CN109852650A - 一种由茶碱调控的人工适体酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由茶碱调控的人工适体酶及应用，属于基因工程技术领域。本发明采用茶碱适体域融合核酶的方式，得到了一种可调控外源蛋白表达的调控元件。该调控元件P_AZSDE1‑BG8可以在枯草芽孢杆菌中调控外源基因的表达。当以绿色荧光蛋白基因为目的基因时，可以使荧光强度提高7.23倍；当以普鲁兰酶基因为目的基因时，加入4mM茶碱溶液，可以使普鲁兰酶的酶活从0.30886U/mL提高到6.07431U/mL。该过程中不需要其他蛋白因子的参与，能够有效快速地实现基因调控。

Description

一种由茶碱调控的人工适体酶及应用

技术领域

本发明涉及一种由茶碱调控的人工适体酶及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因调控在蛋白质表达工程、代谢工程以及合成生物学领域当中多有应用，目前基因调控主要基于诱导型启动子、转录因子等进行。近年来出现了一类RNA调控元件，因其调控过程中不需要蛋白因子的参与等优点逐渐引起研究人员的兴趣。这一类RNA调控元件主要指核糖开关，核糖开关是一类首先在细菌5’非编码区发现的RNA元件，结构简单，由适体域和表达平台域组成，可在转录翻译过程中直接感知特异小分子浓度等变化来进行高效、准确的调控。出于更大基因调控范围的需求，有研究人员尝试了将适体核酶用于调控基因表达，由此诞生了适体核酶型的核糖开关。

适体核酶是专指由核酶和适体域组合形成的核酶，是一段寡核苷酸序列，既有与靶物质结合的高特异性和高亲和力的特性，又有核酶的催化活性，它们的催化活性受到别构效应物调节，可以起到开关的作用，在无配体存在时，不具有或者具有较低的活性，而在配体存在时，配体会与适体核酶上的适体域进行结合从而引起核酶的催化作用。目前使用较多的典型核糖开关在枯草芽孢杆菌中的效率普遍不高，尤其是碱基互补配对的不稳定导致的调控不严谨。因此，提供一种稳定高效的人工适体核酶对于蛋白质表达工程领域、代谢工程领域以及合成生物学领域有重要的意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种适体核酶型核糖开关调控元件以及利用该调控元件在枯草芽孢杆菌中实现对外源基因表达的调控的方法。本发明用基因调控元件替换转录起始位点后到目的基因之间包含RBS和SPACER的序列，在没有配体存在的情况下，SD被隐藏在茎环内，基因无法进行表达；加入配体后，由于适体域和配体结合产生的RNA二级结构的变化使得SD暴露出来，翻译起始，从而使得该质粒上的基因表达受配体调控。

本发明的第一个目的是提供一种调控目的蛋白表达的方法，用含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换目的蛋白基因的RBS和SPACER的序列；将替换后的目的基因连接在质粒转录起始位点后，并在细胞中表达；通过在细胞培养过程中添加茶碱，调控目的蛋白表达。

在本发明的一种实施方式中，添加终浓度为2-10mM的茶碱溶液。

在本发明的一种实施方式中，目的蛋白包括酶。

在本发明的一种实施方式中，枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB800或Bacillus subtilis pWB980。

本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，表达了RBS和SPACER序列被替换的基因，所述替换是用含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换RBS和SPACER序列。

本发明的第三个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，用含SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换目的蛋白基因的RBS和SPACER的序列；将替换后的目的基因连接在质粒转录起始位点后，转化到宿主细胞中。

本发明的第四个目的是提供上述方法在制备目的蛋白中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述方法在食品、化工或制药领域的应用。

本发明的第六个目的是提供上述基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。

本发明的第七个目的是提供上述基因工程菌在食品、化工或制药领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明采用茶碱适体域融合核酶的方式，得到了一种可调控外源蛋白表达的调控元件。该调控元件P_AZSDE1-BG8可以在枯草芽孢杆菌中调控外源基因的表达。当以绿色荧光蛋白基因为目的基因时，可以使荧光强度提高7.23倍；当以普鲁兰酶基因为目的基因时，加入4mM茶碱溶液，可以使普鲁兰酶的酶活从0.30886U/mL提高到6.07431U/mL。该过程中不需要其他蛋白因子的参与，并且能够有效快速地实现基因调控。

附图说明

图1：适体核酶基因PCR验证；其中，M：DNA分子量标准；1：适体核酶基因。

图2：在不同茶碱浓度条件下绿色荧光蛋白表达图(PBp43AZ-GFP-CM3bp-BG8)。

图3：绿色荧光蛋白表达的SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白分子量标准；1：枯草芽孢杆菌168空载；2：168/P_43AZGFP的破碎上清(0mM茶碱溶液)；3：168/P_43AZGFP的破碎上清(4mM茶碱溶液)。

图4：普鲁兰酶表达的SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白分子量标准；1：枯草芽孢杆菌168空载；2：168/P_43AZPUL的细胞破碎上清(0mM茶碱溶液)；3：168/P_43AZPUL的细胞破碎上清(4mM茶碱溶液)。

图5：普鲁兰酶的酶活图。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨(Tryptone)10；酵母提取物(Yeast extract)5；氯化钠(NaCl)10。

(二)枯草芽孢杆菌168转化方法

挑枯草芽孢杆菌168单菌落接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD₆₀₀。当OD₆₀₀约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min^-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min^-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min^-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃培养12-14h。

(三)绿色荧光蛋白GFP荧光检测

绿色荧光蛋白GFP荧光检测样品12000g离心5min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入Synergy TM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光495nm，发射光525nm，增益100，检测荧光强度。

