CN109486848B - 一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用。本发明利用DNA组装技术和组成型启动子驱动的过表达策略,实现了大环内酯类生物杀虫剂多杀菌素的高效异源表达。本发明将多杀菌素合成途径中的23个基因按功能分为五组,分别置于不同组成型强启动子的控制下,构建了102.6kb的人工基因簇,经反转录PCR分析,多杀菌素生物合成的23个基因共分为7个操纵子,与原始基因簇相比,人工基因簇在异源宿主白色链霉菌J1074中的多杀菌素产量提高了328倍。本发明建立的多操纵子人工基因簇策略为次级代谢产物的合成生物学研究提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用,属于基因工程技术领域。
背景技术
多杀菌素(spinosyn A和D的混合物)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经次级代谢产生的一种高效广谱的大环内酯类生物杀虫剂。多杀菌素由一个21碳四环内酯骨架、一个福乐糖胺残基和一个鼠李糖残基三部分构成。刺糖多孢菌发酵产生的多杀菌素类化合物中,含量最高是spinosyn A和D。由于多杀菌素的杀虫机制独特,对哺乳动物毒性低,而且在环境中能较快的被降解等优势,在1999年获得美国“总统绿色化学挑战奖”。
在刺糖多孢菌中,多杀菌素的生物合成共涉及23个基因,其中19个基因成簇排列在74kb的基因簇中:包括聚酮合酶基因spnA,spnB,spnC,spnD和spnE;聚酮交联基因spnF,spnJ,spnL和spnM;福乐糖胺合成基因spnO,spnN,spnQ和spnR;福乐糖胺甲基转移酶基因spnS;鼠李糖基转移酶基因spnG;福乐糖基转移酶基因spnP以及三个鼠李糖甲基化酶基因spnH,spnI和spnK。负责TDP-L-鼠李糖合成的四个基因(gtt,gdh,epi和kre)分散分布在染色体的3个位点上。在刺糖多孢菌中,次级代谢途径与细胞壁合成共用一套鼠李糖合成基因。另外,gtt和gdh基因也同时催化TDP-福乐糖胺合成途径的前两步反应。Spinosyn A的生物合成起始于聚酮合酶和交联酶催化9个乙酸单位和2个丙酸单位缩合交联生成21-碳四环糖苷配基。随后,TDP-鼠李糖连接到糖苷配基上,并被三氧甲基化形成拟糖苷配基。最后,二甲胺基福乐糖胺连接到拟糖苷配基生成spinosyn A。Spinosyn D和A的区别是C6上的取代基不同,spinosyn D为CH3,spinosyn A为H,这是因为聚酮合酶的第八个延伸模块的酰基转移酶在合成spinosyn D时结合丙酸单位,而在合成spinosyn A时结合乙酸单位。迄今为止,已从刺糖多孢菌发酵液中分离鉴定到了20多种多杀菌素衍生物,它们在两个脱氧糖基和四环内酯骨架上各有不同的取代模式。
目前科学家们已经通过诱变育种、发酵条件优化和基因工程育种等传统方法优化刺糖多孢菌的多杀菌素产量,但是远未达到低成本工业化生产的要求。因此急需开发新的多杀菌素高产策略。2016年,Huang等人将4个柯斯质粒组装成完整的多杀菌素基因簇,并整合到红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)染色体上,再通过紫外诱变和部分基因的过表达,使多杀菌素在红色糖多孢菌中的产量达到了830mg.L-1(参考文献:Huang,J.etal.High level of spinosad production in the heterologous hostSaccharopolyspora erythraea.Appl.Environ.Microbiol.82,5603-11(2016).)。2017年,Tan等人通过构建BAC文库获得了完整的多杀菌素基因簇,并通过在链霉菌宿主中异源表达,找到了多杀菌素生物合成的三个限速步骤。随后,通过逐步过表达脱氧糖合成基因、鼠李糖2'-O-甲基转移酶基因spnI和PKS基因spnE,成功将多杀菌素在白色链霉菌(Streptomyces albus)J1074中的产量提高到了1.4mg.L-1(参考文献:Tan,G.Y.etal.Heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketidesynthase gene cluster reconstitution in Streptomyces.ACS Synth.Biol.6,995-1005(2017).)。
为了在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中激活沉默基因簇,Luo等人和Shao等人成功应用DNA组装技术和放线菌来源的组成型或诱导型启动子改造基因簇,使生物合成基因的表达与原有的调控机制解偶联,依次来研究沉默基因簇合成的化合物(参考文献:Luo,Y.et al.Activation and characterization of a cryptic polycyclictetramate macrolactam biosynthetic gene cluster.Nat.Commun.4,2894(2013);Shao,Z.et al.Refactoring the silent spectinabilin gene cluster using a plug-and-play scaffold.ACS Synth.Biol.2,662-9(2013).)。为了进一步便于上述策略的应用,Luo等人从白色链霉菌J1074的32个组成型启动子中筛选到10个比红霉素启动子(ermE*p)活性高的强启动子(参考文献:Luo,Y.,Zhang,L.,Barton,K.W.&Zhao,H.Systematicidentification of a panel of strong constitutive promoters from Streptomycesalbus.ACS Synth.Biol.4,1001-10(2015).)。这些组成型强启动子除了应用于激活沉默基因簇,还可以用于多种链霉菌中生物合成途径的优化。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用。
术语说明:
