CN102597224A - 用于在丝状真菌中改善苹果酸产生的方法 - Google Patents
用于在丝状真菌中改善苹果酸产生的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102597224A CN102597224A CN2010800494904A CN201080049490A CN102597224A CN 102597224 A CN102597224 A CN 102597224A CN 2010800494904 A CN2010800494904 A CN 2010800494904A CN 201080049490 A CN201080049490 A CN 201080049490A CN 102597224 A CN102597224 A CN 102597224A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- dicarboxylicacid
- polynucleotide
- translocator
- host cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法,包括:(a)培养丝状真菌宿主细胞,所述宿主细胞包含选自下组的多核苷酸:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸;其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,能够分泌增加水平的C4二羧酸;和(b)回收所述C4二羧酸。本发明还涉及用于增加C4二羧酸产生的方法,丝状真菌宿主细胞和苹果酸脱氢酶变体。
Description
对相关申请的交叉引用
该申请要求2009年9月1日提交的美国临时申请号61/238,962;2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327,224;和2010年6月21日提交的美国申请号61/356,971的优先权权益。这些申请通过全文提述并入本文。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于在丝状真菌中改善C4二羧酸产生的方法。
背景技术
有机酸在多种工业中具有悠久历史的商业使用。举例而言,有机酸用于食品和饲料工业(柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸),作为用于产生多种聚合物的单体(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸),作为金属螯合剂(葡糖酸)和作为“绿色”溶剂(乙酸)(Sauer等,2008,Trends in Biotechnology 26:100-108)。有机酸自身可为商业产品或其可为用于制造其他化学品的化学构件(building block)。除了专门用途之外,长久以来公认C4二羧酸亦可充当构件化合物以供产生大体积的工业化学品,如1,4-丁二醇,四氢呋喃和γ-丁内酯。由于石油衍生构件的高成本,通过传统石油化学途径产生这些大体积工业化学品的成本显著增加。
有机酸在商业上是通过从石油衍生原料的化学合成(例如,延胡索酸、苹果酸、丙烯酸和己二酸)或通过微生物发酵(例如柠檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)产生的。一些有机酸如延胡索酸和苹果酸亦可通过微生物发酵来产生,但由于更低的生产成本,目前在商业上仍通过化学合成从石油化学原料产生。然而,石油衍生构件化学品的成本的日益升高,地缘政治的不稳定性对原油价格的影响,以及对实施利用来源于可再生资源的原料的制造工艺的需要,刺激了通过微生物发酵产生有机酸和其他化学品中的重建的兴趣。
虽然现在通过化学合成从石油化学原料商业性产生苹果酸,其亦可通过微生物发酵产生。苹果酸已在基因工程的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia))(Zelle等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的丝状真菌如曲霉属菌种(Aspergillus spp.)(美国专利号3,063,910;Bercovitz等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中以高水平产生。Abe等(美国专利号3,063,910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)报道了在几种曲霉属菌种中高水平的苹果酸产生。而且,Battat等(1991,Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)报道了在优化条件下在搅拌的发酵罐中由黄曲霉(Aspergillusflavus)产生了高至113g/L的苹果酸。在WO2010/003728中描述了通过微生物发酵产生二羧酸。亦在WO2009/011974和WO2009/155382中描述了通过微生物发酵产生苹果酸。通过对曲霉属(Aspergillus)进行遗传工程改造改善苹果酸产生会使得能够通过发酵经济地商业性生产苹果酸。
在曲霉属菌种(Aspergillus spp.)中的苹果酸过量产生在特定的培养条件(有氧条件和高C∶N比;碳酸钙亦作为中和剂和作为对于苹果酸生物合成的CO2源添加)下发生。在这些条件下,通过胞质溶胶的、还原性三羧酸(TCA)循环的溢出代谢(overflow metabolism)导致增加的苹果酸生物合成和分泌入培养基。已在酿酒酵母中报道了通过使用遗传工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等,1999,FEMS Microbiol Lett.179:107-113)或苹果酸脱氢酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加苹果酸转运蛋白的表达(Zelle等,2008,见上)增加苹果酸产生。基于生物化学证据,提出了在黄曲霉菌株ATCC 13697中,苹果酸脱氢酶活性限制苹果酸产生(Peleg等,1988,Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。然而,在曲霉属中并未显示作为使用重组DNA技术的遗传工程改造结果的苹果酸产生的直接改善。
本发明涉及在丝状真菌中用于改善C4二羧酸产生,如苹果酸产生的方法。
发明内容
本发明涉及产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法,包括:(a)培养丝状真菌宿主细胞,所述宿主细胞包含一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸;其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸;和(b)回收所述C4二羧酸。
本发明亦涉及用于相对于亲本宿主细胞,增加C4二羧酸产生(例如苹果酸产生)的方法,包括:(a)将一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸转化入丝状真菌宿主细胞:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸;(b)在培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞;和(c)回收所述C4二羧酸。
本发明还涉及丝状真菌宿主细胞,其包含一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
在一个方面,所述异源第二多核苷酸编码亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代;其中所述缺失和取代减少苹果酸脱氢酶变体的体内线粒体摄入,由此增加了胞质溶胶中苹果酸脱氢酶变体的水平,且其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码苹果酸脱氢酶变体的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的苹果酸。
本发明还涉及亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代,其中所述变体具有苹果酸脱氢酶活性。
本发明还涉及编码苹果酸脱氢酶变体的分离的多核苷酸,和包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞。
附图说明
图1显示pShTh60的限制图谱。
图2显示pShTh104的限制图谱。
图3显示米曲霉(Aspergillus oryzae)NRRL 3488C4二羧酸转运蛋白基因(mae3)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:7和8)。
图4显示pShTh73的限制图谱。
图5显示米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶I基因(mdh1)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:17和18)。
图6显示pShTh71的限制图谱。
图7显示米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶3基因(mdh3)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:19和20)。
图8显示pSaMF21的限制图谱。
图9显示米曲霉NRRL 3488丙酮酸羧化酶基因(pyc)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:26和27)。
图10显示pRYAN1的限制图谱。
图11显示pAtC4T的限制图谱。
图12显示pShTh122AtC4t的限制图谱。
图13显示土曲霉C4二羧酸转运蛋白基因(atc4t)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:33和34)
图14显示p0941304_sspMAE1_pMK的限制图谱。
图15显示pSaMF27的限制图谱。
图16A和16B显示粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)C4二羧酸转运蛋白基因(mae1)的基因组密码子优化的DNA序列(CO),推导的氨基酸序列和基因组野生型DNA序列(WT)(分别为SEQ ID NO:35,36和37)。
定义
C4二羧酸转运蛋白:术语“C4二羧酸转运蛋白”在本文中定义为可将苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸转运至细胞外的二羧酸通透酶(Grobler等,1995,Yeast 11:1485-1491;Camarasa等,2001,Applied andEnvironmental Microbiology 67:4144-4151)。用于预测线粒体输入的蛋白及其靶向序列的计算方法如Claros和Vincens,1996,Eur.J.Biochem.241:779-786所述。
所述C4二羧酸转运蛋白具有SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34和/或SEQ IDNO:36的苹果酸转运蛋白活性的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%。
苹果酸脱氢酶:术语“苹果酸脱氢酶”在本文中定义为在NADH+H+的存在下催化将草酰乙酸还原为苹果酸和NAD+的苹果酸:NAD+氧还酶(EC 1.1.1.37)。就本发明而言,根据下述步骤确定苹果酸脱氢酶活性。测定溶液由1mM草酰乙酸,100mM Tris pH 8.0,10mM NaHCO3,5mM MgCl2,和0.1mM NADH(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)组成。将不含草酰乙酸作为底物的测定溶液作为对照运行以测量背景NADH降解率。用双蒸水制备每种上清的1/100,1/500,1/2500和1/12500的稀释。将测定溶液的270μl的等分试样分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每种稀释的上清的30μl样品以起始测定。使用SPECTRAMAX340PC读板器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)以下述设定监测反应:340nm,动力学读取。使用NADH的浓度系列以构建标准曲线,并使用纯化的苹果酸脱氢酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的稀释系列用作阳性对照。一单位的苹果酸脱氢酶活性等于能够在pH 8.0,25℃每分钟将1微摩尔草酰乙酸和NADH+H+转化为苹果酸和NAD+的酶量。
所述苹果酸脱氢酶具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的苹果酸脱氢酶活性的至少20%,例如,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%。
丙酮酸羧化酶:术语“丙酮酸羧化酶”在本文中定义为在ATP和HCO3 -存在下催化将丙酮酸羧化为草酰乙酸,ADP和磷酸的丙酮酸:二氧化碳连接酶(ADP-形成)(EC 6.4.1.1)。就本发明而言,根据针对丙酮酸羧化酶的SIGMAQuality Control Test步骤(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的步骤,除了该测定使用pH 8.0的Tris缓冲液,确定丙酮酸羧化酶活性。一单位的丙酮酸羧化酶活性等于能够在pH 7.8,30℃每分钟将1微摩尔的丙酮酸和CO2转化为草酰乙酸的酶量。
所述丙酮酸羧化酶具有SEQ ID NO:27的丙酮酸羧化酶活性的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%。
异源多核苷酸:术语“异源多核苷酸”在本文中定义为对于宿主细胞并非天然的多核苷酸;其中编码区经结构修饰的天然多核苷酸;作为通过重组DNA技术(例如,不同的(外源)启动子)操纵DNA的结果使其表达定量改变的天然多核苷酸;或通过将一个或多个(几个)额外拷贝的多核苷酸导入宿主细胞而使其表达定量改变的天然多核苷酸。
分离的多肽:术语“分离的多肽”用于本文指一种自来源分离的多肽。在一个优选的方面,如通过SDS-PAGE确定的,该多肽至少是1%纯的,例如至少是5%纯的,至少是10%纯的,至少是20%纯的,至少是40%纯的,至少是60%纯的,至少是80%纯的,至少是90%纯的,至少是95%纯的,至少是96%纯的,至少是97%纯的,至少是98%纯的,至少是99%纯的,至少是99.5%纯的,或100%纯的。
基本上(substantially)纯的多肽:术语“基本上纯的多肽”在本文中指一种多肽制备物,其包含至多10%,例如,至多8%,至多6%,至多5%,至多4%,至多3%,至多2%,至多1%,至多0.5%以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。因此,优选地,基本上纯的多肽是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少92%纯的,例如至少94%纯的,至少95%纯的,至少96%纯的,至少97%纯的,至少98%纯的,至少99%纯的,至少99.5%纯的,或100%纯的。多肽优选为基本上纯的形式。即,所述多肽制备物基本上不含其他与其天然或重组结合的多肽物质。其可通过,例如,以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽而达成。
同一性:两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。
就本发明而言,两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The European Molecular BiologyOpen Software Suite),Rice等,2000,Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本发明而言,两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),Rice等,2000,见上)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5,和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。
同源序列:术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36的米曲霉C4二羧酸转运蛋白,SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20的米曲霉苹果酸脱氢酶,或SEQ ID NO:27的米曲霉丙酮酸羧化酶在tfasty检索(Pearson,W.R.,1999,于Bioinformatics Methods and Protocols,S.Misener和S.A.Krawetz编,185-219页)中给出小于0.001的E值(或期望分数)的预测的蛋白。
多肽片段:术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36;或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽;其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性(对于SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的片段),苹果酸脱氢酶活性(对于SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20的片段),或丙酮酸羧化酶活性(对于SEQ ID NO:27的片段)。
亚序列:术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37;或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列;其中所述亚序列编码具有C4二羧酸转运蛋白活性(对于SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37的片段),苹果酸脱氢酶活性(对于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的片段),或丙酮酸羧化酶活性(对于SEQ ID NO:26的片段)的多肽片段。
等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生,并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸:术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面,如通过琼脂糖电泳测定的,所述多核苷酸为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,至少90%纯,至少95%纯,至少96%纯,至少97%纯,至少98%纯,至少99%纯,至少99.5%纯,或100%纯。
基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物,其不含其它外来的或不期望的核苷酸,并且处于适合在遗传工程蛋白生产体系中使用的形式。因此,基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%,例如至多8%,至多6%,至多5%,至多4%,至多3%,至多2%,至多1%,至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而,基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区,如启动子和终止子。在一个方面,基本上纯的多核苷酸是按制备物中存在的总多核苷酸材料的重量计至少90%纯,例如至少92%纯,至少94%纯,至少95%纯,至少96%纯,至少97%纯,至少98%纯,至少99%,至少99.5%纯,或100%纯的。所述多核苷酸优选为基本上纯的形式,即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或它们的任何组合。
编码序列:当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定,所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始,并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组核苷酸序列。
cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。在一些情况下,cDNA序列可与基因组DNA序列完全相同。
核酸构建体:术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段,或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence):术语“调控序列”在本文定义为包括编码多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的,或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置,使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体:术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子,其包含编码多肽的多核苷酸,并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞:如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型,所述细胞类型对于用包含编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸,编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸和/或编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
人工变体:当用于本文,术语“人工变体”意指由表达修饰的多核苷酸序列(例如包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成的修饰的多核苷酸序列)或其同源序列的生物产生的具有苹果酸脱氢酶活性的多肽。修饰的核苷酸序列是通过藉由修饰包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成的多核苷酸序列或其同源序列的人为介入而获得的。
变体:术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含变化/修饰即取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的,具有活性例如C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同氨基酸替换;缺失意指去除占据某位置的氨基酸;而插入意指在占据某位置的氨基酸的相邻处添加一个或多个(几个),例如1-3个氨基酸。
在本文中,提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言,提及“约X”的描述包括了“X”的方面。
如用于本文中和所附权利要求中,除非上下文明确地表示相反,单数形式“一(个/种...)(a)”或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的发明的各方面包括了“由...组成(consisting)”和/或“基本上由...组成(consisting essentially of)”的方面。
除非另行定义或上下文明确指出,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的相同的含意。
发明详述
本发明描述了特定基因在丝状真菌例如曲霉属(Aspergillus)中的过量表达以增强C4二羧酸产生,如苹果酸产生,其涵盖通过丙酮酸羧化酶将丙酮酸羧化为草酰乙酸,通过苹果酸脱氢酶将草酰乙酸还原为苹果酸,和/或通过C4二羧酸转运蛋白将C4二羧酸转运至细胞外。
本发明涉及产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法,包括:(a)在培养基中培养包含一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸;其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸;和(b)回收所述C4二羧酸。
本发明还涉及用于相对于亲本宿主细胞增加C4二羧酸产生(例如,苹果酸产生)的方法,包括:(a)将一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸转化入丝状真菌宿主细胞:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸,如苹果酸;(b)在培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞;和(c)回收所述C4二羧酸。
本发明还涉及丝状真菌宿主细胞,其包含一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有一种或多种(几种)编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
在任何这些方面,所述C4二羧酸是苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸、琥珀酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸或延胡索酸,或苹果酸和延胡索酸的组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸。
在一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸和包含编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸和包含编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸和包含编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。在另一个方面,所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。
在本发明的方法中,使用本领域公知方法在适于产生C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的营养培养基中培养重组丝状真菌宿主细胞。举例而言,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中),或可从商业上可获得的成分制备。
可以使用本领域已知的对于多肽具特异性的方法来检测C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,如本文中所述,酶测定(enzyme assay)可用于确定苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的活性。
可使用任何本领域中已知的方法来回收C4二羧酸如苹果酸。参见,例如WO 1998/022611和美国专利号7,601,865。
在一个方面,在相同条件下培养时,由包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸,和/或编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸的丝状真菌宿主细胞产生的分泌的C4二羧酸的水平与不具有所述异源第一多核苷酸、异源第二多核苷酸和/或异源第三多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少200%或至少500%。
在一个方面,丝状真菌宿主细胞的培养的制备物以高于大约下述任何的水平产生(或能够产生)C4二羧酸(例如苹果酸):30g/L,60g/L,90g/L,120g/L,150g/L,175g/L,200g/L,225g/L或250g/L。在另一个方面,丝状真菌宿主细胞的培养的制备物在24,48,72,96,120,144,165,或192小时内以高于大约下述任何的水平产生(或能够产生)C4二羧酸(例如苹果酸):30g/L,60g/L,90g/L,120g/L,150g/L,175g/L,200g/L,225g/L或250g/L。举例而言,在一个方面,所述制备物在48小时内以高于大约下述任何的水平产生(或能够产生)C4二羧酸(例如苹果酸):30g/L,60g/L,90g/L,120g/L,150g/L,175g/L,200g/L,225g/L或250g/L。在另一个方面,所述制备物在144小时内以高于大约下述任何的水平产生(或能够产生)C4二羧酸(例如苹果酸):30g/L,60g/L,90g/L,120g/L,150g/L,175g/L,200g/L,225g/L或250g/L。在任何这些方面或本发明中的方法的方面,丝状真菌宿主细胞的培养的制备物在低于或等于约7.0,如6.0至7.0,6.0至6.5,6.5至7.0,约6.5,低于约6.5的pH产生(或能够产生)C4二羧酸(例如苹果酸)。
