CN116837019A

CN116837019A - 基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法及应用

Info

Publication number: CN116837019A
Application number: CN202310866641.4A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 叶超; 施天穹; 钱金旖; 李雅文
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2023-07-14
Filing date: 2023-07-14
Publication date: 2023-10-03

Abstract

本发明公开了一种基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法及应用，属于系统生物学领域，该方法通过首次构建得的藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，获得藤仓赤霉菌的优化培养条件与遗传改造靶点，将优化培养条件用于发酵生产赤霉素GA₃，能够显著提高赤霉素GA₃产量，通过过表达遗传改造靶点，构建基因工程菌，经发酵，能使赤霉素GA₃产量提高75.0％。本发明的藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型可用于指导藤仓赤霉菌的发酵生产，解决传统正交试验方法周期长、成本高、存在不确定性和随机性的问题。

Description

基于模型指导提高赤霉素GA3产量的方法及应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及提高赤霉素GA₃产量的方法，具体地说是一种基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法及应用。

背景技术

赤霉素是一种天然植物激素，但在植物、细菌和真菌中分离的赤霉素仅少数具有活性，其中，赤霉素GA₃因其活性强，在调节植物休眠、促进茎和果实生长等方面具有广泛的应用前景而备受关注，具有良好的经济价值和社会效益，市场需求量大。

目前，赤霉素GA₃的生产方法主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。然而，植物提取法和化学合成法均存在产量低、成本高、产生污染废弃物多等问题，虽然微生物发酵法是目前更节约和绿色的方法，但传统的微生物发酵法操作繁琐、发酵耗时长，且发酵生产赤霉素GA₃的优势菌株，如藤仓赤霉菌，存在代谢网络复杂、部分参与代谢的关键基因未被发现等问题，导致直接利用藤仓赤霉菌发酵的代谢产物产量较低，极大限制各种代谢产物的产业化。因此，需要系统地探究藤仓赤霉菌的生理代谢特性，为发酵条件的优化和提高代谢物产量提供依据。

在探究藤仓赤霉菌的生理代谢特性过程中，采用传统正交试验方法存在周期长、成本高、存在不确定性和随机性的问题，随着生物信息学的发展，采用基因组规模代谢网络模型，有助于加快研究的进程和提高研究效率，但目前的基因组规模代谢在谷氨酸棒杆菌等代谢网络较清晰的原核微生物中应用较多，对于代谢网络复杂、参与代谢的关键基因发现少的真菌，构建相关模型时存在代谢反应分区和细胞组分确定困难的问题，目前尚无藤仓赤霉菌相关模型。

发明内容

本发明的一个目的，是要提供一种基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，该方法基于首次构建的藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，对藤仓赤霉菌发酵生产赤霉素GA₃的发酵培养条件进行优化，对藤仓赤霉菌相关基因进行遗传改造，以解决传统正交试验方法周期长、成本高、存在不确定性和随机性的问题；

本发明另外的目的，是要提供上述方法在提高赤霉素GA₃产量中的应用，利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，构建基因工程菌，达到显著提高赤霉素GA₃产量的目的；

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于模型指导提高赤霉素GA3产量的方法，包括依次进行的以下步骤：

1)构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型

获取基因组规模代谢网络模型所需的代谢反应数据及基因组数据，构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型，通过底物吸收速率和碳氮源的利用率，提高藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型的准确性，得到藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，标记为iCY1235；

本发明中，藤仓赤霉菌蛋白质组为藤仓赤霉菌CBS 195.34(蛋白质组数据来自Uniprot数据库)，拉丁名为Fusarium fujikuroi CBS 195.34。

2)获得藤仓赤霉菌的优化培养条件与遗传改造靶点

利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，模拟藤仓赤霉菌的发酵培养，获得藤仓赤霉菌的优化培养条件；

利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，模拟藤仓赤霉菌的赤霉素GA₃合成反应，利用OptForce算法预测得遗传改造靶点；

3)发酵生产赤霉素GA₃

利用优化培养条件发酵培养藤仓赤霉菌，生产赤霉素GA₃；

和/或将过表达遗传改造靶点的藤仓赤霉菌工程菌用于发酵培养，生产赤霉素GA₃。

作为本发明的进一步限定，所述培养用到的培养基中碳源除了葡萄糖、还可以为淀粉、甘露醇、蔗糖、甘油或果糖。

作为本发明的一种限定，所述藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型的分区为细胞膜区(c)、线粒体区(m)、过氧化物酶体区(p)和细胞外区(e)。