ExoCET技术:使用第一核酸外切酶处理两个或两个以上目标核酸分子,然后使处理后的目标核酸分子在第二核酸外切酶和退火蛋白的存在下进行同源重组,其中发生同源重组的目标核酸分子之间共享至少一段序列同源区域。
Gibson组装克隆技术:使用核酸外切酶处理两个或两个以上目标核酸分子使其进行同源重组,其中发生同源重组的目标核酸分子之间共享至少一段序列同源区域。
RecET重组技术:全长的Rac噬菌体重组蛋白RecE和RecT能够在大肠杆菌细胞内高效地介导线性DNA分子之间发生同源重组,其中RecE是5'-3'核酸外切酶,RecT是单链DNA退火蛋白。
Redαβ重组技术:λ噬菌体重组蛋白Redα和Redβ可以在大肠杆菌细胞内高效介导线性DNA和环状DNA之间发生同源重组,其中Redα是5'-3'核酸外切酶,Redβ是单链DNA退火蛋白。
以上技术均为现有技术。
本发明的技术方案如下:
一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法,步骤如下:
(1)以刺糖多孢菌DSM44228的基因组DNA为模板,XbaI、HpaI双酶切得71.3kbXbaI-HpaI片段和19.4kb HpaI片段,将71.3kb XbaI-HpaI片段克隆到pBeloBAC11载体构建得重组质粒载体pBAC-spn71XH;将19.4kb HpaI片段克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-spn19H;
(2)将鼠李糖合成基因gtt,gdh-kre,epi和卡那霉素抗性基因neo克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-Rhaneo;将pBR322-Rhaneo与步骤(1)中的pBR322-spn19H重组得重组质粒载体pBR322-spnERhaneo;
(3)将步骤(1)中得到的pBAC-spn71XH与步骤(2)得到的pBR322-spnERhaneo重组得含有完整多杀菌素生物合成基因簇的BAC载体pBAC-spn;将apra-oriT-attP-phiC31int基因盒与pBAC-spn经重组得大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra;
(4)将多杀菌素生物合成基因spnJ,spnM,spnF,spnL,gtt,gdh,epi,kre,spnG,spnI,spnK,spnH,spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS,白色链霉菌J1074的组成型强启动子SA15p,SA2p,SA6p,SA31p,SA13p,氯霉素抗性基因cm,与pBR322-amp-ccdB载体经多片段组装得重组质粒载体pBR322-spnFSRhaNEW;
(5)以氨苄青霉素抗性基因amp和潮霉素抗性基因hyg分别替换步骤(3)中pBAC-spn-phiC31-para中的spnF-spnS基因和鼠李糖合成基因得重组质粒载体pBAC-spnAE-hyg-amp,将步骤(4)得到的pBR322-spnFSRhaNEW插入到pBAC-spnAE-hyg-amp中spnA的上游,得到含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒pBAC-spnNEW。
根据本发明优选的,步骤(1)中所述71.3kb XbaI-HpaI片段包括多杀菌素生物合成基因spnA,spnB,spnC,spnD,spnE,spnF,spnJ,spnL,spnM,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS,spnG,spnP,spnH,spnI和spnK;所述19.4kb HpaI片段包括spnE基因的部分片段。
根据本发明优选的,步骤(1)中所述克隆采用ExoCET技术。
根据本发明优选的,步骤(2)中所述克隆采用Gibson组装克隆技术;所述pBR322-Rhaneo与步骤(1)中的pBR322-spn19H重组采用RecET重组技术。
根据本发明优选的,步骤(3)中所述重组为Redαβ重组技术。
根据本发明优选的,步骤(4)中所述spnO、spnN、spnQ、spnR、spnS在组成型强启动子SA13p的控制下形成操纵子;所述spnI、spnK、spnH、spnP在组成型强启动子SA31p的控制下形成操纵子;所述gtt、gdh、epi、kre、spnG在组成型强启动子SA2p的控制下形成操纵子;所述spnJ、spnM、spnF、spnL在组成型强启动子SA6p的控制下形成操纵子;所述cm位于组成型强启动子SA6p的上游,并与组成型强启动子SA15p串联;每个操纵子中,基因按照参与多杀菌素生物合成的顺序排列。
根据本发明优选的,步骤(4)中所述多片段组装采用ExoCET技术。
根据本发明优选的,步骤(5)中所述替换和插入均采用Redαβ重组技术。
根据本发明优选的,步骤(5)中所述spnA的上游为pBR322-spnFSRhaNEW中的组成型强启动子SA15p。
按照上述构建方法构建得到的含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒。
上述含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒在构建高产多杀菌素工程菌中的应用。
根据本发明优选的,所述应用包括步骤:将含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒通过接合转移转化到宿主菌中,筛选鉴定阳性转化子。
进一步优选的,所述宿主菌为天蓝色链霉菌CH999,变铅青链霉菌链霉菌K4-114或白色链霉菌J1074。
进一步优选的,所述工程菌的宿主菌为白色链霉菌J1074。
上述高产多杀菌素工程菌在发酵生产多杀菌素中的应用。
根据本发明优选的,上述应用包括步骤:将高产多杀菌素工程菌接种于发酵培养基中进行发酵培养。
进一步优选的,所述发酵培养基为M1培养基或Tan的发酵培养基;最优选的,所述发酵培养基为Tan的发酵培养基;
其中M1培养基的组分为:1%淀粉,0.4%酵母提取物,0.2%蛋白胨,均为质量百分比;
