頁］。ｐｒ
ｏＵのヌクレオチド配列は全体的に決定されている［ゴ
ウリスハンカー（Gowrishankar）（１９８９）、ジャー
ナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１
巻、第１９２３〜１９３１頁；ゴウリスハンカー（Gowr
ishankar）（１９９０）、ジャーナル・バクテリオロジ
ー（J. Bacteriol. ）、第１７２巻、第１１６５頁］。
およびその転写の浸透圧調節 大腸菌（Escherichia coli）におけるｐｒｏＵ座もしく
はオペロンは浸透圧調節におけるグリシンベタインおよ
びＬ−プロリンの取り込みに関する結合性蛋白質−依存
の輸送系をコードする［ダッタナンダ（Dattananda）お
よびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９８９）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１７１巻、第１９１５〜１９２２頁；クソンカ（Csonk
a）（１９８９）、マイクロバイオロジカル・レビュー
（Microbiol. Rev. ）、第５３巻、第１２１〜１４７
頁］。ｐｒｏＵの転写はＮａＣｌもしくは他の不浸透性
溶質を増殖培地に添加して誘発される［ゴウリスハンカ
ー（Gowrishankar）（１９８５）、ジャーナル・バクテ
リオロジー（J. Bacteriol. ）、第１６４巻、第４３４
〜４４５頁；メイ（May ）等（１９８６）、モレキュラ
・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Gent. ）、第
２０５巻、第２２５〜２３３頁；ダッタナンダ（Dattan
anda）およびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９
８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacterio
l. ）、第１７１巻、第１９１５〜１９２２頁］。ｐｒ
ｏＵのヌクレオチド配列は全体的に決定されている［ゴ
ウリスハンカー（Gowrishankar）（１９８９）、ジャー
ナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１
巻、第１９２３〜１９３１頁；ゴウリスハンカー（Gowr
ishankar）（１９９０）、ジャーナル・バクテリオロジ
ー（J. Bacteriol. ）、第１７２巻、第１１６５頁］。
【０００３】Ｅ．コリ（E. coli ）におけるｐｒｏＵ発
現の浸透圧調節につきｃｉｓに要求される正確な遺伝子
要素がダッタナンダ（Dattananda）等、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）（１９９１）、第１
７３巻、第７４８１〜７４９０頁に規定されている。こ
の論文に記載されたプラスミドｐＨＹＤ２７２は、ｐｒ
ｏＵの３７６−１５５０領域がｐｒｏＵ発現の正常な浸
透圧調節につき必須であると同定している。上昇したオ
スモラリティーにおける定常状態増殖の際のｐｒｏＵの
ｃｉｓ調節要素を含む領域からの増大した転写は、たと
えばｌａｃＺもしくはｇｃｄＡのような、前記ｃｉｓ調
節要素に作用的に結合した或る種のヘテロロガス遺伝子
によりコードされる蛋白質の産生増大を指令しうること
が示されている［メイ（May ）等（１９８６）、モレキ
ュラ・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Gene
t.）、第２０５巻、第２２５〜２３３頁；ダッタナンダ
（Dattananda）（１９９３）、博士号論文、ヤワハラル
・ネール（Jawaharlal Nehru）大学、ニューデリー、イ
ンド；ハーブス（Herbs ）等（１９９４）、ジーン（Ge
ne）、第１５１巻、第１３７〜１４２頁］。
現の浸透圧調節につきｃｉｓに要求される正確な遺伝子
要素がダッタナンダ（Dattananda）等、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）（１９９１）、第１
７３巻、第７４８１〜７４９０頁に規定されている。こ
の論文に記載されたプラスミドｐＨＹＤ２７２は、ｐｒ
ｏＵの３７６−１５５０領域がｐｒｏＵ発現の正常な浸
透圧調節につき必須であると同定している。上昇したオ
スモラリティーにおける定常状態増殖の際のｐｒｏＵの
ｃｉｓ調節要素を含む領域からの増大した転写は、たと
えばｌａｃＺもしくはｇｃｄＡのような、前記ｃｉｓ調
節要素に作用的に結合した或る種のヘテロロガス遺伝子
によりコードされる蛋白質の産生増大を指令しうること
が示されている［メイ（May ）等（１９８６）、モレキ
ュラ・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Gene
t.）、第２０５巻、第２２５〜２３３頁；ダッタナンダ
（Dattananda）（１９９３）、博士号論文、ヤワハラル
・ネール（Jawaharlal Nehru）大学、ニューデリー、イ
ンド；ハーブス（Herbs ）等（１９９４）、ジーン（Ge
ne）、第１５１巻、第１３７〜１４２頁］。
【０００４】上記論文の他にＥ．コリ（E. coli ）のｐ
ｒｏＵに関する他の論文も存在し、そのクローニング
［ゴウリスハンカー（Gowrishankar）（（１９８６）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１６８巻、第１１９７〜１２０４頁；ファーツ（Faatz
）等（１９８８）、モレキュラ・マイクロバイオロジ
ー（Mol. Microbiol. ）、第２巻、第２６５〜２７９
頁；パーク（Park）等（１９８９）、モレキュラ・マイ
クロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３巻、第１
０１１〜１０２３頁］や、配列決定［メイ（May ）等
（１９８９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mo
l. Microbiol. ）、第３巻、第１５２１〜１５３１頁；
スターリング（Stirling）等（１９８９）、モレキュラ
・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３
巻、第１０２５〜１０３８頁］、また浸透圧調節のメカ
ニズム［スザーランド（Sutherland）等（１９８６）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１６８巻、第８０５〜８１４頁；ヒギンス（Higgins ）
等（１９８８）、セル（Cell）、第５２巻、第５６９〜
５８４頁；ヨバノビッチ（Jovanovich）等（１９８
９）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.）、第２６４巻、第７８２１〜７８２５
頁：ラミレズ（Ramirez ）等（１９８９）、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス ＵＳＡ
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第８６巻、第１１５
３〜１１５７頁；ドルマン（Dorman）等（１９８９）、
モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol.
）、第３巻、第５３１〜５４０頁；ニー・ブーリエイ
ン（Ni Bhriain）等（１９８９）、モレキュラ・マイク
ロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３巻、第９３
３〜９４２頁；プリンス（Prince）およびビラレヨ（Vi
llarejo ）（１９９０）、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６５巻、第１
７６７３〜１７６７９頁：ラミレズ（Ramirez ）および
ビラレヨ（Villarejo ）（１９９１）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７３巻、第８
７９〜８８５頁；ルヒト（Lucht ）およびブレマー（Br
emer）（１９９１）、ジャーナル・バクテリオロジー
（J. Bacteriol. ）、第１７３巻、第８０１〜８０９
頁；ウエグチ（Ueguchi ）およびミズノ（Mizuno）（１
９９３）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第１０３９〜１０４６頁；ルヒト（Lucht ）等（１
９９４）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）、第２６９巻、第６５７８〜６５８
６頁：タナカ（Tanaka）等（１９９４）、バイオサイエ
ンス・バイオテクノロジカル・バイオケミストリー（Bi
osci. Biotech. Bioochem.）、第５８巻、第１０９７〜
１１０１頁；メリース（Mellies ）等（１９９４）、ジ
ャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１
７６巻、第３６３８〜３６４５頁；マンナ（Manna ）お
よびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９９４）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１７６巻、第５３７８〜５３８４頁；スレジェスキー
（Sledjeski ）およびゴッテスマン（Gottesman ）（１
９９５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー
・サイエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A）、第９２巻、第２００３〜２００７頁；ジング（Din
g）等（１９９５）、モレキュラ・マイクロバイオロジ
ー（Mol. Microbiol.）、第１６巻、第６４９〜６５６
頁］も記載されている。これらの或る種の知見について
総説がある［クソンカ（Csonka）（１９８９）、マイク
ロバイオロジカル・レビュー（Microbiol. Rev. ）、第
５３巻、第１２１〜１４７頁；クソンカ（Csonka）およ
びハンソン（Hanson）（１９９１）、アニューアル・レ
ビュー・マイクロバイオロジー（Annu. Rev. Microbio
l. ）、第４５巻、第５６９〜６０６頁；ルヒト（Lucht
）およびブレマー（Bremer）（１９９４）、ＦＥＭＳ
マイクロバイオロジカル・レビュー（FEMS Microbiol.
Rev.）、第１４巻、第３〜２０頁］。しかしながら、こ
れら刊行物における記載は全て本発明の範囲外である。
ｒｏＵに関する他の論文も存在し、そのクローニング
［ゴウリスハンカー（Gowrishankar）（（１９８６）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１６８巻、第１１９７〜１２０４頁；ファーツ（Faatz
）等（１９８８）、モレキュラ・マイクロバイオロジ
ー（Mol. Microbiol. ）、第２巻、第２６５〜２７９
頁；パーク（Park）等（１９８９）、モレキュラ・マイ
クロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３巻、第１
０１１〜１０２３頁］や、配列決定［メイ（May ）等
（１９８９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mo
l. Microbiol. ）、第３巻、第１５２１〜１５３１頁；
スターリング（Stirling）等（１９８９）、モレキュラ
・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３
巻、第１０２５〜１０３８頁］、また浸透圧調節のメカ
ニズム［スザーランド（Sutherland）等（１９８６）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１６８巻、第８０５〜８１４頁；ヒギンス（Higgins ）
等（１９８８）、セル（Cell）、第５２巻、第５６９〜
５８４頁；ヨバノビッチ（Jovanovich）等（１９８
９）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.）、第２６４巻、第７８２１〜７８２５
頁：ラミレズ（Ramirez ）等（１９８９）、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス ＵＳＡ
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第８６巻、第１１５
３〜１１５７頁；ドルマン（Dorman）等（１９８９）、
モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol.
）、第３巻、第５３１〜５４０頁；ニー・ブーリエイ
ン（Ni Bhriain）等（１９８９）、モレキュラ・マイク
ロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第３巻、第９３
３〜９４２頁；プリンス（Prince）およびビラレヨ（Vi
llarejo ）（１９９０）、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６５巻、第１
７６７３〜１７６７９頁：ラミレズ（Ramirez ）および
ビラレヨ（Villarejo ）（１９９１）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７３巻、第８
７９〜８８５頁；ルヒト（Lucht ）およびブレマー（Br
emer）（１９９１）、ジャーナル・バクテリオロジー
（J. Bacteriol. ）、第１７３巻、第８０１〜８０９
頁；ウエグチ（Ueguchi ）およびミズノ（Mizuno）（１
９９３）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第１０３９〜１０４６頁；ルヒト（Lucht ）等（１
９９４）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）、第２６９巻、第６５７８〜６５８
６頁：タナカ（Tanaka）等（１９９４）、バイオサイエ
ンス・バイオテクノロジカル・バイオケミストリー（Bi
osci. Biotech. Bioochem.）、第５８巻、第１０９７〜
１１０１頁；メリース（Mellies ）等（１９９４）、ジ
ャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１
７６巻、第３６３８〜３６４５頁；マンナ（Manna ）お
よびゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１９９４）、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第
１７６巻、第５３７８〜５３８４頁；スレジェスキー
（Sledjeski ）およびゴッテスマン（Gottesman ）（１
９９５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー
・サイエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A）、第９２巻、第２００３〜２００７頁；ジング（Din
g）等（１９９５）、モレキュラ・マイクロバイオロジ
ー（Mol. Microbiol.）、第１６巻、第６４９〜６５６
頁］も記載されている。これらの或る種の知見について
総説がある［クソンカ（Csonka）（１９８９）、マイク
ロバイオロジカル・レビュー（Microbiol. Rev. ）、第
５３巻、第１２１〜１４７頁；クソンカ（Csonka）およ
びハンソン（Hanson）（１９９１）、アニューアル・レ
ビュー・マイクロバイオロジー（Annu. Rev. Microbio
l. ）、第４５巻、第５６９〜６０６頁；ルヒト（Lucht
）およびブレマー（Bremer）（１９９４）、ＦＥＭＳ
マイクロバイオロジカル・レビュー（FEMS Microbiol.
Rev.）、第１４巻、第３〜２０頁］。しかしながら、こ
れら刊行物における記載は全て本発明の範囲外である。
【０００５】Ｅ．コリ（E. coli ）のｐｒｏＵと同様な
浸透圧調節系 Ｅ．コリ（E. coli ）のｐｒｏＵにおけると同様なオス
モラリティー増加により転写誘発される数種の他の遺伝
子およびプロモーターも記載されている。サルモネラ・
チフィムリウム（ネズミチフス菌、Salmonella typhimu
rium）はｐｒｏＵを有する［ジャーナル・バクテリオロ
ジー（J. Bacteriol. ）、第１６８巻、第８０５〜８１
４頁；ヒギンス（Higgins ）等（１９８８）、セル（Ce
ll）、第５２巻、第５６９〜５８４頁；オーバーディア
（Overdier）等（１９８９）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１巻、第４６９４〜
４７０６頁；スターリング（Stirling）等（１９８
９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Micro
biol. ）、第３巻、第１０２５〜１０３８頁；オーバー
ディア（Overdier）およびクソンカ（Csonka）（１９９
２）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第
８９巻、第３１４０〜３１４４頁；オウエン・ヒュース
（Owen-Hughes ）等（１９９２）、セル（Cell）、第７
１巻、第２５５〜２６５頁；ツッパー（Tupper）等（１
９９４）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第２５８〜２６８頁；フレッチャー（Fletcher）お
よびクソンカ（Csonka）（１９９５）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７７巻、第４
５０８〜４５１３頁］。さらに、ｐｒｏＵ−相同性配列
もエンテロバクテリアシー（腸内細菌科、Enterobacter
iaceae）科の他の細菌属にて確認されている［クルハム
（Culham）等（１９９４）、カナディアン・ジャーナル
・マイクロバイオロジー（Can. J. Microbiol.）、第４
０巻、第３９７〜４０２頁］。
浸透圧調節系 Ｅ．コリ（E. coli ）のｐｒｏＵにおけると同様なオス
モラリティー増加により転写誘発される数種の他の遺伝
子およびプロモーターも記載されている。サルモネラ・
チフィムリウム（ネズミチフス菌、Salmonella typhimu
rium）はｐｒｏＵを有する［ジャーナル・バクテリオロ
ジー（J. Bacteriol. ）、第１６８巻、第８０５〜８１
４頁；ヒギンス（Higgins ）等（１９８８）、セル（Ce
ll）、第５２巻、第５６９〜５８４頁；オーバーディア
（Overdier）等（１９８９）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１巻、第４６９４〜
４７０６頁；スターリング（Stirling）等（１９８
９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Micro
biol. ）、第３巻、第１０２５〜１０３８頁；オーバー
ディア（Overdier）およびクソンカ（Csonka）（１９９
２）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第
８９巻、第３１４０〜３１４４頁；オウエン・ヒュース
（Owen-Hughes ）等（１９９２）、セル（Cell）、第７
１巻、第２５５〜２６５頁；ツッパー（Tupper）等（１
９９４）、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第２５８〜２６８頁；フレッチャー（Fletcher）お
よびクソンカ（Csonka）（１９９５）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７７巻、第４
５０８〜４５１３頁］。さらに、ｐｒｏＵ−相同性配列
もエンテロバクテリアシー（腸内細菌科、Enterobacter
iaceae）科の他の細菌属にて確認されている［クルハム
（Culham）等（１９９４）、カナディアン・ジャーナル
・マイクロバイオロジー（Can. J. Microbiol.）、第４
０巻、第３９７〜４０２頁］。
【０００６】浸透圧ストレスおよび／またはＮａＣｌに
より転写誘発され、そのプロモーターがクローン化さ
れ、配列決定されているＥ．コリ（E. coli ）および
Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の他の遺伝子に
は、ｋｄｐ［スギウラ（Sugiura）等（１９９２）、モ
レキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol.
）、第６巻、第１７６９〜１７７６頁］；ｔｒｅＡ
［レポイラ（Repolia ）およびグチエレズ（Gutierrez
）（１９９１）、モレキュラ・マイクロバイオロジー
（Mol. Microbiol. ）、第５巻、第７４７〜７５５
頁］；ｏｔｓＢＡ［カーセン（Kaasen）等（１９９
４）、ジーン（Gene）、第１４５巻、第９〜１５頁］；
ｂｅｔ［ラマルク（Lamark）等（１９９１）、モレキュ
ラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第５
巻、第１０４９〜１０６４頁；エシュー（Eshoo ）（１
９８８）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteri
ol. ）、第１７０巻、第５２０８〜５２１５頁］；ｏｓ
ｍＢ［ユング（Jung）等（１９９０）、ジャーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２
６５巻、第１０５７４〜１０５８１頁］；ｏｓｍＣ［グ
チエレズ（Gutierrez ）およびデベジアン（Devedjian
）（１９９１）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol. ）、第２２０巻、第９５９〜９７
３頁］；ｏｓｍＥ［グチエレズ（Gutierrez ）等（１９
９５）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Mic
robiol. ）、第１６巻、第５５３〜５６３頁］；および
ｏｓｍＹ［イム（Yim ）等（１９９４）、ジャーナル・
バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７６巻、第
１００〜１０７頁］の各遺伝子がある。
より転写誘発され、そのプロモーターがクローン化さ
れ、配列決定されているＥ．コリ（E. coli ）および
Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の他の遺伝子に
は、ｋｄｐ［スギウラ（Sugiura）等（１９９２）、モ
レキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol.