C4二羧酸转运蛋白和编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸
在本发明中,所述C4二羧酸转运蛋白可为任何适用于实施本发明的C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白为在以高效价产生苹果酸的培养条件下过表达的转运蛋白。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是:(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,和/或SEQID NO:36具有至少60%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQID NO:35和/或SEQ ID NO:37或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35和/或SEQ ID NO:37具有至少60%序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,和/或SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
在第一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是:(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少60%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:7或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7具有至少60%序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有C4二羧酸转运蛋白活性(下文中称为“同源C4二羧酸转运蛋白”)。在一个方面,所述同源C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
在一个方面,C4二羧酸转运蛋白为变体,其包含SEQ ID NO:8的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。优选地,氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入,其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性;通常为1至大约30个氨基酸的小缺失;小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端甲硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸,如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内:碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的,并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者,氨基酸改变具有这样的性质:使多肽的物理化学性质改变。例如,氨基酸改变可改善多肽的热稳定性,改变底物特异性,改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法,例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中,将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基,并且测试所得突变分子的C4二羧酸转运蛋白活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定,如通过以下这些技术:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记,连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312;Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断,所述多肽与亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法,例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156;WO 95/17413;或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837;美国专利No.5,223,409;WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145;Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子,并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一些方面,SEQ ID NO:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。在另一个方面,SEQ ID NO:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:8的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。SEQ ID NO:8的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽。在一个方面,所述片段含有SEQ ID NO:8的至少320个氨基酸残基,例如优选至少340个氨基酸残基,或至少360个氨基酸残基。
所述C4二羧酸转运蛋白可为融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的,并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中,并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建,其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science 266:776-779)。
融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽,就切割所述位点,释放所述两个多肽。切割位点的实例包括,但不限于,公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381;Eaton等,1986,Biochem.25:505-512);Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987;Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248;以及Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48中的位点。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7,其亚序列,或前述的全长互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,见上)。所述亚序列可编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽片段。SEQ ID NO:7或其同源物的亚序列为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,亚序列含有SEQ ID NO:7的至少960个核苷酸,例如至少1020个核苷酸或至少1080个核苷酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
在第二个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34具有至少60%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:33或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33具有至少60%序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:34的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有C4二羧酸转运蛋白活性(下文中称为“同源C4二羧酸转运蛋白”)。在一个方面,所述同源C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:34。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ IDNO:34的氨基酸序列组成。
在一个方面,C4二羧酸转运蛋白为变体,其包含SEQ ID NO:34的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入,如上文所述。在一些方面,SEQ ID NO:34的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。在另一个方面,SEQ ID NO:34的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:34的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。在一个方面,所述片段含有SEQ IDNO:34的至少334个氨基酸残基,例如至少354个氨基酸残基,或至少374个氨基酸残基。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:33,其亚序列,或前述的全长互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,见上)。所述亚序列可编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽片段。SEQ ID NO:33或其同源物的亚序列,为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,亚序列含有SEQ ID NO:33的至少1002个核苷酸,例如至少1062个核苷酸或至少1122个核苷酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
在第三个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少60%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37,或它们的全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37具有至少60%序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:34的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有C4二羧酸转运蛋白活性(下文中称为“同源C4二羧酸转运蛋白”)。在一个方面,所述同源C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:36。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其等位变体,或其具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由SEQ IDNO:36的氨基酸序列组成。
在一个方面,C4二羧酸转运蛋白为变体,其包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入,如上文所述。在一些方面,SEQ ID NO:36的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。在另一个方面,SEQ ID NO:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:36的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。在一个方面,所述片段含有SEQ IDNO:36的至少375个氨基酸残基,例如至少395个氨基酸残基,或至少415个氨基酸残基。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件下,例如在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37,它们的亚序列,或前述的全长互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,见上)。所述亚序列可编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽片段。SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35或它们的同源物的亚序列,为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,亚序列含有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37的至少1125个核苷酸,例如至少1185个核苷酸或至少1245个核苷酸。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35或SEQID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37的多核苷酸或其亚序列,以及SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其片段,可用于设计核酸探针,以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码C4二羧酸转运蛋白的DNA。具体而言,根据标准的Southern印迹方法,可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交,以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列,但长度上应为至少14,例如至少25,至少35,或至少70个核苷酸。在一个方面,所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度,例如,至少200个核苷酸,至少300个核苷酸,至少400个核苷酸,或至少500个核苷酸的长度,可使用甚至更长的探针,如至少600个核苷酸,至少700个核苷酸,至少800个核苷酸,或至少900个核苷酸的长度的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码C4二羧酸转运蛋白的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,或通过其它分离技术分离来自这些其它株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:35,或SEQ ID NO:37,或它们的亚序列同源的克隆或DNA,将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。就本发明而言,杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核苷酸探针杂交,所述核苷酸探针对应于SEQ IDNO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37中所示的多核苷酸;其互补链;或前述的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他本领域已知的检测手段检测与探针杂交的分子。
在一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,或其亚序列。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的多核苷酸,或其亚序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:7。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:8的多核苷酸,或其亚序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:33。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:34的多核苷酸,或其亚序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:35。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:37。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:36的多核苷酸,或其亚序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃,在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中,并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺,根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性),在50℃(低严格性),在55℃(中严格性),在60℃(中-高严格性),在65℃(高严格性),和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃,在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1×Denhardt溶液,1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate),1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate),0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟,并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次,每次15分钟。
所述C4二羧酸转运蛋白可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为多核苷酸编码的C4二羧酸转运蛋白由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白转运至外膜。
所述C4二羧酸转运蛋白可以是细菌C4二羧酸转运蛋白。例如,所述C4二羧酸转运蛋白可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)C4二羧酸转运蛋白;或革兰氏阴性细菌多肽,如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)C4二羧酸转运蛋白。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)C4二羧酸转运蛋白。
所述C4二羧酸转运蛋白可为真菌C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述真菌C4二羧酸转运蛋白为酵母C4二羧酸转运蛋白,如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)C4二羧酸转运蛋白。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是裂殖酵母属C4二羧酸转运蛋白,例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)C4二羧酸转运蛋白,如SEQID NO:36的粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是丝状真菌C4二羧酸转运蛋白,如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黄曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Asperigullus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)C4二羧酸转运蛋白。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是曲霉属C4二羧酸转运蛋白。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是米曲霉C4二羧酸转运蛋白,如SEQID NO:8的米曲霉C4二羧酸转运蛋白。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是土曲霉(Aspergillus terreus)C4二羧酸转运蛋白,如SEQ ID NO:34的土曲霉C4二羧酸转运蛋白。
可理解的是对于前述的种,本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states),和其它分类学的等同物(equivalent),例如无性型(anamorph),而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得,所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
亦可使用上述的探针从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述C4二羧酸转运蛋白。用于从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合适探针检测到编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸,就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述序列分离或克隆(参见,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
所述C4二羧酸转运蛋白亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽融合于多肽或其片段的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸(或其部分)融合于多核苷酸(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的,并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中,并且使融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建,其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science 266:776-779)。
用于分离或克隆编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的技术是本领域内已知的,包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段,从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见,例如,Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法,如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription;LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属菌株,或其他或相关生物体克隆所述多核苷酸,并且因此可为例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
在一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37。在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:7。在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:33。在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码C4二羧酸转运蛋白,所述C4二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码C4二羧酸转运蛋白,所述C4二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:8。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码C4二羧酸转运蛋白,所述C4二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:34。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码C4二羧酸转运蛋白,所述C4二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ IDNO:36。因此,本发明涵盖核苷酸序列,其编码包含或组成为SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的氨基酸序列,但该核苷酸序列由于遗传密码的简并性而分别与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQID NO:37存在差异。本发明还涉及SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:37的亚序列,其分别编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36的片段。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37组成,其中所述突变体核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:8,SEQID NO:34,或SEQ ID NO:36。在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:7中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO:7组成,其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:8。在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:33中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO:33组成,其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:34。在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:37中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:37组成,其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:36。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码活性的C4二羧酸转运蛋白。
举例而言,在一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码活性C4二羧酸转运蛋白。在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码活性C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQID NO:35或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码活性C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37,其等位变体或亚序列,或前述的全长互补链(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。