作为本发明的进一步限定，所述优化培养条件为：将藤仓赤霉菌接入种子培养基，于28℃且200rpm条件下种子培养2天，得发酵液；

将发酵液以10v/v％的接种量接入发酵培养基，于28℃且200rpm条件下，控制氧气吸收速率为3-7mmol·gDW^-1·h^-1，发酵培养8天。

作为本发明的再进一步限定，所述种子培养基的组分包括：60g/L葡萄糖，5.5g/L酵母粉，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，1.5g/L KH₂PO₄；

所述发酵培养基的组分包括：90g/L甘露醇，12g/L脱脂豆粕，0.1g/LMgSO₄·7H₂O，1.5g/L KH₂PO₄。

作为本发明的另一种限定，遗传改造靶点是FFUJ_02053基因(Acetyl-coenzyme Asynthetase,EC 6.2.1.1)或FFUJ_14337(P450-3，EC 1.-.-.-)基因

本发明还提供了上述基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法在构建高产赤霉素GA₃的藤仓赤霉菌工程菌中的应用，所述藤仓赤霉菌工程菌使遗传改造靶点在藤仓赤霉菌中过表达。

作为本发明的一种限定，通过引物扩增FFUJ_02053基因或FFUJ_14337基因至pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT质粒骨架，构建重组质粒后，经转化，制得所述藤仓赤霉菌工程菌。

作为本发明的再进一步限定，所述FFUJ_02053基因的引物序列为：

FFUJ_02053-PCR-F:

TACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGCGTCAACCCATATCGACACAGCC；

FFUJ_02053-PCR-R:

TCATTTCAGAAATAAGTTGCGCAATCTGTTCTATCAGGTTTTGTCA；

所述FFUJ_14337基因的引物序列为：

FFUJ_14337-PCR-F:

GCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGAGTAATTTTGTGACGTTGATTGA；

FFUJ_14337-PCR-R:

TCATTTCAGAAATAAGTTGCTCATCTCCTTCGCATCTCAAGA。

由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，首次构建了藤仓赤霉菌的基因组规模代谢网络模型iCY1235，该模型包含1752个反应，1979个代谢物和1235个基因，且细胞分区全面，对细胞质基质、细胞核、细胞质膜、高尔基体、溶酶体、细胞骨架和内质网均进行细致分区，填补了藤仓赤霉菌在基因组规模代谢网络模型上的空白；

模型中全面的反应通路为优化培养条件和确定代谢反应中的遗传改造靶点提供数据支撑，通过模型模拟、分析和实验验证，确定甘露醇是藤仓赤霉菌生长的优势碳源，最优摇瓶发酵转速为200rpm，同时确定上调基因为FFUJ_02053(Acetyl-coenzyme Asynthetase,EC 6.2.1.1)和FFUJ_14337(P450-3，EC 1.-.-.-)；

应用本发明的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法构建工程菌，将遗传改造靶点在藤仓赤霉菌基因组中过表达，能使赤霉素GA₃产量分别增加37.5％和75.0％。

本发明的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，通过模型模拟和预测藤仓赤霉菌的发酵培养和赤霉素GA₃合成反应，获得优化培养条件和遗传改造靶点，用于优化赤霉素GA₃的发酵生产，大大缩短了发酵时间，节约了发酵成本，减少实验误差，提高了实验精度。

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同碳源摄取速率下模型预测和实际菌的生长速率结果图；

图2为本发明实施例1中利用iCY1235模型所得生长速率和赤霉素GA₃产量结果图；

图3为本发明实施例1中不同碳源的摇瓶发酵实验中赤霉素GA₃产量结果图；

图4为本发明实施例1中利用iCY1235模型所得预测结果图，图4a为预测氧气吸收速率对菌体生长的影响结果图，图4b为预测氧气吸收速率对赤霉素GA₃合成速率的影响结果图；

图5为本发明实施例1中搅拌速度对赤霉素GA₃产率的影响结果图；

图6为本发明实施例1中质粒FfCas9-HPH-Bik5-HR图谱；

图7为本发明实施例1中质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT图谱；

图8为本发明实施例1中质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_02053图谱；

图9为本发明实施例1中质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_14337图谱；

图10为本发明实施例2中采用藤仓赤霉菌工程菌发酵生产赤霉素GA₃的结果图；

图11为本发明实施例2中采用藤仓赤霉菌工程菌发酵生产赤霉素GA₃中甲羟戊酸的检测结果图；

图12为本发明模型对比例中必需基因的代谢亚系统分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

实施例中的分子生物学实验操作包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如转化采用的感受态细胞法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