Tan的发酵培养基组分为:4%葡萄糖,1%甘油,3%可溶性淀粉,1.5%大豆胨,1%牛肉膏,0.65%蛋白胨,0.05%酵母提取物,0.1%硫酸镁,0.2%氯化钠,0.24%碳酸钙,均为质量百分比。
本发明未做详细说明的实验方法,均为本领域常规技术操作。
有益效果:
本发明利用DNA组装技术和组成型启动子驱动的过表达策略,实现了大环内酯类生物杀虫剂多杀菌素的高效异源表达。本发明将多杀菌素合成途径中的23个基因按功能分为五组,分别置于不同组成型强启动子的控制下,构建了102.6kb的人工基因簇,经反转录PCR分析,多杀菌素生物合成的23个基因共分为7个操纵子,与原始基因簇相比,人工基因簇在异源宿主白色链霉菌J1074中的多杀菌素产量提高了328倍。本发明建立的多操纵子人工基因簇策略为次级代谢产物的合成生物学研究提供了新方法。
附图说明
图1为带有全套多杀菌素生物合成基因的大肠杆菌链霉菌穿梭载体pBAC-spn-phiC31-apra的构建流程图;
图2为pBAC-spn71XH和pBR322-spn19H的PstI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注;
图3为Gibson组装构建的pBR322-Rhaneo的PvuI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注;
图4为pBR322-spnERhaneo的BamHI和SphI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注,第8泳道是pBR322-spn19H;
图5为pBAC-spn和pBAC-spn-phiC31-apra的PstI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注,右图中第9泳道是pBAC-spn;
图6为含有全套多杀菌素生物合成基因的链霉菌工程菌在M1培养基中发酵产物的HPLC-MS检测谱图,
其中,SL为变铅青链霉菌K4-114,spn-SL为含有多杀菌素基因簇的变铅青链霉菌K4-114;SC为天蓝色链霉菌CH999,spn-SC为含有多杀菌素基因簇的天蓝色链霉菌CH999;SA为白色链霉菌J1074,spn-SA为含有多杀菌素基因簇的白色链霉菌J1074;
图7为白色链霉菌J1074在Tan的培养基中产生的多杀菌素的HPLC-MS检测谱图,
其中,STD代表多杀菌素标准品;SA代表白色链霉菌J1074;spn-SA代表整合完整多杀菌素生物合成基因的白色链霉菌J1074;
图8为多杀菌素标准品和白色链霉菌J1074产生的多杀菌素的二级质谱图,
其中,上为spinosyn A,下为spinosyn D。荷质比为142.1和189.1的片段离子分别为福乐糖胺和三甲基鼠李糖的特征片段;
图9为将多杀菌素生物合成基因和启动子通过DNA多片段组装形成pBR322-spnFSRhaNEW的流程图,
其中,标记的启动子分别代表:p2,SA2p;p6,SA6p;p13,SA13p;p15,SA15p;p31,SA31p;
图10为pBR322-spnFSRhaNEW的BamHI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注;
图11为多杀菌素人工基因簇pBAC-spnNEW的构建流程图;
图12为通过Redαβ重组构建的pBAC-spnAE-hyg和pBAC-spnAE-hyg-amp的PstI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注,左图中第15/16泳道是pBAC-spn-phiC31-apra,右图中第17泳道是pBAC-spnAE-hyg;
图13为通过Redαβ重组构建的pBAC-spnNEW和pBAC-spnJL的XmnI酶切分析电泳图,
其中,正确克隆用箭头标注;
图14为含有多杀菌素原始基因簇和人工基因簇的白色链霉菌J1074在不同发酵天数下产生的多杀菌素量柱状图;
图15为含有原始基因簇和人工基因簇的白色链霉菌J1074中多杀菌素生物合成基因的实时定量PCR分析柱状图;
图16为反转录PCR分析多杀菌素人工基因簇的操纵子结构图及验证电泳图,
其中,A为多杀菌素人工基因簇及反转录PCR鉴定的操纵子结构,B为反转录PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明,未作详细说明的步骤均按本领域常规操作。
ExoCET技术:使用第一核酸外切酶处理两个或两个以上目标核酸分子,然后使处理后的目标核酸分子在第二核酸外切酶和退火蛋白的存在下进行同源重组,其中发生同源重组的目标核酸分子之间共享至少一段序列同源区域,参考文献:Wang,H.et al.ExoCET:exonuclease in vitro assembly combined with RecET recombination for highlyefficient direct DNA cloning from complex genomes.Nucleic Acids Res.46,e28(2018)。
Gibson组装克隆技术:使用核酸外切酶处理两个或两个以上目标核酸分子使其进行同源重组,其中发生同源重组的目标核酸分子之间共享至少一段序列同源区域,参考文献:Gibson,D.G.et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat.Methods 6,343-5(2009)。
RecET重组技术:全长的Rac噬菌体重组蛋白RecE和RecT能够在大肠杆菌细胞内高效地介导线性DNA分子之间发生同源重组,其中RecE是5'-3'核酸外切酶,RecT是单链DNA退火蛋白。
Redαβ重组技术:λ噬菌体重组蛋白Redα和Redβ可以在大肠杆菌细胞内高效介导线性DNA和环状DNA之间发生同源重组,其中Redα是5'-3'核酸外切酶,Redβ是单链DNA退火蛋白。
以上技术均为现有技术。
实施例涉及的菌种及质粒如表1:
表1菌种及质粒特征及来源
注:S.spinosa DSM44228购自德国菌种保藏中心;
S.albus J1074的构建方法参考文献:Zaburannyi,N.,Rabyk,M.,Ostash,B.,Fedorenko,V.&Luzhetskyy,A.Insights into naturally minimised Streptomycesalbus J1074genome.BMC Genomics 15,97(2014);