(四)普鲁兰酶检测

取500μL 6％的普鲁兰糖底物，400μL pH 5.8的醋酸钠Buffer和100μL适当稀释酶液混合，65℃下反应15min，加入2mL DNS溶液，煮沸5min显色，待冷却后用蒸馏水补足体积至5mL，测定OD₅₅₀，每个反应做三个平行，每组测定做适当空白。

(五)P_pucSmTheo-E的构建方法

选择ZraI、EcoO109I两个酶切位点将合成的序列SEQ ID NO.1通过酶连方式将其连接至pUC57质粒上，构建质粒P_pucSmTheo-E。

实施例1：调控元件P_AZSDE1的基因序列的设计：

(1)根据Aptamer Database所提供的茶碱适体域序列和来源于曼氏血吸虫的锤头状核酶序列设计合成适体核酶序列SEQ ID NO.1；(2)根据合成的适体核酶序列设计引物P_SmTheo-E-as-T/P_SmTheo-E-as-B，以金唯智公司合成的含有上述适体核酶序列(SEQ ID NO.1)的质粒P_pucSmTheo-E为模板进行PCR，获得含有适体核酶序列的片段P_AZSDE1，并进行PCR验证(图1)，图1中条带大小为161bp，与预测结果大小一致，再以该片段作为大引物，PBSG11质粒为模板进行全质粒PCR，同时进行DNA测序，DNA测序结果表明适体核酶成功引入至原载体pBSG03(构建方法见Guan C,Cui W,Cheng J,et al.Construction and development of anauto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis[J].Microbial CellFactories,2015,14(1):150)RBS及SPACER位置，成功构建了新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，得到重组表达质粒P_43AZgfp。

基于类似的方法，并在质粒P_43AZgfp的基础上用引物SDE1CMDE 6N在通信模块处进行建库突变，成功构建了拥有不同调控功能的调控元件，在其中选择含有元件P_AZSDE1-BG8的菌株P43AZ-GFP-CM3bp-BG8作为后续验证菌株，培养过程中添加不同浓度的茶碱溶液，确认P_AZSDE1-BG8对GFP具有调控功能。

表1引物

注：NNN表示随机序列。

实施例2：绿色荧光蛋白的重组表达

将实施例1得到的序列正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃进行培养；按终OD₆₀₀为0.转接至含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，分别添加0mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM茶碱溶液，200rpm，温度37℃，培养24小时。测定荧光值(图2)，并取分别0mM和4mM茶碱溶液的样品破碎上清进行SDS-PAGE蛋白电泳。如图3所示，获得29kDa左右的电泳条带，且不同泳道条带的差异表明重组枯草芽孢杆菌成功分泌表达了GFP，并且实现了对其表达的调控。

表2不同浓度的茶碱溶液下重组绿色荧光蛋白的荧光值

茶碱溶液浓度(mM)	荧光强度(a.u./OD<sub>600</sub>)
		0	12018.7
2	51430.3
		4	71610.2
6	86924.0
		8	91653.8
10	98921.7

如图2和表2所示，绿色荧光蛋白的表达情况表现出明显的配体依赖，荧光表达随着诱导剂浓度的增加而升高。

实施例3：调控元件P_AZSDE1-BG8用于普鲁兰酶的表达

将普鲁兰酶基因(Genbank登录号：KX576675.1)克隆到PBSG03穿梭质粒上，然后用调控元件P_AZSDE1-BG8代替穿梭质粒上转录起始位点后的RBS及SPACER区域，得到含有调控元件和普鲁兰酶基因的重组表达质粒P_43AZPUL，然后将重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌，即得到基因工程菌，进行验证，结果如图4、5所示，调控元件能实现对普鲁兰酶的表达调控。不加茶碱时，普鲁兰酶的酶活为0.30886U/mL，当添加4mM茶碱溶液时，普鲁兰酶的酶活为6.07431U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种由茶碱调控的人工适体酶及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggacgacctc ctttggtaca tccagctgat gagtcccaaa taggacgaaa aaataggtga 60

taccagcatc gtcttgatgc ccttggcagc acctattttc ctggattcca caaaggaggt 120

aacaacaaga tg 132

<210> 2

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggacgacctc ctttggtaca tccagctgat gagtcccaaa taggacgaaa ggtgatacca 60

gcatcgtctt gatgcccttg gcagctcttc ctggattcca caaaggaggt aacaacaag 119

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgcgcgatta tgtaaaatat aaaggacgac ctcctttggt ac 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gttcttctcc tttactcatc ttgttgttac ctcctttgtg g 41

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

cccaaatagg acgaaannng ataccagcat cgtcttgatg cccttgg 47

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

gtggaatcca ggannngctg ccaagggcat caagacgatg ct 42

Claims (10)

1.一种调控目的蛋白表达的方法，其特征在于，用含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换目的蛋白基因的RBS和SPACER序列；将替换后的目的基因连接在质粒转录起始位点后，并在细胞中表达；通过在细胞培养过程中添加茶碱，调控目的蛋白表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加终浓度为2-10mM的茶碱溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，目的蛋白包括酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis168。

5.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达了RBS和SPACER序列被替换的基因，所述替换是用含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换RBS和SPACER序列。

6.一种权利要求5所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，用含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列替换目的蛋白基因的RBS和SPACER序列；将替换后的目的基因连接在质粒转录起始位点后，转化到宿主细胞中。

7.权利要求1-4任一所述的方法在制备目的蛋白中的应用。

8.权利要求1-4任一所述的方法在食品、化工或制药领域的应用。

9.权利要求5所述基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。

10.权利要求5所述基因工程菌在食品、化工或制药领域的应用。