实施例1基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法

1)构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型

包括依次进行的以下步骤：

(1)构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型

从Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)获取藤仓赤霉菌的蛋白质组数据，通过Model SEED自动建模工具及Cobra 3.0工具箱的xls2model.m指令转化工具，构建计算机可读的数学模型为藤仓赤霉菌的粗模型，该粗模型包含1302个反应，1398个代谢物，965个基因。在Matlab上对粗模型进行精炼，包括：代谢物信息统一、代谢反应分区及添加生物量方程等。

其中，代谢物信息统一是通过比较基因注释结果和代谢通路图，向粗模型中添加缺失的反应和代谢物，修改错误的反应，统一同一种代谢物的表达方式；

代谢反应分区是利用DeepLoc 2.0工具，将模型区室扩展到四个：细胞膜区(c)、线粒体区(m)、过氧化物酶体区(p)和细胞外区(e)。其中，细胞膜分区包含了细胞质基质、细胞核、细胞质膜、高尔基体、溶酶体、细胞骨架、内质网；

添加生物量方程则是由于粗模型中含有大量的空白，且常见的生物量函数无满足后续的各种预测，因此需要添加生物量方程。生物量方程是用于模拟细胞生长的目标方程，通过文献挖掘，结合藤仓赤霉菌的基因组信息，参照现有的酿酒酵母、土曲霉和黑曲霉的模型，确定藤仓赤霉菌的生物量成分及系数，如表1，得到生物量方程。

通过上述模型精炼，构建得藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型iCY1235，包含1752个反应，1979个代谢物和1235个基因。与粗模型相比，反应数、代谢物数和基因数分别增加了34.6％、41.6％和28.0％。

(2)藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型iCY1235的验证

具体准确性验证方法如下：

i、利用iCY1235模型验证葡萄糖吸收速率对藤仓赤霉菌的影响

通过文献挖掘，收集在不同葡萄糖摄取率(GUR)下，藤仓赤霉菌的生长速率。利用iCY1235模型进行FBA通量平衡分析，模拟各种葡萄糖摄取条件下菌体的生长情况。模拟结果与实际实验结果表现出很强的线性相关性，如图1所示，其中Pearson相关系数(PCC)为0.9760，P值＝1.6922e-04。

ii、利用iCY1235模型验证碳氮源的利用能力

在分析碳源的利用能力时，选择NH₃作为氮源，分别以葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油、果糖和甘露醇共六种物质作为唯一碳源，在好氧条件下，模拟菌体的生长情况。如果初模型模拟的生长速率大于零，则说明这种培养条件能够支持菌体生长；反之，则说明菌体无法适应给定的碳源。

在分析氮源的利用能力时，方法和分析碳源时相同，氮源的选择为氯化铵、硝酸铵和硝酸钾。比较发现，模拟结果与实际实验结果吻合，如表2。

2)获得藤仓赤霉菌的优化培养条件与遗传改造靶点

2.1)利用iCY1235模型，模拟藤仓赤霉菌的发酵培养，获得藤仓赤霉菌的优化培养条件；具体方法如下：

(i)基于iCY1235模型模拟发酵培养基中碳源对赤霉素GA₃产量的影响

利用iCY1235模型，采用通量平衡分析(Flux balance analysis,FBA)算法计算生长速率和GA₃合成速率。在葡萄糖、淀粉、甘露醇、蔗糖、甘油和果糖这6种碳源底物的模拟中，甘露醇作为碳源时，最大细胞生长速率(μmax)为0.19/h，比葡萄糖提高14.0％；同时，GA₃的合成速率为0.71mmol/gDW/h，比葡萄糖高7.8％，如图2。进一步分析发现，Acetate:CoA ligase催化反应产生的乙酰辅酶A通量增加，表明甘露醇可以为GA₃的合成提供更多的乙酰辅酶A。

分别以葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油、果糖和甘露醇这六种底物作为发酵培养基的碳源，进行摇瓶发酵实验，实验结果表明以甘露醇作为底物，赤霉素GA₃含量达到0.8g/L，比葡萄糖作为底物的产量高11.1％，如图3。因此，模拟结果与实验结果一致，表明甘露醇作为碳源能有效提高赤霉素GA₃产量。