S.coelicolor CH999的构建方法参考文献:McDaniel,R.,Ebert-Khosla,S.,Hopwood,D.A.&Khosla,C.Engineered biosynthesis of novel polyketides.Science262,1546-50(1993);
S.lividans K4-114的构建方法参考文献:Ziermann,R.&Betlach,M.C.Recombinant polyketide synthesis in Streptomyces:engineering of improvedhost strains.Biotechniques 26,106-10(1999);
E.coli GB2005的构建方法参考文献:Fu,J.et al.Efficient transfer of twolarge secondary metabolite pathway gene clusters into heterologous hosts bytransposition.Nucleic Acids Res.36,e113(2008);
E.coli GB05-red和质粒p15A-hyg-ccdB、p15A-cm-ccdB、pR6K-oriT-TnpA-kan的构建方法参考文献:Wang,H.et al.Improved seamless mutagenesis by recombineeringusing ccdB for counterselection.Nucleic Acids Res.42,e37(2014);
E.coli GB05-dir和质粒pSC101-BAD-ETgA-tet的构建方法参考文献:Fu,J.etal.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination andfacilitates direct cloning for bioprospecting.Nat.Biotechnol.30,440-6(2012);
E.coli GBdir-gyrA462和质粒pBeloBAC11、pBR322-amp-tetR-tetO-hyg-ccdB、pR6K-oriT-phiC31、pBR322-amp-ccdB-rpsL的构建方法参考文献:Wang,H.et al.RecETdirect cloning and Redαβ recombineering of biosynthetic gene clusters,largeoperons or single genes for heterologous expression.Nat.Protoc.11,1175-90(2016)。
实施例中涉及的培养基组分如下:
M1培养基的组分:1%淀粉,0.4%酵母提取物,0.2%蛋白胨,均为质量百分比;
Tan的发酵培养基组分:4%葡萄糖,1%甘油,3%可溶性淀粉,1.5%大豆胨,1%牛肉膏,0.65%蛋白胨,0.05%酵母提取物,0.1%硫酸镁,0.2%氯化钠,0.24%碳酸钙,均为质量百分比;
TSB种子培养基组分:3%胰蛋白胨大豆肉汤,质量百分比。
实施例中HPLS-MS使用的分析仪器为装配Acclaim RSLC 120,C18,2.2μm,2.1x100mm(Thermo Scientific)色谱柱和电喷雾离子化(ESI)的Bruker Impact HD micrOTOFQ III mass spectrometer(BrukerDaltonics,Bremen,Germany)液质联用平台。质谱检测条件:采用电喷雾电离源(ESI),正离子扫描模式,扫描范围设定为100-1500m/z,auto MS2二级质谱模式。HPLC采用紫外光度检测器,流动相A为H2O+0.1%TFA,流动相B为乙腈+0.1%TFA,流速0.3mL/min,洗脱流程如下:0-5min,5%B;5-10min,5%-55%B;10-15min,55%B;15-20min,55%to 95%B;20-25min 95%B。用于产量检测的多杀菌素标准品购自西格玛公司(Sigma-Aldrich,cat.no.33706)。
实施例1 ExoCET技术直接克隆多杀菌素基因簇
提取刺糖多孢菌DSM44228的基因组DNA,并用XbaI和HpaI酶切消化,得71.3kbXbaI-HpaI片段和19.4kb HpaI片段,其中,71.3kb XbaI-HpaI片段中含有19个成簇排列的多杀菌素生物合成基因:spnA,spnB,spnC,spnD,spnE,spnF,spnJ,spnL,spnM,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS,spnG,spnP,spnH,spnI和spnK;19.4kb HpaI片段包括spnE基因的部分片段(图1)。通过ExoCET技术将71.3kb XbaI-HpaI片段克隆到pBeloBAC11载体,得重组质粒载体pBAC-spn71XH,其中,pBeloBAC11载体通过两轮PCR制备:以质粒pBR322-amp-ccdB-rpsL为模板,以Spn71-1和Spn71-2为引物进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板,以Spn71-3和Spn71-4为引物,进行第二轮PCR,得pBR322-amp-ccdB载体,经过两轮PCR将71.3kb XbaI-HpaI片段和pBeloBAC11原始质粒的同源臂引入到pBR322-amp-ccdB载体;将第二轮PCR产物插入pBeloBAC11原始质粒,得pBeloBAC11载体,即将pBR322-amp-ccdB载体中的BamHI酶切位点引入到pBeloBAC11载体,所用引物序列如表2所示;
表2 71.3kb XbaI-HpaI片段连接pBeloBAC11载体的引物序列