举例而言,在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:SEQ ID NO:7,其等位变体或亚序列,或前述的全长互补链(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:SEQ ID NO:33,其等位变体或亚序列,或前述的全长互补链(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37,其等位变体或亚序列,或前述的全长互补链(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。
在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
举例而言,在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7,或其全长互补链杂交;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与SEQ ID NO:33,或其全长互补链杂交;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
其他可用于实施本发明的C4二羧酸转运蛋白包括,例如黄曲霉C4二羧酸转运蛋白(AFLA_107340)。
苹果酸脱氢酶和编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸
在本发明中,所述苹果酸脱氢酶可为任何适用于实施本发明的苹果酸脱氢酶。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶为存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
可用于实施本发明的苹果酸脱氢酶包括但不限于:烟曲霉苹果酸脱氢酶(AFUA 2G13800;Nierman等,2005,Nature 438:1151-1156);构巢曲霉苹果酸脱氢酶(AN5031.1,AN6499.1;Sims等,2004,Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉苹果酸脱氢酶(An11g07190,An12g00160,An15g00070;Pel等,2007,NatureBiotechnology 25:221-231);米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶(SEQ ID NO:19的基因组DNA和SEQ ID NO:20的推导的氨基酸序列);Phytophthorainfestans苹果酸脱氢酶(PITG 15476.1;Calcagno等,2009,Mycological Research113:771-781);和酿酒酵母苹果酸脱氢酶(YOL126C;Minard和McAlister-Henn,1991,Mol.Cell.Biol.11:370-380;YDL078C;McAlister-Henn等,1995,Journalof Biological Chemistry 270:21220-21225)。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶是:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17,或SEQ ID NO:19具有至少60%序列同一性;(d)苹果酸脱氢酶变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的苹果酸脱氢酶的具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有苹果酸脱氢酶活性(下文中称为“同源苹果酸脱氢酶”)。在一个方面,所述同源苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度。在一个方面,所述同源苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度。在一个方面,所述同源苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
基本上同源的苹果酸脱氢酶可具有一个或多个(几个)氨基酸取代,缺失和/或插入,如上文所述。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其等位变体,或其具有苹果酸脱氢酶活性的片段。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其等位变体,或其具有苹果酸脱氢酶活性的片段组成。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶为变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入,如上文所述。在一些方面,SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。在另一个方面,SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的片段,其中所述片段具有苹果酸脱氢酶活性。在一个方面,SEQ ID NO:18的片段含有至少290个氨基酸残基,例如至少305个氨基酸残基,或至少320个氨基酸残基。在一个方面,SEQ ID NO:20的片段含有至少280个氨基酸残基,例如至少295个氨基酸残基,或至少310个氨基酸残基。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亚序列,或(iv)(i),(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,见上)。所述亚序列可编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽片段。
SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19,或其同源物的亚序列,为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,SEQ IDNO:17的亚序列含有至少870个核苷酸,例如至少915个核苷酸或至少960个核苷酸。在另一个方面,SEQ ID NO:19的亚序列含有至少840个核苷酸,例如至少885个核苷酸或至少930个核苷酸。
SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的多核苷酸或其亚序列,以及SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其片段,可用于设计核酸探针,以根据如上文所述的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码苹果酸脱氢酶的DNA。此类探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码苹果酸脱氢酶的DNA,如上文中所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。在另一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:17。在另一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:19。在另一个方面,所述核酸探针是编码SEQ ID NO:18或SEQID NO:20的多核苷酸序列,或其亚序列。在另一个方面,所述核酸探针是编码SEQ ID NO:18的多核苷酸序列,或其亚序列。在另一个方面,所述核酸探针是编码SEQ ID NO:20的多核苷酸序列,或其亚序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17或SEQID NO:19具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽。
所述苹果酸脱氢酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的苹果酸脱氢酶由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌苹果酸脱氢酶。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶为米曲霉苹果酸脱氢酶,例如SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的米曲霉苹果酸脱氢酶。
亦可从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述苹果酸脱氢酶,如上文中所述。
所述苹果酸脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文中所述。
用于分离或克隆编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含氨基酸序列的一个或多个(几个)修饰,这减少苹果酸脱氢酶的体内线粒体输入。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在等同于或对应于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代,其中所述缺失和取代减少了苹果酸脱氢酶变体的体内线粒体输入,由此增加了胞质溶胶中苹果酸脱氢酶变体的水平。此类变体在下文中详细描述。
苹果酸脱氢酶变体命名规则
就本发明而言,将公开于SEQ ID NO:18中的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列用于确定在其他苹果酸脱氢酶中对应或等同的氨基酸残基。将其他苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:18中的苹果酸脱氢酶氨基酸序列进行比对,并基于该比对,可以确定SEQ ID NO:18的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
多肽序列的比对可使用,例如,“ClustalW”(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.,1994,CLUSTAL W:Improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,positions-specific gappenalties and weight matrix choice,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)得到。DNA序列的比对可以使用所述多肽比对作为模板,将氨基酸用来自所述DNA序列的对应密码子替代来进行。
通常使用的逐对序列比较算法(pairwise sequence comparison algorithm)足以检测未分歧超越大约20-30%序列同一性的点的多肽序列之间的相似性(Doolittle,1992,Protein Sci.1:191-200;Brenner等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6073-6078)。然而,具有相同折叠(fold)和相似生物学功能的真正同源的多肽经常分歧到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的点(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。举例而言,PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型,并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。当目标多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(几个)代表时,甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)使用来自多个来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为向预测查询序列(query sequence)的结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地,Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对又可用于产生目标多肽的同源性模型,且所述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质,可用数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。举例而言,已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对,且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法,如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Eng.11:739-747)进行比对,且这些算法的执行可另外用于查询具有目标结构的结构数据库,以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。这些结构比对可用于在相同结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息,连同来源于同源性建模与序型搜索的信息,可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的同源物时预测哪个残基进行突变。
在描述本发明的苹果酸脱氢酶变体时,为了参照方便起见,采用了下面所述的命名法。在所有情况下,使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代,使用下述命名法:初始氨基酸,位置,取代氨基酸。相应地,在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开,例如,“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”,代表分别在205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G),以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。
缺失。对于氨基酸缺失,使用了如下命名法:初始氨基酸,位置*。相应地,在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开,例如,“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入,使用了如下的命名法:初始氨基酸,位置,初始氨基酸,新插入的氨基酸。因此,在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸插入命名为[初始氨基酸,位置,初始氨基酸,新插入的氨基酸#1,新插入的氨基酸#2;等等]。例如,在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此情况下,通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此,在上一例子中序列为:
亲本: | 变体: |
195 | 195 195a 195b |
G | G- K- A |
亲本苹果酸脱氢酶和编码亲本苹果酸脱氢酶的多核苷酸
在本发明中,亲本苹果酸脱氢酶可为任何在体内输入宿主细胞线粒体的苹果酸脱氢酶。
在一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶是:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;或(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%序列同一性,其中所述亲本苹果酸脱氢酶包含一个或多个(几个)线粒体靶向序列(Claros和Vincens,1996,见上)。
在一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有苹果酸脱氢酶活性(下文中称为“同源苹果酸脱氢酶”)。在一个方面,所述同源苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
基本上同源的亲本苹果酸脱氢酶可具有一个或多个(几个)氨基酸取代、缺失和/或插入,如上文中所述。
在一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其等位变体,或其具有苹果酸脱氢酶活性的片段。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其等位变体,或其具有苹果酸脱氢酶活性的片段组成。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO:18的片段为从其氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽。在一个方面,片段含有SEQ ID NO:18的至少295个氨基酸残基,例如至少310个氨基酸残基,或至少325个氨基酸残基。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亚序列,或(iv)(i),(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。所述亚序列可编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽片段。
SEQ ID NO:17,或其同源物的亚序列,为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,亚序列含有SEQ ID NO:17的至少885个核苷酸,例如至少930个核苷酸或至少975个核苷酸。
所述亲本酶亦可为苹果酸脱氢酶的等位变体或人工变体。
SEQ ID NO:17的多核苷酸或其亚序列,以及SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其片段,可用于设计核酸探针,以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本苹果酸脱氢酶的DNA,如上文所述。
可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码苹果酸脱氢酶的DNA,如上文中所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:17。在另一个方面,所述核酸探针是编码SEQ ID NO:18的多核苷酸序列,或其亚序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
在另一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽。
所述亲本苹果酸脱氢酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的亲本苹果酸脱氢酶由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
在一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶可为从本文中C4二羧酸转运蛋白部分所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌苹果酸脱氢酶。
在另一个方面,所述亲本苹果酸脱氢酶为米曲霉苹果酸脱氢酶,例如SEQID NO:18的米曲霉苹果酸脱氢酶。
亦可从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述亲本苹果酸脱氢酶,如上文中所述。
所述亲本苹果酸脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文中所述。
用于分离或克隆编码亲本苹果酸脱氢酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
在一个方面,所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码亲本苹果酸脱氢酶,所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。本发明亦涵盖核苷酸序列,其编码多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成,但该核苷酸序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:17存在差异。本发明还涉及SEQ ID NO:17的亚序列,其编码具有苹果酸脱氢酶活性的SEQID NO:18的片段。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:17中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ IDNO:17组成,其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:18。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性,且其编码具有苹果酸脱氢酶活性的亲本多肽。
在另一个方面,所述编码亲本苹果酸脱氢酶的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;或其等位变体或亚序列(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。
在另一个方面,编码所述亲本苹果酸脱氢酶的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有苹果酸脱氢酶活性的亲本多肽。
其他可用于实施本发明的亲本苹果酸脱氢酶包括但不限于:构巢曲霉苹果酸脱氢酶(AN6717.1;SIMS等,2004,Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉苹果酸脱氢酶(An16g00120;Pel等,2007,Nature Biotechnology 25:221-231);Phytophthorainfestans苹果酸脱氢酶(PITG 13614.1;Calcagno等,2009,Mycological Research113:771-781);酿酒酵母苹果酸脱氢酶(YKL085W;McAlister-Henn and Thompson,1987,J Bacteriol.169:5157-5166);埃默森踝节菌苹果酸脱氢酶(AF439996,AF487682;Maloney等,2004,Eur.J.Biochem.271:3115-3126);和玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)苹果酸脱氢酶(um00403,um11161;McCann和Snetselaar,2008,Fungal Genetics and Biology 45:S77-S87)。
变体的制备
亲本苹果酸脱氢酶的变体可根据本领域任何已知的任何诱变方法,如定点诱变、合成基因构建(synthetic gene construction)、半合成基因构建(semisynthetic gene construction)等来制备。
定点诱变是在编码亲本苹果酸脱氢酶的多核苷酸分子上的确定位点创建一个或几个突变的技术。所述技术可在体外或体内进行。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽分子的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行,如由Tian等所述基于多路微芯片(multiplex microchip-based)的技术(Tian等,Nature 432:1050-1054),以及类似的技术,其中合成寡核苷酸并在光可编程的(photo-programmable)微流芯片(microfluidic chip)上组装。
定点诱变可在体外通过PCR达成,涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行,涉及用限制酶在包含编码亲本苹果酸脱氢酶的多核苷酸的质粒中的位点进行剪切,然后将含有突变的寡核苷酸连接于所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的,使所述质粒和插入物的粘性末端能够彼此连接。参见,例如,Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955;以及Barton等,1990,Nucleic Acids Research 18:7349-7355。
定点诱变可在体内通过本领域已知方法达成。参见,例如,美国专利号7,314,712;Storici等,2001,Nature Biotechnology 19:773-776;Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290;以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。
任何定点诱变方法可用于本发明。有许多可用的商业试剂盒可用于制备亲本苹果酸脱氢酶的变体。
可使用已知的诱变方法接着进行有关的筛选方法,如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO 95/17413;或者WO 95/22625所公开的那些,来进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO 92/06204)和区域定向的诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:145;等,1988,DNA 7:127)。
半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成,而其他区域可使用定点诱变引物扩增,还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-error prone PCR)扩增(implication)。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行,如由Tian等所述基于多路微芯片(multiplexmicrochip-based)的技术(2004,Nature 432:1050-1054),以及类似的技术,其中合成寡核苷酸并在光可编程的微流芯片(microfluidic chip)上组装。
诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
变体和编码苹果酸脱氢酶变体的多核苷酸
在本发明中,亲本苹果酸脱氢酶的变体可包含:(i)在等同于或对应于SEQID NO:18的位置2至17或其部分的位置的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代。在一个优选的方面,具有苹果酸脱氢酶活性的变体包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与亲本苹果酸脱氢酶氨基酸序列,例如SEQ ID NO:18,具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少约97%,至少98%,至少99%的序列同一性程度。在一个优选的方面,所述亲本苹果酸脱氢酶为SEQ ID NO:18。
在一个方面,本发明的变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的缺失和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代。在另一个方面,本发明的变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的缺失和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代。在另一个方面,本发明的变体包含在SEQ ID NO:18的位置2至17的缺失和在SEQ ID NO:18的位置48的取代。在另一个方面,本发明的变体包含在SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的缺失和在SEQ ID NO:18的位置48的取代。在另一个方面,所述变体包含在对应于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的缺失,和在等同于位置48的位置用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一个方面,所述变体包含在对应于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的缺失和在等同于位置48的位置用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一个方面,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的Phe、Ala、Ala、Arg、Gln、Ser、Phe、Asn、Leu、Leu、Gln、Lys、Arg、Ala、Phe或Ser的缺失,和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的Tyr作为取代。在另一个方面,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的Phe、Ala、Ala、Arg、Gln、Ser、Phe、Asn、Leu、Leu、Gln、Lys、Arg、Ala、Phe或Ser的缺失,和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的Tyr作为取代。在另一个方面,所述变体包含SEQ ID NO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。在另一个方面,所述变体包含SEQ ID NO:18的一个或多个(几个)缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQID NO:18的取代Arg48Tyr。