）、第６巻、第１７６９〜１７７６頁］；ｔｒｅＡ
［レポイラ（Repolia ）およびグチエレズ（Gutierrez
）（１９９１）、モレキュラ・マイクロバイオロジー
（Mol. Microbiol. ）、第５巻、第７４７〜７５５
頁］；ｏｔｓＢＡ［カーセン（Kaasen）等（１９９
４）、ジーン（Gene）、第１４５巻、第９〜１５頁］；
ｂｅｔ［ラマルク（Lamark）等（１９９１）、モレキュ
ラ・マイクロバイオロジー（Mol. Microbiol. ）、第５
巻、第１０４９〜１０６４頁；エシュー（Eshoo ）（１
９８８）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteri
ol. ）、第１７０巻、第５２０８〜５２１５頁］；ｏｓ
ｍＢ［ユング（Jung）等（１９９０）、ジャーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２
６５巻、第１０５７４〜１０５８１頁］；ｏｓｍＣ［グ
チエレズ（Gutierrez ）およびデベジアン（Devedjian
）（１９９１）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol. ）、第２２０巻、第９５９〜９７
３頁］；ｏｓｍＥ［グチエレズ（Gutierrez ）等（１９
９５）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol. Mic
robiol. ）、第１６巻、第５５３〜５６３頁］；および
ｏｓｍＹ［イム（Yim ）等（１９９４）、ジャーナル・
バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７６巻、第
１００〜１０７頁］の各遺伝子がある。
【０００７】グラム陽性細菌バチルス・ズブチリス（枯
草菌、Bacillus subtilis ）でＯｐｕＡトランスポータ
ーが同定されており、これは転写レベルにでコグネート
遺伝子のその構造、機能および浸透圧調節に関しＥ．コ
リ（E. coli ）のｐｒｏＵトランスポーターと顕著な類
似性を示し［ケンプ（Kempf ）およびブレマー（Breme
r）（１９９５）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第１６７０
１〜１６７１３頁］、また、その構造、機能および調節
でＥ．コリ（E. coli ）の遺伝子と相同性である遺伝子
座［クソンカ（Csonka）（１９８２）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１５１巻、第１
４３３〜１４４３頁；ダンラップ（Dunlap）およびクソ
ンカ（Csonka）（１９８５）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１６３巻、第２９６〜３
０４頁；ケアニー（Cairney ）等（１９８５）、第１６
４巻、第１２２４〜１２３２頁；スザーランド（Suther
land）等（１９８６）、ジャーナル・バクテリオロジー
（J. Bacteriol. ）、第１６８巻、第８０５〜８１４
頁；ヒギンス（Higgins ）等（１９８８）セル（Cel
l）、第５２巻、第５６９〜５８４頁；オーバーディア
（Overdier）等（１９８９）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１巻、第４６９４〜
４７０６頁；スターリング（Stirling）等（１９８
９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol.Microb
iol. ）、第３巻、第１０２５〜１０３８頁；オーバー
ティア（Overdier）およびクソンカ（Csonka）（１９９
２）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第
８９巻、第３１４０〜３１４４頁；オーウエン・ヒュー
ス（Owen-Hughes ）等（１９９２）、セル（Cell）、第
７１巻、第２５５〜２６５頁；ツッパー（Tupper）等
（１９９４）ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第２５８〜２６８頁；フレッチャー（Fletcher）お
よびクソンカ（Csonka）（１９９５）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７７巻、第４
５０８〜４５１３頁］、およびｐｒｏＵ−相同配列もエ
ンテロバクテリアシー（Enterobacteriaceae）科の他の
細菌属にて同定されている［クルハム（Culham）等（１
９９４）、カナディアン・ジャーナル・マイクロバイオ
ロジー（Can. J. Microbiol.）、第４０巻、第３９７〜
４０２頁］。
草菌、Bacillus subtilis ）でＯｐｕＡトランスポータ
ーが同定されており、これは転写レベルにでコグネート
遺伝子のその構造、機能および浸透圧調節に関しＥ．コ
リ（E. coli ）のｐｒｏＵトランスポーターと顕著な類
似性を示し［ケンプ（Kempf ）およびブレマー（Breme
r）（１９９５）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第１６７０
１〜１６７１３頁］、また、その構造、機能および調節
でＥ．コリ（E. coli ）の遺伝子と相同性である遺伝子
座［クソンカ（Csonka）（１９８２）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１５１巻、第１
４３３〜１４４３頁；ダンラップ（Dunlap）およびクソ
ンカ（Csonka）（１９８５）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１６３巻、第２９６〜３
０４頁；ケアニー（Cairney ）等（１９８５）、第１６
４巻、第１２２４〜１２３２頁；スザーランド（Suther
land）等（１９８６）、ジャーナル・バクテリオロジー
（J. Bacteriol. ）、第１６８巻、第８０５〜８１４
頁；ヒギンス（Higgins ）等（１９８８）セル（Cel
l）、第５２巻、第５６９〜５８４頁；オーバーディア
（Overdier）等（１９８９）、ジャーナル・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol. ）、第１７１巻、第４６９４〜
４７０６頁；スターリング（Stirling）等（１９８
９）、モレキュラ・マイクロバイオロジー（Mol.Microb
iol. ）、第３巻、第１０２５〜１０３８頁；オーバー
ティア（Overdier）およびクソンカ（Csonka）（１９９
２）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第
８９巻、第３１４０〜３１４４頁；オーウエン・ヒュー
ス（Owen-Hughes ）等（１９９２）、セル（Cell）、第
７１巻、第２５５〜２６５頁；ツッパー（Tupper）等
（１９９４）ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J. ）、第１３
巻、第２５８〜２６８頁；フレッチャー（Fletcher）お
よびクソンカ（Csonka）（１９９５）、ジャーナル・バ
クテリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１７７巻、第４
５０８〜４５１３頁］、およびｐｒｏＵ−相同配列もエ
ンテロバクテリアシー（Enterobacteriaceae）科の他の
細菌属にて同定されている［クルハム（Culham）等（１
９９４）、カナディアン・ジャーナル・マイクロバイオ
ロジー（Can. J. Microbiol.）、第４０巻、第３９７〜
４０２頁］。
【０００８】誘発性プロモーターに基づく発現系
誘発性プロモーターはＥ．コリ（E. coli ）中でクロー
ン化された有用な遺伝子産物の合成を瞬間的に誘発する
ことにより、調節された過剰産生を達成するための主た
る手段を与えている。この意味で、最も一般的に使用さ
れる系の２つのものは次の通りである：（ｉ）Ｅ．コリ
（E. coli ）のｌａｃオペロンの調節系［この系におい
ては、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の産物はｌａｃＰプ
ロモーターもしくはその変異体からの発現を負に調節
し、イソプロピルチオ−ａ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）もしくは他の関連するインデューサーを適する時点
で培養物に添加することにより誘発することができ
る］；および（ｉｉ）バクテリオファージλの調節系
［この系においては、感温性リプレッサー蛋白質をコー
ドする突然変異体λのｃＩ遺伝子（ｃＩ８５７）はファ
ージλのＰＬもしくはＰＲプロモーターからの発現を負
に調節し、培養物の増殖温度を３０℃から４２℃まで昇
温シフトすることにより誘発することができる］。これ
ら誘発性プロモーター系のいずれかによる調節発現はク
ローン化した遺伝子の上流にプロモーター配列をおくこ
とにより直接的に、或いは、誘発性プロモーターが２列
（two-tier）の調節系において、たとえば、プラスミド
コピー数を制御する遺伝子［ノルドストローム（Nord
strom ）およびウーリン（Uhlin ）（１９９２）、バイ
オ／テクノロジー（Bio/Technology）、第１０巻、第６
６１〜６６６頁］やファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子［テーバー（Tabor ）およびリチャードソン（Ri
chardson）（１９８５）、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA）、第８２巻、第１０７４〜１０７８頁；
スツヂエール（Studier ）およびモファット（Moffatt
）（１９８６）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol. ）、第１８９巻、第１１３〜１３
０頁；スツヂエール（Studier ）等（１９９０）、米国
特許第４，９５２，４９５号］のような正に調節する遺
伝子の発現をコントロールする数種の異なる間接的な手
法の１つにより達成されている。
ン化された有用な遺伝子産物の合成を瞬間的に誘発する
ことにより、調節された過剰産生を達成するための主た
る手段を与えている。この意味で、最も一般的に使用さ
れる系の２つのものは次の通りである：（ｉ）Ｅ．コリ
（E. coli ）のｌａｃオペロンの調節系［この系におい
ては、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の産物はｌａｃＰプ
ロモーターもしくはその変異体からの発現を負に調節
し、イソプロピルチオ−ａ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）もしくは他の関連するインデューサーを適する時点
で培養物に添加することにより誘発することができ
る］；および（ｉｉ）バクテリオファージλの調節系
［この系においては、感温性リプレッサー蛋白質をコー
ドする突然変異体λのｃＩ遺伝子（ｃＩ８５７）はファ
ージλのＰＬもしくはＰＲプロモーターからの発現を負
に調節し、培養物の増殖温度を３０℃から４２℃まで昇
温シフトすることにより誘発することができる］。これ
ら誘発性プロモーター系のいずれかによる調節発現はク
ローン化した遺伝子の上流にプロモーター配列をおくこ
とにより直接的に、或いは、誘発性プロモーターが２列
（two-tier）の調節系において、たとえば、プラスミド
コピー数を制御する遺伝子［ノルドストローム（Nord
strom ）およびウーリン（Uhlin ）（１９９２）、バイ
オ／テクノロジー（Bio/Technology）、第１０巻、第６
６１〜６６６頁］やファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子［テーバー（Tabor ）およびリチャードソン（Ri
chardson）（１９８５）、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス ＵＳＡ（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA）、第８２巻、第１０７４〜１０７８頁；
スツヂエール（Studier ）およびモファット（Moffatt
）（１９８６）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol. ）、第１８９巻、第１１３〜１３
０頁；スツヂエール（Studier ）等（１９９０）、米国
特許第４，９５２，４９５号］のような正に調節する遺
伝子の発現をコントロールする数種の異なる間接的な手
法の１つにより達成されている。
【０００９】これら課題を解決するためのその他の誘発
性プロモーター、たとえばｔｒｐプロモーター［ヤンス
ラ（Yansura ）およびヘナー（Henner）（１９９０）、
メソッズ・エンチモロジー（Meth. Enzymol.）、第１８
５巻、第５４〜６０頁］またはｐＨ−誘発性プロモータ
ー［トレンチノ（Tolentino ）等（１９９２）、バイオ
テク・レタース（Bietech Lett. ）、第１４巻、第１５
７〜１６２頁］も記載されているが、これらは充分開発
されておらずまた上記の２つの方法ほど広く用いられて
いない。
性プロモーター、たとえばｔｒｐプロモーター［ヤンス
ラ（Yansura ）およびヘナー（Henner）（１９９０）、
メソッズ・エンチモロジー（Meth. Enzymol.）、第１８
５巻、第５４〜６０頁］またはｐＨ−誘発性プロモータ
ー［トレンチノ（Tolentino ）等（１９９２）、バイオ
テク・レタース（Bietech Lett. ）、第１４巻、第１５
７〜１６２頁］も記載されているが、これらは充分開発
されておらずまた上記の２つの方法ほど広く用いられて
いない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】クローン化した遺伝子
産生物を過剰産生させるためにｌａｃ−もしくはファー
ジλ−由来のプロモーターを使用する調節発現系は効果
的かつ便利であって、実験室規模のＥ．コリ（E. coli
）培養におけるクローン化された遺伝子の産物の過剰
産生につき広範に開発されているが、これらは特に極め
て大量の細菌培養物を使用することに関する或る種の問
題を伴う。ｌａｃ調節系を用いる場合、この問題は誘発
を得るために要する化学品ＩＰＴＧはコストが高く、さ
らに数種の市販され入手できるＩＰＴＧは、極めて毒性
が高く、かつ環境上不都合な化学品であるジオキサン
［シグマ・ケミカル社カタログ（１９９５）、５９６］
を含むという問題を伴う。ファージλ調節系を用いる場
合、主たる問題は熱源との直接的な接触により細胞に顕
著な死滅が生じないように大量の培養物を比較的急速に
温度を上昇させることができるかという点であり；さら
にＥ．コリ（E. coli ）における数種の蛋白質の過剰産
生は不溶性の封入体（inclusion body）の形成をもたら
し、この問題はより高温度における培養物のインキュベ
ーションに際し目立つようになると思われる。したがっ
て、たとえはＥ．コリ（E. coli ）のような細菌でクロ
ーン化された遺伝子の産物の調節された過剰発現を達成
するには、ベクターおよび適する宿主菌株を包含する効
率的な代替方法を開発することが未だ未達成のニーズと
して残されている。
産生物を過剰産生させるためにｌａｃ−もしくはファー
ジλ−由来のプロモーターを使用する調節発現系は効果
的かつ便利であって、実験室規模のＥ．コリ（E. coli
）培養におけるクローン化された遺伝子の産物の過剰
産生につき広範に開発されているが、これらは特に極め
て大量の細菌培養物を使用することに関する或る種の問
題を伴う。ｌａｃ調節系を用いる場合、この問題は誘発
を得るために要する化学品ＩＰＴＧはコストが高く、さ
らに数種の市販され入手できるＩＰＴＧは、極めて毒性
が高く、かつ環境上不都合な化学品であるジオキサン
［シグマ・ケミカル社カタログ（１９９５）、５９６］
を含むという問題を伴う。ファージλ調節系を用いる場
合、主たる問題は熱源との直接的な接触により細胞に顕
著な死滅が生じないように大量の培養物を比較的急速に
温度を上昇させることができるかという点であり；さら
にＥ．コリ（E. coli ）における数種の蛋白質の過剰産
生は不溶性の封入体（inclusion body）の形成をもたら
し、この問題はより高温度における培養物のインキュベ
ーションに際し目立つようになると思われる。したがっ
て、たとえはＥ．コリ（E. coli ）のような細菌でクロ
ーン化された遺伝子の産物の調節された過剰発現を達成
するには、ベクターおよび適する宿主菌株を包含する効
率的な代替方法を開発することが未だ未達成のニーズと
して残されている。
【００１１】誘発につきＩＰＴＧもしくは温度上昇を用
いる方法に比べ、誘発剤としてＮａＣｌもしくは他のオ
スモライトを用いる調節発現系の有力な利点は当業界に
てまだ認識されていない。この結論は、宿主微生物とし
てＥ．コリ（E. coli ）を用いる広く使用されている唯
一の誘発性過剰発現系がＩＰＴＧ−もしくは温度−誘発
性のｌａｃ由来もしくはファージλ−由来のプロモータ
ーをそれぞれ使用するものであるという事実からも明か
である。本発明の利点は限定はしないが次のことを包含
する：（ｉ）誘発剤のコストが極めて安価。（ｉｉ）比
較的不純な誘発剤の調製物であっても使用することがで
きる。（ｉｉｉ）大量培養物であっても低コストでほぼ
瞬間的な誘発を全細胞において達成することができる。
（ｉｖ）誘発剤の製造には潜在的な環境汚染物質の合成
を伴うことはない。（ｖ）複合培地で増殖する培養物へ
の誘発剤としてのＮａＣｌもしくは他のオスモライトの
添加はグリシンベタインの細胞質蓄積を可能にし、この
条件下で或る種の過剰発現蛋白質を有する封入体形成と
いう問題が緩和される［ブラックウェル（Blackwell ）
およびホーガン（Horgan）（１９９１）、ＦＥＢＳレタ
ース（FEBS Lett.）、第２９５巻、第１０〜１２頁］。
いる方法に比べ、誘発剤としてＮａＣｌもしくは他のオ
スモライトを用いる調節発現系の有力な利点は当業界に
てまだ認識されていない。この結論は、宿主微生物とし
てＥ．コリ（E. coli ）を用いる広く使用されている唯
一の誘発性過剰発現系がＩＰＴＧ−もしくは温度−誘発
性のｌａｃ由来もしくはファージλ−由来のプロモータ
ーをそれぞれ使用するものであるという事実からも明か
である。本発明の利点は限定はしないが次のことを包含
する：（ｉ）誘発剤のコストが極めて安価。（ｉｉ）比
較的不純な誘発剤の調製物であっても使用することがで
きる。（ｉｉｉ）大量培養物であっても低コストでほぼ
瞬間的な誘発を全細胞において達成することができる。
（ｉｖ）誘発剤の製造には潜在的な環境汚染物質の合成
を伴うことはない。（ｖ）複合培地で増殖する培養物へ
の誘発剤としてのＮａＣｌもしくは他のオスモライトの
添加はグリシンベタインの細胞質蓄積を可能にし、この
条件下で或る種の過剰発現蛋白質を有する封入体形成と
いう問題が緩和される［ブラックウェル（Blackwell ）
およびホーガン（Horgan）（１９９１）、ＦＥＢＳレタ
ース（FEBS Lett.）、第２９５巻、第１０〜１２頁］。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、細菌における
プロモーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘
発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に
前記プロモーターをコードするＤＮＡ配列を、前記細菌
におけるヘテロロガス遺伝子の産物を瞬間的に誘発する
ことにより産生する発現ベクター系を作製するために使
用すること；有用なヘテロロガス遺伝子産物をコードす
るヘテロロガス遺伝子の発現方法；ｃｉｓで第２のＤＮ
Ａセグメントに結合した第１のＤＮＡセグメントを含む
組換ＤＮＡ；並びに（ｉ）細菌染色体に組込まれるか、
或いは（ｉｉ）前記細菌内で自律複製しうる組換プラス
ミドもしくはファージベクターとして存在する組換ＤＮ
Ａ構成物を宿すトランスフォームされた細菌に関するも
のである。
プロモーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘
発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に
前記プロモーターをコードするＤＮＡ配列を、前記細菌
におけるヘテロロガス遺伝子の産物を瞬間的に誘発する
ことにより産生する発現ベクター系を作製するために使
用すること；有用なヘテロロガス遺伝子産物をコードす
るヘテロロガス遺伝子の発現方法；ｃｉｓで第２のＤＮ
Ａセグメントに結合した第１のＤＮＡセグメントを含む
組換ＤＮＡ；並びに（ｉ）細菌染色体に組込まれるか、
或いは（ｉｉ）前記細菌内で自律複製しうる組換プラス
ミドもしくはファージベクターとして存在する組換ＤＮ
Ａ構成物を宿すトランスフォームされた細菌に関するも
のである。
【００１３】したがって本発明は、細菌におけるプロモ
ーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の
転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に前記プ
ロモーターをコードするＤＮＡ配列を、前記細菌におけ
るヘテロロガス遺伝子の産物を瞬間的に誘発することに
より産生する発現ベクター系を作製するために使用する
使用方法を提供する。
ーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の
転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に前記プ
ロモーターをコードするＤＮＡ配列を、前記細菌におけ
るヘテロロガス遺伝子の産物を瞬間的に誘発することに
より産生する発現ベクター系を作製するために使用する
使用方法を提供する。
【００１４】さらに本発明は、エンテロバクテリアシー
（Enterobacteriaceae）科の細菌種にてヘテロロガス遺
伝子の産物を瞬間的に誘発することにより産生するため
の発現ベクター系にも関するものであり、これは細菌種
の中で複製しうるか、或いは公知の方法により前記細菌
種の染色体に組込むことができるプラスミドもしくはバ
クテリオファージ構成物で構成されるものである。好ま
しくは細菌種は大腸菌（Escherichia coli）である。
（Enterobacteriaceae）科の細菌種にてヘテロロガス遺
伝子の産物を瞬間的に誘発することにより産生するため
の発現ベクター系にも関するものであり、これは細菌種
の中で複製しうるか、或いは公知の方法により前記細菌
種の染色体に組込むことができるプラスミドもしくはバ
クテリオファージ構成物で構成されるものである。好ま