(i i)基于iCY1235模型模拟氧气吸收速率对赤霉素GA₃产量的影响

利用iCY1235模型，基于Matlab采用鲁棒性分析模拟氧气吸收速率对藤仓赤霉菌的细胞生长和GA₃合成的影响。在细胞生长期，当氧气吸收速率(OUR)低于17.03mmol·gDW^-1·h^-1时，细胞生长速率持续升高，μmax为0.16/h；然而，当OUR超过17.03mmol·gDW^-1·h^-1时，细胞生长速率开始下降，最终达到0，如图4a。同样，在GA₃合成阶段，随着OUR的增加，GA3合成速率增加到最大值，为0.65mmol·gDW^-1·h^-1。当OUR达到4.23mmol·gDW^-1·h^-1时，GA₃的合成会降低，如图4b，控制氧气吸收速率为3-7mmol·gDW^-1·h^-1，产量较高。

为了验证OUR对GA₃生成的影响，在不同搅拌速度下进行了实际实验。当搅拌速度设置为200rpm时，GA₃的产率达到最大值810.3mg/L，如图5，一旦搅拌速度增加到250rpm，GA₃的产量就会显著下降，这与模拟结果一致。这些结果表明，发酵过程中过量的氧气会抑制GA₃的积累，而相对较低的DO水平有利于GA₃的产生。

通过上述实验，获得藤仓赤霉菌的优化培养条件为：

将藤仓赤霉菌接入种子培养基，于28℃且200rpm条件下种子培养2天，得发酵液；

其中，种子培养基的组分包括：60g/L葡萄糖，5.5g/L酵母粉，0.2g/LMgSO₄·7H₂O，1.5g/L KH₂PO₄；

发酵培养基的组分包括：90g/L甘露醇，12g/L脱脂豆粕，0.1g/LMgSO₄·7H₂O，1.5g/L KH₂PO₄。

此外，在另外的实施方式中，发酵培养基中甘露醇还可替换为葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油或果糖。

2.2)利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，模拟藤仓赤霉菌的赤霉素GA3合成反应，利用OptForce算法预测遗传改造靶点；具体方法如下：

利用OptForce算法识别提高赤霉素GA₃产量的潜在的遗传改造靶点。当设定赤霉素GA₃交换反应为目标函数时，有20个反应被确定为目标，去除掉缺少基因的反应，还剩下14组潜在组合，如表3。通过上调、下调或敲除能催化这些反应的酶的编码基因，将GA₃产量增加1.2倍。选择其中两个过表达基作为遗传改造靶点分别是FFUJ_02053(Acetyl-coenzyme A synthetase,EC 6.2.1.1)基因和FFUJ_14337(P450-3，EC 1.-.-.-)基因，其中，FFUJ_02053基因全长为2247bp，FFUJ_14337基因全长为1794bp。

表3潜在靶点的组合

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3)发酵生产赤霉素GA₃

利用优化培养条件发酵培养藤仓赤霉菌，生产赤霉素GA₃；

挑取藤仓赤霉菌接入100mL种子培养基，于28℃且200rpm条件下种子培养2天，得发酵液；

将发酵液以10v/v％的接种量接入发酵培养基，于28℃且200rpm条件下，控制氧气吸收速率为4.5mmol·gDW^-1·h^-1，发酵培养8天，以生产赤霉素GA3，经检测，发酵培养第8天，赤霉素GA3产量为790mg/L。

其中，种子培养基的制备方法为：60g葡萄糖，5.5g酵母粉，0.2gMgSO₄·7H₂O，1.5gKH₂PO₄,加入蒸馏水，搅拌混匀，定容至1L；

发酵培养基的的制备方法为：90g甘露醇，12g脱脂豆粕，0.1gMgSO₄·7H₂O，1.5gKH₂PO₄，加入蒸馏水，搅拌混匀，定容至1L。

实施例2构建藤仓赤霉菌工程菌发酵生产赤霉素GA₃

本实施例分别采用过表达FFUJ_02053基因和FFUJ_14337基因的藤仓赤霉菌工程菌生产赤霉素GA₃，其中，初始菌株为藤仓赤霉菌NRF-C1(保藏号为CCTCC M 20231195)，两种藤仓赤霉菌工程菌的构建方法如下：

以质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-sgRNA为基础骨架，主要包括fFuCas9基因、功能性crRNA、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph；使用强启动子pGPD转录fFuCas9基因，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph。其中，引物序列如表4；

