CN103849642A - 一种通过糖多孢红霉菌sace_3986基因提高红霉素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的方法为：通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌的SACE_3986基因，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述技术获得的菌株发酵可以提高红霉素产量，本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负向调控子SACE_3986，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3986基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。

Description

一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法

技术领域

本发明主要涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过缺失糖多孢红霉菌染色体上负向调控基因SACE_3986提高红霉素产量的方法。

背景技术

放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂[1]。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的[2]。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法指导对育种进行理性设计。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物生产。

糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。由于红霉素及其衍生物每年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。2007年，Oliynyk等^[3]报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有bldD(SACE_2077)^[4]、SACE_7040^[5]、SACE_0012^[6]和SACE_5599^[7]的调控基因研究报道，及我们申报的SACE_3446（申请号:201210099708.8）和SACE_7301（申请号:201310082765.X）两项发明专利。

原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR和Crp等16个家族^[8]，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋-转角-螺旋（HTH）的结构特征^[9][10]。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有101个TetR家族基因^[3]，其中有些基因可能参与红霉素生物合成。

发明内容

本发明目的就是提供一种通过缺失糖多孢红霉菌中负向调控基因SACE_3986提高红霉素产量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_3986基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的SACE_3986基因产物可以负向调控红霉素生物合成。

一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的方法具体表现为以糖多孢红霉菌SACE_3986基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物

本发明的特点是：

本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负向调控子SACE_3986，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3986基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。

糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3986基因时红霉素产量提高了43%，而在ΔSACE_3986基因突变株中回补SACE_3986基因，红霉素产量得到恢复，表明SACE_3986是一个参与红霉素生物合成的负向调控子。当在糖多孢红霉菌A226中增加SACE_3986基因拷贝时，红霉素产量较出发菌株降低50%，说明在糖多孢红霉菌中缺失SACE_3986基因，可以构建红霉素高产菌株。

同时，红霉素生物合成基因调控是一个网络，通过基因工程途径改变SACE_3986基因或产物的上下游调控因子，也可构建红霉素高产菌株，用于提高发酵红霉素产量。

附图说明

图1为本发明的染色体同源重组技术示意图；

图2为SACE_3986基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置及所编码的氨基酸序列；

图3为ΔSACE_3986突变体鉴定及红霉素产量分析，其中(A)ΔSACE_3986突变体鉴定：SACE_3986基因（672bp）被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度增加了688bp；M,5000bp DNA Marker；(B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、突变菌株ΔSACE_3986及回复菌株ΔSACE_3986/pIB1393986(对照为ΔSACE_3986/pIB139)在R5培养基中30℃发酵6天产物HPLC分析；

图4为SACE_3986基因过表达及红霉素产量分析，其中(A)A226/pIB1393986过表达菌株PCR鉴定:PCR产物为pIB139载体上SACE_3986基因（672bp）和apr抗性基因（776bp）；M,5000bp DNA Marker；(B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、过表达菌株A226/pIB1393986(对照为A226/pIB139)在R5培养基中30℃发酵6天产物HPLC分析；

图5为ΔSACE_3986与出发菌株A226中相关基因转录分析；

图6为载体pET28a3986的成功构建与SACE_3986蛋白的表达及其纯化，其中（A）为pET28a3986质粒的鉴定：目的条带SACE_3986基因（672bp）被PCR扩增出；M,5000bp DNA Marker，（B）为SACE_3986蛋白的诱导表达及纯化：1M泳道显示的为纯化后的目的蛋白；M.Marker1.pET28a2.pET28a3986(未诱导)3.pET28a3986(诱导未纯化)1M-40mM.不同浓度咪唑洗脱后的蛋白

图7为阳性对照BldD蛋白和SACE_3986蛋白与eryAI基因启动子的EMSA实验：其中(A)为BldD蛋白与PeryAI启动子的EMSA实验，(B)为SACE_3986蛋白与PeryAI启动子的EMSA实验；

图8为SACE_3986蛋白与SACE_3985--SACE_3986基因间隔区的EMSA实验。

具体实施方式

实施例1

1.1菌株、质粒与生长条件

试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB(Luria-Bertani)培养基或在添加1.25%琼脂的LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌A226及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。

1.2材料、DNA操作与测序

PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1试验中使用到的菌株和质粒

1.3SACE_3986基因缺失突变体的构建

pUCTSR质粒是在pUC18的BamH I和Sma I酶切位点之间插入1.36kb硫链丝菌肽抗性基因（tsr）。为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_3986基因，分别用PU1/PU2和PD1/PD2为引物、糖多孢红霉菌基因组为模板，PCR扩增SACE_3986基因的上、下游各约1.5kb的同源臂SU和SD DNA片段。