しくは細菌種は大腸菌（Escherichia coli）である。
【００１５】さらに本発明は、たとえばＲＮＡもしくは
ポリペプチドのような有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードするヘテロロガス遺伝子の発現方法をも提供し、
この方法は、（ａ） 有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードし、公知の方法により得られる配列を有する第１
のＤＮＡセグメントを得、（ｂ） 細菌でプロモーター
からの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の転写の
開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に前記プロモー
ターをコードし、公知の方法により得られる配列を有す
る第２のＤＮＡセグメントを得、（ｃ） 前記細菌内に
安定に維持される組換ＤＮＡ構成物を受け渡しうるベク
ターを公知の組換ＤＮＡ法により作製し、前記組換ＤＮ
Ａ構成物は、前記細菌のトランスフォームされた細胞に
おける前記ヘテロロガス遺伝子の転写が専らもしくはほ
ぼ専ら前記プロモーターにより指令されるようにｃｉｓ
で互いに連結した前記第１および第２のＤＮＡセグメン
トで構成され、（ｄ） 前記ベクターを用いて、前記組
換ＤＮＡ構成物を安定的に受け継いだ前記細菌のトラン
スフォームされた細胞を公知の方法によって得、（ｅ）
組換トランスフォームされた細菌を低オスモラリティ
ーの培地で公知の方法により増殖させ、（ｆ） たとえ
ばＮａＣｌのようなオスモライト（osmolyte）を培養物
に添加して有用なヘテロロガス遺伝子産物の合成を誘発
させ、（ｇ） 前記有用な遺伝子産物を公知の方法によ
り分離、精製およびキャラクタライゼーション化するこ
とを備えるものである。
ポリペプチドのような有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードするヘテロロガス遺伝子の発現方法をも提供し、
この方法は、（ａ） 有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードし、公知の方法により得られる配列を有する第１
のＤＮＡセグメントを得、（ｂ） 細菌でプロモーター
からの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の転写の
開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒に前記プロモー
ターをコードし、公知の方法により得られる配列を有す
る第２のＤＮＡセグメントを得、（ｃ） 前記細菌内に
安定に維持される組換ＤＮＡ構成物を受け渡しうるベク
ターを公知の組換ＤＮＡ法により作製し、前記組換ＤＮ
Ａ構成物は、前記細菌のトランスフォームされた細胞に
おける前記ヘテロロガス遺伝子の転写が専らもしくはほ
ぼ専ら前記プロモーターにより指令されるようにｃｉｓ
で互いに連結した前記第１および第２のＤＮＡセグメン
トで構成され、（ｄ） 前記ベクターを用いて、前記組
換ＤＮＡ構成物を安定的に受け継いだ前記細菌のトラン
スフォームされた細胞を公知の方法によって得、（ｅ）
組換トランスフォームされた細菌を低オスモラリティ
ーの培地で公知の方法により増殖させ、（ｆ） たとえ
ばＮａＣｌのようなオスモライト（osmolyte）を培養物
に添加して有用なヘテロロガス遺伝子産物の合成を誘発
させ、（ｇ） 前記有用な遺伝子産物を公知の方法によ
り分離、精製およびキャラクタライゼーション化するこ
とを備えるものである。
【００１６】本発明の好ましい特徴は、第２のＤＮＡセ
グメントが大腸菌（Escherichia coli）のｐｒｏＵ Ｄ
ＮＡ配列もしくはその１部、または大腸菌（Escherichi
a coli）のｐｒｏＵ ＤＮＡ配列に対し少なくとも８０
％の類似性を有する任意のＤＮＡ配列もしくはその１部
であり、また、たとえば大腸菌（Escherichia coli）の
ように、細菌がエンテロバクテリアシー（Enterobacter
iaceae）科内の細菌種に属する点である。
グメントが大腸菌（Escherichia coli）のｐｒｏＵ Ｄ
ＮＡ配列もしくはその１部、または大腸菌（Escherichi
a coli）のｐｒｏＵ ＤＮＡ配列に対し少なくとも８０
％の類似性を有する任意のＤＮＡ配列もしくはその１部
であり、また、たとえば大腸菌（Escherichia coli）の
ように、細菌がエンテロバクテリアシー（Enterobacter
iaceae）科内の細菌種に属する点である。
【００１７】さらに本発明は、（ｉ）適する宿主細菌に
てプロモーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧
誘発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒
に前記プロモーターをコードする配列を持った第１のＤ
ＮＡセグメントからなり、これを（ｉｉ）転写−アクテ
ィベーター蛋白質をコードする配列を有する第２のＤＮ
Ａセグメントにｃｉｓで結合し、前記蛋白質の合成が前
記組換構成物を有する前記細菌の誘導体でＮａＣｌもし
くは他のオスモライトを培地に添加することにより活性
化されるように連結した組換ＤＮＡ構成物に関するもの
である。
てプロモーターからの、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧
誘発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調節要素と一緒
に前記プロモーターをコードする配列を持った第１のＤ
ＮＡセグメントからなり、これを（ｉｉ）転写−アクテ
ィベーター蛋白質をコードする配列を有する第２のＤＮ
Ａセグメントにｃｉｓで結合し、前記蛋白質の合成が前
記組換構成物を有する前記細菌の誘導体でＮａＣｌもし
くは他のオスモライトを培地に添加することにより活性
化されるように連結した組換ＤＮＡ構成物に関するもの
である。
【００１８】本発明の好ましい特徴は、第１のＤＮＡセ
グメントを有する組換ＤＮＡ構成物が大腸菌（Escheric
hia coli）のｐｒｏＵのＤＮＡ配列もしくはその１部、
または大腸菌（Escherichia coli）のｐｒｏＵのＤＮＡ
配列と少なくとも８０％の類似性を有する任意のＤＮＡ
配列もしくはその１部であり、また、転写−アクティベ
ーター蛋白質がバクテリオファージＴ７の酵素的に活性
なＲＮＡポリメラーゼである点にある。
グメントを有する組換ＤＮＡ構成物が大腸菌（Escheric
hia coli）のｐｒｏＵのＤＮＡ配列もしくはその１部、
または大腸菌（Escherichia coli）のｐｒｏＵのＤＮＡ
配列と少なくとも８０％の類似性を有する任意のＤＮＡ
配列もしくはその１部であり、また、転写−アクティベ
ーター蛋白質がバクテリオファージＴ７の酵素的に活性
なＲＮＡポリメラーゼである点にある。
【００１９】さらに本発明は、組換ＤＮＡ構成物である
ＢａｍＨＩ−末端化したＤＮＡ断片をも提供し、前記組
換ＤＮＡ構成物は（ｉ）大腸菌（Escherichia coli）か
ら誘導され、プラスミドｐＨＹＤ５１３から得られるＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片上のｐｒｏＵのｃｉｓ調節要素
からなり、これを（ｉｉ）酵素的に活性なＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼをコードし、プラスミドｐＨＹＤ５０１を
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩで切断して得られる２種の断片の
うち大きい方に存在するＤＮＡセグメントにｃｉｓで連
結して構成されたものであり、前記ＢａｍＨＩ−末端化
したＤＮＡ断片はプラスミドｐＨＹＤ５０３から得られ
るものである。
ＢａｍＨＩ−末端化したＤＮＡ断片をも提供し、前記組
換ＤＮＡ構成物は（ｉ）大腸菌（Escherichia coli）か
ら誘導され、プラスミドｐＨＹＤ５１３から得られるＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片上のｐｒｏＵのｃｉｓ調節要素
からなり、これを（ｉｉ）酵素的に活性なＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼをコードし、プラスミドｐＨＹＤ５０１を
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩで切断して得られる２種の断片の
うち大きい方に存在するＤＮＡセグメントにｃｉｓで連
結して構成されたものであり、前記ＢａｍＨＩ−末端化
したＤＮＡ断片はプラスミドｐＨＹＤ５０３から得られ
るものである。
【００２０】好ましくは前記組換ＤＮＡ構成物は（ｉ）
細菌染色体に組込まれ、或いは（ｉｉ）前記細菌内で自
律複製しうる組換プラスミドもしくはファージベクター
として存在する。細菌は大腸菌（Escherichia coli）、
好ましくは大腸菌（Escherichia coli）株ＧＪ１１５０
から選択することができ、ここでＢａｍＨＩ−末端化し
たＤＮＡ断片は染色体のｍａｌＰＱ座に組込まれる。
細菌染色体に組込まれ、或いは（ｉｉ）前記細菌内で自
律複製しうる組換プラスミドもしくはファージベクター
として存在する。細菌は大腸菌（Escherichia coli）、
好ましくは大腸菌（Escherichia coli）株ＧＪ１１５０
から選択することができ、ここでＢａｍＨＩ−末端化し
たＤＮＡ断片は染色体のｍａｌＰＱ座に組込まれる。
【００２１】さらに本発明は組換ＤＮＡ構成物を有する
トランスフォームされた細菌を得るための方法をも提供
し、この方法は次の工程からなる： Ｉ． 組換ＤＮＡ構成物を作製し、この作製は（ａ）適
する宿主細菌にてプロモーターから、ＮａＣｌ誘発性も
しくは浸透圧誘発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調
節要素と一緒にプロモーターをコードする配列を持った
第１のＤＮＡセグメントを公知の方法により得ると共に
クローニングし；（ｂ）前記第１のＤＮＡセグメント
を、転写−アクティベーター蛋白質をコードする配列を
有する第２のＤＮＡセグメントと公知の方法により結合
させて、前記組換ＤＮＡ構成物を有する前記宿主細菌の
誘導体における前記蛋白質の合成が専らもしくはほぼ専
ら前記プロモーターから開始された転写に依存するよう
にすると共に、前記組換ＤＮＡ構成物がプラスミドもし
くはファージのようなベクターのＤＮＡ配列に対し共有
結合で隣接するように結合し；（ｃ）結合した混合物
を、前記ベクターが自律複製すると共に維持されるよう
な適する菌株にトランスフォームし；さらに（ｄ）正確
な組換構成物を有するクローンを公知の方法により同定
する各工程からなり、 ＩＩ． 前記組換ＤＮＡ構成物が（ｉ）細菌染色体に組
込まれ、或いは（ｉｉ）前記宿主細菌内で自律複製しう
る組換プラスミドもしくはファージベクターとして存在
する前記宿主細菌のトランスフォームされた誘導体を得
ることからなる。
トランスフォームされた細菌を得るための方法をも提供
し、この方法は次の工程からなる： Ｉ． 組換ＤＮＡ構成物を作製し、この作製は（ａ）適
する宿主細菌にてプロモーターから、ＮａＣｌ誘発性も
しくは浸透圧誘発性の転写の開始を可能にするｃｉｓ調
節要素と一緒にプロモーターをコードする配列を持った
第１のＤＮＡセグメントを公知の方法により得ると共に
クローニングし；（ｂ）前記第１のＤＮＡセグメント
を、転写−アクティベーター蛋白質をコードする配列を
有する第２のＤＮＡセグメントと公知の方法により結合
させて、前記組換ＤＮＡ構成物を有する前記宿主細菌の
誘導体における前記蛋白質の合成が専らもしくはほぼ専
ら前記プロモーターから開始された転写に依存するよう
にすると共に、前記組換ＤＮＡ構成物がプラスミドもし
くはファージのようなベクターのＤＮＡ配列に対し共有
結合で隣接するように結合し；（ｃ）結合した混合物
を、前記ベクターが自律複製すると共に維持されるよう
な適する菌株にトランスフォームし；さらに（ｄ）正確
な組換構成物を有するクローンを公知の方法により同定
する各工程からなり、 ＩＩ． 前記組換ＤＮＡ構成物が（ｉ）細菌染色体に組
込まれ、或いは（ｉｉ）前記宿主細菌内で自律複製しう
る組換プラスミドもしくはファージベクターとして存在
する前記宿主細菌のトランスフォームされた誘導体を得
ることからなる。
【００２２】この方法の第１のＤＮＡセグメントは大腸
菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵＤＮＡ配列もしくはそ
の１部、または大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ
ＤＮＡ配列に対し少なくとも８０％の類似性を有する任
意のＤＮＡ配列もしくはその１部を有したものであり、
さらに転写−アクティベーター蛋白質はバクテリオファ
ージＴ７の酵素的に活性なＲＮＡポリメラーゼである。
菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵＤＮＡ配列もしくはそ
の１部、または大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ
ＤＮＡ配列に対し少なくとも８０％の類似性を有する任
意のＤＮＡ配列もしくはその１部を有したものであり、
さらに転写−アクティベーター蛋白質はバクテリオファ
ージＴ７の酵素的に活性なＲＮＡポリメラーゼである。
【００２３】好ましくは本発明の方法は、大腸菌（Esch
erichia coli）ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融
合体で構成された組換ＤＮＡ構成物で適用され、ここで
細菌は大腸菌（Escherichia coli）であり；第１のＤＮ
Ａセグメントは大腸菌（Escherichia coli）由来のｐｒ
ｏＵ ｃｉｓ調節要素で、プラスミドｐＨＹＤ５１３も
しくはｐＨＹＤ５１４からＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断に
より得られたものであり、第２のＤＮＡセグメントは酵
素的に活性なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする配
列を有し、プラスミドｐＨＹＤ５０１上に存在するもの
であり、組換ＤＮＡ構成物はＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−末
端化した第１のＤＮＡセグメントをプラスミドｐＨＹＤ
５０１のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断により得られた２種
の断片のうち大きい方と結合することにより得られ；さ
らに前記組換ＤＮＡ構成物を有するプラスミド、たとえ
ばｐＨＹＤ５０３は、適する菌株の結合した混合物によ
るトランスフォームやテトラサイクリン耐性による選択
に続く公知の方法により同定される。
erichia coli）ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融
合体で構成された組換ＤＮＡ構成物で適用され、ここで
細菌は大腸菌（Escherichia coli）であり；第１のＤＮ
Ａセグメントは大腸菌（Escherichia coli）由来のｐｒ
ｏＵ ｃｉｓ調節要素で、プラスミドｐＨＹＤ５１３も
しくはｐＨＹＤ５１４からＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断に
より得られたものであり、第２のＤＮＡセグメントは酵
素的に活性なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする配
列を有し、プラスミドｐＨＹＤ５０１上に存在するもの
であり、組換ＤＮＡ構成物はＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−末
端化した第１のＤＮＡセグメントをプラスミドｐＨＹＤ
５０１のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断により得られた２種
の断片のうち大きい方と結合することにより得られ；さ
らに前記組換ＤＮＡ構成物を有するプラスミド、たとえ
ばｐＨＹＤ５０３は、適する菌株の結合した混合物によ
るトランスフォームやテトラサイクリン耐性による選択
に続く公知の方法により同定される。
【００２４】さらに、本発明は大腸菌（Escherichia co
li）ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体を含む
組換ＤＮＡ構成物を大腸菌（Escherichia coli）染色体
のｍａｌＰＱ座に組込む方法にも関し、この方法は： （ａ） ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体を
有し、プラスミドｐＨＹＤ５０３から得られるＢａｍＨ
Ｉ−末端化したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ−切断したｐＯ
Ｍ４１ ＤＮＡと結合させ、（ｂ） 挿入物におけるｐ
ｒｏＵ プロモーターがｐＯＭ４１におけるプロモータ
ーなしのｔｅｔ遺伝子と同じ方向に転写される組換プラ
スミド（たとえばｐＨＹＤ５０７）を同定し、（ｃ）
前記組換プラスミドを菌株ｐｏｐ２２４９にトランスフ
ォームし、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性お
よび低オスモラリティーでＬａｃ−である誘導体を同定
し、菌体内でｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合
構成物は逆相同組換によりｍａｌＰＱ座に転移され、
（ｄ） 次いで、アンピシリン耐性およびテトラサイク
リン耐性マーカーがｐＯＭ４１由来プラスミド レプリ
コンの自然喪失により消失している、たとえばＧＪ１１
５０のような組込体コロニーを同定し、（ｅ） 必要に
応じ、遺伝子転移および相同組換の公知の方法により、
組込ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合構成物を
有するｍａｌＰＱ座をこれらの組込菌株から他の大腸菌
（Escherichia coli）の菌株に転移させることを備える
ものである。
li）ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体を含む
組換ＤＮＡ構成物を大腸菌（Escherichia coli）染色体
のｍａｌＰＱ座に組込む方法にも関し、この方法は： （ａ） ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体を
有し、プラスミドｐＨＹＤ５０３から得られるＢａｍＨ
Ｉ−末端化したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ−切断したｐＯ
Ｍ４１ ＤＮＡと結合させ、（ｂ） 挿入物におけるｐ
ｒｏＵ プロモーターがｐＯＭ４１におけるプロモータ
ーなしのｔｅｔ遺伝子と同じ方向に転写される組換プラ
スミド（たとえばｐＨＹＤ５０７）を同定し、（ｃ）
前記組換プラスミドを菌株ｐｏｐ２２４９にトランスフ
ォームし、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性お
よび低オスモラリティーでＬａｃ−である誘導体を同定
し、菌体内でｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合
構成物は逆相同組換によりｍａｌＰＱ座に転移され、
（ｄ） 次いで、アンピシリン耐性およびテトラサイク
リン耐性マーカーがｐＯＭ４１由来プラスミド レプリ
コンの自然喪失により消失している、たとえばＧＪ１１
５０のような組込体コロニーを同定し、（ｅ） 必要に
応じ、遺伝子転移および相同組換の公知の方法により、
組込ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合構成物を
有するｍａｌＰＱ座をこれらの組込菌株から他の大腸菌
（Escherichia coli）の菌株に転移させることを備える
ものである。
【００２５】さらに本発明は、たとえばＲＮＡもしくは
ポリペプチドのような有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードするヘテロロガス遺伝子の発現方法をも提供し、
この方法は、 （ａ） 有用なヘテロロガス遺伝子産物をコードし、公
知の方法により得られる配列を有する第１のＤＮＡセグ
メントを得、 （ｂ） 適する宿主細菌に受け渡して宿主細菌内で維持
することができるベクターを公知の組換ＤＮＡ法により
作製し、宿主細菌内で前記ＤＮＡ断片は転写−アクティ
ベーター蛋白質により活性化される第１のプロモーター
の下流で正確な方向にクローン化され、前記細菌のトラ
ンスフォームされた細胞で前記有用な遺伝子産物の合成
が専らもしくはほぼ専ら前記第１のプロモーターから開
始される転写に依存するようにし、 （ｃ） 前記ベクターとさらに追加の組換ＤＮＡ構成物
との両者を有する前記細菌のトランスフォームされた細
胞を公知の方法により得、前記組換ＤＮＡ構成物は
（ｉ）前記細菌で第２のプロモーターから、ＮａＣｌ誘
発性もしくは浸透圧誘発性の転写の開始を可能にするｃ
ｉｓ調節要素と一緒に第２のプロモーターをコードする
配列を有する第２のＤＮＡセグメントを、（ｉｉ）前記
転写−アクティベーター蛋白質をコードする配列を有す
る第３のＤＮＡセグメントにｃｉｓで結合して構成さ
れ、前記蛋白質の合成が前記組換構成物を保持する前記
細菌の誘導体で、培地へのＮａＣｌもしくは他のオスモ
ライトの添加により活性化されるようにし、 （ｄ） トランスフォームされた組換細菌を低オスモラ
リティーの培地にて公知の方法により増殖させ、 （ｅ） たとえば、ＮａＣｌのようなオスモライトを培
養物に添加して前記有用な遺伝子産物の合成を誘発し、 （ｆ） 前記有用な遺伝子産物を公知の方法により分
離、精製およびキャラクタライゼーション化することを
備える。
ポリペプチドのような有用なヘテロロガス遺伝子産物を
コードするヘテロロガス遺伝子の発現方法をも提供し、
この方法は、 （ａ） 有用なヘテロロガス遺伝子産物をコードし、公
知の方法により得られる配列を有する第１のＤＮＡセグ
メントを得、 （ｂ） 適する宿主細菌に受け渡して宿主細菌内で維持
することができるベクターを公知の組換ＤＮＡ法により
作製し、宿主細菌内で前記ＤＮＡ断片は転写−アクティ
ベーター蛋白質により活性化される第１のプロモーター
の下流で正確な方向にクローン化され、前記細菌のトラ
ンスフォームされた細胞で前記有用な遺伝子産物の合成
が専らもしくはほぼ専ら前記第１のプロモーターから開
始される転写に依存するようにし、 （ｃ） 前記ベクターとさらに追加の組換ＤＮＡ構成物
との両者を有する前記細菌のトランスフォームされた細
胞を公知の方法により得、前記組換ＤＮＡ構成物は