所述变体可进一步包含氨基酸序列的一个或多个(几个)缺失、取代和/或插入。
本发明还涉及编码亲本苹果酸脱氢酶的变体的分离的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,其包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代,其中所述亲本苹果酸脱氢酶为:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链,其中所述变体具有苹果酸脱氢酶活性。
在一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的缺失和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的缺失和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在SEQID NO:18的位置2至17的缺失和在SEQ ID NO:18的位置48的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在SEQ IDNO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的缺失和在SEQ ID NO:18的位置48的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在对应于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的缺失,和在等同于位置48的位置的用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在对应于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个位置的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的缺失和在等同于位置48的位置用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的位置的Phe、Ala、Ala、Arg、Gln、Ser、Phe、Asn、Leu、Leu、Gln、Lvs、Arg、Ala、Phe或Ser的缺失,和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的Tyr作为取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17的一个或多个(几个)位置的Phe、Ala、Ala、Arg、Gln、Ser、Phe、Asn、Leu、Leu、Gln、Lys、Arg、Ala、Phe或Ser的缺失,和在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置的Tyr作为取代。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含SEQ ID NO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码苹果酸脱氢酶变体,所述变体包含SEQ ID NO:18的一个或多个(几个)缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。
丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸
在本发明中,所述丙酮酸羧化酶可为任何适用于实施本发明的丙酮酸羧化酶。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶为存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶是:(a)丙酮酸羧化酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%序列同一性;(d)丙酮酸羧化酶变体,其包含SEQ ID NO:26的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的丙酮酸羧化酶的具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,并具有丙酮酸羧化酶活性(下文中称为“同源丙酮酸羧化酶”)。在一个方面,所述同源丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
基本上同源的亲本丙酮酸羧化酶可具有一个或多个(几个)氨基酸取代、缺失和/或插入,如上文中所述。
在一个方面,所述亲本丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其等位变体,或其具有丙酮酸羧化酶活性的片段。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其等位变体,或其具有丙酮酸羧化酶活性的片段组成。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶为变体,其包含SEQ ID NO:27的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入,如上文所述。在一些方面,SEQ ID NO:27的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。在另一个方面,SEQ ID NO:27的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。
在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶是SEQ ID NO:27的片段,其中所述片段具有丙酮酸羧化酶活性。在一个方面,所述片段含有SEQ ID NO:27的至少1020个氨基酸残基,例如至少1080个氨基酸残基,或至少1140个氨基酸残基。
在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亚序列,或(iv)(i),(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上)。所述亚序列可编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽片段。
SEQ ID NO:26,或其同源物的亚序列,为其中从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。在一个方面,亚序列含有SEQ ID NO:26的至少3060个核苷酸,例如至少3240个核苷酸或至少3420个核苷酸。
SEQ ID NO:26的多核苷酸或其亚序列,以及SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其片段,可用于设计核酸探针,以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码丙酮酸羧化酶的DNA,如上文中所述。此类探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码丙酮酸羧化酶的DNA,如上文中所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:26。在另一个方面,所述核酸探针是编码SEQ ID NO:27的多核苷酸序列,或其亚序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。
所述丙酮酸羧化酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的丙酮酸羧化酶由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌丙酮酸羧化酶。
在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶为米曲霉丙酮酸羧化酶,例如SEQ IDNO:27的米曲霉丙酮酸羧化酶。
亦可从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述丙酮酸羧化酶,如上文中所述。
所述丙酮酸羧化酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文中所述。
所述丙酮酸羧化酶亦可为线粒体丙酮酸羧化酶的变体,使得对线粒体的体内输入减少,由此增加胞质溶胶中丙酮酸羧化酶变体的水平。
用于分离或克隆编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
在一个方面,所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码丙酮酸羧化酶,所述丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成。本发明亦涵盖编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ IDNO:27的氨基酸序列组成,但所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:26存在差异。本发明还涉及SEQ ID NO:26的亚序列,其编码具有丙酮酸羧化酶活性的SEQ ID NO:27的片段。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变体多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:26中的至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ IDNO:26组成,其中所述突变体核苷酸序列编码SEQ ID NO:27。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性程度,且其编码活性丙酮酸羧化酶。
在另一个方面,所述编码丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸在至少非常低严格条件,例如,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;或其等位变体或亚序列(Sambrook等,1989,见上),如本文中所定义。
在另一个方面,编码丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸通过如下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(b)分离杂交的多核苷酸,其编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。
其他可用于实施本发明的丙酮酸羧化酶包括但不限于:棒曲霉(Aspergillusclavatus)NRRL 1丙酮酸羧化酶(XP_001271664;Direct Submission,Submitted(26-OCT-2006),The Institute for Genomic Research,9712 Medical Center Drive,Rockville,MD 20850,USA);烟曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等,2005,Nature 438:1151-1156);构巢曲霉FGSCA4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等,2005,Nature 438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(An15g02820;Pel等,2007,Nature Biotechnology 25:221-231;ASPNG 5061;Panneman等,Submitted(JUL-1998)to the EMBL/GenBank/DDBJ数据库);土曲霉丙酮酸羧化酶(O93918;Direct Submission,Submitted(OCT-1998)The Institute for GenomicResearch,9712 Medical Center Drive,Rockville,MD 20850,USA);Magnaporthegrisea 70-15丙酮酸羧化酶(XP_367852;Direct Submission,Submitted(26-SEP-2005)Broad Institute of MIT and Harvard,320 Charles Street,Cambridge,MA 02142,USA);粗糙脉孢菌OR74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等,2003,Nature 422:859-868);米根霉(Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶(RO3G_06931.1);酿酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等,1996,Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;Direct Submission,Submitted(29-JUN-2007)European Schizosaccharomyces genome sequencingproject,Sanger Institute,The Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SA);和玉蜀黍黑粉菌丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008,Fungal Genetics and Biology 45:S77-S87)。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的分离的多核苷酸,和/或编码丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸,所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接,所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体,在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可为合适的启动子序列,其为由用于表达编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉翻译延伸因子(translation elongation factor)、米曲霉磷酸甘油酸激酶、米曲霉甘油-3-磷酸脱氢酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶,以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体);和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列,即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
调控序列还可以是合适的前导序列,即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可在本发明中使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列,其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列,并且在转录时,宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可在本发明中使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
调控序列还可以是信号肽编码序列,其编码氨基酸序列,所述氨基酸序列与多肽的氨基端相连,并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列,其与编码分泌的多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是,编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者,外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而,可在本发明中使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径,即分泌入培养基的任何信号肽编码序列。
调控序列还可以是前肽编码序列,其编码位于多肽氨基端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的,并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基端时,将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基端,并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基端。
同样理想的是添加调节序列,其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物,包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。丝状真菌中的调节系统包括TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子,可用作调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中,这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因,和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体,所述重组表达载体包含编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸、编码苹果酸脱氢酶的分离的多核苷酸和/或编码丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸,启动子,以及转录和翻译终止信号。本文中所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体,所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。或者,可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达所述多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中,将编码序列置于载体中,从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被引入宿主细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA),或可以使用转座子(transposon)。
所述载体含有一个或多个(几个)选择性标记,其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
选择性标记的实例包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
所述载体含有元件,其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组,载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者,载体可以含有额外的核苷酸序列,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件可含有足够数量的核酸,如100至10,000碱基对,例如400至10,000碱基对,或800至10,000碱基对,其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列,其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外,整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面,可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator),其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67;Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175;WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得:将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组,或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸,其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝,且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组丝状真菌宿主细胞,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸、编码苹果酸脱氢酶的分离的多核苷酸和/或编码丙酮酸羧化酶的分离的多核苷酸,启动子,以及转录和翻译终止信号,其有利地用于所述多肽的重组产生。将包含此种(此类)多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞,使所述载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代,其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是任何可用于重组产生C4二羧酸的丝状真菌细胞。
“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面,丝状真菌宿主细胞为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞为泡盛曲霉、黄曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)或酱油曲霉细胞。、在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞为杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞为黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、米根霉、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
在一个优选的方面,所述曲霉属宿主细胞是米曲霉。
可将丝状真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法描述于美国专利号5,536,661和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和美国专利号5,837,847描述。
本发明进一步通过下述实施例描述,其不应视为对本发明范围的限制。
实施例
用作缓冲液和底物是至少试剂级的商品。
菌株
使用米曲霉NRRL 3488(或ATCC 56747)作为C4二羧酸转运蛋白基因,丙酮酸羧化酶基因,和苹果酸脱氢酶基因mdh1和mdh3的来源,并用于产生苹果酸。
培养基
YEG培养基组成为:20g葡萄糖,5g酵母提取物,和去离子水加至1升。
COVE平板组成为:1M蔗糖,2%COVE盐溶液,10mM乙酰胺,15mMCsCl,和25g/l Agar Noble。
COVE盐溶液组成为:26g KCl,26g MgSO4·7H2O,76g KH2PO4,50mlCOVE微量元素溶液,和去离子水加至1升。
COVE微量元素溶液组成为:0.04g Na2B4O7·10H2O,0.04g CuSO4·5H2O,1.2g FeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·2H2O,10g ZnSO4·7H2O和去离子水加至1升。
种子培养基B组成为:30g葡萄糖,3g Bacto Peptone,560mg KH2PO4,560mg K2HPO4,925mg NaH2PO4·H2O,820mg Na2HPO4,75mg MgSO4·7H2O,75mgCaCl2·H2O,0.75ml的1000X Micronutrient Solution,和去离子水加至1升。
酸产生培养基C组成为:100g葡萄糖,80g CaCO3,6g Bacto Peptone,150mg KH2PO4,150mg K2HPO4,100mg MgSO4·7H2O,100mg CaCl2·H2O,1ml 1000X Micronutrient Solution,和去离子水加至1升。
1000X Micronutrient Solution组成为:5g NaCl,5g FeSO4·7H2O,1g柠檬酸,和去离子水加至1升。
PDA平板组成为:39g/l马铃薯右旋糖琼脂。
2XYT+amp平板组成为:16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5g NaCl,100mg氨苄青霉素,15g Bacto agar,和去离子水加至1升。
实施例1:米曲霉NRRL 3488C4二羧酸转运蛋白基因mae3的克隆和表达载体pShTh104/mae3的构建
通过PCR扩增使用同源于米曲霉ATCC 42149预测的C4二羧酸转运蛋白基因模型号AO090023000318(Galagan等,2005,Nature 438:1105-1115)的引物从米曲霉NRRL 3488基因组DNA克隆苹果酸转运蛋白基因mae3。
通过用2x106个孢子接种摇瓶中的100ml的YEG培养基,并将所述瓶在37℃以200rpm振荡温育过夜来分离来自米曲霉NRRL 3488的基因组DNA。通过使用MIRACLOTH(Calbiochem,San Diego,CA,USA)衬里的漏斗(linedfunnel)的过滤收获菌丝体,并回收了大约2g的菌丝体,并冷冻于液氮。所述菌丝体通过在冷的杵和研钵中磨碎来破坏。使用DNeasyPlant Maxi Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)根据生产商的指示从粉末状的菌丝体分离基因组DNA。使用如下所示的引物065266和引物065267扩增米曲霉mae3基因:
引物065266:
5’-GTGATAGAACATCGTCCATAATGCTGACACCTCCCAAGTT-3’(SEQ ID NO:1)
引物065267:
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTACTAATCAGATACATCCTCAT-3’(SEQ ID NO:2)
使用EXPANDHigh Fidelity PCR System(Roche,Indianapolis,IN,USA)根据生产商的指示进行所述扩增反应。每个PCR反应含有47ng的米曲霉NRRL 3488基因组DNA,200μM dNTP,50pM引物065266,50pM引物065267,1X EXPAND反应缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),和2.6单位的EXPANDHigh Fidelity酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA),终体积为50μl。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER(EppendorfScientific Inc.,Westbury,New York,USA)中温育,其程序为:1个循环,在94℃进行2分钟;30个循环,每循环在94℃进行15秒,60℃进行30秒,和72℃进行1分钟;和1个循环,在72℃进行7分钟。