通过ExoCET技术将19.4kb HpaI片段克隆到pBR322-amp载体,得重组质粒载体pBR322-spn19H,其中,pBR322-amp载体使用高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)通过重叠延伸PCR制备:以琼脂糖凝胶电泳纯化回收的以Spn19-2和Spn19-3为引物的第一轮PCR产物为模板,以Spn19-1和Spn19-4为引物,进行第二轮PCR;经过两轮PCR,将直接克隆的同源臂和71.3kb XbaI-HpaI片段的50bp同源臂同时引入pBR322-amp载体中;PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离和通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化后作为载体用于直接克隆。所用引物的序列如表3所示:
表3 pBR322-amp载体PCR制备所用引物序列
在ExoCET克隆过程中,使用10μg XbaI和HpaI酶切消化后的基因组DNA和1μgBamHI线性化的pBeloBAC11载体或200ng通过重叠延伸PCR制备的pBR322-amp载体。将含有基因组DNA和载体的混合物,经0.02U·μL-1的T4聚合酶体外处理(25℃,1h;75℃,20min;50℃,30min;4℃保存)后,使用Millipore Membrane Filters(Merck-Millipore,cat.no.VSWP01300)透析除盐,然后转化到L-阿拉伯糖诱导的含有质粒pSC101-BAD-ETgA-tet的E.coli GB05-dir中。转化子经氨苄青霉素或氯霉素平板筛选,挑取单菌落,进行PstI酶切鉴定以获得正确重组质粒,酶切检测结果如图2所示:带有71.3kb XbaI-HpaI片段的pBAC-spn71XH和带有19.4kb HpaI片段的pBR322-spn19H。
实施例2鼠李糖生物合成基因的克隆及多杀菌素表达载体的构建
经PCR扩增得pBR322-amp载体(引物为BR322-rha-1和BR322-rha-2)、鼠李糖合成基因gtt,gdh-kre,epi(引物为gtt-1和gtt-2,gdhkre-1和gdhkre-2,epi-1和epi-2)和卡那霉素抗性基因(neo)(引物为neo-1和neo-2),并在各片段两端引入40bp组装同源臂;PCR使用的高保真酶为PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer(Takara,cat.no.R044A),所用模板和引物如表4所示。
表4 PCR扩增的引物序列及模板
5个PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化回收后,使用Gibson试剂盒一步组装(每个片段150ng),组装体系经透析除盐转化到E.coli GB2005中。转化子经氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板筛选和PvuI酶切分析,以鉴定正确的含有gtt-gdh-kre-epi-neo基因簇的pBR322-Rhaneo重组质粒(图3)。在构建pBR322-Rhaneo时,在gtt-gdh-kre-epi-neo基因簇两端预留了BstZ17I酶切位点和pBR322-spn19H的50bp同源臂。将200ng BstZ17I酶切pBR322-Rhaneo制备的gtt-gdh-kre-epi-neo片段和500ng实施例1制备的pBR322-spn19H的NotI和NheI酶切片段共转化到L-阿拉伯糖诱导表达了RecET重组酶的E.coli GB05-dir细胞内,转化子经氨苄青霉素和卡那霉素双抗LB平板筛选和BamHI和SphI酶切验证以获得正确的pBR322-spnERhaneo重组质粒(图4)。在pBR322-spnERhaneo中,gtt-gdh-kre-epi-neo连接到到spnE下游构成spnE-gtt-gdh-kre-epi-neo基因簇,并在两端引入了BstZ17I酶切位点和pBAC-spn71XH的50bp同源臂。
将500ng线性化的spnE-gtt-gdh-kre-epi-neo片段转化到L-阿拉伯糖诱导表达了Redαβ重组酶的含有pBAC-spn71XH质粒的E.coli GB05-Red细胞内,将spnE-gtt-gdh-kre-epi-neo片段插入pBAC-spn71XH质粒,形成104.2kb的含有完整多杀菌素生物合成基因簇的BAC载体pBAC-spn(图1)。
SnaBI酶切消化pR6K-oriT-phiC31质粒产生apra-oriT-attP-phiC31int基因盒,随后,将200ng apra-oriT-attP-phiC31int转化到L-阿拉伯糖诱导表达了Redαβ重组酶的含有重组质粒pBAC-spn的E.coli GB05-Red细胞内,将apra-oriT-attP-phiC31int基因盒插入pBAC-spn,获得大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra(图1)。pBAC-spn和pBAC-spn-phiC31-apra的重组子经氯霉素和阿伯拉霉素平板筛选和PstI酶切鉴定(图5)。
实施例3大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra在链霉菌中的异源表达
将实施例2制备的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra通过接合转移转化到三种不同的链霉菌宿主(天蓝色链霉菌CH999,变铅青链霉菌链霉菌K4-114和白色链霉菌J1074)中,并通过phiC31位点特异性重组整合到染色体的attB位点上。选取基因簇不同位点的特异性引物,通过菌落PCR鉴定接合子中多杀菌素基因簇的完整性,所述的特异性引物如表5所示。
表5通过菌落PCR鉴定含有多杀菌素基因簇的链霉菌工程菌的引物序列
名称 | 序列(5’-3’) |
SpnF-1 | TTGCCAGGTGGCGCACCAAC |
SpnF-2 | GCTTCTCGTTTGACGACCTC |
SpnQ-1 | TGGTCCGTTATGCCTGGGTA |
SpnQ-2 | TCGGCGACCTGACAACGGTCA |
epi-1 | GCATGACTGGGAGCCTGGCCTGATGCCTGTCCGGGGCGTTAAGATCTCCTCGTTGGTCAATTCG |