（ｉ）前記細菌で第２のプロモーターから、ＮａＣｌ誘
発性もしくは浸透圧誘発性の転写の開始を可能にするｃ
ｉｓ調節要素と一緒に第２のプロモーターをコードする
配列を有する第２のＤＮＡセグメントを、（ｉｉ）前記
転写−アクティベーター蛋白質をコードする配列を有す
る第３のＤＮＡセグメントにｃｉｓで結合して構成さ
れ、前記蛋白質の合成が前記組換構成物を保持する前記
細菌の誘導体で、培地へのＮａＣｌもしくは他のオスモ
ライトの添加により活性化されるようにし、 （ｄ） トランスフォームされた組換細菌を低オスモラ
リティーの培地にて公知の方法により増殖させ、 （ｅ） たとえば、ＮａＣｌのようなオスモライトを培
養物に添加して前記有用な遺伝子産物の合成を誘発し、 （ｆ） 前記有用な遺伝子産物を公知の方法により分
離、精製およびキャラクタライゼーション化することを
備える。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明は、細菌でヘテロロガス遺
伝子産物を瞬間的な誘発により、調節された過剰産生を
させるために、誘発剤としてのＮａＣｌもしくは他のオ
スモライトの新規な使用による簡略化した方法について
説明する。本発明の方法は、適する宿主細菌のトランス
フォームされた細胞でＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘
発性であって、有用な遺伝子産物をコードする標的遺伝
子の発現を指令するプロモーター（ｃｉｓ調節要素に関
連する）を使用する。これは、関連するｃｉｓ調節要素
を有する前記プロモーターを前記適する宿主細菌のトラ
ンスフォームされた細胞内における前記標的遺伝子に対
しｃｉｓで作用的に結合させるような直接的手法により
達成することができる。
伝子産物を瞬間的な誘発により、調節された過剰産生を
させるために、誘発剤としてのＮａＣｌもしくは他のオ
スモライトの新規な使用による簡略化した方法について
説明する。本発明の方法は、適する宿主細菌のトランス
フォームされた細胞でＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘
発性であって、有用な遺伝子産物をコードする標的遺伝
子の発現を指令するプロモーター（ｃｉｓ調節要素に関
連する）を使用する。これは、関連するｃｉｓ調節要素
を有する前記プロモーターを前記適する宿主細菌のトラ
ンスフォームされた細胞内における前記標的遺伝子に対
しｃｉｓで作用的に結合させるような直接的手法により
達成することができる。
【００２７】前記直接的手法を用いる本発明の方法は次
の工程を備え、（ｉ） 適する宿主細菌でＮａＣｌ誘発
性もしくは浸透圧誘発性であるプロモーター（関連した
ｃｉｓ調節要素を含む）の同定およびクローニングを行
い、（ｉｉ） 標的遺伝子の同定およびクローニングを
行い、（ｉｉｉ） 細菌のトランスフォームされた細胞
における前記標的遺伝子産物の合成が専らもしくはほぼ
専ら前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモー
ターから開始される転写に依存するように、たとえば翻
訳−開始のシグナルのような他の適するシグナルと一緒
に標的遺伝子に対しｃｉｓで前記ＮａＣｌ誘発性もしく
は浸透圧誘発性プロモーターを作用的に結合させること
によるオペロン融合体を形成し、（ｉｖ） 前記細菌の
細胞内に前記オペロン融合体を受け渡し、維持すること
によって前記細菌のトランスフォームされた細胞を得、
（ｖ） 低オスモラリティーの培地で前記トランスフォ
ームされた細胞を増殖し、前記培地にＮａＣｌもしくは
他のオスモライトを添加することによって前記標的遺伝
子産物の合成を誘発し、（ｉｖ） 前記標的遺伝子産物
がこれら条件下で実質的に誘発されたことを確認し、
（ｖｉｉ） 前記培地からの前記標的遺伝子産物の濃縮
されたもしくは精製された調製物を作製する、という各
工程である。
の工程を備え、（ｉ） 適する宿主細菌でＮａＣｌ誘発
性もしくは浸透圧誘発性であるプロモーター（関連した
ｃｉｓ調節要素を含む）の同定およびクローニングを行
い、（ｉｉ） 標的遺伝子の同定およびクローニングを
行い、（ｉｉｉ） 細菌のトランスフォームされた細胞
における前記標的遺伝子産物の合成が専らもしくはほぼ
専ら前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモー
ターから開始される転写に依存するように、たとえば翻
訳−開始のシグナルのような他の適するシグナルと一緒
に標的遺伝子に対しｃｉｓで前記ＮａＣｌ誘発性もしく
は浸透圧誘発性プロモーターを作用的に結合させること
によるオペロン融合体を形成し、（ｉｖ） 前記細菌の
細胞内に前記オペロン融合体を受け渡し、維持すること
によって前記細菌のトランスフォームされた細胞を得、
（ｖ） 低オスモラリティーの培地で前記トランスフォ
ームされた細胞を増殖し、前記培地にＮａＣｌもしくは
他のオスモライトを添加することによって前記標的遺伝
子産物の合成を誘発し、（ｉｖ） 前記標的遺伝子産物
がこれら条件下で実質的に誘発されたことを確認し、
（ｖｉｉ） 前記培地からの前記標的遺伝子産物の濃縮
されたもしくは精製された調製物を作製する、という各
工程である。
【００２８】後記の実施例において、上記直接的手法を
用いる本発明の特定な具体例を示す方法の詳細を説明す
る。そこでは前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
プロモーターは大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ座
から誘導され；前記有用な標的遺伝子産物の選択例はバ
クテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼであり；さ
らに前記宿主細菌が大腸菌（Escherichia coli）であ
る。これら実施例を含め本明細書における説明は、当業
者に従来技術で入手しうる材料および方法とを組合せ
て、上記の直接的手法に関し本発明を完全に開示する。
用いる本発明の特定な具体例を示す方法の詳細を説明す
る。そこでは前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
プロモーターは大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ座
から誘導され；前記有用な標的遺伝子産物の選択例はバ
クテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼであり；さ
らに前記宿主細菌が大腸菌（Escherichia coli）であ
る。これら実施例を含め本明細書における説明は、当業
者に従来技術で入手しうる材料および方法とを組合せ
て、上記の直接的手法に関し本発明を完全に開示する。
【００２９】さらに本発明者等は、適する宿主細菌で誘
発剤としてＮａＣｌもしくは他のオスモライトを用い、
ヘテロロガス標的遺伝子産物の調節された過剰産生を得
るための間接的手法をも開発した。この間接的手法にお
いては、前記細菌のトランスフォームされた細胞にてＮ
ａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性であるプロモーター
（関連したｃｉｓ調節要素を含む）を転写−アクティベ
ーター蛋白質をコードする遺伝子にｃｉｓで作用的に結
合させる。得られる新規な組換構成物は前記細菌のトラ
ンスフォームされた細胞に存在し、これら細胞はプロモ
ーターで構成された第２の組換構成物を担うように処理
され、そして、プロモーターから標的遺伝子に対しｃｉ
ｓで作用的に結合された前記転写−アクティベーター蛋
白質により転写が活性化される。
発剤としてＮａＣｌもしくは他のオスモライトを用い、
ヘテロロガス標的遺伝子産物の調節された過剰産生を得
るための間接的手法をも開発した。この間接的手法にお
いては、前記細菌のトランスフォームされた細胞にてＮ
ａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性であるプロモーター
（関連したｃｉｓ調節要素を含む）を転写−アクティベ
ーター蛋白質をコードする遺伝子にｃｉｓで作用的に結
合させる。得られる新規な組換構成物は前記細菌のトラ
ンスフォームされた細胞に存在し、これら細胞はプロモ
ーターで構成された第２の組換構成物を担うように処理
され、そして、プロモーターから標的遺伝子に対しｃｉ
ｓで作用的に結合された前記転写−アクティベーター蛋
白質により転写が活性化される。
【００３０】間接的手法を用いる本発明の方法は次の工
程を備え、（ｉ） 適する宿主細菌にてＮａＣｌ誘発性
もしくは浸透圧誘発性であるプロモーターを同定および
クローニングを行い、（ｉｉ） 前記細菌で転写−アク
ティベーターとして機能しうる転写−アクティベーター
蛋白質の遺伝子を同定およびクローニングを行い、（ｉ
ｉｉ） 第２のプロモーターを同定およびクローニング
を行って、プロモーターからの転写を前記細菌における
前記転写−アクティベーター蛋白質により特異的に活性
化するようにし； （ｉｖ） 標的遺伝子を同定およびクローニングを行
い、（ｖ） 新規な組換構成物において、前記ＮａＣｌ
誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターを前記転写−
アクティベーター蛋白質の遺伝子に、たとえば転写−開
始におけるような他の適するシグナルと一緒に結合させ
て、前記細菌のトランスフォームされた細胞で前記転写
−アクティベーター蛋白質の合成が殆ど専ら前記ＮａＣ
ｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターから開始さ
れる転写に依存するようにし、（ｖｉ） 第２の組換構
成物において、前記第２のプロモーターを前記標的遺伝
子に、たとえば転写−開始におけるような適する他のシ
グナルと一緒に結合させて、前記細菌のトランスフォー
ムされた細胞で前記標的遺伝子産物の合成が前記第２の
プロモーターにて開始された転写物から指令されるよう
にし、（ｖｉｉ） 前記細菌の細胞内で、前記新規な組
換構成物と第２の組換構成物とを受け渡し、維持するこ
とにより前記細菌のトランスフォームされた細胞を得、
（ｖｉｉｉ） 前記トランスフォームされた細胞を低オ
スモラリティーの培地で増殖させ、ＮａＣｌもしくは他
のオスモライトを前記培地に添加することにより前記標
的遺伝子産物の合成を誘発させ、（ｉｘ） 前記標的遺
伝子産物がこれら条件下で実質的に誘発されることを確
認、（ｘ） 前記培地からの前記標的遺伝子産物の濃縮
されたもしくは精製された調製物を作製する、ことを備
えている。
程を備え、（ｉ） 適する宿主細菌にてＮａＣｌ誘発性
もしくは浸透圧誘発性であるプロモーターを同定および
クローニングを行い、（ｉｉ） 前記細菌で転写−アク
ティベーターとして機能しうる転写−アクティベーター
蛋白質の遺伝子を同定およびクローニングを行い、（ｉ
ｉｉ） 第２のプロモーターを同定およびクローニング
を行って、プロモーターからの転写を前記細菌における
前記転写−アクティベーター蛋白質により特異的に活性
化するようにし； （ｉｖ） 標的遺伝子を同定およびクローニングを行
い、（ｖ） 新規な組換構成物において、前記ＮａＣｌ
誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターを前記転写−
アクティベーター蛋白質の遺伝子に、たとえば転写−開
始におけるような他の適するシグナルと一緒に結合させ
て、前記細菌のトランスフォームされた細胞で前記転写
−アクティベーター蛋白質の合成が殆ど専ら前記ＮａＣ
ｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターから開始さ
れる転写に依存するようにし、（ｖｉ） 第２の組換構
成物において、前記第２のプロモーターを前記標的遺伝
子に、たとえば転写−開始におけるような適する他のシ
グナルと一緒に結合させて、前記細菌のトランスフォー
ムされた細胞で前記標的遺伝子産物の合成が前記第２の
プロモーターにて開始された転写物から指令されるよう
にし、（ｖｉｉ） 前記細菌の細胞内で、前記新規な組
換構成物と第２の組換構成物とを受け渡し、維持するこ
とにより前記細菌のトランスフォームされた細胞を得、
（ｖｉｉｉ） 前記トランスフォームされた細胞を低オ
スモラリティーの培地で増殖させ、ＮａＣｌもしくは他
のオスモライトを前記培地に添加することにより前記標
的遺伝子産物の合成を誘発させ、（ｉｘ） 前記標的遺
伝子産物がこれら条件下で実質的に誘発されることを確
認、（ｘ） 前記培地からの前記標的遺伝子産物の濃縮
されたもしくは精製された調製物を作製する、ことを備
えている。
【００３１】後記の実施例において、上記の間接的手法
を用いる本発明の特定の具体例を示す方法の詳細を例示
した。ここで前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
プロモーターを大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ座
から誘導し；前記転写−アクティベーター蛋白質はファ
ージＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり；前記第２のプロモ
ーターはファージＴ７のｍ１０プロモーターであり；前
記標的遺伝子はＥ．コリ（E. coli ）のＳＳＢ蛋白質を
コードするｓｓｂであり；さらに前記宿主細菌は大腸菌
（Escherichia coli）である。本明細書における実施例
を含む説明は、当業者に従来技術で入手しうる材料およ
び方法とを組合せて、上記間接的手法に関する本発明の
全開示を構成する。
を用いる本発明の特定の具体例を示す方法の詳細を例示
した。ここで前記ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
プロモーターを大腸菌（Escherichia coli）ｐｒｏＵ座
から誘導し；前記転写−アクティベーター蛋白質はファ
ージＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり；前記第２のプロモ
ーターはファージＴ７のｍ１０プロモーターであり；前
記標的遺伝子はＥ．コリ（E. coli ）のＳＳＢ蛋白質を
コードするｓｓｂであり；さらに前記宿主細菌は大腸菌
（Escherichia coli）である。本明細書における実施例
を含む説明は、当業者に従来技術で入手しうる材料およ
び方法とを組合せて、上記間接的手法に関する本発明の
全開示を構成する。
【００３２】瞬間的な誘発に対してＮａＣｌもしくは他
のオスモライトを用いる本発明で開示した調節された発
現系は、誘発剤が定常状態の増殖に際し培養物中に連続
的に存在する発現系に対して或る種の一般的な利点を与
える。これは、定常状態の増殖に際しクローン化された
遺伝子産物を過剰産生するよう設計されたトランスフォ
ームされた宿主細胞が、しばしば前記定常状態の増殖の
条件下で増殖性が極めて少なく、しかも培養物中で、ク
ローン化された遺伝子の発現レベルが減少している突然
変異体により急速にとってかわられるためである。瞬間
的な誘発を用いる調節された発現系（たとえば本発明と
して開示したもの）によって、細菌培養物の増殖の相と
クローン化された遺伝子産物の発現の増大とが時間的に
分離され、次いで個々に最適化することができる。
のオスモライトを用いる本発明で開示した調節された発
現系は、誘発剤が定常状態の増殖に際し培養物中に連続
的に存在する発現系に対して或る種の一般的な利点を与
える。これは、定常状態の増殖に際しクローン化された
遺伝子産物を過剰産生するよう設計されたトランスフォ
ームされた宿主細胞が、しばしば前記定常状態の増殖の
条件下で増殖性が極めて少なく、しかも培養物中で、ク
ローン化された遺伝子の発現レベルが減少している突然
変異体により急速にとってかわられるためである。瞬間
的な誘発を用いる調節された発現系（たとえば本発明と
して開示したもの）によって、細菌培養物の増殖の相と
クローン化された遺伝子産物の発現の増大とが時間的に
分離され、次いで個々に最適化することができる。
【００３３】後記の実施例は次のことを説明する：
（ｉ）プラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５１４
の作製（実施例１）。ここではＥ．コリ（E. coli ）ｐ
ｒｏＵのｃｉｓ調節要素は通常の制限酵素切断部位に隣
接した「カセットＤＮＡ配列」上に常在して、カセット
が（ａ）上記直接的手法の遂行において標的遺伝子に直
接的に、或いは（ｂ）上記間接的手法の遂行において転
写−アクティベーター蛋白質をコードする遺伝子に容易
に結合できるようになっている：（ｉｉ）プラスミドｐ
ＨＹＤ５０３の作製。ここではＥ．コリ（E. coli ）ｐ
ｒｏＵのｃｉｓ調節要素を有するｐＨＹＤ５１３からの
カセットをファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコード
する遺伝子にｃｉｓで作用的に結合させ、新規な組換構
成物を得、これは上記直接的手法の実用的例示である
が、ｐＨＹＤ５０３によりトランスフォームされたＥ．
コリ（E. coli ）細胞でファージＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼをＮａＣｌ添加の後に過剰産生させることを記載し
ている（実施例２）；（ｉｉｉ）安定な単一コピーの組
込菌株ＧＪ１１５０を得ることに関して、ｐＨＹＤ５０
３からＥ．コリ（E. coli ）の染色体におけるｍａｌＰ
Ｑ座への前記新規な組換構成物の転移（実施例３）；お
よび（ｉｖ）上記の間接的手法により、Ｅ．コリ（E. c
oli ）ｓｓｂ遺伝子（標的遺伝子）がＴ７ ｍ１０プロ
モーターに融合したプラスミドから、ＮａＣｌ誘発性の
ＳＳＢ蛋白質を過剰産生を指令する菌株ＧＪ１１５０の
使用（実施例４）。
（ｉ）プラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５１４
の作製（実施例１）。ここではＥ．コリ（E. coli ）ｐ
ｒｏＵのｃｉｓ調節要素は通常の制限酵素切断部位に隣
接した「カセットＤＮＡ配列」上に常在して、カセット
が（ａ）上記直接的手法の遂行において標的遺伝子に直
接的に、或いは（ｂ）上記間接的手法の遂行において転
写−アクティベーター蛋白質をコードする遺伝子に容易
に結合できるようになっている：（ｉｉ）プラスミドｐ
ＨＹＤ５０３の作製。ここではＥ．コリ（E. coli ）ｐ
ｒｏＵのｃｉｓ調節要素を有するｐＨＹＤ５１３からの
カセットをファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコード
する遺伝子にｃｉｓで作用的に結合させ、新規な組換構
成物を得、これは上記直接的手法の実用的例示である
が、ｐＨＹＤ５０３によりトランスフォームされたＥ．
コリ（E. coli ）細胞でファージＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼをＮａＣｌ添加の後に過剰産生させることを記載し
ている（実施例２）；（ｉｉｉ）安定な単一コピーの組
込菌株ＧＪ１１５０を得ることに関して、ｐＨＹＤ５０
３からＥ．コリ（E. coli ）の染色体におけるｍａｌＰ
Ｑ座への前記新規な組換構成物の転移（実施例３）；お
よび（ｉｖ）上記の間接的手法により、Ｅ．コリ（E. c
oli ）ｓｓｂ遺伝子（標的遺伝子）がＴ７ ｍ１０プロ
モーターに融合したプラスミドから、ＮａＣｌ誘発性の
ＳＳＢ蛋白質を過剰産生を指令する菌株ＧＪ１１５０の
使用（実施例４）。
【００３４】
【実施例】以下の実施例においては次の材料および方法
を使用した： １． 菌株ＤＨ５’［ハナハン（Hanahan ）（１９８
３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（J. Mo
l. Biol. ）、第１６６巻、第５５７〜５８０頁および
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda Resea
rch Labs）（１９８６）、フォーカス（Focus ）、第８
巻、第９頁に記載されている］；ＢＬ２１［スツジエー
ル（Studier ）およびモファット（Moffatt ）（１９８
６）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（J. Mo
l. Biol. ）、第１８９巻、第１１３〜１３０頁に記載
されている］、およびｐｏｐ２２４９［ユング（Jung）
等（１９９０）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー（J. Biol. Chem.）、第２６５巻、第１０５７４
〜１０５８１頁に記載されている］を細菌菌株およびプ
ラスミド用の宿主として使用した。
を使用した： １． 菌株ＤＨ５’［ハナハン（Hanahan ）（１９８
３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（J. Mo
l. Biol. ）、第１６６巻、第５５７〜５８０頁および
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda Resea
rch Labs）（１９８６）、フォーカス（Focus ）、第８
巻、第９頁に記載されている］；ＢＬ２１［スツジエー
ル（Studier ）およびモファット（Moffatt ）（１９８
６）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（J. Mo
l. Biol. ）、第１８９巻、第１１３〜１３０頁に記載
されている］、およびｐｏｐ２２４９［ユング（Jung）
等（１９９０）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー（J. Biol. Chem.）、第２６５巻、第１０５７４
〜１０５８１頁に記載されている］を細菌菌株およびプ
ラスミド用の宿主として使用した。
【００３５】２． 使用したプラスミドはｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ−ＫＳ［ストラタジーン（Stratagene）Ｇｍ
ｂＨ社、ポストファッハ（Postfach）１０ ５４ ６
６、Ｄ−６９００、ハイデルベルク（Heidelberg）、Ｆ
ＲＧ］；ｐＧＥＭ−３Ｚ［プロメガ（Promega Co. ）
社、２８００、ウッズ・ハロウ・ロード（Woods Hollow
Road ）、マジソン（Madison ）、ＷＩ ５３７１１−
５３９９、ＵＳＡ］；ｐＯＭ４１［ビダル−インギグリ
アルジ（Vidal-Ingigliardi ）およびライバウド（Raib
aud ）（１９８５）、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）、第１３巻、第５９１９〜５
９２６頁］；ｐＧＫ２［キショア（Kishore ）等（１９
９４）、インディアン・ジャーナル・バイオケミストリ
ー・バイオフィジークス（Ind. J. Biochem. Biophys.
