CN105039380B - 调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法及其应用 - Google Patents
调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及dasR基因对红霉素生产菌红色糖多孢菌在影响次级代谢产物合成方法及其应用；该方法包括如下步骤：敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，得到突变工程菌；所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。所述敲除dasR基因的得到的突变株或所述的突变株在影响次级代谢物产量中的应用，所述次级代谢物具体为红霉素和红棕色色素。与未敲除的野生型菌株相比，dasR基因敲除工程菌株产生红霉素和色素的量减少。说明该基因与次级代谢物的产生正相关。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及dasR基因对红霉素生产菌红色糖多孢菌在影响次级代谢产物合成方法及其应用。
背景技术
红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)是一种革兰氏阳性丝状细菌，它最初被认为属于链霉菌属，曾一度被称为“红色链霉菌”(Streptomyces erythraeus)，但是后来进一步研究发现它其实是属于糖多孢菌属。
红色糖多孢菌是红霉素主要生产菌，而红霉素主要用于杀死革兰氏阳性致病菌。这种大环内酯类的广谱抗生素自J.M.McGurie最初发现至今已逾六十年历史。然而红霉素因其高效的治疗效果和使用的安全性至今仍然在医药界广泛应用。此后，人们对红霉素A的分子结构进行改造并由此演变出丰富多样更加有效的衍生物。这些半合成的第二代衍生物比如克拉霉素(Clarithromycin)和阿奇霉素(Azithromycin)和第三代衍生物酮内酯类抗菌药(ABT-773和HMR-3647)不仅具有更好的疗效作用，也增加了红霉素A作为初始原料的使用需求，从而推动了整个红霉素在医药市场的发展。
在早期，由于技术落后导致基因组序列信息的匮乏，使人们对于一些产抗生素放线菌的改造主要基于对野生菌的多轮的随机诱变，进而大量筛选得到高产的突变菌株，这种近乎暗箱操作的菌株优化方法不仅耗时耗力且往往效率低下。随着测序技术的进步，2007年剑桥大学的研究者们完成了对红色糖多孢菌野生株(S.erythraea NRRL23338)全基因组的测序工作，从而使人们对这个重要的工业放线菌的分子改造变得更加有的放矢。
通过基因工程改造红色糖多孢菌以提高红霉素产量有两个策略：一是在对红霉素合成生化途径的了解的基础上，通过理性改造红霉素合成前体甲基丙二酰辅酶A(Methylmalonyl-CoA)的代谢流，二是在体内高表达调控红霉素合成基因簇的调控基因。而后者直接提出了对于抗生素合成调控相关基因的研究的紧迫性，这也是目前对于放线菌领域研究的重要部分。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过缺失红色糖多孢菌dasR基因影响次级代谢物产量的方法及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法，包括如下步骤：敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，得到突变工程菌；
所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。
上述方法中，所述敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因是通过双交换同源重组基因敲除的方法，包括如下步骤：
1)在敲除质粒pUC18-tsr的抗性基因tsr上下游接入预敲除基因dasR的上下约1500bp的同源臂序列，得到dasR基因缺失的pUC18-dasR质粒；
2)将dasR基因缺失的质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红色糖多孢菌野生株原生质体中，得到dasR基因缺失的突变工程菌；
3)在含硫链丝菌肽抗性平板上筛选突变工程菌，并通过PCR和测序的方法验证突变菌。