PCR扩增SU DNA片段引物为：

PU1：5ˊ-GCGGAATTCGCGTGCGGGAACACCGC-3ˊ(划线的序列为EcoR I的酶切位点),

PU2：5ˊ-TCTGGTACCGGGCCATCACGAGGCTACGATAACGGC-3ˊ(划线的序列为KpnI的酶切位点)；

PCR扩增SD DNA片段引物为：

PD1：5ˊ-CGCTCTAGATTAGTGGTACGCCGCTGCTACGGTGC-3ˊ(划线的序列为Xba I的酶切位点),

PD2：5ˊ-CCGAAGCTTGTGCGCGCCACCAAGCG-3ˊ(划线的序列为Hind III的酶切位点)。

分别将上述SU和SD两个DNA片段连接到pUCTSR的tsr抗性基因两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ3986；以PU1和PD2为引物、pUCTSRΔ3986质粒为模板，PCR扩增SU-tsr-SD DNA片段，利用染色体片段同源重组技术将SU-tsr-SD DNA片段导入糖多孢红霉菌中，根据硫链丝菌肽抗性筛选突变体，即获得SACE_3986基因被硫链丝菌肽抗性基因（tsr）替换的基因工程菌株，使用P1/P2引物PCR验证该突变体被成功构建（见图3A），命名为ΔSACE_3986。

PCR成功验证得到ΔSACE_3986突变株的引物为：

P1：5ˊ-CGGTGACCACCGCGACCCTGCCCGC-3ˊ；

P2：5ˊ-AGTAGCCGGTCATGCGTTGCCACCTGCCTCGG-3ˊ。

1.4SACE_3986基因回复菌株的构建

为了在ΔSACE_3986中引入SACE_3986基因，设计了PCR扩增SACE_3986基因引物：

上游：5ˊ-AGCCATATGATGGCCCGAGTCAAGAGCA-3ˊ(划线的序列为Nde I的酶切位点)，

下游：5ˊ-GGCTCTAGACTAACTTCCGGCGATCACGAC-3ˊ(划线的序列为Xba I的酶切位点)。

从糖多孢红霉菌A226基因组中扩增出SACE_3986基因，插入到pIB139的Nde I和Xba I酶切位点之间，构建表达质粒pIB1393986，然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB1393986导入ΔSACE_3986中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因（apr）和SACE_3986基因为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_3986/pIB1393986。

1.5糖多孢红霉菌A226中过量表达SACE_3986基因

pIB1393986经过大肠杆菌ET12567去甲基化以后，通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226中，以安普霉素抗性基因（apr）为对象进行PCR鉴定，获得菌株命名为A226/pIB1393986。

1.6糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测

接种糖多孢红霉菌于TSB培养基，在30℃振荡培养24小时后，转接R5液体培养基30℃振荡培养144小时。

1.7ΔSACE_3986与出发菌株A226中相关基因的转录分析

将分别培养三天的ΔSACE_3986和出发菌株A226采用液氮研磨方式和赛百盛RNA提取试剂盒获得所需RNA，PCR反转成cDNA后，使用荧光定量PCR仪上机检测。

eryAI、ermE、SACE_3985转录分析所设计的引物：

eryAI-P1:5ˊ-CCGCTGATGCCGAACGAC-3ˊ；

eryAI-P2:5ˊ-CACCCTTCCCCGCACTCTG-3ˊ；

ermE-P1:5ˊ-CCTCCAGGCACCAGTCCAC-3ˊ；

ermE-P2:5ˊ-AGTCGTTGCGGGAGAAGCT-3ˊ；

SACE_3985-P1:5ˊ-GCGTTGTAGGCGCTCTGC-3ˊ；

SACE_3985-P2:5ˊ-GCGTGTCATGGACGTCAACTT-3ˊ。

1.8SACE_3986蛋白表达载体pET28a3986的构建、表达及其纯化

从糖多孢红霉菌A226基因组中扩增出SACE_3986基因，插入到pET28a的Nde I和Hind III酶切位点之间，构建出质粒pET28a3986，然后将其导入到BL21感受态中，得到蛋白表达载体pET28a3986。

将得到的蛋白表达载体pET28a3986以1%的接种量接种到摇管中培养12小时后，再以2%的接种量接种到含有50ml液体LB的250ml的摇瓶中，37℃培养1.5小时后加入适量IPTG，并于30℃诱导过夜，培养结束后取适量菌液热变性后跑蛋白变性胶观察目的蛋白是否成功表达。

成功表达后的目的蛋白进行镍柱纯化，先使用适量浓度的梯度咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，最后用1M咪唑缓冲液将目的蛋白洗脱下来，即得到纯化后的目的蛋白。