）、第３１巻、第２４９〜２５３頁］；ｐＨＹＤ２７
２［ダッタナンダ（Dattananda）等（１９９１）、ジャ
ーナル・バクテリオロジー（J. Bactriol.）、第１７３
巻、第７４８１〜７４９０頁］；およびｐＨＹＤ５０１
である。
ｃｒｉｐｔ−ＫＳ［ストラタジーン（Stratagene）Ｇｍ
ｂＨ社、ポストファッハ（Postfach）１０ ５４ ６
６、Ｄ−６９００、ハイデルベルク（Heidelberg）、Ｆ
ＲＧ］；ｐＧＥＭ−３Ｚ［プロメガ（Promega Co. ）
社、２８００、ウッズ・ハロウ・ロード（Woods Hollow
Road ）、マジソン（Madison ）、ＷＩ ５３７１１−
５３９９、ＵＳＡ］；ｐＯＭ４１［ビダル−インギグリ
アルジ（Vidal-Ingigliardi ）およびライバウド（Raib
aud ）（１９８５）、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）、第１３巻、第５９１９〜５
９２６頁］；ｐＧＫ２［キショア（Kishore ）等（１９
９４）、インディアン・ジャーナル・バイオケミストリ
ー・バイオフィジークス（Ind. J. Biochem. Biophys.
）、第３１巻、第２４９〜２５３頁］；ｐＨＹＤ２７
２［ダッタナンダ（Dattananda）等（１９９１）、ジャ
ーナル・バクテリオロジー（J. Bactriol.）、第１７３
巻、第７４８１〜７４９０頁］；およびｐＨＹＤ５０１
である。
【００３６】３． 使用した増殖培地はＬＢＯＮ培地
［バクトトリプトン１０．０ｇ／Ｌ、バクト酵母抽出物
５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０に調整］である。抗生物質を
次の最終濃度（ｆｇ／ｍＬ）で（必要に応じ）使用し
た；アンピシリン（Ａｍｐ）、１００；テトラサイクリ
ン（Ｔｅｔ）、１５；およびトリメトプリム（Ｔｐ）、
６０。添字ｒおよびｓを用いて、それぞれ耐性および感
受性の表現型を示す。５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−ａ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を２５
ｆｇ／ｍＬの最終濃度にてプレートに使用した。これら
はアンピシリンおよびテトラサイクリンの原液からそれ
ぞれ水およびエタノールで調製し、トリメトプリムおよ
びＸ−ｇａｌの原液からジメチルホルムアミドで調製し
た。
［バクトトリプトン１０．０ｇ／Ｌ、バクト酵母抽出物
５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０に調整］である。抗生物質を
次の最終濃度（ｆｇ／ｍＬ）で（必要に応じ）使用し
た；アンピシリン（Ａｍｐ）、１００；テトラサイクリ
ン（Ｔｅｔ）、１５；およびトリメトプリム（Ｔｐ）、
６０。添字ｒおよびｓを用いて、それぞれ耐性および感
受性の表現型を示す。５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−ａ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を２５
ｆｇ／ｍＬの最終濃度にてプレートに使用した。これら
はアンピシリンおよびテトラサイクリンの原液からそれ
ぞれ水およびエタノールで調製し、トリメトプリムおよ
びＸ−ｇａｌの原液からジメチルホルムアミドで調製し
た。
【００３７】４． 培地、薬品および抗生物質はシグマ
（Sigma ）社［私書箱１４５０８、セントルイス、ＭＵ
６３１７８、ＵＳＡ］；ディフコ・ラボラトリース（Di
fco Laboratories）社［私書箱３３１０５８、デトロイ
ト、ＭＩ ４８２３２−７０５８、ＵＳＡ］、およびハ
イ・メディア・ラボラトリース Ｐｖｔ（Hi Media Lab
oratories Pvt.）社［２３、バドハニ・インダストリア
ル・エステート（Vadhani Industrial Estate ）、ボン
ベイ ４０００８６、インド］から入手した。
（Sigma ）社［私書箱１４５０８、セントルイス、ＭＵ
６３１７８、ＵＳＡ］；ディフコ・ラボラトリース（Di
fco Laboratories）社［私書箱３３１０５８、デトロイ
ト、ＭＩ ４８２３２−７０５８、ＵＳＡ］、およびハ
イ・メディア・ラボラトリース Ｐｖｔ（Hi Media Lab
oratories Pvt.）社［２３、バドハニ・インダストリア
ル・エステート（Vadhani Industrial Estate ）、ボン
ベイ ４０００８６、インド］から入手した。
【００３８】５． ＤＮＡクローニングに用いた制限エ
ンドヌクレアーゼおよび酵素はニュー・イングランド・
バイオラボ（New England Biolabs ）社［３２、トザー
・ロード（Tozer Road）、ビバリー（Beverly ）、ＭＡ
０１９１５−５５９９、ＵＳＡ］；ベーリンガー・マ
ンハイム（Boehringer Mannheim ）ＧｍｂＨ社［ビオヘ
ミカ（Biochemica）私書箱３２１ １２０、Ｄ−６８０
０マンハイム（Mannheim）３１、ＦＲＧ］；プロメガ
（Promega ）社［２８００、ウッズ・ハロー・ロード、
（Woods Hollow Road ）マジソン（Madison ）、ＷＩ
５３７１１−５３９９、ＵＳＡ］；およびバンガロア・
ゼネイＰｖｔ（Bangalore Genei Pvt.）社［Ｎｏ．２７
７、セカンド・メイン（サンケイ・ロード）（2nd Main
(Sankey Road)）、１８番クロス（Cross ）、マレスワ
ラム（Malleswaram ）、バンガロア（Bangalore ）−５
６０００３、インド］から入手した。アガロースゲル上
での電気泳動によって分離されたＤＮＡ断片を精製する
ためのゼネクリーン・キット（Geneclean kit ）はビオ
１０１（Bio101）社［私書箱２２８４、ラ・ヨラ（La J
olla）、ＣＡ ９２０３８−２２８４、ＵＳＡ］から購
入した。
ンドヌクレアーゼおよび酵素はニュー・イングランド・
バイオラボ（New England Biolabs ）社［３２、トザー
・ロード（Tozer Road）、ビバリー（Beverly ）、ＭＡ
０１９１５−５５９９、ＵＳＡ］；ベーリンガー・マ
ンハイム（Boehringer Mannheim ）ＧｍｂＨ社［ビオヘ
ミカ（Biochemica）私書箱３２１ １２０、Ｄ−６８０
０マンハイム（Mannheim）３１、ＦＲＧ］；プロメガ
（Promega ）社［２８００、ウッズ・ハロー・ロード、
（Woods Hollow Road ）マジソン（Madison ）、ＷＩ
５３７１１−５３９９、ＵＳＡ］；およびバンガロア・
ゼネイＰｖｔ（Bangalore Genei Pvt.）社［Ｎｏ．２７
７、セカンド・メイン（サンケイ・ロード）（2nd Main
(Sankey Road)）、１８番クロス（Cross ）、マレスワ
ラム（Malleswaram ）、バンガロア（Bangalore ）−５
６０００３、インド］から入手した。アガロースゲル上
での電気泳動によって分離されたＤＮＡ断片を精製する
ためのゼネクリーン・キット（Geneclean kit ）はビオ
１０１（Bio101）社［私書箱２２８４、ラ・ヨラ（La J
olla）、ＣＡ ９２０３８−２２８４、ＵＳＡ］から購
入した。
【００３９】６． 特記しない限り、ＤＮＡ断片の調製
およびクローニングはモレキュラ・クローニング：ラボ
ラリー・マニュアル（Moleculra Cloning: A Laborator
y manual）、第２版（１９８９）、サムブルック（Samb
rook）等、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド
・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュ
ーヨークに記載された標準技術により行った。
およびクローニングはモレキュラ・クローニング：ラボ
ラリー・マニュアル（Moleculra Cloning: A Laborator
y manual）、第２版（１９８９）、サムブルック（Samb
rook）等、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド
・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュ
ーヨークに記載された標準技術により行った。
【００４０】７． 全細胞溶解物の蛋白質のプロフィー
ルもモレキュラ・クローニング：ラボラリー・マニュア
ル、第２版（１９８９）、サムブルック等、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨークに記載された
標準技術を用いて入手した。
ルもモレキュラ・クローニング：ラボラリー・マニュア
ル、第２版（１９８９）、サムブルック等、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨークに記載された
標準技術を用いて入手した。
【００４１】寄託
充分な開示の要件に即して、本発明の２種のプラスミド
を本出願の出願日に先立ちナショナル・コレクションス
・フォア・インダストリアル・アンド・マリーン・バク
テリア・リミテッド（National Collections for Indus
trial and Marine Bacteria Limited ）、スコットラン
ド、ユナイテッド・キングダム（ＮＣＩＭＢ）に寄託し
た。これら２種のプラスミドはｐＨＹＤ２７２およびｐ
ＨＹＤ５０１である。寄託は菌株ＤＨ５’／ｐＨＹＤ２
７２／ｐＨＹＤ５０１のものであり、寄託番号はＮＣＩ
ＭＢ ４０７７２で、１９９５年１０月２日付けであ
る。
を本出願の出願日に先立ちナショナル・コレクションス
・フォア・インダストリアル・アンド・マリーン・バク
テリア・リミテッド（National Collections for Indus
trial and Marine Bacteria Limited ）、スコットラン
ド、ユナイテッド・キングダム（ＮＣＩＭＢ）に寄託し
た。これら２種のプラスミドはｐＨＹＤ２７２およびｐ
ＨＹＤ５０１である。寄託は菌株ＤＨ５’／ｐＨＹＤ２
７２／ｐＨＹＤ５０１のものであり、寄託番号はＮＣＩ
ＭＢ ４０７７２で、１９９５年１０月２日付けであ
る。
【００４２】実施例１
通常の制限酵素部位が隣接したｐｒｏＵのｃｉｓ調節領
域を有するプラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５
１４の作製 プラスミドｐＨＹＤ２７２は選択マーカーとしてＴｐｒ
をコードするＩｎｃＷ−レプリコンに基づく低コピー数
プラスミドであり、これはヌクレオチド３７６〜１５５
０のｐｒｏＵ配列を有し、２個のｐｒｏＵプロモーター
とこれら２個のプロモーターから開始される正常な浸透
圧誘発性の転写を行うのに必要かつ十分な他の調節配列
とを有している［ダッタナンダ（Dattananda）等（１９
９１）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacterio
l. ）、第１７３巻、第７４８１〜７４９０頁］。ｐｒ
ｏＵ座におけるヌクレオチドの数の規定に関する命名法
は次の刊行物［ゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１
９８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteri
ol. ）、第１７１巻、第１９２３〜１９３１頁およびエ
ラツム（Erratum ）（１９９０）、第１７２巻、第１１
６５頁］に拠った。次いで位置１６３１に存在するｐＨ
ＹＤ２７２におけるｐｒｏＵ配列の右側末端を同定した
（図１参照。図１は、位置３７６〜１６３１のＥ．コリ
（E. coli ）のｐｒｏＵ配列を含むプラスミドｐＨＹＤ
２７２からのＳａｃＩ断片のヌクレオチド配列を示し；
ｐｒｏＵ配列の２つの末端は対応するヌクレオチドの数
の規定によりマークし；断片のＳａｃＩ末端および位置
１０４５−１０５０におけるＮｄｅＩ部位には上線を施
した）。ｐｒｏＵ調節配列を容易に処理するため、ｐＨ
ＹＤ２７２からのこの１．２５−ｋｂ断片を高コピー数
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳおよびｐＧＥ
Ｍ−３Ｚの複クローニング部位でクローニングした。こ
の目的で、プラスミドｐＨＹＤ２７２を制限酵素Ｓａｃ
Ｉで切断して１．２５−ｋｂのｐｒｏＵ断片を遊離させ
（図１参照）、次いでこれをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ−ＫＳおよびｐＧＥＭ−３ＺのそれぞれのＳａｃ
Ｉ部位でサブクローニングした。得られたプラスミドを
それぞれｐＨＹＤ５１１およびｐＨＹＤ５１４と命名し
た。
域を有するプラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５
１４の作製 プラスミドｐＨＹＤ２７２は選択マーカーとしてＴｐｒ
をコードするＩｎｃＷ−レプリコンに基づく低コピー数
プラスミドであり、これはヌクレオチド３７６〜１５５
０のｐｒｏＵ配列を有し、２個のｐｒｏＵプロモーター
とこれら２個のプロモーターから開始される正常な浸透
圧誘発性の転写を行うのに必要かつ十分な他の調節配列
とを有している［ダッタナンダ（Dattananda）等（１９
９１）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacterio
l. ）、第１７３巻、第７４８１〜７４９０頁］。ｐｒ
ｏＵ座におけるヌクレオチドの数の規定に関する命名法
は次の刊行物［ゴウリスハンカー（Gowrishankar）（１
９８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteri
ol. ）、第１７１巻、第１９２３〜１９３１頁およびエ
ラツム（Erratum ）（１９９０）、第１７２巻、第１１
６５頁］に拠った。次いで位置１６３１に存在するｐＨ
ＹＤ２７２におけるｐｒｏＵ配列の右側末端を同定した
（図１参照。図１は、位置３７６〜１６３１のＥ．コリ
（E. coli ）のｐｒｏＵ配列を含むプラスミドｐＨＹＤ
２７２からのＳａｃＩ断片のヌクレオチド配列を示し；
ｐｒｏＵ配列の２つの末端は対応するヌクレオチドの数
の規定によりマークし；断片のＳａｃＩ末端および位置
１０４５−１０５０におけるＮｄｅＩ部位には上線を施
した）。ｐｒｏＵ調節配列を容易に処理するため、ｐＨ
ＹＤ２７２からのこの１．２５−ｋｂ断片を高コピー数
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳおよびｐＧＥ
Ｍ−３Ｚの複クローニング部位でクローニングした。こ
の目的で、プラスミドｐＨＹＤ２７２を制限酵素Ｓａｃ
Ｉで切断して１．２５−ｋｂのｐｒｏＵ断片を遊離させ
（図１参照）、次いでこれをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ−ＫＳおよびｐＧＥＭ−３ＺのそれぞれのＳａｃ
Ｉ部位でサブクローニングした。得られたプラスミドを
それぞれｐＨＹＤ５１１およびｐＨＹＤ５１４と命名し
た。
【００４３】これら構成物の他の改変において、プラス
ミドｐＨＹＤ５１１のｐｒｏＵ配列における位置１０４
５−１０５１に存在するＮｄｅＩ部位を（インビボにお
けるプロモーターの浸透圧誘発性をもたらすことなし
に）次のように切断した：プラスミドｐＨＹＤ５１１を
制限酵素ＮｄｅＩでの切断によりＮｄｅＩ部位で線状化
させ、クレノウＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキ
シヌクレオチド三リン酸を用いて各末端を「平滑化」さ
せ、さらにプラスミドをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い標
準的結合反応条件により再び環化した。Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを熱失活させ、ＤＮＡ試料をエタノールで沈澱さ
せた。このＤＮＡ試料を再びＮｄｅＩで処理し、処理混
合物を用いてＡｍｐｒに対して応答能力のあるＤＨ５’
の細胞の調製物をトランスフォームした。次いで、１０
種の個々の各トランスフォーム体から得られたＤＮＡ
を、制限酵素分析を用いてｐｒｏＵの１０４５−１０５
０におけるＮｄｅＩ部位が存在しないことを試験し、こ
のように同定されたＮｄｅＩ部位が破壊されている１種
のプラスミドをｐＨＹＤ５１２と命名した。
ミドｐＨＹＤ５１１のｐｒｏＵ配列における位置１０４
５−１０５１に存在するＮｄｅＩ部位を（インビボにお
けるプロモーターの浸透圧誘発性をもたらすことなし
に）次のように切断した：プラスミドｐＨＹＤ５１１を
制限酵素ＮｄｅＩでの切断によりＮｄｅＩ部位で線状化
させ、クレノウＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキ
シヌクレオチド三リン酸を用いて各末端を「平滑化」さ
せ、さらにプラスミドをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い標
準的結合反応条件により再び環化した。Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを熱失活させ、ＤＮＡ試料をエタノールで沈澱さ
せた。このＤＮＡ試料を再びＮｄｅＩで処理し、処理混
合物を用いてＡｍｐｒに対して応答能力のあるＤＨ５’
の細胞の調製物をトランスフォームした。次いで、１０
種の個々の各トランスフォーム体から得られたＤＮＡ
を、制限酵素分析を用いてｐｒｏＵの１０４５−１０５
０におけるＮｄｅＩ部位が存在しないことを試験し、こ
のように同定されたＮｄｅＩ部位が破壊されている１種
のプラスミドをｐＨＹＤ５１２と命名した。
【００４４】ｐＨＹＤ５１２からの１．２５−ｋｂ ｐ
ｒｏＵ配列も同様にベクターｐＧＥＭ−３ＺのＳａｃＩ
部位でＳａｃＩ断片についてサブクローニングし、得ら
れたプラスミドをｐＨＹＤ５１３と称した。したがっ
て、プラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５１４は
ｐｒｏＵのｃｉｓ調節領域を有し（他の実施例では、ｐ
ｒｏＵｐとして示す）、さらにｐｒｏＵｐのいずれかの
側における独特な制限部位を図２に示す（この図面はｐ
ＧＥＭ３Ｚ由来のプラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨ
ＹＤ５１４の物理的マップを示し、ｐｒｏＵｐ「カセッ
ト」の上流および下流で利用できる独特な制限部位を示
し、ｐｒｏＵｐからの転写方向を上側の矢印によって示
し、両プラスミドはｐＨＹＤ５１３におけるｐｒｏＵｐ
内のＮｄｅＩ部位の変異を除き同一である）。
ｒｏＵ配列も同様にベクターｐＧＥＭ−３ＺのＳａｃＩ
部位でＳａｃＩ断片についてサブクローニングし、得ら
れたプラスミドをｐＨＹＤ５１３と称した。したがっ
て、プラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨＹＤ５１４は
ｐｒｏＵのｃｉｓ調節領域を有し（他の実施例では、ｐ
ｒｏＵｐとして示す）、さらにｐｒｏＵｐのいずれかの
側における独特な制限部位を図２に示す（この図面はｐ
ＧＥＭ３Ｚ由来のプラスミドｐＨＹＤ５１３およびｐＨ
ＹＤ５１４の物理的マップを示し、ｐｒｏＵｐ「カセッ
ト」の上流および下流で利用できる独特な制限部位を示
し、ｐｒｏＵｐからの転写方向を上側の矢印によって示
し、両プラスミドはｐＨＹＤ５１３におけるｐｒｏＵｐ
内のＮｄｅＩ部位の変異を除き同一である）。
【００４５】実施例２
ｐｒｏＵｐがファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
に結合したプラスミドｐＨＹＤ５０３の作製 プラスミドｐＨＹＤ５０１は選択マーカーとしてＴｅｔ