通过使用50mM Tris碱-50mM乙酸(盐)-0.1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物。从凝胶切出并使用QIAQUICKGelExtraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从琼脂糖提取大约1.1kb的片段。使用DNA序列分析以使用如下所示的引物996270,065067,065130,065129确认mae3编码序列的完整性。
引物996270:
5’-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3’(SEQ ID NO:3)
引物065067:
5’-TGACCTTCCACGCTGACCAC-3’(SEQ ID NO:4)
引物065130:
5’-CTAATCAGATACATCCTCA-3’(SEQ ID NO:5)
引物065129:
5’-ATGCTGACACCTCCCAAGT-3’(SEQ ID NO:6)
然后使用IN-FUSIONTM Cloning Kit(Clontech,Mountain View,CA,USA)根据生产商的指示将1.1kb片段克隆入Sex AI/绿豆核酸酶和Pac I消化的pShTh60,得到质粒pShTh104(图2)。质粒pShTh60是包含米曲霉Pgk启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子的表达载体。质粒pShTh104使用QIAfilter MaxiPlasmid Isolation Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)分离。
实施例2:米曲霉NRRL 3488 mae3 C4二羧酸转运蛋白基因的表征
米曲霉NRRL 3488C4二羧酸转运蛋白基因mae3的DNA测序用ABI3130XLDNA Analyzer(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)使用引物步移技术及染料终止子化学进行(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods38:47-60)。
米曲霉NRRL 3488C4二羧酸转运蛋白mae3基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:7)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)示于图3。1143bp的基因组编码序列(包含终止密码子)编码380个氨基酸的多肽,其具有42kDa的预测分子量。该基因不含内含子。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),以缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵,确定了公开数据库中氨基酸序列的比较性逐对全局比对。该比对显示米曲霉NRRL 3488C4二羧酸转运蛋白mae3基因推导的氨基酸序列与粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因(mae1;GenBank登录号U21002)的推导的氨基酸序列共享29.5%的序列同一性。
实施例3:将pShTh104转化入米曲霉NRRL 3488
通过将大约2x107个孢子接种入100ml的YEG培养基,并将烧瓶在27℃以140rpm温育16-18小时来制备米曲霉NRRL 3488的原生质体。通过将培养物倾倒经过用MIRACLOTH衬里的灭菌漏斗,并用50ml的0.7MKCl漂洗来收集菌丝体。将洗涤的菌丝体重悬于含有20ml原生质体化溶液(protoplastingsolution)的125ml烧瓶中,其中所述溶液组成为5mg的GLUCANEXTM(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)和0.5mg的壳多糖酶(chitinase)(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO,USA)每毫升0.7M KCl(经过滤灭菌),然后在34℃以80rpm的混合进行温育30分钟。将所述原生质体化溶液倾倒经过用MIRACLOTH衬里的灭菌漏斗,并用50ml的STC缓冲液(1M山梨醇-10mMTris-HCl pH 6.5-10mM CaCl2)漂洗。在两个50ml聚丙烯管中收集流过物,将其以1300xg在室温离心10分钟。弃去上清,并将原生质体沉淀重悬于20ml的STC缓冲液。通过将沉淀在20ml的STC缓冲液中重悬两轮并以1300xg在室温离心10分钟来洗涤原生质体。将最终沉淀重悬于2ml的STC缓冲液。通过移出10μl样品并将其在血细胞计数器中计数(VWR,West Chester,PA,USA)来对原生质体进行计数。用STC缓冲液调整体积以获得2x107每ml的原生质体浓度。
对于每个表达载体制备六个转化反应。对于每个转化反应,将100μl的原生质体制备物转移至12ml聚丙烯管。添加五微克pShTh104和250μl的聚乙二醇(PEG),并通过旋转管轻柔地混合。将反应在37℃温育30分钟。用3ml的STC缓冲液稀释转化物,并将全量铺板于COVE平板。将平板在37℃温育7-10日。将所得的转化物的三十个转化体转移至单个COVE平板,并在34℃温育5日。通过在0.1%TWEEN80中收集孢子来制备孢子储备物。通过制备每个培养物的甘油储备物(800μl孢子储备,200μl 0.1%TWEEN80)并冻结于-80℃来储藏培养物。
实施例4:在摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例3中所述的每个转化体和作为对照的米曲霉NRRL 3488的孢子铺板于单个COVE平板,并允许其在34℃进行5至7日的孢子形成。在0.1%TWEEN80中收集孢子,并使用血细胞计数器进行计数。在含有100ml的种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并用总共2x108个孢子接种。将种子培养物在30℃以200rpm振荡生长大约17个小时。在含有50ml的酸产生培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备酸产生培养物。将培养物在30℃以200rpm振荡温育2-10日。
实施例5:苹果酸摇瓶培养的HPLC定量
对于实施例4的摇瓶培养物的苹果酸定量通过使用1200Series Binary LCSystem和1200Series Diode Array Detector(DAD)(Agilent Technologies,SantaClara,CA USA)的Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography(RP-HPLC)进行。使用Aqua 5μC18205x4.6mm ID柱和AQ C18 4x3.0mm SecurityGuard Cartridge(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)进行反向分离。流动相由10%甲醇(HPLC级)和90%145mM磷酸盐pH 1.5缓冲液组成。
移出全培养样品,并将其在HPLC Running Buffer中以1∶10稀释,所述HPLCRunning Buffer组成为850ml的64mM磷酸盐缓冲液和150ml的甲醇pH 1.65。然后将样品通过25mm 0.45微米聚醚砜膜(Whatman,Florham Park,NJ,USA)过滤,并将1.5ml的滤过物置于HPLC小瓶中以供酸分析。将剩余量的摇瓶培养物通过三层粗滤布(cheese cloth)过滤,并用10体积的双蒸灭菌水漂洗三次以去除不溶性CaCO3。从粗滤布收获细胞沉淀,置于15ml培养管中,并储藏于-20℃。
使用10μl的注入体积以0.7ml/分钟(等度洗脱)的流速以25℃的柱温度和11分钟的运行时间进行RP-HPLC。检测设定为210nm,8nm带宽,参照为360nm,40nm带宽。确定空白时间(voidtime)为3.8分钟。通过进行浓度范围为49.2至3.93mM的系列稀释的苹果酸标样的重复注入,对于苹果酸确定了反相方法的定量能力。对于重复注入的相对标准偏差为≤5%。苹果酸显示R2≥0.9999。
表1显示了在5日的摇瓶生长之后,转化体米曲霉ShTh1040-8和米曲霉ShTh1040-28的苹果酸效价与作为对照的米曲霉NRRL 3488的苹果酸产生相比较的相对增加。均含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因的米曲霉ShTh1040-8和米曲霉ShTh1040-28,与米曲霉NRRL 3488相比,分别产生了苹果酸效价的2.1倍和2.2倍的增加。
表1
菌株 | 苹果酸的相对效价 | %CV |
NRRL 3488 | 1 | 2.70% |
ShTh1040-8 | 2.1 | 12.60% |
ShTh1040-28 | 2.2 | 6.10% |
实施例6:米曲霉ShTh1040菌株的发酵
将命名为ShTh1040-8,ShTh1040-28和米曲霉NRRL 3488(对照)的米曲霉转化体在32℃在PDA平板上生长大约7日。将5-6ml体积的含有0.1%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬液转移至50ml锥形管。对于每个管,将25ml的灭菌的磷酸钠缓冲液添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后将其用2ml的孢子悬液接种。种子培养基组成为:40g葡萄糖,4.0g(NH4)2SO4,0.75g KH2PO4,0.75g K2HPO4,0.1gMgSO4·7H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。然后将烧瓶在32℃和180rpm温育约24小时。合并三个种子烧瓶以供应每罐所需的144ml接种物。
通过导入144ml(8%)的来自米曲霉转化体ShTh1040-8,米曲霉转化体ShTh1040-28,或米曲霉NRRL 3488的三个合并的种子烧瓶的种子培养液来分别接种含有1.8升的培养基的三升发酵罐。培养基组成为:120g葡萄糖,90g CaCO3,6g Bacto蛋白胨,0.150g KH2PO4,0.150g K2HPO4,0.10gMgSO4·7H2O,0.10g CaCl2-2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。
将发酵罐平衡于32±0.1℃并以500rpm搅拌。输入空气流维持在1v/v/m。未使用酸或碱添加以供pH控制。
每日移出样品,并就苹果酸产生进行分析。发酵在7日之后完成。
实施例7:苹果酸发酵的HPLC定量
对于实施例6的发酵的苹果酸定量如实施例5中所述进行。
表1显示了转化体米曲霉ShTh1040-8和米曲霉ShTh1040-28的苹果酸效价与作为对照的米曲霉NRRL 3488的苹果酸产生相比较的相对增加。均含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因的米曲霉ShTh1040-8和米曲霉ShTh1040-28,与米曲霉NRRL 3488相比,分别产生了苹果酸效价的1.98倍和2.18倍的增加。
表2
转化体 | 相对苹果酸效价 |
NRRL 3488 | 1.00 |
ShTh1040-28 | 1.98 |
ShTh1040-8 | 2.18 |
实施例8:米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶基因的克隆和表达载体pShTh104/mae3的构建
通过PCR扩增使用同源于见于公开的米曲霉ATCC 42149基因组序列(Galagan等,2005,Nature 438:1105-1115)中的mdh1和mdh3基因模型(分别为AO090005000438和AO090701000013)的引物从米曲霉NRRL 3488基因组DNA克隆苹果酸脱氢酶基因mdh1和mdh3。
使用引物062390和062391扩增米曲霉mdh1基因,并使用如下所示的引物062388和062389扩增米曲霉mdh3基因。通过用2x106个孢子接种摇瓶中的100ml的YEG培养基,并将所述瓶在37℃以200rpm振荡温育过夜来生长米曲霉NRRL 3488。使用MIRACLOTH衬里的漏斗来收获菌丝体,并回收了大约2g的组织,并冷冻于液氮。所述菌丝体通过在冷的杵和研钵中磨碎来破坏。使用DNeasyPlant Maxi Kit根据生产商的指示从粉末状的菌丝体分离基因组DNA。
引物062390:
5’-ACACAACTGGCCATGTTCGCTGCTCGCCAGTCTTTCAACCTCCTCCAGA-3’(SEQ ID NO:9)
引物062391:
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATTAAGGGTTGGCCTTGACGAAGTCAATACCCTTCTGA-3’(SEQ ID NO:10)
引物062388:
5’-ACACAACTGGCCATGGTCAAAGCTGGTGAGTTAGCAATCCTTAACAGAT-3’(SEQ ID NO:11)
引物062389:
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATTACTTTGGTGGTGGGTTCTTAACGAAGTCGATGCCT-3’(SEQ ID NO:12)
扩增反应使用EXPANDHigh Fidelity PCR System根据生产商的指示进行。每个PCR反应含有47ng的米曲霉NRRL 3488基因组DNA,200μM dNTPs,50pM正向引物,50pM反向引物,1X EXPAND反应缓冲液,和2.6单位的EXPANDHigh Fidelity酶混合物,终体积为50μl。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在94℃进行2分钟;10个循环,每循环在94℃进行15秒,62.2℃进行30秒,和72℃进行1分钟;20个循环,每循环在94℃进行15秒,在62.2℃进行30秒,和72℃进行1分钟,其中每个后续循环增加0.5秒;和1个循环,在72℃进行7分钟。
通过TAE缓冲液(50mM Tris碱-50mM乙酸(盐)-0.1mM EDTA二钠)中的1%琼脂糖凝胶电泳纯化来自每个扩增反应的PCR产物。从凝胶切出并使用QIAQUICKGel Extraction Kit琼脂糖提取来自每个扩增反应的大约1.3kb的片段。使用采用ABI3130XL DNAAnalyzer的DNA序列分析以使用如下所示的引物62399,62400,62396,62393确认mdh1和mdh3编码序列的完整性。
引物62399:
5’-CTTTGGTGTCACCACACTGG-3’(SEQ ID NO:13)
引物62400:
5’-GGGATTTGAACAGCAGAAGG-3’(SEQ ID NO:14)
引物62396:
5’-CTTAGCAAGGTCGCGGACAATGG-3’(SEQ ID NO:15)
引物62393:
5’-GGCACTGGGAATTGAATAC-3’(SEQ ID NO:16)
然后将每个1.3kb片段使用In-FusionTM Cloning Kit根据生产商的指示克隆入Nco I和Pac I消化的pBM120a(WO 2008/008950),对于mdh1和mdh3分别得到质粒pShTh73(图4)和pShTh71(图6)。质粒pBM120a是包含NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子的表达载体。质粒pShTh71和pShTh73使用QIAfilter Maxi Plasmid Isolation Kit分离。
实施例9:米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶的表征
米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶mdh1和mdh3的DNA测序用ABI3130XL DNA Analyzer使用引物步移技术及染料终止子化学进行(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods 38:47-60)。
米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶mdh1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)示于图5。1294bp的基因组编码序列(包含终止密码子)编码340个氨基酸的多肽,其具有36kDa的预测分子量。该基因由85bp(67-151bp),73bp(270-342bp),60bp(493-552bp),和53bp(648-700bp)的4个内含子间隔。mdh1基因的G+C含量是56.5%,而对于编码区为60.4%。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453),以缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵,确定了公开数据库中氨基酸序列的比较性逐对全局比对。该比对显示米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶mdh1基因的推导的氨基酸序列与酿酒酵母苹果酸脱氢酶基因(MDH1;登录号YK1085W)的推导的氨基酸序列共享61.9%的序列同一性(排除缺口)。
米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶mdh3基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)示于图7。1430bp的基因组编码序列(包含终止密码子)编码330个氨基酸的多肽,其具有35kDa的预测分子量。该基因由57bp(14-70bp),70bp(103-172bp),74bp(284-357bp),68bp(446-513bp),58bp(892-949bp),48bp(1035-1082bp),和62bp(1228-1289bp)的7个内含子间隔。Mdh3基因的编码区的G+C含量是50.3%。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上),以缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵,确定了公开数据库中氨基酸序列的比较性逐对全局比对。该比对显示米曲霉NRRL 3488苹果酸脱氢酶mdh3基因的推导的氨基酸序列与酿酒酵母苹果酸脱氢酶基因(MDH3;登录号YD1078C)的推导的氨基酸序列共享47.8%的序列同一性(排除缺口)。
实施例10:质粒pShTh74和pShTh75的构建
构建质粒pShTh74以含有编码米曲霉NRRL 3488MDH1的氨基酸2至17的推定的线粒体靶向序列的缺失。构建质粒pShTh75以含有MDH1的R48Y的取代和编码氨基酸2至17的推定的线粒体靶向序列的缺失。两个突变均旨在阻止mdh1基因产物导向并输入线粒体,因此该苹果酸脱氢酶变体位于细胞质。
通过使用如下所示的寡核苷酸引物063183和引物062391(实施例8)PCR扩增来自米曲霉NRRL 3488基因组DNA的mdh1基因来构建质粒pShTh74:
引物063183:
5’-ACACAACTGGCCATGGCCTCTGCCAGCCAGGTGTG-3’(SEQ ID NO:21)
扩增反应包含47ng米曲霉NRRL 3488基因组DNA,200μM dNTPs,50pM正向引物,50pM反义引物,1X EXPAND反应缓冲液,和2.6单位EXPANDHigh Fidelity混合物。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在94℃进行3分钟;29个循环,每循环在94℃进行15秒,62.2℃进行30秒,和72℃进行1分钟;和1个循环,在72℃进行7分钟。
通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物。从凝结切出并使用QIAQUICKGel Extraction Kit琼脂糖提取1.2kb片段,然后将其使用In-FusionTM Cloning Kit克隆入Nco I和Pac I消化的pBM120a(WO2008/008950),得到质粒pShTh74。使用采用ABI3130XL DNA Analyzer的DNA序列分析以确认mdh1 DNA片段的完整性。
使用如下所示的引物063184和063186,使用QUIKCHANGEII SLSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA,USA)将质粒pShTh74诱变为pShTh75以含有氨基酸突变R48Y。精氨酸残基至酪氨酸的突变导致协助靶向蛋白并转运蛋白通过线粒体膜的两亲性螺旋的破坏。
引物063184:
5’-CCTCAAGCTCAACCCCTACGTTTCTGAGCTTGCCCTCTAC-3’(SEQ ID NO:22)
引物063186:
5’-GTAGAGGGCAAGCTCAGAAACGTAGGGGTTGAGCTTGAGG-3’(SEQ ID NO:23)
使用QIAfilter Maxi Plasmid Isolation Kit分离质粒pShTh74和pShTh75。
实施例11:表达载体pSaMF21的构建
设计了质粒pSaMF21以含有NAD依存性苹果酸脱氢酶(mdh3)基因序列(DOGAN:AO090701000013),来自米曲霉的1430bp片段。通过用Sex AI和Pac I进行的限制性消化使pShTh60直链化(图1)而构建了该质粒。消化的载体通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用QIAQUICKGelExtraction Kit纯化。使用引物067522和067525从pShTh71扩增mdh3基因。
引物067522:
5’-AGAACATCGTCCATAATGGTCAAAGCTGGTGAGTTA-3’(SEQ ID NO:28)
引物067525:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTTTGGTGGTGGGTTCT-3’(SEQ ID NO:29)
PCR反应包含5μl 10X反应缓冲液,1μl pShTh71模板(87ng/μl),1μl引物067522(100ng/μl),1μl引物067525(100ng/μl),1μl dNTP混合物(10mM),45.5μl去离子水,和0.5μl HerculaseHotStart DNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,程序为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,50℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟,每循环增加10秒。对PCR反应物进行用DpnI的限制性消化1小时以降解任何质粒DNA模板。然后使用MinElutePCR Purification Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物使用In-FusionTMAdvantage反应物插入载体,其中所述反应物组成为2μl 5X缓冲液,0.5μl纯化的PCR产物(110ng/μl),1.7μl凝胶纯化的、Sex AI和Pac I限制性消化的pShTh60(图1;78ng/μl),1μlIn-FusionTM酶和4.8μl去离子水。反应在37℃温育15分钟,接着在50℃温育15分钟,之后将其置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pSaMF21(图8)。将连接反应物的2μl等分试样依照生产商的指示转化入ONESHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,San Diego,CA,USA)。将转化体铺板于2XYT+amp平板上,并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并对其进行DNA测序以确认mdh3基因成功地整合入载体。
实施例12:米曲霉NRRL 3488和米曲霉ATCC 56747丙酮酸羧化酶基因的克隆
通过使用同源于见于公开的米曲霉ATCC 42149基因组序列(Galagan等,2005,见上;DDBJ登录号AP007150-AP007177)(uniprot登录号Q2UGL1)中的推定的丙酮酸羧化酶基因模型编号AO090023000801的引物的PCR扩增从米曲霉NRRL 3488和米曲霉ATCC 56747基因组DNA克隆丙酮酸羧化酶基因(pyc)。
使用如下所示的引物061929和061930扩增米曲霉pyc基因。如实施例1中所述分离米曲霉(NRRL 3488和ATCC 56747)基因组DNA。
引物061929:
5’-ACACAACTGGCCATGGCGGCTCCGTTTCGTCA-3’(SEQ ID NO:24)
引物061930
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATTACGCTTTGACGATCTTGCAG-3’(SEQ ID NO:25)
扩增反应使用EXPANDHigh Fidelity PCR System根据生产商的指示进行。扩增反应组成为47ng的米曲霉基因组DNA,200μM dNTPs,50pM正向引物,50pM反向引物,1X EXPAND反应缓冲液,和2.6单位的EXPANDHigh Fidelity酶混合物,终体积为50μl。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在94℃进行2分钟;10个循环,每循环在94℃进行15秒,60℃进行30秒,和72℃进行1分钟;15个循环,每循环在94℃进行15秒,在60℃进行30秒,和72℃进行1分钟,其中每个后续循环增加0.5秒;和1个循环,在72℃进行7分钟。
实施例13:米曲霉NRRL 3488和ATCC 56747丙酮酸羧化酶的表征
米曲霉NRRL 3488和ATCC 56747丙酮酸羧化酶基因(pyc)的DNA测序用ABI3130XL DNA Analyzer使用引物步移技术及染料终止子化学进行(Giesecke等,1992,见上)。
米曲霉丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)示于图9A和9B。米曲霉NRRL 3488和ATCC 56747丙酮酸羧化酶基因均具有相同的氨基酸序列。3643bp的基因组编码序列(包含一个终止密码子)编码1193个氨基酸的多肽,其具有131kDa的预测分子量。该基因由61bp(3475-3535bp)的1个内含子间隔。基因编码区的G+C含量是57.1%。
使用如EMBOSS的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上),以缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵,确定了公开数据库中氨基酸序列的比较性逐对全局比对。该比对显示米曲霉NRRL 3488或ATCC 56747丙酮酸羧化酶pyc基因的推导的氨基酸序列与酿酒酵母丙酮酸羧化酶基因(PYC1;登录号YG1062W)的推导的氨基酸序列共享68.4%的序列同一性。
实施例14:表达载体pRyan1的构建
构建了质粒pRyan1以含有丙酮酸羧化酶(pyc)基因序列(DOGAN:AO090023000801),来自米曲霉的3646bp片段(包含两个终止密码子)。通过用Sex AI和Pac I进行的限制性消化使pShTh60直链化(图1)而构建了该质粒。消化的载体通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化。使用如下所示的引物066549和067388从米曲霉NRRL 3488基因组DNA扩增pyc基因。
引物066549:
5’-TAGAACATCGTCCATAATGGCGGCTCCGTTTCGTCA-3’(SEQ ID NO:30)
引物067388:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTACGCTTTGACGATCT-3’(SEQ ID NO:31)
PCR反应包含5μl 10X反应缓冲液,1μl米曲霉NRRL3488基因组DNA(110ng/μl),1μl引物066549(100ng/μl),1μl引物067388(100ng/μl),1μldNTP混合物(10mM),45.5μl去离子水,和0.5μl HerculaseHotStart DNA聚合酶。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,程序为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行3.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行3.5分钟,每循环增加10秒。然后使用MinElutePCRPurification Kit纯化PCR产物。
使用In-FusionTMAdvantage反应物将纯化的PCR产物插入载体,其中所述反应物组成为2μl 5X缓冲液,1μl纯化的PCR产物(144ng/μl),2μl凝胶纯化的、Sex AI和Pac I限制性消化的pShTh60(图1;78ng/μl),1μl In-FusionTM酶和4μl去离子水。反应在37℃温育15分钟,接着在50℃温育15分钟,之后将其置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pRYAN1(图10)。将连接反应物的2μl等分试样依照生产商的指示转化入ONE SHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化体铺板于2XYT+amp平板上,并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并对其进行DNA测序以确认pyc基因成功地整合入载体。核苷酸1308从C变为T,但并不影响蛋白序列。