1.9SACE_3986蛋白与eryAI基因启动子的EMSA试验

取适量上述纯化的目的蛋白和BldD蛋白（阳性对照）分别与适量的eryAI基因启动子混合，加入一定量的结合缓冲液，于30℃温育10min，跑蛋白活性胶观察其是否结合。

eryAI基因启动子扩增的FAM引物：

eryAI-P3：5ˊ-CGGAGCATTTGCTCGCTTTCCAGG-3ˊ；

eryAI-P4：5ˊ-GCGTCCCCCTACTCGACGACCAC-3ˊ。

1.10SACE_3986蛋白与SACE_3985--SACE_3986基因间隔区的EMSA试验

方法同上述1.8中所述。

SACE_3985--SACE_3986基因间隔区（NT4373221-4373305）相关扩增的FAM引物：

U-P1:5ˊ-ACCGGCGGTCTCCCGCGCCG-3ˊ；

U-P2:5ˊ-TTGGCGAGGCGGGAATCCTGGGCG-3ˊ；

M-P1:5ˊ-GCCTCGCCAACGCCGCAAGC-3ˊ；

M-P2:5ˊ-CGACCTGCCGTCCGCCGGTG-3ˊ；

D-P1:5ˊ-CGGCGCACCGGCGGACGGCA-3ˊ；

D-P2:5ˊ-CTTGGGGCGCGGTACCCCGGCCGC-3ˊ。

结果分析：

2.1ΔSACE_3986比出发菌株A226红霉素产量提高

SACE_3986基因突变构建ΔSACE_3986突变菌株过程见图1。糖多孢红霉菌TetR家族转录调控基因SACE_3986是由223个氨基酸组成的，氨基酸序列见图2。根据其保守区域的结构特征，SACE_3986基因属于TetR家族转录调控基因。SACE_3986和临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置见图2。SACE_3986基因缺失突变体在含有30μg ml^-1硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实（见图3A）。ΔSACE_3986在R5液体培养基中发酵6天（144h），其红霉素产量比出发菌株A226的产量提高了43%（见图3B），表明SACE_3986可能是参与红霉素生物合成的负向调控子。

2.2SACE_3986基因回复实验

为了验证突变体ΔSACE_3986中红霉素产量的提高是因为SACE_3986基因缺失引起的，将SACE_3986基因表达载体pIB1393986，导入突变体ΔSACE_3986中。ΔSACE_3986/pIB1393986的红霉素产量与出发菌株A226的产量相比，恢复到82%，没有完全恢复是由于空载体pIB139整合导致产量总体降低（见图3B），此结果亦表明SACE_3986是一种参与红霉素生物合成的负向调控子。

2.3A226中过表达SACE_3986基因引起红霉素产量降低

为了进一步验证SACE_3986是糖多孢红霉菌中红霉素合成负向调控因子，将表达载体pIB1393986导入到A226构建了工程菌A226/pIB1393986，图4A中672bp的SACE_3986基因和776bp的安普霉素抗性基因PCR产物证实了工程菌株A226/pIB1393986构建的完成。其红霉素产量比A226的产量降低了50%，而与对照A226/pIB139相比，产量降低了46.6%（见图4B），确证了SACE_3986是糖多孢红霉菌中负向调控因子，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌中SACE_3986基因可以提高红霉素产量。

2.4ΔSACE_3986与出发菌株A226中相关基因转录变化显著

荧光定量PCR结果显示ΔSACE_3986与出发菌株A226中eryAI、ermE、SACE_3986上游基因SACE_3985的转录量变化显著。与出发菌株A226相比，突变株ΔSACE_3986中eryAI和SACE_3985基因的转录量分别提高了3倍和5倍，ermE基因的转录量提高了1倍。说明突变株中红霉素产量提高可能是通过上述三个基因的转录量增加所致，见图5。

2.5载体pET28a3986的成功构建与SACE_3986蛋白的表达及其纯化

SACE_3986蛋白表达载体pET28a3986的构建成功，图6A中672bp的SACE_3986基因PCR产物证实了蛋白表达载体pET28a3986构建的完成。图6B显示SACE_3986蛋白（大小为26.36KDa）成功表达并纯化。

2.6SACE_3986蛋白与eryAI基因启动子体外不结合

EMSA实验结果显示SACE_3986蛋白与eryAI基因启动子体外未观察到结合现象，说明SACE_3986蛋白可能并非通过结合eryAI基因启动子直接调控红霉素合成，见图7A、B。

2.7SACE_3986蛋白与SACE_3985--SACE_3986基因间隔区体外成功结合

EMSA实验结果显示SACE_3986蛋白与SACE_3985--SACE_3986基因间隔区（NT4373221-4373305）体外成功结合，见图8，并根据上述转录实验结果，我们得出：SACE_3986蛋白可能通过与SACE_3985基因作用来调控红霉素生物合成。SACE_3985基因编码产生的一种脱氢酶/还原酶，其影响糖多孢红霉菌中红霉素的产量机制还有待更深入研究。

Claims (3)

1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_3986基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

2.根据权利要求1所述的一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于所述的SACE_3986基因产物可以负向调控红霉素生物合成。

3.根据权利要求1所述的一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于所述的方法具体表现为以糖多孢红霉菌SACE_3986基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。

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