ｒをコードするＰ１５Ａ−レプリコンに基づく多コピー
のプラスミドであって、上流のプロモーターなしにファ
ージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）遺伝
子を保有している（図３）。ｐＨＹＤ５０１でＴ７ Ｒ
ＮＡＰ遺伝子の上流にｐｒｏＵｐ配列をクローン化する
ため、プラスミドｐＨＹＤ５０１およびｐＨＹＤ５１３
をそれぞれＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限酵素で切断した。
これら酵素を熱失活させ、２種のＤＮＡ試料を混合し、
エタノールで沈澱させ、さらに結合反応を標準法にした
がって行った。受容能力のあるＤＨ５’細胞を結合混合
物によりトランスフォームした。Ｔｅｔｒトランスフォ
ーム体を選択し、これらをＡｍｐｓ表現型につきスクリ
ーニングした。プラスミドＤＮＡを５種のＡｍｐｓ Ｔ
ｅｔｒトランスフォーム体から調製した。これらＤＮＡ
試料のそれぞれをＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動により分析した。すべての
試料はそれぞれ５．７ｋｂおよび１．２５ｋｂの長さの
２つのバンドを示し、これは各々の場合にｐｒｏＵ ｃ
ｉｓ調節配列がＴ７ ＲＮＡＰ遺伝子の上流にクローン
化されたことを示す。これらプラスミド誘導体の１種を
ｐＨＹＤ５０３と命名した（図３参照。この図はプラス
ミドｐＨＹＤ５０１の構造およびｐＨＹＤ５０１からプ
ラスミドｐＨＹＤ５０３を作製する工程を図示するが大
きさは示していない。矢印は別のプロモーターからの転
写の範囲および方向を示し、ベクター上のマーカー遺伝
子の転写は示さず、各種のＤＮＡ分子におけるＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位の位置をマーク
し、円弧はｐＨＹＤ５０３の形成に使用したｐＨＹＤ５
０１の断片を示す）。
に結合したプラスミドｐＨＹＤ５０３の作製 プラスミドｐＨＹＤ５０１は選択マーカーとしてＴｅｔ
ｒをコードするＰ１５Ａ−レプリコンに基づく多コピー
のプラスミドであって、上流のプロモーターなしにファ
ージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）遺伝
子を保有している（図３）。ｐＨＹＤ５０１でＴ７ Ｒ
ＮＡＰ遺伝子の上流にｐｒｏＵｐ配列をクローン化する
ため、プラスミドｐＨＹＤ５０１およびｐＨＹＤ５１３
をそれぞれＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限酵素で切断した。
これら酵素を熱失活させ、２種のＤＮＡ試料を混合し、
エタノールで沈澱させ、さらに結合反応を標準法にした
がって行った。受容能力のあるＤＨ５’細胞を結合混合
物によりトランスフォームした。Ｔｅｔｒトランスフォ
ーム体を選択し、これらをＡｍｐｓ表現型につきスクリ
ーニングした。プラスミドＤＮＡを５種のＡｍｐｓ Ｔ
ｅｔｒトランスフォーム体から調製した。これらＤＮＡ
試料のそれぞれをＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動により分析した。すべての
試料はそれぞれ５．７ｋｂおよび１．２５ｋｂの長さの
２つのバンドを示し、これは各々の場合にｐｒｏＵ ｃ
ｉｓ調節配列がＴ７ ＲＮＡＰ遺伝子の上流にクローン
化されたことを示す。これらプラスミド誘導体の１種を
ｐＨＹＤ５０３と命名した（図３参照。この図はプラス
ミドｐＨＹＤ５０１の構造およびｐＨＹＤ５０１からプ
ラスミドｐＨＹＤ５０３を作製する工程を図示するが大
きさは示していない。矢印は別のプロモーターからの転
写の範囲および方向を示し、ベクター上のマーカー遺伝
子の転写は示さず、各種のＤＮＡ分子におけるＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位の位置をマーク
し、円弧はｐＨＹＤ５０３の形成に使用したｐＨＹＤ５
０１の断片を示す）。
【００４６】プラスミドｐＨＹＤ５０３を菌株ＢＬ２１
にトランスフォームし、Ｔｅｔｒトランスフォーム体を
ＬＢＯＮ−Ｔｅｔプレートで選択した。次いで、単一の
精製されたＴｅｔｒコロニーを１００ｍＬ三角フラスコ
中の１０ｍＬのＬＢＯＮ−Ｔｅｔ肉汁培地（ブロス）に
接種し、環境振とう器（environmental shaker）にて３
７℃で１晩インキュベートした。翌日、培養物を同じ組
成の１０ｍＬの新鮮な培養液で１：５０に希釈し、上記
と同様にインキュベートした。培養物のＯＤ６００が約
０．８の数値に達したとき、培養物を２つの１００ｍＬ
フラスコに均等に分割し、その一方にはＮａＣｌを０．
４Ｍの最終濃度まで（水中、５Ｍ原液から）添加して浸
透圧誘発を行ったのに対し、他方のフラスコは非誘発の
対照として用いた。その後、これらフラスコを３７℃に
て環境振とう器内でさらに３時間にわたりインキュベー
トした後、培養物における細胞をベンチトップ遠心分離
器で４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して収集し
た。細胞ペレットを０．５ｍＬの熱（約８０℃）試料緩
衝液に再懸濁した。試料混合物を２分間にわたり煮沸し
た後、試料を直ちに氷中に移し、次いで−２０℃にて貯
蔵した。これら試料を次いで６％ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準法に
したがい、ゲルをクーマシーブルーにより染色した。こ
の手順により、ＢＬ２１／ｐＨＹＤ５０３培養物にＮａ
Ｃｌの添加の後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの調節され
た過剰な産生が明かに示され、これによりｐｒｏＵｐが
ヘテロロガス蛋白質の塩誘発性の過剰産生に有用である
という知見が得られた。
にトランスフォームし、Ｔｅｔｒトランスフォーム体を
ＬＢＯＮ−Ｔｅｔプレートで選択した。次いで、単一の
精製されたＴｅｔｒコロニーを１００ｍＬ三角フラスコ
中の１０ｍＬのＬＢＯＮ−Ｔｅｔ肉汁培地（ブロス）に
接種し、環境振とう器（environmental shaker）にて３
７℃で１晩インキュベートした。翌日、培養物を同じ組
成の１０ｍＬの新鮮な培養液で１：５０に希釈し、上記
と同様にインキュベートした。培養物のＯＤ６００が約
０．８の数値に達したとき、培養物を２つの１００ｍＬ
フラスコに均等に分割し、その一方にはＮａＣｌを０．
４Ｍの最終濃度まで（水中、５Ｍ原液から）添加して浸
透圧誘発を行ったのに対し、他方のフラスコは非誘発の
対照として用いた。その後、これらフラスコを３７℃に
て環境振とう器内でさらに３時間にわたりインキュベー
トした後、培養物における細胞をベンチトップ遠心分離
器で４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して収集し
た。細胞ペレットを０．５ｍＬの熱（約８０℃）試料緩
衝液に再懸濁した。試料混合物を２分間にわたり煮沸し
た後、試料を直ちに氷中に移し、次いで−２０℃にて貯
蔵した。これら試料を次いで６％ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準法に
したがい、ゲルをクーマシーブルーにより染色した。こ
の手順により、ＢＬ２１／ｐＨＹＤ５０３培養物にＮａ
Ｃｌの添加の後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの調節され
た過剰な産生が明かに示され、これによりｐｒｏＵｐが
ヘテロロガス蛋白質の塩誘発性の過剰産生に有用である
という知見が得られた。
【００４７】実施例３
Ｅ．コリ（E. coli ）菌株ｐｏｐ２２４９の染色体への
単一コピーでの新規なｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ組換
構成物の組込み Ｅ．コリ（E. coli ）の染色体にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ Ｒ
ＮＡＰ融合体を挿入するため、ライバウド（Raibaud ）
等［ジーン（Gene）、第２９巻、第２３１〜２４１頁
（１９８４）］により記載された組込技術を用いた。こ
の系では、染色体に組込むべき挿入物を第１工程におい
てプラスミド ベクターｐＯＭ４１でクローン化し、挿
入物をｍａｌＰ−ｍａｌＴ座の配列により２つの側で隣
接するようにした。このＡｍｐｒプラスミド ベクター
もまたプロモーターなしのｍａｌＰ遺伝子とＴｅｔｒを
コードする遺伝子との間に転写融合物を有している。し
たがって、もし、プロモーターを有するいずれかの挿入
物がベクター中で右方向でクローン化されれば、得られ
るプラスミドトランスフォーム体はＴｅｔｒとなる。ｐ
ＯＭ４１にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ断片を挿入する
ため、プラスミドｐＨＹＤ５０３をＢａｍＨＩで切断
し、ｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合物を含む４．０−
ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動の後にジェネクリー
ン（Geneclean ）により抽出した。次いで、この断片
を、ｍａｌＰ遺伝子中のＢｇｌＩＩ部位で線状化したｐ
ＯＭ４１ ＤＮＡと結合した（図４参照：これはプラス
ミドｐＨＹＤ５０３からプラスミドｐＨＹＤ５０７を作
製する工程を図示する。用いた記号は図３における記号
と同じである）。受容能力のあるＤＨ５’細胞を結合混
合物でトランスフォームし、Ａｍｐｒトランスフォーム
体を選択した。次いで、これらトランスフォーム体を浸
透圧誘発されたＴｅｔｒの表現型［ｐＯＭ４１へのｐｒ
ｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰの挿入がの図４に示した方向で
挿入されているプラスミドと期待されるもの］について
スクリーニングを行った。これは一方は０．３ＭのＮａ
Ｃｌを含み、他方は０．３ＭのＮａＣｌを含まない１対
のＬＢＯＮ−Ｔｅｔプレート上でレプリカのそれぞれを
画線培養して行った。ｐＨＹＤ５０７と命名した一つの
プラスミドを貯蔵し、これはｐＨＹＤ５０３からのｐｒ
ｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体がｐＯＭ４１のＢｇｌＩ
Ｉ部位に所望の方向で挿入されているものである。
単一コピーでの新規なｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ組換
構成物の組込み Ｅ．コリ（E. coli ）の染色体にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ Ｒ
ＮＡＰ融合体を挿入するため、ライバウド（Raibaud ）
等［ジーン（Gene）、第２９巻、第２３１〜２４１頁
（１９８４）］により記載された組込技術を用いた。こ
の系では、染色体に組込むべき挿入物を第１工程におい
てプラスミド ベクターｐＯＭ４１でクローン化し、挿
入物をｍａｌＰ−ｍａｌＴ座の配列により２つの側で隣
接するようにした。このＡｍｐｒプラスミド ベクター
もまたプロモーターなしのｍａｌＰ遺伝子とＴｅｔｒを
コードする遺伝子との間に転写融合物を有している。し
たがって、もし、プロモーターを有するいずれかの挿入
物がベクター中で右方向でクローン化されれば、得られ
るプラスミドトランスフォーム体はＴｅｔｒとなる。ｐ
ＯＭ４１にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ断片を挿入する
ため、プラスミドｐＨＹＤ５０３をＢａｍＨＩで切断
し、ｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合物を含む４．０−
ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動の後にジェネクリー
ン（Geneclean ）により抽出した。次いで、この断片
を、ｍａｌＰ遺伝子中のＢｇｌＩＩ部位で線状化したｐ
ＯＭ４１ ＤＮＡと結合した（図４参照：これはプラス
ミドｐＨＹＤ５０３からプラスミドｐＨＹＤ５０７を作
製する工程を図示する。用いた記号は図３における記号
と同じである）。受容能力のあるＤＨ５’細胞を結合混
合物でトランスフォームし、Ａｍｐｒトランスフォーム
体を選択した。次いで、これらトランスフォーム体を浸
透圧誘発されたＴｅｔｒの表現型［ｐＯＭ４１へのｐｒ
ｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰの挿入がの図４に示した方向で
挿入されているプラスミドと期待されるもの］について
スクリーニングを行った。これは一方は０．３ＭのＮａ
Ｃｌを含み、他方は０．３ＭのＮａＣｌを含まない１対
のＬＢＯＮ−Ｔｅｔプレート上でレプリカのそれぞれを
画線培養して行った。ｐＨＹＤ５０７と命名した一つの
プラスミドを貯蔵し、これはｐＨＹＤ５０３からのｐｒ
ｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体がｐＯＭ４１のＢｇｌＩ
Ｉ部位に所望の方向で挿入されているものである。
【００４８】この方法における第２工程では（図５参
照：これはプラスミドｐＨＹＤ５０７からのｐｒｏＵｐ
−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体が染色体に組み込まれた菌株Ｇ
Ｊ１１５０の作製各工程を図示し、大部分の記号は図３
で説明した通りであるが、プラスミドおよび染色体にお
ける数字１および２は、２つのレプリコン間の推定され
る二重交差逆組換現象に対する基質として作用する相同
性の対の部位を示している）、プラスミドｐＨＹＤ５０
７からのｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合物を相同組換
により菌株ｐｏｐ２２４９のｍａｌＴＰＱ座に転移させ
た［この菌株ｐｏｐ２２４９もｍａｌＱ−ｌａｃＺ遺伝
子融合体を有しており、ガラクトシターゼ活性を持った
ハイブリッド蛋白質がｍａｌＰ遺伝子の上流のプロモー
ターからの転写により発現される］。この目的で、菌株
ｐｏｐ２２４９をｐＨＹＤ５０７によりトランスフォー
ムし、Ａｍｐｒトランスフォーム体をＬＢＯＮ−Ａｍｐ
プレートで選択した。次いでトランスフォーム体をＬＢ
ＯＮ系の培地でＴｅｔおよびＬａｃ表現型につきスクリ
ーニングした。大部分のトランスフォーム体はこれら条
件下でＬａｃ＋およびＴｅｔｓであったが、約１〜２％
はＴｅｔｒおよびＬａｃ−となった。それらは恐らく逆
相同組換現象によりｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体
をプラスミドから染色体に、また、ｍａｐプロモーター
を染色体からプラスミドにスイッチしたことによると思
われる。次いで後者のコロニー（これはＸ−ｇａｌおよ
びテトラサイクリンが補充されたＬＢＯＮ培地で白色で
あり、Ｔｅｔｒであるもの）を抗生物質アンピシリンお
よびテトラサイクリンの両者を含まないプレートで２回
にわたりサブ培養して自己のプラスミドを含まない分離
体を得た。これらはその後の試験でＡｍｐｓコロニーお
よびＴｅｔｓコロニーとして同定された。菌株はその後
にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体を有することが確
認され、これはプラスミドｐＧＫ２を有する誘導体の浸
透圧誘発に関してＳＳＢ蛋白質を過剰に発現しうること
が示された（ここでｓｓｂ遺伝子はファージＴ７ｍ１０
プロモーターの下流にクローン化されている：実施例４
参照）。この菌株をＧＪ１１５０と命名した。必要に応
じ、当業界で既に知られた（トランスポゾン・マーカー
・タッギング、ＧＪ１１５０からの遺伝子転移および相
同組換の）方法により、たとえばＢＬ２１もしくはＢ８
３４のような他の菌株のｍａｌＰＱ組込誘導体を作製す
ることができ、これらの誘導体はＧＪ１１５０のｍａｌ
ＰＱ座に存在する同じｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合
体を有している。
照：これはプラスミドｐＨＹＤ５０７からのｐｒｏＵｐ
−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体が染色体に組み込まれた菌株Ｇ
Ｊ１１５０の作製各工程を図示し、大部分の記号は図３
で説明した通りであるが、プラスミドおよび染色体にお
ける数字１および２は、２つのレプリコン間の推定され
る二重交差逆組換現象に対する基質として作用する相同
性の対の部位を示している）、プラスミドｐＨＹＤ５０
７からのｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合物を相同組換
により菌株ｐｏｐ２２４９のｍａｌＴＰＱ座に転移させ
た［この菌株ｐｏｐ２２４９もｍａｌＱ−ｌａｃＺ遺伝
子融合体を有しており、ガラクトシターゼ活性を持った
ハイブリッド蛋白質がｍａｌＰ遺伝子の上流のプロモー
ターからの転写により発現される］。この目的で、菌株
ｐｏｐ２２４９をｐＨＹＤ５０７によりトランスフォー
ムし、Ａｍｐｒトランスフォーム体をＬＢＯＮ−Ａｍｐ
プレートで選択した。次いでトランスフォーム体をＬＢ
ＯＮ系の培地でＴｅｔおよびＬａｃ表現型につきスクリ
ーニングした。大部分のトランスフォーム体はこれら条
件下でＬａｃ＋およびＴｅｔｓであったが、約１〜２％
はＴｅｔｒおよびＬａｃ−となった。それらは恐らく逆
相同組換現象によりｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体
をプラスミドから染色体に、また、ｍａｐプロモーター
を染色体からプラスミドにスイッチしたことによると思
われる。次いで後者のコロニー（これはＸ−ｇａｌおよ
びテトラサイクリンが補充されたＬＢＯＮ培地で白色で
あり、Ｔｅｔｒであるもの）を抗生物質アンピシリンお
よびテトラサイクリンの両者を含まないプレートで２回
にわたりサブ培養して自己のプラスミドを含まない分離
体を得た。これらはその後の試験でＡｍｐｓコロニーお
よびＴｅｔｓコロニーとして同定された。菌株はその後
にｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体を有することが確
認され、これはプラスミドｐＧＫ２を有する誘導体の浸
透圧誘発に関してＳＳＢ蛋白質を過剰に発現しうること
が示された（ここでｓｓｂ遺伝子はファージＴ７ｍ１０
プロモーターの下流にクローン化されている：実施例４
参照）。この菌株をＧＪ１１５０と命名した。必要に応
じ、当業界で既に知られた（トランスポゾン・マーカー
・タッギング、ＧＪ１１５０からの遺伝子転移および相
同組換の）方法により、たとえばＢＬ２１もしくはＢ８
３４のような他の菌株のｍａｌＰＱ組込誘導体を作製す
ることができ、これらの誘導体はＧＪ１１５０のｍａｌ
ＰＱ座に存在する同じｐｒｏＵｐ−Ｔ７ ＲＮＡＰ融合
体を有している。
【００４９】実施例４
浸透圧誘発によるＧＪ１１５０の誘導体におけるＥ．コ
リ（E. coli ）ＳＳＢ蛋白質の過剰産生 菌株ＧＪ１１５０をプラスミドｐＧＫ２でトランスフォ
ームし、これは選択マーカーとしてＡｍｐｒをコード
し、ファージＴ７ ｍ１０プロモーターの下流にＥ．コ
リ（E. coli ）ｓｓｂ遺伝子を有している。Ａｍｐｒト
ランスフォーム体を１００ｍＬの三角フラスコ中のＬＢ
ＯＮ−Ａｍｐ肉汁培地（ブロス）上で選択し、環境振と
う器で３７℃で１晩インキュベートした。翌日、培養物
を１０ｍＬの新鮮なＬＢＯＮ−Ａｍｐ培養液で１：５０
で希釈し、上記と同様にインキュベートした。培養物の
ＯＤ６００が約０．８の数値（約５×１０8 細胞／ｍＬ
の細胞密度に対応）に達したとき、培養物を２本の１０
０ｍＬフラスコに均等に分割し、その一方にはＮａＣｌ
を０．３Ｍの最終濃度まで（水中、５Ｍ原液から）添加
して浸透圧誘発を生ぜしめる、一方、他方のフラスコを
非誘発性の対照として用いた。その後、フラスコを環境