所述红色糖多孢菌为红色糖多孢菌野生株NRRL23338。
本发明还提出了一种敲除dasR基因的得到的突变株或上述的突变株在影响次级代谢物产量中的应用。
所述次级代谢物具体为红霉素和红棕色色素。
所述dasR基因在调控抗生素产量中的应用；所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。
上述dasR调控次级代谢物产量为降低次级代谢物产量。
本发明的实验证明，本发明利用双交换同源重组基因敲除技术构建了dasR基因敲除工程菌株，检测其与次级代谢产物的关系，结果为与未敲除的野生型菌株相比，dasR基因敲除工程菌株产生红霉素和色素的量减少。说明该基因与次级代谢物的产生正相关。
附图说明
图1为dasR基因敲除工程菌构建技术图及PCR和测序验证图。
图2为dasR基因敲除工程菌与野生菌的生长和红霉素合成效果图。
图3为dasR基因敲除工程菌与野生菌色素合成的效果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中培养基配方如下：
LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠10g/L，将pH调节至7.0，121℃高温高压灭菌20分钟，烘箱干燥后置于常温备用。
TSB液体培养基：称取商品化的TSB培养基干粉30g溶于800ml去离子水定容至1L，分装所需小玻璃摇瓶(对于所有放线菌的培养需加入一定量的玻璃珠)，于115℃高压灭菌，烘箱干燥后置于常温备用。
R2YE固体培养基：蔗糖103g，硫酸钾0.25g，氯化镁10.12g，葡萄糖10g，酪蛋白氨基酸水解物(Casamino acids)0.1g，用双蒸水800ml溶解后，分装80ml/瓶，并加入2.2g细菌学琼脂，121℃高压灭菌。在使用前再在每瓶中加入0.5％磷酸二氢钾溶液1ml，3.68％氯化钙溶液8ml，20％L-脯氨酸1.5ml，5.73％pH 7.2TES缓冲液10ml，微量元素混合液0.2ml，1N氢氧化钠0.5ml，10％酵母提取物溶液5ml。
微量元素混合液(Trace element solution)：氯化锌40mg，氯化铁200mg，氯化铜10mg，氯化锰10mg，硼酸钠10mg，钼酸铵10mg，溶解到1L去离子水。
实施例1
利用双交换同源重组基因敲除技术构建dasR基因敲除工程菌
1.1 dasR基因敲除质粒的构建
pUC18-tsr质粒是在pUC18质粒的BamH I和Sma I酶切位点之间插入1.36kb的硫链丝菌肽抗性基因(tsr)。为了敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，分别用dasR-up-fw/rev和dasR-dw-fw/rev为引物，以红色糖多孢菌基因组为模板，PCR扩增dasR基因的上下游各约1.5kb的同源臂DNA片段。
扩增上同源臂DNA片段所用引物为：
dasR-up-fw:5'-AACTGCAGGTCTCGGCCAGCTTCAGGG-3′
dasR-up-rev:5'-GCGGGATCCCGTTCCTCCTACCACCGCAA-3'
扩增下同源臂DNA片段所用引物为：
dasR-dw-fw:5'-TATGGTACCTACAAGTTCGTCGCCCGC-3'
dasR-dw-rev:5'-CCGGAATTCCACCGACCTCAGCGTTTACG-3'
分别将上述上游/下游两个同源臂片段DNA连接到pUC18-tsr质粒的tsr抗性基因两侧，构建完成敲除质粒pUC18-dasR。
1.2红色糖多孢菌原生质体制备方法：
1)按1％接种红色糖多孢菌野生株于50ml TSB(含0.4g甘氨酸)液体培养基，30℃摇床振荡培养至生长对数期，镜检观察菌体是否有杂菌污染；
2)3000rpm离心10min收集菌体，用事先灭菌的20ml蔗糖溶液(10.3％)吹打洗涤一次，再用10ml改P缓冲液洗涤两次；
3)用10ml改P缓冲液充分悬浮菌丝体后，加入配置好的溶菌酶(Sigma，50mg/ml)使其终浓度为0.55mg/ml，温和混匀后置于30℃恒温水浴锅中孵育65min，过程中需用无菌枪头轻轻吹打2～3次，镜检观察菌体额酶解情况；
4)将溶菌酶处理后的菌液全部转移至事先灭菌处理过的孢子过滤器中，过滤下来的液体即为原生质体，然后3000rpm低温离心约7min；