epi-2 | ACGTCGAGGGCGACAACAACTTCG |
spnE-1 | GATCGTGACACGTTGTTGTCTG |
spnE-2 | ACCGAGTTCCACAATCGTGTCG |
将携带多杀菌素基因簇pBAC-spn-phiC31-apra的工程菌株和野生型菌株分别接种到M1培养基中摇瓶发酵12天。对发酵液进行高效液相色谱和质谱联用(HPLC-MS)分析,检测结果如图6所示,结果表明三种链霉菌工程菌株均产生spinosyn A和D,且白色链霉菌J1074工程菌的产量最高。采用Tan等发表的发酵培养基再次发酵白色链霉菌J1074工程菌株,采用HPLC-MS分析,检测结果如图7、图8所示,结果发现在Tan的发酵培养基中白色链霉菌J1074工程菌株具有更高的多杀菌素产量(平均发酵产量3.4μg·L-1)。因此,选择白色链霉菌J1074作为表达多杀菌素人工基因簇的宿主,并使用Tan等发表的发酵培养基发酵生产多杀菌素。
实施例4多杀菌素相关基因的多片段重组
将多杀菌素合成途径中的23个基因按功能分为五组:(1)聚酮合酶操纵子spnA-spnE;(2)聚酮分子内交联基因spnJ,spnM,spnF和spnL;(3)鼠李糖生物合成基因gtt,gdh,epi,kre和鼠李糖基转移酶基因spnG;(4)鼠李糖甲基化酶基因spnI,spnK,spnH,和福乐糖胺转移酶基因spnP,(5)福乐糖胺生物合成基因spnO,spnN,spnQ,spnR和福乐糖胺甲基转移酶基因spnS;采用PCR扩增技术,以刺糖多孢菌DSM44228基因组DNA为模板,扩增得到多杀菌素合成途径中除聚酮合酶操纵子spnA-spnE以外的18个基因;以白色链霉菌J1074基因组DNA为模板,扩增得到五种组成型强启动子SA15p,SA2p,SA6p,SA31p和SA13p;以质粒p15A-cm-ccdB为模板PCR扩增得到氯霉素抗性基因cm;以质粒pBR322-amp-ccdB-rpsL为模板PCR扩增得到pBR322-amp-ccdB载体。并在上述各片段两端引入40bp的组装同源臂,PCR使用的高保真酶为PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer(Takara),上述模板和引物如表6所示。
表6构建多杀菌素人工基因簇所用引物列表
注:下划线标注的核苷酸为相邻片段重叠延伸PCR的引物。
为提高组装成功率,通过重叠延伸PCR将相邻片段两两串联,两两串联的基因如图9所示,SA15p和cm、SA6p和spnJ、spnM和spnF、spnL和SA2p、gtt和gdh、epi和kre、spnG和SA31p、spnI和spnK、spnH和spnP、SA13p和spnO、spnN和spnQ、spnR和spnS分别进行两两串联。串联PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化回收后,每片段取150ng和pBR322-amp-ccdB载体150ng与T4 DNA聚合酶(T4 DNAPolymerase,0.02U·μL-1)混合成总体积为20μL的ExoCET组装体系。
ExoCET组装体系通过体外处理(25℃,1h;75℃,20min;50℃,30min;4℃保存)和Millipore Membrane Filters(Merck-Millipore,cat.no.VSWP01300)透析除盐后转化到L-阿拉伯糖诱导的含有pSC101-BAD-ETgA-tet质粒的E.coli GBdir-gyrA462中完成组装。多片段组装的转化子,用氨苄青霉素抗性平板过夜培养,并通过BamHI酶切鉴定组装后的质粒pBR322-spnFSRhaNEW,鉴定结果如图10所示,组装完成的质粒pBR322-spnFSRhaNEW如图9所示,spnO、spnN、spnQ、spnR、spnS在组成型强启动子SA13p的控制下形成操纵子;spnI、spnK、spnH、spnP在组成型强启动子SA31p的控制下形成操纵子;gtt、gdh、epi、kre、spnG在组成型强启动子SA2p的控制下形成操纵子;spnJ、spnM、spnF、spnL在组成型强启动子SA6p的控制下形成操纵子;cm位于组成型强启动子SA6p的上游;每个操纵子中,基因按照参与多杀菌素生物合成的顺序排列。
实施例5构建多杀菌素人工基因簇
以pBR322-amp-ccdB-rpsL质粒为模板,扩增得氨苄青霉素抗性基因(amp),以p15A-hyg-ccdB为模板,扩增得潮霉素抗性基因(hyg),氨苄青霉素抗性基因(amp)和潮霉素抗性基因(hyg)通过高保真PCR扩增并引入同源臂,PCR使用的高保真酶为PrimeSTAR MaxDNA Polymerase(Takara,cat.no.R045A),PCR产物用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化回收后溶于ddH2O备用,上述所用模板和引物如表7所示。
表7 amp和hyg基因扩增所用引物列表
将上述PCR产物分别取200ng用于Redαβ重组,通过Redαβ重组,用氨苄青霉素抗性基因(amp)和潮霉素抗性基因(hyg)分别替换实施例2制备的重组质粒pBAC-spn-phiC31-para中的spnF-spnS基因和鼠李糖合成基因(图11)。pBAC-spnAE-hyg和pBAC-spnAE-hyg-amp的重组子经潮霉素和氨苄青霉素平板筛选后,挑取单菌落,用PstI酶切分析,筛选正确重组的质粒,酶切分析结果如图12所示。
将实施例4经多片段重组制备得到的重组质粒pBR322-spnFSRhaNEW经过PacI酶切释放重构的多杀菌素生物合成基因,取500ng酒精沉制后的DNA用于通过Redαβ重组将重构的多杀菌素生物合成基因插入到pBAC-spnAE-hyg-amp中spnA的上游,形成含有多杀菌素人工基因簇的BAC载体,pBAC-spnNEW(图11)。pBAC-spnNEW的重组子经氯霉素和阿泊拉霉素平板筛选后,挑取单菌落,用XmnI酶切分析,筛选正确重组的质粒,酶切结果如图13所示。
实施例6人工基因簇在白色链霉菌J1074中多杀菌素的合成