振とう器にて３７℃でさらに２時間インキュベートし、
その後に培養物中の細胞をベンチトップ型遠心分離器で
４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して収集した。２ｍ
Ｌの培養物から収集した細胞を０．５ｍＬの熱（約８０
℃）試料緩衝液に再び懸濁した。試料混合物を２分間煮
沸し、その後に試料を直ちに氷中に移し、次いで−２０
℃で貯蔵した。蛋白質のプロフィールを得るため、試料
を１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動し、標準法にしたがいクーマシーブル
ーで染色した。この手順により、ＧＪ１１５０／ｐＧＫ
２培養物にＮａＣｌを添加した後にＥ．コリ（E. coli
）のＳＳＢ蛋白質の調節された過剰な産生が明かに示
された。
リ（E. coli ）ＳＳＢ蛋白質の過剰産生 菌株ＧＪ１１５０をプラスミドｐＧＫ２でトランスフォ
ームし、これは選択マーカーとしてＡｍｐｒをコード
し、ファージＴ７ ｍ１０プロモーターの下流にＥ．コ
リ（E. coli ）ｓｓｂ遺伝子を有している。Ａｍｐｒト
ランスフォーム体を１００ｍＬの三角フラスコ中のＬＢ
ＯＮ−Ａｍｐ肉汁培地（ブロス）上で選択し、環境振と
う器で３７℃で１晩インキュベートした。翌日、培養物
を１０ｍＬの新鮮なＬＢＯＮ−Ａｍｐ培養液で１：５０
で希釈し、上記と同様にインキュベートした。培養物の
ＯＤ６００が約０．８の数値（約５×１０8 細胞／ｍＬ
の細胞密度に対応）に達したとき、培養物を２本の１０
０ｍＬフラスコに均等に分割し、その一方にはＮａＣｌ
を０．３Ｍの最終濃度まで（水中、５Ｍ原液から）添加
して浸透圧誘発を生ぜしめる、一方、他方のフラスコを
非誘発性の対照として用いた。その後、フラスコを環境
振とう器にて３７℃でさらに２時間インキュベートし、
その後に培養物中の細胞をベンチトップ型遠心分離器で
４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して収集した。２ｍ
Ｌの培養物から収集した細胞を０．５ｍＬの熱（約８０
℃）試料緩衝液に再び懸濁した。試料混合物を２分間煮
沸し、その後に試料を直ちに氷中に移し、次いで−２０
℃で貯蔵した。蛋白質のプロフィールを得るため、試料
を１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動し、標準法にしたがいクーマシーブル
ーで染色した。この手順により、ＧＪ１１５０／ｐＧＫ
２培養物にＮａＣｌを添加した後にＥ．コリ（E. coli
）のＳＳＢ蛋白質の調節された過剰な産生が明かに示
された。
【００５０】同じ手法により、さらに、ｐＧＫ２の代わ
りに適する置換されたプラスミドを用いて、Ｅ．コリ
（E. coli ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、
ファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリ（E. col
i ）のＲＮＡポリメラーゼのα−サブユニット、酵母Ｔ
ＡＴＡ−結合性蛋白質、ラットリンパ球蛋白質チロシン
ホスファターゼＰＴＰ−Ｓおよびヒト カリウム−チャ
ンネル蛋白質のトランケート体を過剰産生させることに
成功した。さらに、遺伝子発現、遺伝子調節（ｐｒｏＵ
の浸透圧調節を含む）およびプラスミドの複製と維持に
関してエンテロバクテヤシー（Enterobacteriaceae）科
の種々のメンバー中に存在する実質的に同じメカニズム
に鑑み、ここに記載した手法および構成物はエンテロバ
クテリアシー（Enterobacteriaceae）科内のいずれの細
菌菌株においてもヘテロロガス蛋白質の塩誘発性の過剰
産生を与えるものと予想される。
りに適する置換されたプラスミドを用いて、Ｅ．コリ
（E. coli ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、
ファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリ（E. col
i ）のＲＮＡポリメラーゼのα−サブユニット、酵母Ｔ
ＡＴＡ−結合性蛋白質、ラットリンパ球蛋白質チロシン
ホスファターゼＰＴＰ−Ｓおよびヒト カリウム−チャ
ンネル蛋白質のトランケート体を過剰産生させることに
成功した。さらに、遺伝子発現、遺伝子調節（ｐｒｏＵ
の浸透圧調節を含む）およびプラスミドの複製と維持に
関してエンテロバクテヤシー（Enterobacteriaceae）科
の種々のメンバー中に存在する実質的に同じメカニズム
に鑑み、ここに記載した手法および構成物はエンテロバ
クテリアシー（Enterobacteriaceae）科内のいずれの細
菌菌株においてもヘテロロガス蛋白質の塩誘発性の過剰
産生を与えるものと予想される。
【００５１】ここに示した実施例は単にたとえば本発明
に示した用途、方法、並びにたとえばＤＮＡ配列、ベク
ターおよび菌株のような産生物の例示に過ぎず、本発明
の実施はここに説明した実施例のみに限定されないこと
に注目すべきである。上記した実施例に対し当業界で既
に知られた材料を用いて或いは当業界で公知の方法によ
り得られる材料を用いて次の改変の１つもしくはそれ以
上を加えることにより本発明の他の構成を得ることがで
きる。
に示した用途、方法、並びにたとえばＤＮＡ配列、ベク
ターおよび菌株のような産生物の例示に過ぎず、本発明
の実施はここに説明した実施例のみに限定されないこと
に注目すべきである。上記した実施例に対し当業界で既
に知られた材料を用いて或いは当業界で公知の方法によ
り得られる材料を用いて次の改変の１つもしくはそれ以
上を加えることにより本発明の他の構成を得ることがで
きる。
【００５２】（ｉ） ｐｒｏＵのｃｉｓ調節要素はＥ．
コリ（E. coli ）もしくはサルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）から或いはＥ．コリ（E. c
oli）のｐｒｏＵ配列がＤＮＡ−ＤＮＡサザンブロット
・ハイブリッド化法やポリメラーゼ連鎖反応−増幅法に
より同定されるように充分な類似性を有しているエンテ
ロバクテリアシー（Enterobacteriaceae）科の他の菌種
から得ることができる。さらに、これら配列の突然変異
体またはネイティブなｐｒｏＵ配列と異なる長さの配列
または両者の組合せはｐｒｏＵプロモーターからの転写
による実質的な浸透圧誘発性を示し続け、これらも使用
することができる。
コリ（E. coli ）もしくはサルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）から或いはＥ．コリ（E. c
oli）のｐｒｏＵ配列がＤＮＡ−ＤＮＡサザンブロット
・ハイブリッド化法やポリメラーゼ連鎖反応−増幅法に
より同定されるように充分な類似性を有しているエンテ
ロバクテリアシー（Enterobacteriaceae）科の他の菌種
から得ることができる。さらに、これら配列の突然変異
体またはネイティブなｐｒｏＵ配列と異なる長さの配列
または両者の組合せはｐｒｏＵプロモーターからの転写
による実質的な浸透圧誘発性を示し続け、これらも使用
することができる。
【００５３】（ｉｉ） ｐｒｏＵとは異なる他のＮａＣ
ｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターも使用する
ことができる。これらプロモーターは従来技術で挙げた
ような他の公知のＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
の遺伝子のプロモーターとすることができ、或いは誘発
性もしくは非誘発性の増殖条件下でレポーター遺伝子融
合技術もしくは定量的ｍＲＮＡ決定法を用いる当業界で
知られた方法により同定することもできる。一旦、この
ようなＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の遺伝子が
同定されれば、各遺伝子のプロモーターは当業界で知ら
れた方法により得ることができる。
ｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターも使用する
ことができる。これらプロモーターは従来技術で挙げた
ような他の公知のＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性
の遺伝子のプロモーターとすることができ、或いは誘発
性もしくは非誘発性の増殖条件下でレポーター遺伝子融
合技術もしくは定量的ｍＲＮＡ決定法を用いる当業界で
知られた方法により同定することもできる。一旦、この
ようなＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性の遺伝子が
同定されれば、各遺伝子のプロモーターは当業界で知ら
れた方法により得ることができる。
【００５４】（ｉｉｉ） 上記の直接的手法を実施する
際し、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモータ
ーと標的遺伝子との間のオペロン融合物をプラスミドも
しくはファージを含む他のベクターでクローン化し、適
する宿主細菌に導入することができる。
際し、ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモータ
ーと標的遺伝子との間のオペロン融合物をプラスミドも
しくはファージを含む他のベクターでクローン化し、適
する宿主細菌に導入することができる。
【００５５】（ｉｖ） 上記の間接手法を実施する際
し、当業界で知られた他の転写−アクティベーター遺伝
子および／またはコグネート活性化プロモーターを用い
ることができ、これらはＲＮＡポリメラーゼの遺伝子お
よび当業界で知られた任意のＴ７関連ファージからのコ
グネートプロモーターを包含し［ハウスマン（Hausman
n）（１９８８）バクテリオファージ（Bacteriophage
s）中、Ｒ．カレンダー（Calendar）編）、プレナム・
プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、ＵＳＡ、第２
５９〜２８９頁］、特定の転写−アクティベーター蛋白
質により活性化されたコグネートプロモーターに融合さ
れた前記標的遺伝子によるものである。前記転写−アク
ティベーター遺伝子およびそのコグネート活性化プロモ
ーターは当業界で知られた方法により得ることができ、
次いで、前記新規な第２の組換構成物も当業界にて公知
の方法により作製することもできる。
し、当業界で知られた他の転写−アクティベーター遺伝
子および／またはコグネート活性化プロモーターを用い
ることができ、これらはＲＮＡポリメラーゼの遺伝子お
よび当業界で知られた任意のＴ７関連ファージからのコ
グネートプロモーターを包含し［ハウスマン（Hausman
n）（１９８８）バクテリオファージ（Bacteriophage
s）中、Ｒ．カレンダー（Calendar）編）、プレナム・
プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、ＵＳＡ、第２
５９〜２８９頁］、特定の転写−アクティベーター蛋白
質により活性化されたコグネートプロモーターに融合さ
れた前記標的遺伝子によるものである。前記転写−アク
ティベーター遺伝子およびそのコグネート活性化プロモ
ーターは当業界で知られた方法により得ることができ、
次いで、前記新規な第２の組換構成物も当業界にて公知
の方法により作製することもできる。
【００５６】（ｖ） 上記の間接的手法を実施する際
し、前記新規な組換構成物を適する宿主細菌に導入する
ためプラスミドもしくはファージを含む他のベクターで
クローン化することができる。同様に、前記新規な組換
構成物を菌株中のｍａｌＰＱ以外の染色体座に当業界で
知られた各種の任意の方法により組み込むこともできる
［ガッターソン（Gutterson ）およびコシュランド（Ko
shland）（１９８３）、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（Proc. Natl.Acad.
Sci. USA）、第８０巻、第４８９４〜４８９８頁；ウ
ィナンス（Winans）等（１９８５）、ジャーナル・バク
テリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１６１巻、第１２
１９〜１２２１頁；パーカー（Parker）およびマリヌス
（Marinus ）（１９８８）、ジーン（Gene）、第７３
巻、第５３１〜５３５頁；ハミルトン（Hamilton）等
（１９８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bac
teriol. ）、第１７１巻、第４６１７〜４６２２頁；ダ
イデリッヒ（Deiderich ）等（１９９２）、プラスミド
（Plasmid ）、第２８巻、第１４〜２４頁；スチード
（Steed ）およびワナー（Wanner）（１９９３）、ジャ
ーナル・バクテリオロジー（J.Bacteriol. ）、第１７
５巻、第６７９７〜６８０９頁］。
し、前記新規な組換構成物を適する宿主細菌に導入する
ためプラスミドもしくはファージを含む他のベクターで
クローン化することができる。同様に、前記新規な組換
構成物を菌株中のｍａｌＰＱ以外の染色体座に当業界で
知られた各種の任意の方法により組み込むこともできる
［ガッターソン（Gutterson ）およびコシュランド（Ko
shland）（１９８３）、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ（Proc. Natl.Acad.
Sci. USA）、第８０巻、第４８９４〜４８９８頁；ウ
ィナンス（Winans）等（１９８５）、ジャーナル・バク
テリオロジー（J. Bacteriol. ）、第１６１巻、第１２
１９〜１２２１頁；パーカー（Parker）およびマリヌス
（Marinus ）（１９８８）、ジーン（Gene）、第７３
巻、第５３１〜５３５頁；ハミルトン（Hamilton）等
（１９８９）、ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bac
teriol. ）、第１７１巻、第４６１７〜４６２２頁；ダ
イデリッヒ（Deiderich ）等（１９９２）、プラスミド
（Plasmid ）、第２８巻、第１４〜２４頁；スチード
（Steed ）およびワナー（Wanner）（１９９３）、ジャ
ーナル・バクテリオロジー（J.Bacteriol. ）、第１７
５巻、第６７９７〜６８０９頁］。
【００５７】（ｖｉ） 上記の直接的手法の実施に際
し、前記プロモーターがＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧
誘発性を示す任意の細菌を適する宿主菌株として使用す
ることができる。
し、前記プロモーターがＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧
誘発性を示す任意の細菌を適する宿主菌株として使用す
ることができる。
【００５８】（ｖｉｉ） 上記の間接的手法を実施する
際し、前記新規な組換構成物のプロモーターがＮａＣｌ
誘発性もしくは浸透圧誘発性を示し、前記転写−アクテ
ィベーター蛋白質が前記第２の組換体構成物の１部とし
て導入されたコグネートプロモーター配列のみから実質
的に転写を活性化するような任意の細菌は適する宿主菌
株として使用することができる。
際し、前記新規な組換構成物のプロモーターがＮａＣｌ
誘発性もしくは浸透圧誘発性を示し、前記転写−アクテ
ィベーター蛋白質が前記第２の組換体構成物の１部とし
て導入されたコグネートプロモーター配列のみから実質
的に転写を活性化するような任意の細菌は適する宿主菌
株として使用することができる。
【００５９】（ｖｉｉｉ） 上記の間接的手法を実施す
る際し、前記第２の組換構成物をプラスミドもしくはフ
ァージを含む各種のいずれかのベクターでクローン化す
ることができるし、また、当業界で公知の方法により宿
主菌株の染色体に組込むこともできる。
る際し、前記第２の組換構成物をプラスミドもしくはフ
ァージを含む各種のいずれかのベクターでクローン化す
ることができるし、また、当業界で公知の方法により宿
主菌株の染色体に組込むこともできる。
【００６０】（ｉｘ） 標的遺伝子は実施例にあげた以
外の蛋白質やポリペプチドを含むいずれかのヘテロロガ
ス遺伝子産物をコードすることができ、前記標的遺伝子
は当業界で公知の方法により入手することができる。本
発明で説明した方法を用いて特に、Ｅ．コリ（E. coli
）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ファージＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリ（E. coli ）のＲＮＡ
ポリメラーゼのα−サブユニット、酵母のＴＡＴＡ−結
合性蛋白質、ラットのリンパ球蛋白質チロシンホスファ
ターゼＰＴＰ−Ｓおよびヒトのカリウム−チャンネル蛋
白質のトランケート体を過剰産生することに成功した。
さらに、従来技術の方法を用いた過剰産生ではＥ．コリ
（E. coli ）中に細胞内封入体を形成する或る種の蛋白
質が、本発明で説明したＮａＣｌ誘発性の過程による過
剰産生では可溶性のまま残るという証拠も得られた。
外の蛋白質やポリペプチドを含むいずれかのヘテロロガ
ス遺伝子産物をコードすることができ、前記標的遺伝子
は当業界で公知の方法により入手することができる。本
発明で説明した方法を用いて特に、Ｅ．コリ（E. coli
）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ファージＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリ（E. coli ）のＲＮＡ
ポリメラーゼのα−サブユニット、酵母のＴＡＴＡ−結
合性蛋白質、ラットのリンパ球蛋白質チロシンホスファ
ターゼＰＴＰ−Ｓおよびヒトのカリウム−チャンネル蛋
白質のトランケート体を過剰産生することに成功した。
さらに、従来技術の方法を用いた過剰産生ではＥ．コリ
（E. coli ）中に細胞内封入体を形成する或る種の蛋白
質が、本発明で説明したＮａＣｌ誘発性の過程による過
剰産生では可溶性のまま残るという証拠も得られた。
【００６１】（ｘ） 宿主細胞の原形質膜に対し実質的
に不浸透性であり、前記宿主細胞に対し浸透圧的に活性
を有する物質（総合して、ここでは「オスモライト」と
称した）で構成される単独物質もしくは混合物を、前記
ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターから
の転写を誘発させるように、ＮａＣｌの代わりに用いる
ことができる。
に不浸透性であり、前記宿主細胞に対し浸透圧的に活性
を有する物質（総合して、ここでは「オスモライト」と
称した）で構成される単独物質もしくは混合物を、前記
ＮａＣｌ誘発性もしくは浸透圧誘発性プロモーターから
の転写を誘発させるように、ＮａＣｌの代わりに用いる
ことができる。
【００６２】（ｘｉ） 上記の間接的手法の実施におい
て説明した２−列の調節カスケードの変種として、多−
列調節カスケードも用いることができ、ここでは前記新
規な組換構成物は最初の列を構成している。
て説明した２−列の調節カスケードの変種として、多−
列調節カスケードも用いることができ、ここでは前記新
規な組換構成物は最初の列を構成している。
【００６３】さらに本発明の実施は限定はしないが組換
ＤＮＡ取扱およびトランスフォームの方法；低オスモラ
リティー増殖培地の組成や容積；並びに上記したＮａＣ
ｌもしくは他のオスモライトによる誘発での添加時、最
終濃度または持続時間を包含している。
ＤＮＡ取扱およびトランスフォームの方法；低オスモラ
リティー増殖培地の組成や容積；並びに上記したＮａＣ
ｌもしくは他のオスモライトによる誘発での添加時、最
終濃度または持続時間を包含している。
【００６４】
【発明の効果】本発明によると、たとえはＥ．コリ（E.