实施例15:将pShTh104,pSaMF21和pRyan1转化入米曲霉NRRL 3488(SaMF2103)
将质粒pShTh104,pSaMF21和pRyan1转化入米曲霉NRRL 3488以对于如上所述含有mae3C4二羧酸转运蛋白,mdh3NBD依存性苹果酸脱氢酶,和pyc丙酮酸羧化酶基因的菌株来测定C4二羧酸产生。
将100μl的原生质体制备物(如实施例3中所述制备)转移至12ml聚丙烯管。向其添加2.6μg pSaMF21,5.5μg pShTh104,4.73μg pRyan1和250μl PEG溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),10mM Tris 6.5,10mM CaCl2),然后轻柔地混合并在37℃温育30分钟。用9ml的STC缓冲液稀释每个转化物,接着将三个不同的3ml等分试样分别铺板于COVE平板。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将六十个SaMF2103转化体转移至单个COVE平板,并在34℃温育5日。通过在0.1%TWEEN80中收集孢子来制备孢子储备物。通过制备每个培养的甘油储备物(800μl孢子储备物,200μl 0.1%TWEEN80)并冻结于-80℃来储藏培养物。
通过将大约2x107个孢子接种于100ml YEG培养基,并将烧瓶在34℃以160rpm温育16-18小时来从五个产生最多苹果酸的菌株(SaMF2103-14,29,37,39,53)提取DNA。通过将培养物倾倒经过灭菌的真空过滤单元来收集菌丝体。将生物质在液氮中温育约10秒,然后置于两层具MIRACLOTH衬里的粗滤布上。将该布折叠为袋状,并用锤子撞击(smash)12-15次。将粉碎的生物质转移至灭菌的15ml锥形管,向其添加10ml的1X Lysis Buffer(100mM EDTA,10mM Tris pH 8.0,1%Triton X-100,0.5M胍-HCl,200mMNaCl)和3μl 100mg/ml RNase A。在室温温育5分钟之后,添加150μl 20mg/mlProteinase K(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA),通过倒置混合,并在50℃温育1小时。将试管以7240xg离心20分钟。将上清倾倒入用4ml QBT缓冲液预平衡的Midi-Tip(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA),并通过重力使其流动。将移液尖(tip)用15ml QC buffer(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)洗涤,然后用5ml的QF缓冲液(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)洗脱。向其添加了3.5ml的异丙醇,并混合,然后在4℃以12,380xg离心20分钟。弃去上清,并用2ml冷70%乙醇洗涤沉淀,然后在4℃以12,380xg离心10分钟。将沉淀风干,然后重悬于100μl EB缓冲液(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)。DNA浓度为71ng/μl SaMF2103-14,220ng/μl SaMF2103-29,210ng/μlSaMF2103-37,230ng/μl SaMF2103-39,233ng/μl SaMF2103-53。
引物062012:
5’-GGAAACGTCAAGCGGCTTGC-3’(SEQ ID NO:32)
用于测试pShTh104表达盒的PCR反应物组成为2.5μl 10X反应缓冲液,1μl模板(80-300ng/μl),0.5μl引物065067(实施例1;50pM),0.5μl引物065130(实施例1;50pM),0.5μl dNTP混合物(10mM),19.75μl去离子水,和0.25μlHerculaseHotStart DNA聚合酶。用于测试pSaMF21表达盒的PCR反应物组成为2.5μl 10X反应缓冲液,1μl模板(80-300ng/μl),0.5μl引物065067(实施例1;50pM),0.5μl引物062400(实施例8;50pM),0.5μl dNTP混合物(10mM),19.75μl去离子水,和0.25μl和HerculaseHotStart DNA聚合酶。用于测试pRyan1表达盒的PCR反应物组成为2.5μl 10X反应缓冲液,1μl模板(80-300ng/μl),0.5μl引物065067(实施例1;50pM),0.5μl引物062012(见上;50pM),0.5μl dNTP混合物(10mM),19.75μl去离子水,和0.25μl HerculaseHotStartDNA聚合酶。使用米曲霉NRRL 3488基因组DNA(110ng/μl)作为供所有三种表达盒的阴性对照模板,并使用诸质粒(稀释至20ng/μl)作为阳性克隆模板。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,55℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,50℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟,每循环增加10秒。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析来自每个样品(以此顺序:pShTh104,pSaMF21,pRyan1)的PCR产物(5μl)。五个测试的样品(及阳性对照)具有预期的条带大小,而米曲霉NRRL 3488对照样品则无。
实施例16:在摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例15中所述的每个转化体和作为对照的米曲霉NRRL 3488的孢子铺板于单个PDA平板上,并允许其在34℃进行5至7日的孢子形成。在0.05%TWEEN80中收集孢子。在含有100ml的种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并用300μl孢子储备物接种。将种子培养物在30℃以200rpm振荡生长大约22个小时。在含有50ml的酸产生培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备酸产生培养物。将培养物在30℃以200rpm振荡温育3日。
含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因,异源mdh3NBD依存性苹果酸脱氢酶基因,和异源pyc丙酮酸羧化酶基因的米曲霉SaMF2103转化体(实施例15),与米曲霉NRRL 3488对照相比,产生高至2.6倍的苹果酸效价的增加。
实施例17:米曲霉ShTh1040和SaMF2103菌株的发酵
将米曲霉菌株ShTh1040-31和ShTh1040-44(均含有mae3C4二羧酸转运蛋白基因;实施例3),和SaMF2103-37和SaMF2103-39(均含有mae3C4二羧酸转运蛋白基因,mdh3NBD依存性苹果酸脱氢酶基因,和pyc丙酮酸羧化酶基因;实施例15)在34℃在PDA平板上生长大约7日。将5-6ml体积的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬浮的孢子从平板转移至50ml锥形管。对于每个管,将25ml的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后将其用2ml的孢子悬液接种。种子培养基组成为40g葡萄糖,6g Bacto蛋白胨,0.75g KH2PO4,0.75g K2HPO4,0.1g MgSO4·7H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.005gFeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。然后将烧瓶在34℃和180rpm温育大约24小时。合并三个种子烧瓶以供应每罐的144ml接种物。通过导入144ml(8%)的来自米曲霉转化体ShTh1040-31,米曲霉转化体ShTh1040-44,米曲霉转化体SaMF2103-37或米曲霉转化体SaMF2103-39的三个合并的种子烧瓶的种子培养液来用所选的菌株单独接种含有1.8升的培养基的三升发酵罐。培养基组成为120g葡萄糖,120g CaCO3,9g Bacto蛋白胨,0.150gKH2PO4,0.150g K2HPO4,0.10g MgSO·7H2O,0.10g CaCl2·2H2O,0.005gFeSO4·7H2O,0.005g NaCl,1.22mg生物素,和去离子水加至1升。
将发酵罐平衡于34±0.1℃并以500rpm搅拌。输入空气流维持在1v/v/m。未使用酸或碱添加以供pH控制。将由20%葡萄糖组成的补料在发酵开始约43小时时,以大约7.3g/hr的速率施于每个罐。在发酵第5日向每个罐导入额外的100g的CaCO3。每日移出样品,并就苹果酸产生进行分析。发酵在8日之后完成。
实施例18:苹果酸发酵的HPLC定量
对于实施例17的发酵的苹果酸定量如实施例5中所述进行。
表3显示米曲霉转化体ShTh1040-44,SaMF2103-37,SaMF2103-39,和ShTh1040-31的相对苹果酸效价。每种类型的转化体的相对排名与摇瓶结果一致。两种含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因,异源mdh3NBD依存性苹果酸脱氢酶基因,和异源pyc丙酮酸羧化酶基因的SaMF2103转化体(实施例15)与每个含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因,但不含异源mdh3NBD依存性苹果酸脱氢酶基因或异源pyc丙酮酸羧化酶基因的ShTh1040转化体(实施例3)相比,均产生较高的苹果酸效价。
表3
转化体 | 相对苹果酸效价 |
ShTh1040-31 | 1.00 |
ShTh1040-44 | 1.21 |
SaMF2103-37 | 1.40 |
SaMF2103-39 | 1.50 |
实施例19:土曲霉C4二羧酸转运蛋白基因的克隆和表达载体pShTh122AtC4T的构建
将1182bp的土曲霉C4二羧酸转运蛋白基因atc4t(ATEG_00085)人工构建入pAtC4T(图11;DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)。使用如下所示的引物069739和069740从pAtC4T扩增atc4t基因:
引物069739:
5’-GTGTGATAGAACATCGTCCATAATGTTTGAGAACACTGCCCC-3’(SEQ ID NO:38)
引物069740:
5’-GTCAGTCACCTCTAGTTAATTAATTACTCCACCACATCCTCGTC-3’(SEQ ID NO:39)
PCR反应混合物组成为50ng的pAtC4T模板,200μM dNTP混合物,50pM的引物069739,50pM引物069740,1X Pol1反应缓冲液(New EnglandBiolabs,MA,USA),3%DMSO,1单位的Vent DNA Polymerase(New EnglandBiolabs),和去离子水50μl。PCR反应在EPPENDORF MASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在94℃进行3分钟;35个循环,每循环在94℃进行15秒,59℃进行30秒,和72℃进行1分钟;和1个循环,在72℃进行5分钟。PCR产物通过TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶电泳纯化,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化。
用Sex AI和Pac I消化质粒pShTh60(图1),然后通过TBE缓冲液(10.8g/L Tris Base,5.5g/L硼酸,2mM EDTA,pH 8.0)中的0.8%琼脂糖凝胶电泳来分离,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化。然后将上述纯化的PCR产物使用InFusionTM Cloning Kit依照生产商的指示插入消化的载体,得到质粒pShTh122AtC4T(图12)。使用QIAfilter Maxi Plasmid Isolation Kit分离质粒pShTh122AtC4T。使用上述实施例中所述的引物996270和065067,使用DNA序列分析以确认atc4t编码序列的完整性。
atc4t基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:34)示于图13。1182bp的基因组编码序列(包含终止密码子)编码393个氨基酸的多肽,其具有43.2kDa的预测的分子量和6.54的等电点pH。该基因不含内含子。
实施例20:将pShTh12AtC4T转化入米曲霉NRRL3488
制备实施例19中的pShTh12AtC4T载体以供通过用Pme I的限制性消化进行的转化。将大约5kb的表达盒通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳从载体序列分离,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化。
制备了四个转化反应。对于每个反应,将原生质体制备物的100μl溶液(如实施例3中所述制备)转移至12ml聚丙烯管,向其添加2-5μg的上述消化的质粒载体和250μl的聚乙二醇溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),10mM Tris 6.5,10mM CaCl2),然后轻柔地混合,并在37℃温育30分钟。用6ml STC稀释每种转化反应,然后将三个不同等分试样铺板于COVE平板上。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将所得的转化体转移至单个COVE平板,并在34℃温育5日。通过在0.1%TWEEN80中收集孢子来制备孢子储备物。通过制备每个培养物的甘油储备物(800μl孢子储备物,200μl 0.1%TWEEN80)并冻结于-80℃来储藏培养物。
实施例21:在摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例20(ShTh1220)中所述的每个转化体和作为对照的米曲霉NRRL 3488的孢子铺板于单个PDA平板,并允许其在34℃进行5至7日的孢子形成。在0.05%TWEEN80中收集孢子。在含有100ml的种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并用300μl孢子储备物接种。将种子培养物在30℃以200rpm振荡生长大约22个小时。在含有50ml的酸产生培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备酸产生培养物。将培养物在30℃以200rpm振荡温育3日。
含有异源土曲霉C4二羧酸转运蛋白基因atc4t的米曲霉ShTh1220转化体,与米曲霉NRRL 3488对照相比,产生高至1.9倍的苹果酸效价的增加。
实施例22:米曲霉ShTh1220菌株的发酵
将米曲霉菌株ShTh1220-11,ShTh1220-22和ShTh1220-25在34℃在PDA平板上生长大约7日。将5-6ml体积的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬浮的孢子从平板转移至50ml锥形管。对于每个管,将25ml的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后将其用2ml的孢子悬液接种。种子培养基组成为40g葡萄糖,6g Bacto蛋白胨,0.75g KH2PO4,0.75g K2HPO4,0.1g MgSO4·7H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。然后将烧瓶在34℃和180rpm温育大约24小时。合并三个种子烧瓶以供应每罐的144ml接种物。通过导入144ml(8%)的来自米曲霉转化体ShTh1220-11,米曲霉转化体ShTh1220-22或米曲霉转化体ShTh1220-25的三个合并的种子烧瓶的种子培养液来用所选的菌株单独接种含有1.8升的培养基的三升发酵罐。培养基组成为60g葡萄糖,120g CaCO3,9g Bacto蛋白胨,0.150gKH2PO4,0.150g K2HPO4,0.10g MgSO·7H2O,0.10g CaCl2·2H2O,0.005gFeSO4·7H2O,0.005g NaCl,1.22mg生物素,和去离子水加至1升。
将发酵罐平衡于34±0.1℃并以500rpm搅拌。输入空气流维持在1v/v/m。未使用酸或碱添加以供pH控制。将由25%葡萄糖组成的补料在发酵开始约43小时时,以大约7.3g/hr的速率施于每个罐。在约92小时的发酵之后,将补料速率增加至大约9.3g/hr,然后在约164小时回到大约7.3g/hr。在发酵第5日向每个罐导入额外的100g的CaCO3。每日移出样品,并就苹果酸产生进行分析。发酵在8日之后完成。
实施例23:苹果酸发酵的HPLC定量
对于实施例22的发酵的苹果酸定量如实施例5中所述进行。
表4显示了米曲霉转化体ShTh1220-11,ShTh1220-22和ShTh1220-25与ShTh1040-22的苹果酸产生相比的相对苹果酸效价。每种转化体的相对排名与烧瓶结果相一致,即表现为诸ShTh1220转化体(其含有异源土曲霉C4二羧酸转运蛋白基因atc4t)产生与ShTh1040转化体(其含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因,并如实施例7中所示相对于缺乏异源C4二羧酸转运蛋白的米曲霉NRRL 3488对照具有增加的效价)相类似的苹果酸效价。
表4
转化体 | 相对苹果酸效价 |
ShTh1040-22 | 1.00 |
ShTh1220-11 | 0.97 |
ShTh1220-22 | 0.96 |
ShTh1220-25 | 0.96 |
实施例24:粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因的克隆和表达载体pSaMF27的构建
就在米曲霉中表达来对推定的粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因mae1(GenBank:U21002.1)进行密码子优化,并将其人工构建入p0941304_sspMAE1_pMK(图14;GENEART,Burlingame,CA,USA)。使用引物068320和068808从p0941304_sspMAE1_pMK扩增mae1基因。
引物068320:
5’-GAACATCGTCCATAATGGGAGAATTGAAGGAAATTC-3’(SEQ ID NO:40)
引物068808:
5’-GGTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTAGACCGACTCGTGT-3’(SEQ ID NO:41)
所述PCR反应组成为5μl 10X反应缓冲液,1μl 0941304_sspMAE1_pMK模板(50ng/μl),1μl引物068320(100ng/μl),1μl引物068808(100ng/μl),1μl dNTP混合物(10mM),45.5μl去离子水,和0.5μl HerculaseHotStart DNA聚合酶。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER中温育,其程序为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,55℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,55℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟,每循环增加10秒。对PCR反应进行用Dpn I的消化1小时以降解任何质粒DNA模板,然后使用Qiagen MinElutePCR纯化试剂盒纯化。用Sex AI和Pac I消化质粒pShTh60(Figure 1),然后通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit纯化。然后将上述纯化的PCR产物在以下反应中使用In-Fusion AdvantageTM Reaction Kit插入消化的载体,所述反应组成为2μl 5X缓冲液,0.5μl纯化的PCR产物(148ng/μl),2.5μl消化的和凝胶纯化的pShTh60(78ng/μl),1μl InFusionTM酶和4μl去离子水。将反应在37℃温育15分钟,然后在50℃温育15分钟,然后将其置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pSaMF27(图15)。
将上述连接反应物的2μl等分试样依照生产商的指示转化入ONESHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化体铺板于2XYT+amp平板并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并使用引物065067和996270对其进行DNA测序(参见上述实施例)以确认mae1基因成功地整合入载体。
粟酒裂殖酵母mae1基因的密码子优化的核苷酸序列(CO),推导的氨基酸序列,和野生型核苷酸序列(WT)示于图16A和16B(分别为SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,和SEQ ID NO:37)。编码序列为1317bp(包含终止密码子)。编码的预测的蛋白为439个氨基酸,具有49.4kDa的预测的分子量和8.24的等电点pH。该基因不含内含子。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering 10:1-6),预测了49个残基的信号肽。基于该程序,预测的成熟蛋白含有389个氨基酸,具有43.7kDa的预测的分子量和7.67的等电点pH。
实施例25:将pSaMF27转化入米曲霉NRRL3488
制备实施例24中的pSaMF27载体以供通过用Pme I在37℃限制性消化1小时进行的转化。将5103bp的表达盒通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳纯化,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit依照生产商的指示纯化。
制备了三个转化反应。对于每个反应,将100μl的原生质体制备物(如实施例3中所述制备)转移至12ml聚丙烯管,向其添加5μg的不含氨苄青霉素标记、经直链化的pSaMF27质粒载体和250μl的聚乙二醇(PEG),然后轻柔地混合,并在37℃温育30分钟。用3ml的STC缓冲液稀释每种转化,然后将其铺板于COVE平板。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将所得的转化体转移至单个COVE平板,并在34℃温育5日。通过在0.1%TWEEN80中收集孢子来制备孢子储备物。通过制备每个培养物的甘油储备物(800μl孢子储备物,200μl 0.1%TWEEN80)并冻结于-80℃来储藏培养物。
实施例26:在摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例25中所述的每个转化体和作为对照的米曲霉NRRL 3488的孢子铺板于单个PDA平板,并允许其在34℃进行5至7日的孢子形成。在0.05%TWEEN80中收集孢子。在含有100ml的种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并用300μl孢子储备物接种。将种子培养物在30℃以200rpm振荡生长大约22个小时。在含有50ml的酸产生培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备酸产生培养物。将培养物在30℃以200rpm振荡温育3日。
含有异源粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因mae1的米曲霉SaMF27转化体,与米曲霉NRRL 3488对照相比,产生高至1.9倍的苹果酸效价的增加。
实施例27:米曲霉SaMF27菌株的发酵
将米曲霉菌株ShTh1040-44,SaMF27-2,SaMF27-4和SaMF27-7在34℃在PDA平板上生长大约7日。将5-6ml体积的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬浮的孢子从平板转移至50ml锥形管。对于每个管,将25ml的含有0.2%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠pH 6.8缓冲液添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后将其用2ml的孢子悬液接种。种子培养基组成为40g葡萄糖,6g Bacto蛋白胨,0.75g KH2PO4,0.75g K2HPO4,0.1g MgSO4·7H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。然后将烧瓶在34℃和180rpm温育大约24小时。合并三个种子烧瓶以供应每罐的144ml接种物。通过导入144ml(8%)的来自米曲霉转化体ShTh1040-44,米曲霉转化体SaMF27-2,米曲霉转化体SaMF27-4或米曲霉转化体SaMF27-7的三个合并的种子烧瓶的种子培养液来用所选的菌株单独接种含有1.8升的培养基的三升发酵罐。培养基组成为120g葡萄糖,120g CaCO3,9g Bacto蛋白胨,0.150g KH2PO4,0.150g K2HPO4,0.10g MgSO·7H2O,0.10g CaCl2·2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005gNaCl,1.22mg生物素,和去离子水加至1升。
将发酵罐平衡于34±0.1℃并以500rpm搅拌。输入空气流维持在1v/v/m。未使用酸或碱添加以供pH控制。将由20%葡萄糖组成的补料在发酵开始约43小时时,以大约7.3g/hr的速率施于每个罐。在发酵第5日向每个罐导入额外的100g的CaCO3。每日移出样品,并就苹果酸产生进行分析。发酵在8日之后完成。
实施例28:苹果酸发酵的HPLC定量
对于实施例27的发酵的苹果酸定量如实施例5中所述进行。
表5显示了米曲霉转化体SaMF27-2,SaMF27-4,和SaMF27-7与ShTh1040-44的苹果酸产生相比的相对苹果酸效价。每种转化体的相对排名与烧瓶结果相一致,即表现为诸SaMF27转化体(其含有异源粟酒裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因mae1)给出与ShTh1040转化体(其含有异源mae3C4二羧酸转运蛋白基因,并如实施例7中所示相对于缺乏异源C4二羧酸转运蛋白的米曲霉NRRL 3488对照具有增加的效价)相类似的苹果酸产率(yield)。
表5
转化体 | 相对苹果酸效价 |
ShTh1040-44 | 1.00 |
SaMF27-2 | 0.89 |
SaMF27-4 | 0.95 |
SaMF27-7 | 0.84 |
本发明可进一步通过下述编号段落描述:
一种产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法,包括:(a)在培养基中培养丝状真菌宿主细胞,所述宿主细胞包含一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸;其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸;和(b)回收所述C4二羧酸。
段1的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白选自下组:(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7,SEQID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
段1或2的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段1-3任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段1-4任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段1-5任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7或其全长互补链杂交。
段1-6任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:33或其全长互补链杂交。
段1-7任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37;或其全长互补链杂交。