将实施例5制备的含有多杀菌素人工基因簇的载体pBAC-spnNEW和实施例2制备的含有多杀菌素原始基因簇的载体pBAC-spn-phiC31-apra分别转化到白色链霉菌J1074中,两种质粒通过phiC31位点特异性重组整合到染色体的attB位点上,得两种转基因白色链霉菌J1074。在基因簇不同位点选取特异性引物(表5),通过菌落PCR鉴定接合子中基因簇的完整性。
首先将野生型和两种转基因白色链霉菌J1074分别接种到30mL TSB种子培养基中,30℃ 220rpm培养3-4天,得种子液;然后转接500μL(接种量1%,v/v)上述种子液到50mL(250mL锥形瓶)Tan的发酵培养基中,30℃220rpm摇瓶培养10天;最后,加入1mL(添加量2%,v/v)Amberlite XAD-16吸附树脂,继续摇瓶培养2天。发酵液用Eppendorf 5810R离心机最大转速离心10min收集细胞和XAD-16;沉淀经甲醇萃取旋转蒸发浓缩后溶于1mL甲醇,取3μL用于HPLC-MS分析。
HPLC-MS分析结果如图14所示,结果表明,与原始基因簇相比,人工基因簇在白色链霉菌J1074中发酵12天的多杀菌素产量提高了328倍(含人工基因簇的白色链球菌J1074多杀菌素产量为1.12mg L-1,含原始基因簇的白色链球菌J1074多杀菌素产量为3.4μg L-1)。质谱分析表明,原始基因簇发酵液中只能检测到spinosyn A和D两种化合物,而在人工基因簇发酵液中不但检测到了spinosyn A和D,还检测到了氮-脱甲基spinosyn A(spinosyn B)和氮-脱甲基spinosyn D两种中间产物,这是首次在发酵液中检测到半合成多杀菌素衍生物氮-脱甲基spinosyn D,证明了氮-脱甲基spinosyn D是可以通过生物合成的,检测结果如表8所示。
表8转基因白色链霉菌J1074发酵产生的spinosyns列表
实施例7多杀菌素合成基因的转录分析
收集实施例6中发酵第4天,第6天,第10天发酵液中的菌体,然后用细菌总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA,通过实时定量PCR对人工基因簇中每个操纵子的第一个和最后一个基因(spnA和spnE,spnJ和spnL,gtt和spnG,spnI和spnP,spnO和spnS)进行了转录分析,并与原始基因簇进行了对比。采用PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser(Takara,cat.no.RR047A)试剂盒以除去基因组DNA并反转录为cDNA。
应用StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)和SYBR PremixEx Taq GC(Takara,cat.no.RR071A)试剂盒参照说明书进行实时定量PCR,数据分析采用StepOne Software v2.3(Applied Biosystems)完成。数据处理时,以表达RNA聚合酶σ因子的hrdB基因为内参基因来计算多杀菌素各生物合成基因的相对表达量。实时定量PCR引物如表9所示。
表9.实时定量PCR所用引物列表
实时定量PCR结果如图15所示,在人工基因簇中所有选定基因的转录水平均高于原始基因簇中的相应基因。尤其是在发酵第4天时,人工基因簇中spnJ和spnO的转录水平分别较原始基因簇提高了14.7和12.8倍,第6天时spnA,spnJ和spnI的转录水平分别提高了10.4,25和22.6倍。在人工基因簇中,操纵子spnJMFL,rhaspnG和spnIKHP中的第一个基因的转录水平均高于最后一个基因,但是,spnA/spnE和spnO/spnS的转录却相反。
通过反转录PCR检测了人工基因簇中所有操纵子的结构组成,通过延伸活性良好的LA Taq with GC Buffer(Takara,cat.no.RR02AG)进行反转录PCR,反转录PCR的引物如表10所示。
表10.反转录PCR引物列表
名称 | 序列(5’-3’) | 名称 | 序列(5’-3’) |
RT-AB-1 | AGCTGATCCTGGAGCTGGTA | RT-gttG-1 | TGATCTCGTCGCTGAGTTTG |
RT-AB-2 | TCGGGCGCGCCCACTCGCAG | RT-gttG-2 | CTGTTGTCCATCGTGGAGAA |
RT-BC-1 | ACCTCGTCCGCATGCATGTG | RT-JL-1 | TCCTCGTTTCTGGCGTAATC |
RT-BC-2 | GCACTCATTTCGATGAACAG | RT-JL-2 | ATCCTCGTTATCCGGACCTC |
RT-CD-1 | TTCGCCCCAGCCTTCACCTCG | RT-OQ-1 | ACTTCCGGTGGATGACTTTG |
RT-CD-2 | TGTCATTCCTAGCGAATACG | RT-OQ-2 | GTCGGTGGTCTTGAGGTTGT |
RT-DE-1 | GCACGCACTCCTCGCCAAGTG | RT-OR-1 | ACTTCCGGTGGATGACTTTG |
RT-DE-2 | ACCACCCTCGCGGACGTAGGAG | RT-OR-2 | GGTCGTACTGCGTAGCGATT |
RT-OS-1 | AACCCGTCGATGAACTTGTC | RT-OS2-1 | ACTTCCGGTGGATGACTTTG |
RT-OS-2 | GCAACGCGCGTTCCGCTGAG | RT-OS2-2 | AACCCGTCGATGAACTTGTC |
RT-IP-1 | AGCGGTACGTATTCGTGGAC | RT-RS-1 | AATCGCTACGCAGTACGACC |
RT-IP-2 | CCCGCGGCCCAGCGCACCTC | RT-RS-2 | AACCCGTCGATGAACTTGTC |
反转录PCR结果如图16所示,spnJMFL,gtt-gdh-epi-kre-spnG和spnIKHP的转录偶联关系得以确认;另外,spnD和spnE是共转录的,而spnA,spnB和spnC共转录成另一个信使RNA。因此,在spnC的下游存在一个终止子,而且在spnD的上游存在一个启动子,它们使spnDE摆脱了SA15p的控制,并将spnABCDE分为两个操纵子。还检测到spnO,spnN和spnQ是共转录的,而spnR和spnS则共转录成另一个信使RNA,因此,spnONQRS也被分为两个操纵子,其中,spnONQ受到SA13p的控制,而spnRS受到spnR上游启动子的控制。所以,在多杀菌素人工基因簇中存在7个操纵子:spnABC,spnDE,spnJMFL,gtt-gdh-epi-kre-spnG,spnIKHP,spnONQ和spnRS。