①FfCas9-HPH-Bik5-HR

a)pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-sgRNA质粒经过speⅠ酶切后，插入靶向BIK5基因的N20序列，构建质粒pfFCas9-hph-sgRNA-N20BIK5；

b)pfFCas9-hph-sgRNA-N20Bik5质粒经过pmeI酶切后，插入比卡菌素基因簇的上游同源臂序列，构建质粒pfFCas9-hph-BIK5-UP；

c)pCpf1Ff-DR-BIK3-UP质粒经过swaI酶切后，插入比卡菌素基因簇的下游同源臂序列，构建质粒pfFCas9-hph-BIK5-HR，质粒图谱如图6；

②pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT

a)FfCas9-HPH-Bik5-HR质粒经过PmlI酶切后，插入启动子pGPD，并在后面保留PmlI酶切位点，得到质粒FfCas9-HPH-Bik5-HR-pGPD；

b)FfCas9-HPH-Bik5-HR-pGPD经过PmlI再次酶切，在插入第二个片段(终止子T1)时，在启动子和终止子之间设计一个新的酶切位点SpeI，得到质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT，质粒图谱如图7；

③pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_02053

pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT质粒经过SpeI酶切后，设计一对引物FFUJ_02053-PCR-F/R从藤仓赤霉菌基因组中扩增片段FFUJ_02053(2247 bp)，一步克隆得到质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_02053，质粒图谱如图8，即为过表达FFUJ_02053基因的藤仓赤霉菌工程菌。

④pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_14337

pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT质粒经过SpeI酶切后，设计一对引物FFUJ_14337-PCR-F/R从藤仓赤霉菌基因组中扩增片段FFUJ_14337(1794 bp)，一步克隆得到质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT-FFUJ_14337，质粒图谱如图9，即为过表达FFUJ_14337基因的藤仓赤霉菌工程菌。

表4引物序列

按照3)发酵生产赤霉素GA₃中的优化培养条件，分别采用过表达FFUJ_02053基因和FFUJ_14337基因的藤仓赤霉菌工程菌生产赤霉素GA₃，以c初始菌株为对照组，通过高效液相色谱仪检测赤霉素GA₃产量，具体检测方法如下：

采用高效液相色谱仪(Dionex U3000)和Venusil MPC18色谱柱(5μm，AgelaTechnologies公司)进行GA₃分析。取2mL发酵液，12000g离心2min，上清通过0.22μm滤膜，注入液相小瓶中。流速为0.3mL/min，检测波长210nm，进样量10μL，GA₃的保留时间为23.12min。将0.1g GA₃标准品用10ml甲醇稀释成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8g/L的溶液，制作标准曲线，用0.22μm孔径的有机滤膜过滤，进行液相分析。制作标准曲线，公式为：Y＝36960282.88*X+3357763.402(R²＝0.990982298)，其中Y为峰面积，X为GA3浓度(g/L)；量化检测结果，如图10。

甲羟戊酸是赤霉素GA₃的前体物质，为研究赤霉素GA₃，在测定其产量的同时，还测定了甲羟戊酸的产量，如图11。测定方法如下：

将280μL发酵液上清与70μL的300mmol/L HCl和过量的无水硫酸钠混合，将甲羟戊酸从酸形式转化为内酯形式。接下来，向每个样品中添加350μL乙酸乙酯，然后在漩涡振荡仪上以最大速度震荡5min，将无水硫酸钠充分溶解。然后12000r/min离心5min，取有机层转移到气质进样瓶中。最后通过气相色谱/质谱仪(GC/MS)分析有机层中的甲羟戊酸酯。

使用岛津气相色谱质谱联用仪(GC/MS)采用液体自动进样，对样品进行分析。使用Rtx-Wax柱子在GC上分离样品。氦气为载气，采用分流上样，分流比5:1，进样口温度250℃，柱温箱温度50℃持续两分钟，以20℃/min将温度提升至230℃保持6min。离子源温度230℃，扫描时间从3.5min到17min，扫描30-350m/z。