coli ）のような細菌でクローン化された遺伝子産物の
調節された過剰発現が達成でき、ベクターおよび適する
宿主菌株を包含する効率的な代替方法が提供される。
coli ）のような細菌でクローン化された遺伝子産物の
調節された過剰発現が達成でき、ベクターおよび適する
宿主菌株を包含する効率的な代替方法が提供される。
【図１】Ｅ．コリ（E. coli ）ｐｒｏＵ配列の位置３７
６〜１６３１を含むプラスミドｐＨＹＤ２７２からのＳ
ａｃＩ断片のヌクレオチド配列を示す図である。ｐｒｏ
Ｕ配列の２つの末端は対応するヌクレオチドの数の規定
によりマークし、断片のＳａｃＩ末端および位置１０４
５−１０５０におけるＮｄｅＩ部位には上線を施してあ
る。
６〜１６３１を含むプラスミドｐＨＹＤ２７２からのＳ
ａｃＩ断片のヌクレオチド配列を示す図である。ｐｒｏ
Ｕ配列の２つの末端は対応するヌクレオチドの数の規定
によりマークし、断片のＳａｃＩ末端および位置１０４
５−１０５０におけるＮｄｅＩ部位には上線を施してあ
る。
【図２】ｐＧＥＭ３Ｚ由来のプラスミドｐＨＹＤ５１３
およびｐＨＹＤ５１４の物理的マップを示す図面であ
る。ｐｒｏＵｐ「カセット」の上流および下流で利用で
きる独特な制限部位を示し、ｐｒｏＵｐからの転写方向
を上側の矢印によって示し、両プラスミドはｐＨＹＤ５
１３におけるｐｒｏＵｐ内のＮｄｅＩ部位の変異を除き
同一である。
およびｐＨＹＤ５１４の物理的マップを示す図面であ
る。ｐｒｏＵｐ「カセット」の上流および下流で利用で
きる独特な制限部位を示し、ｐｒｏＵｐからの転写方向
を上側の矢印によって示し、両プラスミドはｐＨＹＤ５
１３におけるｐｒｏＵｐ内のＮｄｅＩ部位の変異を除き
同一である。
【図３】プラスミドｐＨＹＤ５０１の構造およびｐＨＹ
Ｄ５０１からプラスミドｐＨＹＤ５０３を作製する工程
を説明するための図である。矢印は異なるプロモーター
からの転写の範囲および方向を示し、ベクター上のマー
カー遺伝子の転写は示さず、各ＤＮＡ分子におけるＥｃ
ｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位の位置をマ
ークし、円弧はｐＨＹＤ５０３の形成に使用したｐＨＹ
Ｄ５０１の断片を示している。
Ｄ５０１からプラスミドｐＨＹＤ５０３を作製する工程
を説明するための図である。矢印は異なるプロモーター
からの転写の範囲および方向を示し、ベクター上のマー
カー遺伝子の転写は示さず、各ＤＮＡ分子におけるＥｃ
ｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限部位の位置をマ
ークし、円弧はｐＨＹＤ５０３の形成に使用したｐＨＹ
Ｄ５０１の断片を示している。
【図４】プラスミドｐＨＹＤ５０３からプラスミドｐＨ
ＹＤ５０７を作製する工程を説明するための図である。
用いた記号は図３における記号と同じである。
ＹＤ５０７を作製する工程を説明するための図である。
用いた記号は図３における記号と同じである。
【図５】プラスミドｐＨＹＤ５０７からのｐｒｏＵｐ−
Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体が染色体に組み込まれた菌株ＧＪ
１１５０の作製各工程を説明するための図である。大部
分の記号は図３で説明した通りであるが、プラスミドお
よび染色体における数字１および２は、２つのレプリコ
ン間の推定される二重交差逆組換現象に対する基質とし
て作用する相同性の対の部位を示している。
Ｔ７ ＲＮＡＰ融合体が染色体に組み込まれた菌株ＧＪ
１１５０の作製各工程を説明するための図である。大部
分の記号は図３で説明した通りであるが、プラスミドお
よび染色体における数字１および２は、２つのレプリコ
ン間の推定される二重交差逆組換現象に対する基質とし
て作用する相同性の対の部位を示している。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(73)特許権者 596128492
デパートメント オブ バイオテクノロ
ジー、ミニストリー オブ サイエンス
アンド テクノロジー、 ガヴァメン
ト オブ インディア
インド国 110 003 ニューデリー ロ
ディ ロード スィージーオー コンプ
レックス ７−８ フローア ブロック
−２
(72)発明者 ジャヤラマン ゴウリシャンカル
インド国 500 007 ハイデラバード
センター フォア セリュラー アンド
マレキュラー バイオロジー （番地
なし)
(72)発明者 プーナン バンダリ
インド国 500 007 ハイデラバード
センター フォア セリュラー アンド
マレキュラー バイオロジー （番地
なし)
(72)発明者 カヴェティ ラジュクマリ
インド国 500 007 ハイデラバード
センター フォア セリュラー アンド
マレキュラー バイオロジー （番地
なし)
(56)参考文献 特開 昭61−100197（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−506302（ＪＰ，Ａ)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｇ．1995），177
（15），ｐ．4508−4513
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎ．1995），177
（１），ｐ．144−151
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ（1989），３（８），ｐ.
1011−1023
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ，ＵＳＡ（1985），ｐ．82（４）,
ｐ．1074−1078
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (25)
- 【請求項１】 組換ＤＮＡ構成物であって、該構成物
は、 細菌中で複製しうるか、または細菌の染色体に組込みう
るプラスミドもしくはバクテリオファージベクター； 第１の細菌プロモーター； ＮａＣｌの濃度もしくは他のオスモライトの濃度に呼応
して細菌中で前記第１のプロモーターからの転写を調節
するｃｉｓ調節要素；及び、 転写−アクティベーター蛋白質をコードするＤＮＡとを
含み、 前記第１のプロモーターは前記転写−アクティベーター
蛋白質をコードするＤＮＡの発現を指令するように前記
構成物中に配置され、前記ｃｉｓ調節要素は前記細菌に
て前記第１のプロモーターからの発現を調節するように
前記構成物中に配置される、前記組換ＤＮＡ構成物。 - 【請求項２】 前記細菌プロモーター及びｃｉｓ調節要
素が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の
ｐｒｏＵ ＤＮＡ配列由来であるか、または大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｐｒｏＵ ＤＮＡ
配列に対して１または数個の核酸の置換、挿入、欠失及
び／または付加を有し、且つｐｒｏＵＤＮＡ配列の転写
調整機能を有するＤＮＡ配列に由来する請求項１に記載
の組換ＤＮＡ構成物。 - 【請求項３】 転写−アクティベーター蛋白質が酵素的
に活性なバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ
である請求項１に記載の組換ＤＮＡ構成物。 - 【請求項４】 請求項３に記載の組換ＤＮＡ構成物であ
って、該構成物はＢａｍＨＩ−末端化したＤＮＡ断片か
らなり、該断片は、 （ｉ） ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片上にプラスミドｐＨ
ＹＤ５１３から得られる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）のｐｒｏＵのｃｉｓ調節要素を含み、該
ｃｉｓ調節要素は、 （ｉｉ） 酵素的に活性なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを
コードするＤＮＡセグメントにｃｉｓで結合し、 該ＤＮＡセグメントはプラスミドｐＨＹＤ５０１からＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断して得られる２種の断片の大き
い方に存在し、さらに前記ＢａｍＨＩ−末端化したＤＮ
Ａ断片はプラスミドｐＨＹＤ５０３から得られることを
特徴とする、前記ＤＮＡ構成物。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組
換ＤＮＡ構成物である第１のヘテロロガスＤＮＡ要素に
よりトランスフォームされた細菌細胞。 - 【請求項６】 第１のヘテロロガスＤＮＡ要素の１部と
してまたはそれとは分離した第２のヘテロロガスＤＮＡ
要素をさらに含んでなり、ただし、該第２のＤＮＡ要素
は前記第１のＤＮＡ要素から発現される転写−アクティ
ベーター蛋白質に呼応する第２のプロモーターの制御下
で発現するように配置された所望の遺伝子産物をコード
するＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の細
菌細胞。 - 【請求項７】 転写−アクティベーター蛋白質が酵素的
に活性なバクテリオファージ Ｔ７のＲＮＡポリメラー
ゼであり、第２のプロモーターがバクテリオファージＴ
７のプロモーターである請求項６に記載の細菌細胞。 - 【請求項８】 第２のプロモーターがｍ１０ バクテリ
オファージ Ｔ７プロモーターである請求項７に記載の
細菌細胞。 - 【請求項９】 組換ＤＮＡ構成物が（ｉ）細菌染色体に
組込まれているか、または（ｉｉ）前記細菌内で自律複
製することができる組換プラスミドもしくはファージベ
クターとして存在する請求項５に記載の細菌細胞。 - 【請求項１０】 細菌がエンテロバクテリアシー（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科のメンバーであ
る請求項５に記載の細菌細胞。 - 【請求項１１】 細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）種のメンバーである請求項１０に記載の
細菌細胞。 - 【請求項１２】 ＲＮＡもしくはポリペプチドである有
用な遺伝子産物をコードするヘテロロガス遺伝子を発現
する方法であって、 （ａ） 請求項６に記載の細菌細胞を用意し、 （ｂ） まず、前記細菌細胞の培養物を低オスモラリテ
ィーの培地で増殖し、 （ｃ） 次いで、ＮａＣｌまたは他のオスモライトを前
記培養物に添加して有用な遺伝子産物の合成を誘発し、 （ｄ） 前記有用な遺伝子産物を分離する工程を含むヘ
テロロガス遺伝子の発現方法。 - 【請求項１３】 第１のヘテロロガスＤＮＡ要素がプラ
スミドｐＨＹＤ５０３から得られるＢａｍＨＩ−末端化
したＤＮＡ断片を含み、該ＤＮＡ断片は、 （ｉ） ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片上にプラスミドｐＨ
ＹＤ５１３から得られる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）のｐｒｏＵ由来のｃｉｓ調節要素を含
み、この調節要素は、 （ｉｉ） 酵素的に活性なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを
コードする配列を有し、且つプラスミドｐＨＹＤ５０１
からＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断をして得られる２種の断
片の大きい方として存在するＤＮＡセグメントにｃｉｓ
で結合していることを特徴とする請求項１２に記載の方
法。 - 【請求項１４】 細胞がエンテロバクテリアシー（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科の細菌種のもの
である請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１５】 細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）種のものである請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１６】 細菌細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）種のものであり、ＢａｍＨＩ−末端
化したＤＮＡ断片が染色体上のｍａｌＰＱ座に組込まれ
ている請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１７】 細菌細胞がＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ
）菌株ＧＪ１１５０のものである請求項１６に記載の
方法。 - 【請求項１８】 請求項４に記載のＢａｍＨＩ−末端化
したＤＮＡ断片が染色体のｍａｌＰＱ座に組込まれた大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株ＧＪ１
１５０。 - 【請求項１９】 ヘテロロガス遺伝子を発現する組換Ｄ
ＮＡを有するトランスフォームされた細菌を得る方法で
あって、 （ａ） 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換ＤＮ
Ａ構成物を用意し、 （ｂ） 該構成物を安定に維持することができる細菌中
に前記組換ＤＮＡ構成物をトランスフォームし、 （ｃ） 前記組換ＤＮＡ構成物を有するクローンを同定
し、 （ｄ） 前記組換ＤＮＡ構成物が（ｉ）細菌染色体に組
み込まれているか、または、（ｉｉ）前記宿主細菌内で
自律複製できる組換プラスミドもしくはファージベクタ
ーとして存在する、トランスフォームされた細菌を得る
工程を含む、トランスフォームされた細菌を得る方法。 - 【請求項２０】 前記細菌プロモーター及びｃｉｓ調節
要素が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
のｐｒｏＵ ＤＮＡ配列由来であるか、または大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｐｒｏＵ Ｄ
ＮＡ配列に対して１または数個の核酸の置換、挿入、欠
失及び／または付加を有し、且つｐｒｏＵ ＤＮＡ配列
の転写調整機能を有するＤＮＡ配列に由来する請求項１
９に記載の方法。 - 【請求項２１】 転写−アクティベーター蛋白質が酵素
的に活性なバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラー
ゼである請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２２】 次の工程を備える請求項１９に記載の
方法であって、 Ｉ． 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換ＤＮＡ
構成物を、以下の工程： （ａ） プロモーターと、適切な宿主細菌内において該
プロモーターからのＮａＣｌもしくは浸透圧誘発性の転
写開始を可能にするｃｉｓ調節要素とを一緒にコードす
る配列を持った第１のＤＮＡセグメントを得て、これを
クローニングする； （ｂ） 転写−アクティベーター蛋白質をコードする配
列を有する第２のＤＮＡセグメントと前記第１のＤＮＡ
セグメントとを結合する、ただし該結合は、前記組換Ｄ
ＮＡ構成物を有している宿主細菌誘導体中での前記蛋白
質の合成が前記プロモーターから開始される転写に依存
するように行い、且つ、該結合は、前記組換ＤＮＡ構成
物がプラスミドもしくはファージのようなベクターのＤ
ＮＡ配列と共有結合的に隣接するように行なう； （ｃ） 前記ベクターが自律的に複製して維持されるよ
うな適切な菌株に上記の結合混合物をトランスフォーム
する；及び （ｄ） ヘテロロガスな遺伝子のＮａＣｌまたはオスモ
ライト誘導性発現を行なわせ得る組換ＤＮＡ構成物を有
するクローンを同定する； により調製し、及び ＩＩ． 前記組換ＤＮＡ構成物を（ｉ）細菌染色体に組
込んでいるか、または、前記組換ＤＮＡ構成物を（ｉ
ｉ）前記宿主細菌内で自律複製することができる組換プ
ラスミドもしくはファージベクターとして有している、
トランスフォームされた細菌誘導体を得ることを含む、
トランスフォームされた細菌を得る方法。 - 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法であって、 Ａ． 組換ＤＮＡ構成物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）のｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ融合体であり； Ｂ． 細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）であり； Ｃ． 第１のＤＮＡセグメントは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｐｒｏＵｃｉｓ調節要素
を有し、且つＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断によりプラスミ
ドｐＨＹＤ５１３もしくはｐＨＹＤ５１４から得られる
ものであり；第２のＤＮＡセグメントは、酵素的に活性
なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列を有し、
且つプラスミドｐＨＹＤ５０１に存在するものであり；
前記組換ＤＮＡ構成物は、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−末端
化した第１のＤＮＡセグメントを、プラスミドｐＨＹＤ
５０１をＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ切断して得られた２つの
断片の大きい方の断片と結合させることにより得られ；
さらに前記組換ＤＮＡ構成物を有するｐＨＹＤ５０３の
ようなプラスミドは、結合混合物による適切な菌株のト
ランスフォームの後のテトラサイクリン耐性での選択に
よって同定されることを特徴とする、トランスフォーム
された細菌を得る方法。 - 【請求項２４】 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）の染色体のｍａｌＰＱ座への請求項４に記載の
組換ＤＮＡ構成物の組込体を得る方法であって、 （ａ） ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合体を
有し、プラスミドｐＨＹＤ５０３から得られたＢａｍＨ
Ｉ−末端化したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ−切断を行った
ｐＯＭ４１ ＤＮＡと結合し、 （ｂ） 挿入物上のｐｒｏＵ プロモーターがｐＯＭ４
１におけるプロモーターなしでのｔｅｔ遺伝子と同じ方
向に転写される、ｐＨＹＤ５０７のような組換プラスミ
ドを同定し； （ｃ） 前記組換プラスミドで菌株ｐｏｐ２２４９をト
ランスフォームし、テトラサイクリン耐性、アンピシリ
ン耐性および低オスモラリティーでＬａｃ−である誘導
体を同定し、ｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ融合
構成物は逆相同組換によりｍａｌＰＱ座に移行され、 （ｄ） 次いで、ｐＯＭ４１由来プラスミドのレプリコ
ンが自然に消失した後で、アンピシリン耐性およびテト
ラサイクリン耐性マーカーを喪失している、たとえばＧ
Ｊ１１５０のような組込体コロニーを同定することを備
える組換ＤＮＡ構成物の組込み体を得る方法。 - 【請求項２５】 組込まれたｐｒｏＵ−Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼ融合構成物を有するｍａｌＰＱ座を、遺伝子
転移および相同組換により一の組込体菌株から大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の他の菌株に転
移させることをさらに含む請求項２４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN2055DE1995 IN192399B (ja) | 1995-11-10 | 1995-11-10 | |
| IN2055/DEL/95 | 1995-11-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234083A JPH09234083A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3375830B2 true JP3375830B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=11092760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23086096A Expired - Fee Related JP3375830B2 (ja) | 1995-11-10 | 1996-08-30 | ｃｉｓ調節要素と一緒にプロモーターをコードするＤＮＡの使用およびペプチドを産生させる新規な方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3375830B2 (ja) |
| IN (1) | IN192399B (ja) |
-
1995
- 1995-11-10 IN IN2055DE1995 patent/IN192399B/en unknown
-
1996
- 1996-08-30 JP JP23086096A patent/JP3375830B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｇ．１９９５），１７７（１５），ｐ．４５０８−４５１３ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎ．１９９５），１７７（１），ｐ．１４４−１５１ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），３（８），ｐ．１０１１−１０２３ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ（１９８５），ｐ．８２（４），ｐ．１０７４−１０７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IN192399B (ja) | 2004-04-10 |
| JPH09234083A (ja) | 1997-09-09 |
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