段1-8任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段1-9任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段1-10任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35或SEQID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段1-11任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成。
段1-11任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:34或由SEQ ID NO:34组成。
段1-11任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成。
段1-14任一项的方法,其中编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸可操作地连接于对于所述第一多核苷酸是外源的启动子。
段1-15任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17,或SEQ ID NO:19具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)苹果酸脱氢酶变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的苹果酸脱氢酶的具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
段1-16任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段1-17任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段1-18任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,或高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段1-19任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,或高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段1-20任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段1-21任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段1-22任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段1-22任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成。
段1-15任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在对应于或等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代;其中所述缺失和取代减少苹果酸脱氢酶变体的体内线粒体摄入,由此增加了胞质溶胶中苹果酸脱氢酶变体的水平,且其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码苹果酸脱氢酶变体的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
段25的方法,其中所述亲本苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ IDNO:17或其全长互补链杂交;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段26的方法,其中所述亲本苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段25-27任一项的方法,其中苹果酸脱氢酶变体包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段25-28任一项的方法,其中所述变体包含SEQ ID NO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。
段1-29任一项的方法,其中苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对于所述第二多核苷酸是外源的启动子。
段1-30任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶选自下组:(a)丙酮酸羧化酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)丙酮酸羧化酶,其包含SEQ ID NO:26的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的丙酮酸羧化酶的具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
段1-31任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段1-32任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件或高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段1-33任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段1-34任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成。
段1-35任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶是线粒体丙酮酸羧化酶的变体。
段1-36任一项的方法,其中丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对于所述第三多核苷酸是外源的启动子。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段1-37任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段1-44任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
段45的方法,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞,如米曲霉。
段1-46任一项的方法,其中在相同条件下培养时,C4二羧酸(例如苹果酸)的水平与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少200%,或至少500%。
一种增加C4二羧酸产生(例如苹果酸)的方法,包括:(a)将一种或多种(几种)选自下组的多核苷酸转化入丝状真菌宿主细胞:编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸;(b)在培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞;和(c)回收所述C4二羧酸。
段48的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白选自下组:(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:34,或SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%的序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
段48或49的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段48-50任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段48-51任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段48-52任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7或其全长互补链杂交。
段48-53任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:33或其全长互补链杂交。
段48-54任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37;或其全长互补链杂交。
段48-55任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段48-56任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段48-57任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35或SEQID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段48-58任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ IDNO:8或由SEQ ID NO:8组成。
段48-58任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ IDNO:34或由SEQ ID NO:34组成。
段48-58任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ IDNO:36或由SEQ ID NO:36组成。
段48-61任一项的方法,其中编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸可操作地连接于对于所述第一多核苷酸是外源的启动子。
段48-62任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19具有至少60%序列同一性,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%的序列同一性;(d)苹果酸脱氢酶变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的苹果酸脱氢酶的具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
段48-63任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段48-64任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段48-65任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件下,或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段48-66任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件下,或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段48-67任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段48-68任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段48-69任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段48-69任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成。
段48-62任一项的方法,其中所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代;其中所述缺失和取代减少苹果酸脱氢酶变体的体内线粒体摄入,由此增加了胞质溶胶中苹果酸脱氢酶变体的水平,且其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码苹果酸脱氢酶变体的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
段72的方法,其中所述亲本苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:17或其全长互补链杂交;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段73的方法,其中所述亲本苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段72-74任一项的方法,其中苹果酸脱氢酶变体包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段72-75任一项的方法,其中所述变体包含SEQ ID NO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。
段48-76任一项的方法,其中苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对于所述第二多核苷酸是外源的启动子。
段48-77任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶选自下组:(a)丙酮酸羧化酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)丙酮酸羧化酶的变体,其包含SEQ ID NO:27的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的丙酮酸羧化酶的具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
段48-78任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段48-79任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段48-80任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段48-81任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成。
段48-82任一项的方法,其中所述丙酮酸羧化酶是线粒体丙酮酸羧化酶的变体。
段48-83任一项的方法,其中丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对于所述第三多核苷酸是外源的启动子。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段48-84任一项的方法,其中所述丝状真菌宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
段92的方法,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞,如米曲霉。
段48-93任一项的方法,其中在相同条件下培养时,C4二羧酸(例如苹果酸)的水平与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少200%,或至少500%。
一种丝状真菌宿主细胞,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸,其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
段95的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白选自下组:(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7,SEQID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
段95或96的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段95-97任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段95-98任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。
段95-99任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:7或其全长互补链杂交。
段95-100任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:33或其全长互补链杂交。
段95-101任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37;或其全长互补链杂交。
段95-102任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQID NO:7具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段95-103任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQID NO:33具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段95-104任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性。
段95-105任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成。
段95-105任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:34或由SEQ ID NO:34组成。
段95-105任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成。
段95-108任一项的丝状真菌宿主细胞,其中编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸可操作地连接于对于所述第三多核苷酸是外源的启动子。
段95-109任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:17或SEQID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQID NO:17或SEQ ID NO:19具有至少60%序列同一性,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或100%的序列同一性;(d)苹果酸脱氢酶变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的苹果酸脱氢酶的具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
段95-110任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段95-111任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段95-112任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件下,或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17,(ii)包含于SEQ ID NO:17中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段95-113任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件下,或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段95-114任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段95-115任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段95-116任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段95-117任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成。
段95-109任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代;其中所述缺失和取代减少苹果酸脱氢酶变体的体内线粒体摄入,由此增加了胞质溶胶中苹果酸脱氢酶变体的水平,且其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码苹果酸脱氢酶变体的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,分泌(或能够分泌)增加水平的C4二羧酸(例如,苹果酸)。
段119的丝状真菌宿主细胞,其中所述亲本苹果酸脱氢酶选自下组:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ IDNO:17或其全长互补链杂交;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段120的丝状真菌宿主细胞,其中所述亲本苹果酸脱氢酶包含SEQID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段119-121任一项的丝状真菌宿主细胞,其中苹果酸脱氢酶变体包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段119-122任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述变体包含SEQ IDNO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。
段119-123任一项的丝状真菌宿主细胞,其中苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对于所述第一多核苷酸是外源的启动子。
段95-124任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶选自下组:(a)丙酮酸羧化酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性;(d)丙酮酸羧化酶,其包含SEQ ID NO:27的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或(e)(a),(b),(c)或(d)的丙酮酸羧化酶的具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
段95-125任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段95-126任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
段95-127任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段95-128任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成。
段95-129任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶是线粒体丙酮酸羧化酶的变体。
段95-130任一项的丝状真菌宿主细胞,其中丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对于所述第二多核苷酸是外源的启动子。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段95-131任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸和编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
段95-138任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
段139的丝状真菌宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞,如米曲霉。
段95-140任一项的丝状真菌宿主细胞,其中在相同条件下培养时,C4二羧酸(例如苹果酸)的水平与不具有编码C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的一种或多种(几种)异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少200%,或至少500%。
一种亲本苹果酸脱氢酶的分离的变体,包含(i)在等同于SEQ ID NO:18的位置2至17或其部分的位置处的缺失,和(ii)在等同于SEQ ID NO:18的位置48的位置处的取代。
段142的变体,其中所述亲本苹果酸脱氢酶为:(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如,中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:17或其全长互补链杂交;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17具有至少60%,例如,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。
段142的变体,其中所述亲本苹果酸脱氢酶包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。
段142-144任一项的变体,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与亲本苹果酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
段142-145任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述变体包含SEQ IDNO:18的缺失Phe2*+Ala3*+Ala4*+Arg5*+Gln6*+Ser7*+Phe8*.Asn9*+Leu10*+Leu11*+Gln12*+Lys13*+Arg14*+Ala15*+Phe16*+Ser17*和SEQ ID NO:18的取代Arg48Tyr。
一种分离的多核苷酸,其编码段142-146任一项的变体。
一种核酸构建体,其包含段147的多核苷酸。
一种重组表达载体,其包含段147的多核苷酸。
一种重组宿主细胞,其包含段147的多核苷酸。
段1-94任一项的方法,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
段95-140任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内,因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上,从前面的说明中,除本文所显示和描述的之外,本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下,将以包括定义部分的本公开为准。
Claims (20)
1.一种丝状真菌宿主细胞,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸,其中所述C4二羧酸转运蛋白选自下组:
(a)C4二羧酸转运蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36具有至少60%序列同一性;
(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,或其全长互补链杂交;
(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,或SEQ ID NO:37具有至少60%的序列同一性;
(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或
(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;
而且其中在相同条件下培养时,所述丝状真菌宿主细胞与不具有编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,能够分泌增加水平的C4二羧酸。
2.权利要求1的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36;或者由SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:34,或SEQ ID NO:36组成。