Claims (7)
1.一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法,其特征在于,步骤如下:
(1)以刺糖多孢菌DSM44228的基因组DNA为模板,XbaI、HpaI双酶切得71.3kb XbaI-HpaI片段和19.4kb HpaI片段,将71.3kb XbaI-HpaI片段克隆到pBeloBAC11载体构建得重组质粒载体pBAC-spn71XH;将19.4kb HpaI片段克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-spn19H;
所述71.3kb XbaI-HpaI片段包括多杀菌素生物合成基因spnA,spnB,spnC,spnD,spnE,spnF,spnJ,spnL,spnM,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS,spnG,spnP,spnH,spnI和spnK;所述19.4kb HpaI片段包括spnE基因的部分片段;
(2)将鼠李糖合成基因gtt,gdh-kre,epi和卡那霉素抗性基因neo克隆到pBR322-amp载体构建得重组质粒载体pBR322-Rhaneo;将pBR322-Rhaneo与步骤(1)中的pBR322-spn19H重组得重组质粒载体pBR322-spnERhaneo;
(3)将步骤(1)中得到的pBAC-spn71XH与步骤(2)得到的pBR322-spnERhaneo重组得含有完整多杀菌素生物合成基因簇的BAC载体pBAC-spn;将apra-oriT-attP-phiC31int基因盒与pBAC-spn经重组得大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC-spn-phiC31-apra;
(4)将多杀菌素生物合成基因spnJ,spnM,spnF,spnL,gtt,gdh,epi,kre,spnG,spnI,spnK,spnH,spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS,白色链霉菌J1074的组成型强启动子SA15p,SA2p,SA6p,SA31p,SA13p,氯霉素抗性基因cm,与pBR322-amp-ccdB载体经多片段组装得重组质粒载体pBR322-spnFSRhaNEW;所述spnO、spnN、spnQ、spnR、spnS在组成型强启动子SA13p的控制下形成操纵子;所述spnI、spnK、spnH、spnP在组成型强启动子SA31p的控制下形成操纵子;所述gtt、gdh、epi、kre、spnG在组成型强启动子SA2p的控制下形成操纵子;所述spnJ、spnM、spnF、spnL在组成型强启动子SA6p的控制下形成操纵子;所述cm位于组成型强启动子SA6p的上游,并与组成型强启动子SA15p串联;每个操纵子中,基因按照参与多杀菌素生物合成的顺序排列;
(5)以氨苄青霉素抗性基因amp和潮霉素抗性基因hyg分别替换步骤(3)中pBAC-spn-phiC31-para中的spnF-spnS基因和鼠李糖合成基因得重组质粒载体pBAC-spnAE-hyg-amp,将步骤(4)得到的pBR322-spnFSRhaNEW插入到pBAC-spnAE-hyg-amp中spnA的上游,spnA的上游为pBR322-spnFSRhaNEW中的组成型强启动子SA15p,得到含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒pBAC-spnNEW。
2.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,包括以下一项或多项:
i. 步骤(1)中所述克隆采用ExoCET技术;
ii. 步骤(2)中所述克隆采用Gibson组装克隆技术;所述pBR322-Rhaneo与步骤(1)中的pBR322-spn19H重组采用RecET重组技术;
iii. 步骤(3)中所述重组为Redαβ重组技术;
iv. 步骤(4)中所述多片段组装采用ExoCET技术;
v. 步骤(5)中所述替换和插入均采用Redαβ重组技术。
3.按照权利要求1~2任一项所述的构建方法构建得到的含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒。
4.权利要求3所述的含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒在构建高产多杀菌素工程菌中的应用,包括步骤:将权利要求3所述的含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒通过接合转移转化到宿主菌中,筛选鉴定阳性转化子;
所述宿主菌为天蓝色链霉菌CH999,变铅青链霉菌链霉菌K4-114或白色链霉菌J1074。
5.按照权利要求4所述的应用构建得到的高产多杀菌素工程菌在发酵生产多杀菌素中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,包括步骤:将按照权利要求4所述的应用构建得到的高产多杀菌素工程菌接种于发酵培养基中进行发酵培养。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述发酵培养基为M1培养基或Tan的发酵培养基;
其中,M1培养基的组分为:1%淀粉,0.4%酵母提取物,0.2%蛋白胨,均为质量百分比;
Tan的发酵培养基组分为:4%葡萄糖,1%甘油,3%可溶性淀粉,1.5%大豆胨,1%牛肉膏,0.65%蛋白胨,0.05%酵母提取物,0.1%硫酸镁,0.2%氯化钠,0.24%碳酸钙,均为质量百分比。
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