5)用适量的改P缓冲液轻柔的将原生质体悬浮，然后分装到1.5ml的无菌离心管(每管50μl)保存于-80℃冰箱备用。
1.3原生质体转化步骤
将上述制备好的敲除质粒pUC18-dasR通过PEG介导的方法导入到上述制备好的红色糖多孢菌原生质体中，其具体步骤如下：
1)向红色糖多孢菌原生质体中加入约50μl事先构建好的dasR敲除质粒，然后迅速加入200μl PEG-T缓冲液；
2)轻柔吹吸充分混匀后，将EP管中的菌液全部均匀涂布于无抗的R2YE平板上；
3)在30℃恒温培养箱中培养约24h至表面稍为干燥时，加入1ml稀释的筛选抗生素(Thio的终浓度为30μg/mL)；
4)培养3～5天后，待平板上长出单克隆菌落后即可进入后续的筛选工作。
1.4突变株的筛选和验证
在上述长出转化子的抗性平板上挑取单克隆菌落，接种到硫链丝菌肽抗性TSB培养基中培养48h，抽提基因组，分别用上接头验证引物Ud1/Ut1或Ud1/Ut2和下接头验证引物Dd1/Dt1或Dd1/Dt2通过PCR验证和测序验证突变株构建成功(见图1B和图1C)，突变菌命名为△dasR。
PCR和测序验证引物为：
Ud1：5'-CGCAACACGCGACGAACC-3'
Ut1：5'-GAGTTGCTGGATCTGTGCG-3'
Ut2：5'-CCCCTTGCGTTGGTGATTG-3'
Dd1：5'-GGCTGGCTCGGGTGGAT-3'
Dt1：5'-ACGACGGGAAGGGAGAAG-3'
Dt2：5'-AGAGGCGCTTATCGGTTGG-3'
实施例2
dasR基因敲除工程菌的生长及次级代谢产物产量的测定
1.1菌体生长量的测定
红色糖多孢菌菌种在TSB中活化，制备R2YE平板并在表面铺设玻璃纸，分别接种野生型菌株和△dasR菌株。30℃恒温培养箱培养，分别在24h、36h、48h、60h、72h、96h、108h和120h时将玻璃纸揭去并将菌体收集下来，每个时间点每种菌株收集3个平板的菌体。将3个平板的菌体分别收集在已经称取重量(称为始量)的1.5ml离心管中，然后在50℃烘箱中烘过夜(12h)，使其完全干燥，然后称取重量(称为终量)，用终量减去始量得到菌体的干重(以毫克为单位)。
结果如图2A所示，dasR的缺失对敲除菌的生长并没有太大影响，野生株在48h进入生长稳定期，敲除株虽然在36h生长放缓，但是营养生长还在继续，即使在生长后期(96～120h)菌丝体还有较高的积累。
表面dasR的缺失对菌体的生长并无太大影响。
1.2红霉素的测定
红霉素的含量采用生物法测定
在上述揭去玻璃纸的R2YE平板琼脂中含有红霉素，用圆形打孔器打出均匀的小琼脂块，小琼脂块即可用于抗生素的生物鉴定。将小琼脂块贴于预涂有枯草杆菌(检测菌)的LB固体检测平板表面，并置于恒温培养箱培养至枯草杆菌生长出一层菌苔，由于扩散作用，在琼脂块附近的培养基含有抗生素使检测菌枯草杆菌无法生长，从而形成圆形的透明抑菌圈，测定透明圈的直径即可判定抗生素产量的多少。并用标准浓度抗生素溶于同样大小的琼脂块制作标准曲线。
红霉素合成的测定结果如图2B，比较单位菌体产生的红霉素水平，dasR敲除株比野生株在各个时间点都要低，说明在营养丰富的R2YE培养基上生长，dasR的缺失导致红霉素合成下降，dasR对于红霉素的合成具有正面影响。
表明，dasR基因敲除降低红色糖多孢菌的红霉素产量，是红霉素合成的正向调控基因。
1.3色素的测定
将上述各个时间点培养的平板在揭去玻璃纸后，直接拍照观测红色色素的产生情况。
红色糖多孢菌色素为暗红色的醌类淡黄霉素，在270nm下有特征吸收峰。
用圆形打孔器打出均匀的小琼脂块，将琼脂块捣碎，用甲醇萃取法溶解萃取色素，再通过多功能酶标仪在270nm处测定色素吸收峰OD270。
结果如图3所示，无论是直接观测平板中色素的颜色的深浅，还是比较单位菌体产生的红色色素水平，dasR敲除菌在各个时间点色素产生都比野生菌低。
表明，dasR基因是红色糖多孢菌色素合成的正向调控基因。
Claims (1)
1.一种红色糖多孢菌dasR基因在调控次级代谢物产量中的应用，其特征在于，所述次级代谢物为红霉素和红棕色色素，所述dasR基因正向调控红霉素和红棕色色素的生物合成，其中所述dasR基因的核苷酸序列为序列表1中的序列。
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