图10-图11表明，FFUJ_02053基因或FFUJ_14337基因过表达会增加赤霉素GA₃合成。通过本发明的iCY1235模型分析藤仓赤霉菌碳代谢路径，FFUJ_02053基因增加了前体乙酰辅酶A的合成，为赤霉素GA₃合成提供了充足的乙酰辅酶A底物反应池；FFUJ_14337基因负责最后一步GA₇向赤霉素GA₃的转化，是提高赤霉素GA₃合成有效直观的策略。上述实际实验表明，通过过表达这两种基因，赤霉素GA₃产量为1.1g/L和1.4g/L，分别比对照组的0.8g/L，提高了37.5％和75.0％。甲羟戊酸产量从对照组的0.7g/L降低到0.3g/L以及0.1g/L，推测随着GA3的大量合成，中间产物甲羟戊酸被消耗掉，使得代谢流从堵塞状态变成疏通状态。上述结果证明此模型可预测参与赤霉素GA₃合成的相关基因，并被应用于提高赤霉素GA₃的产量。

模型对比例

对于iCY1235模型进行特征分析，以对比与粗模型的区别，具体如下：

藤仓赤霉菌的基因组规模代谢网络模型iCY1235，该模型包含1752个反应，1979个代谢物和1235个基因。

与粗模型相比，iCY1235模型的大部分参数都有增加。其中，如表5，iCY1235模型的节点数和边数为4437和10807，分别增加了21.1％和10.0％。然而，iCY1235模型的平均邻居数为4.871，表明iCY1235模型的网络在增加了缺失反应后更加紧凑。iCY1235模型的基因覆盖率为8.4％。与其他基因组规模代谢网络模型相比，基因数量高于所有已发表的真核生物基因组规模代谢网络模型的平均数量1043。此外，iCY1235模型代谢物数量为1979，也高于真核生物基因组规模代谢网络模型的平均数量1654。

依次删除每个基因，利用iCY1235模型，分析在基础培养基下藤仓赤霉菌各个基因的重要性。基因的重要性结果显示，在基础培养基中，共有65个必需基因，11个部分必需基因；在这些必需基因中，30.8％与辅助因子和维生素的代谢有关。核苷酸代谢相关基因占23.1％，如图12，将这些必需基因与DEG数据库(Database of Essential Genes)进行比较，结果显示有41个基因(准确率63.1％)是匹配的，具体结果identity≥40％,e-value≤1e-3。

表5两模型代谢网络比较表

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims

1.一种基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，包括依次进行的以下步骤：

1)构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型

获取基因组规模代谢网络模型所需的代谢反应数据及基因组数据，构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型，通过底物吸收速率和碳氮源的利用率提高藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型的准确性，得到藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型；

2)获得藤仓赤霉菌的优化培养条件与遗传改造靶点

3)发酵生产赤霉素GA₃

利用优化培养条件发酵培养藤仓赤霉菌，生产赤霉素GA₃；

和/或将过表达所述遗传改造靶点的藤仓赤霉菌工程菌用于发酵培养，生产赤霉素GA₃。

2.根据权利要求1所述的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，所述藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型分区为细胞膜区、线粒体区、过氧化物酶体区和细胞外区。

3.根据权利要求2所述的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，所述优化培养条件为：

4.根据权利要求3所述的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分包括：60g/L葡萄糖，5.5g/L酵母粉，0.2g/LMgSO₄·7H₂O和1.5g/L KH₂PO₄；

5.根据权利要求3所述的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，所述发酵培养基中碳源为葡萄糖、淀粉、甘露醇、蔗糖、甘油或果糖。

6.根据权利要求2所述的基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法，其特征在于，所述遗传改造靶点是FFUJ_02053基因或FFUJ_14337基因。

7.基于模型指导提高赤霉素GA₃产量的方法在构建高产赤霉素GA₃的藤仓赤霉菌工程菌中的应用，其特征在于，所述藤仓赤霉菌工程菌使遗传改造靶点在藤仓赤霉菌中过表达。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过引物扩增FFUJ_02053基因或FFUJ_14337基因至pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-bik5-GT质粒骨架，构建重组质粒后，经转化，制得所述藤仓赤霉菌工程菌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述FFUJ_02053基因的扩增引物序列为：

FFUJ_02053-PCR-F:

TACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGCGTCAACCCATATCGACACAGCC；

FFUJ_02053-PCR-R:

TCATTTCAGAAATAAGTTGCGCAATCTGTTCTATCAGGTTTTGTCA；

所述FFUJ_14337基因的扩增引物序列为：

FFUJ_14337-PCR-F:

GCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGAGTAATTTTGTGACGTTGATTGA；

FFUJ_14337-PCR-R:

TCATTTCAGAAATAAGTTGCTCATCTCCTTCGCATCTCAAGA。