3.权利要求1或2的丝状真菌宿主细胞,其中所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸可操作地连接于对于所述第三多核苷酸是外源的启动子。
4.权利要求1-3任一项的丝状真菌宿主细胞,进一步包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
5.权利要求4的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶选自下组:
(a)苹果酸脱氢酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60%序列同一性;
(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19,(ii)包含于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;
(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17,或SEQ ID NO:19具有至少60%序列同一性;
(d)苹果酸脱氢酶变体,其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;或
(e)(a),(b),(c)或(d)的苹果酸脱氢酶的具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
6.权利要求4的丝状真菌宿主细胞,其中所述苹果酸脱氢酶包含SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20;或者由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20组成。
7.权利要求4-6任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对于所述第二多核苷酸是外源的启动子。
8.权利要求1-7任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述丝状真菌宿主细胞进一步包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
9.权利要求8的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶选自下组:
(a)丙酮酸羧化酶,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有至少60%序列同一性;
(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:26,(ii)包含于SEQ ID NO:26中的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;
(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少60%序列同一性;
(d)包含SEQ ID NO:27的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的丙酮酸羧化酶变体;或
(e)(a),(b),(c)或(d)的丙酮酸羧化酶的具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
10.权利要求8的丝状真菌宿主细胞,其中所述丙酮酸羧化酶包含SEQID NO:27;或者由SEQ ID NO:27组成。
11.权利要求8-10任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对于所述第三多核苷酸是外源的启动子。
12.权利要求1-11任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
13.权利要求12的丝状真菌宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
14.权利要求13的丝状真菌宿主细胞,其中所述宿主细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
15.权利要求1-14任一项的丝状真菌宿主细胞,其中在相同条件下培养时,所述宿主细胞与不具有编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞相比,能够多分泌至少50%的C4二羧酸。
16.权利要求1-15任一项的丝状真菌宿主细胞,其中所述C4二羧酸为苹果酸。
17.一种产生C4二羧酸的方法,包括:
(a)在培养基中培养权利要求1-16任一项的丝状真菌宿主细胞;和
(b)回收所述C4二羧酸。
18.一种增加C4二羧酸产生的方法,包括:
(a)将编码C4二羧酸转运蛋白的异源第一多核苷酸转化入丝状真菌宿主细胞,得到权利要求1-16任一项的丝状真菌宿主细胞;
(b)在培养基中培养所述转化的丝状真菌宿主细胞;和
(c)回收所述C4二羧酸。
19.权利要求17或18的方法,其中产生的C4二羧酸为大于150g/L的浓度。
20.权利要求17-19任一项的方法,其中培养基的pH为6.0至7.0。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US23896209P | 2009-09-01 | 2009-09-01 | |
US61/238,962 | 2009-09-01 | ||
US32722410P | 2010-04-23 | 2010-04-23 | |
US61/327,224 | 2010-04-23 | ||
US35697110P | 2010-06-21 | 2010-06-21 | |
US61/356,971 | 2010-06-21 | ||
PCT/US2010/047002 WO2011028643A1 (en) | 2009-09-01 | 2010-08-27 | Methods for improving malic acid production in filamentous fungi |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102597224A true CN102597224A (zh) | 2012-07-18 |
CN102597224B CN102597224B (zh) | 2015-07-15 |
Family
ID=43017152
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201080049490.4A Expired - Fee Related CN102597224B (zh) | 2009-09-01 | 2010-08-27 | 用于在丝状真菌中改善苹果酸产生的方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8741611B2 (zh) |
EP (2) | EP3103876A1 (zh) |
JP (1) | JP5833553B2 (zh) |
CN (1) | CN102597224B (zh) |
AU (1) | AU2010289725A1 (zh) |
BR (1) | BR112012004594A2 (zh) |
CA (1) | CA2772695A1 (zh) |
DK (1) | DK2473600T3 (zh) |
MX (1) | MX2012002532A (zh) |
WO (1) | WO2011028643A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105861574A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一种利用米曲霉发酵产l-苹果酸的方法 |
WO2016127920A1 (zh) * | 2015-02-15 | 2016-08-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 新的二元有机酸生产菌株及其制备和应用 |
CN106778062A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 西南大学 | 出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用 |
CN111073864A (zh) * | 2018-10-19 | 2020-04-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 |
WO2023093794A1 (zh) * | 2021-11-24 | 2023-06-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种高产l-苹果酸的耐酸酵母菌株及其构建方法和应用 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2576606T3 (en) | 2010-06-04 | 2015-02-23 | Novozymes Inc | Preparation of C4 dicarboxylic acid in filamentous fungi |
DK2769985T3 (da) | 2010-06-21 | 2018-01-29 | Novozymes Inc | Polypeptider fra Aspergillus aculeatus med C4-dicarboxylsyre-transportøraktivitet samt polynukleotider, som koder for samme |
EP2582829B1 (en) | 2010-06-21 | 2016-11-30 | Novozymes, Inc. | Methods for improved c4-dicarboxylic acid production in filamentous fungi |
CN103492551A (zh) * | 2011-02-28 | 2014-01-01 | 诺维信股份有限公司 | 用于生产c4-二羧酸的微生物 |
CN103917649A (zh) | 2011-08-19 | 2014-07-09 | 诺维信股份有限公司 | 用于生产c4-二羧酸的重组微生物 |
US9803209B2 (en) | 2012-05-18 | 2017-10-31 | Novozymes A/S | Bacterial mutants with improved transformation efficiency |
WO2014052630A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Novozymes, Inc. | Bacterial mutants with improved transformation efficiency |
JP2016165225A (ja) * | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
WO2018051837A1 (ja) * | 2016-09-15 | 2018-03-22 | 花王株式会社 | 変異糸状菌、及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 |
WO2019133632A1 (en) | 2017-12-27 | 2019-07-04 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods of treating disorders associated with castor |
SG11202006047RA (en) | 2017-12-27 | 2020-07-29 | St Jude Childrens Res Hospital Inc | Small molecule modulators of pantothenate kinases |
CN109628472A (zh) | 2018-11-23 | 2019-04-16 | 山东理工大学 | 一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体 |
CN109628473A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-04-16 | 山东理工大学 | 一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体 |
US20220282265A1 (en) * | 2019-08-12 | 2022-09-08 | Zymergen Inc. | Engineered biosynthetic pathways for production of 3-amino-4-hydroxybenzoic acid by fermentation |
CN110734865B (zh) * | 2019-12-02 | 2022-11-01 | 南京昊禾生物科技有限公司 | 一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用 |
CN111269950B (zh) * | 2020-02-26 | 2022-03-08 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 发酵生产l-苹果酸的培养基及其制备方法与应用 |
CN111676146B (zh) * | 2020-07-03 | 2022-02-01 | 江南大学 | 一株耐酸酿酒酵母及其应用 |
US20240115566A1 (en) * | 2020-12-16 | 2024-04-11 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Methods of treating disorders associated with castor |
CN114806902B (zh) * | 2022-05-12 | 2024-04-02 | 王玮 | 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008144626A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Microbia Precision Engineering, Inc. | Malic acid production in recombinant yeast |
WO2009011974A1 (en) * | 2007-05-18 | 2009-01-22 | Microbia Precision Engineering, Inc. | Organic acid production by fungal cells |
WO2009065778A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Succinic acid production in a eukaryotic cell |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3063910A (en) | 1960-02-03 | 1962-11-13 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of producing l-malic acid by fermentation |
US5536661A (en) | 1987-03-10 | 1996-07-16 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of protein products in aspergillus |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
BR9507817A (pt) | 1994-06-03 | 1997-09-16 | Novo Nordisk Biotech Inc | Construção de dna enzima vetor recombinante célula hospedeira recombinante lacase de ascomicete ou deuteromicete processos para obter uma enzima de lacase para melhorar o rendimento de enzima recombinante para polimerizar um substrato de lignina ou lignossulfato em soluç o para despolimerizar in situ a pasta kraft para oxidar corantes ou precursores de corantes para pintar cabelo e para polimerizar ou oxidar um composto fenólico ou anilina composição de corante e recipiente contendo a mesma |
WO1996000787A1 (en) | 1994-06-30 | 1996-01-11 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
US5766439A (en) | 1996-10-10 | 1998-06-16 | A. E. Staley Manufacturing Co. | Production and recovery of organic acids |
US20090119022A1 (en) * | 1998-09-25 | 2009-05-07 | Timberlake William E | Emericella Nidulans Genome Sequence On Computer Readable Medium and Uses Thereof |
US7504490B1 (en) * | 1998-10-16 | 2009-03-17 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Apergillus fumigatus for diagnostics and therapeutics |
DE69932345T2 (de) | 1998-10-26 | 2007-07-19 | Novozymes A/S | Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen |
WO2000056900A2 (en) | 1999-03-22 | 2000-09-28 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Promoter sequences derived from fusarium venenatum and uses thereof |
CA2455013A1 (en) | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Francesca Storici | Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides |
JP5013879B2 (ja) | 2004-01-29 | 2012-08-29 | ズィーケム インコーポレイテッド | 有機酸の回収 |
US20080090273A1 (en) | 2005-11-21 | 2008-04-17 | Aaron Adriaan Winkler | Malic Acid Production in Recombinant Yeast |
WO2008008950A2 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Novozymes, Inc. | Methods for producing secreted polypeptides having biological activity |
EP2304039B1 (en) | 2008-06-17 | 2019-08-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate |
EA018463B1 (ru) | 2008-07-08 | 2013-08-30 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | ПОЛУЧЕНИЕ ДИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ НИЗКИХ pH |
WO2010111344A2 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Microbia, Inc. | Methods and microorganisms for production of c4-dicarboxylic acids |
JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
WO2011066304A2 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Codexis, Inc. | Engineered beta-class carbonic anhydrase polypeptides and uses thereof |
EP2582829B1 (en) * | 2010-06-21 | 2016-11-30 | Novozymes, Inc. | Methods for improved c4-dicarboxylic acid production in filamentous fungi |
DK2769985T3 (da) * | 2010-06-21 | 2018-01-29 | Novozymes Inc | Polypeptider fra Aspergillus aculeatus med C4-dicarboxylsyre-transportøraktivitet samt polynukleotider, som koder for samme |
-
2010
- 2010-08-27 DK DK10748214.3T patent/DK2473600T3/en active
- 2010-08-27 BR BR112012004594A patent/BR112012004594A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-08-27 WO PCT/US2010/047002 patent/WO2011028643A1/en active Application Filing
- 2010-08-27 MX MX2012002532A patent/MX2012002532A/es active IP Right Grant
- 2010-08-27 CN CN201080049490.4A patent/CN102597224B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-08-27 JP JP2012527943A patent/JP5833553B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-08-27 EP EP16176171.3A patent/EP3103876A1/en not_active Withdrawn
- 2010-08-27 EP EP10748214.3A patent/EP2473600B1/en not_active Not-in-force
- 2010-08-27 AU AU2010289725A patent/AU2010289725A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-27 CA CA2772695A patent/CA2772695A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-27 US US12/870,523 patent/US8741611B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-05-05 US US14/269,591 patent/US8999685B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-10-09 US US14/510,582 patent/US20150024446A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008144626A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Microbia Precision Engineering, Inc. | Malic acid production in recombinant yeast |
WO2009011974A1 (en) * | 2007-05-18 | 2009-01-22 | Microbia Precision Engineering, Inc. | Organic acid production by fungal cells |
WO2009065778A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Succinic acid production in a eukaryotic cell |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016127920A1 (zh) * | 2015-02-15 | 2016-08-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 新的二元有机酸生产菌株及其制备和应用 |
US10781462B2 (en) | 2015-02-15 | 2020-09-22 | Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences | Dibasic organic acid producing strain and preparation and application of same |
US11390890B2 (en) | 2015-02-15 | 2022-07-19 | Tianjin Institute Of Industrial Biotechnology, Chinese Academy Of Sciences | Dibasic organic acid producing strain and preparation and application of same |
CN105861574A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一种利用米曲霉发酵产l-苹果酸的方法 |
CN105861574B (zh) * | 2016-04-25 | 2019-04-02 | 江南大学 | 一种利用米曲霉发酵产l-苹果酸的方法 |
CN106778062A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 西南大学 | 出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用 |
CN106778062B (zh) * | 2016-11-29 | 2019-04-02 | 西南大学 | 出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用 |
CN111073864A (zh) * | 2018-10-19 | 2020-04-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 |
CN112867790A (zh) * | 2018-10-19 | 2021-05-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 |
CN111073864B (zh) * | 2018-10-19 | 2022-06-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 |
CN112867790B (zh) * | 2018-10-19 | 2022-09-27 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 |
WO2023093794A1 (zh) * | 2021-11-24 | 2023-06-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种高产l-苹果酸的耐酸酵母菌株及其构建方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2010289725A1 (en) | 2012-04-05 |
JP5833553B2 (ja) | 2015-12-16 |
US20140234925A1 (en) | 2014-08-21 |
US8741611B2 (en) | 2014-06-03 |
CN102597224B (zh) | 2015-07-15 |
CA2772695A1 (en) | 2011-03-10 |
JP2013503631A (ja) | 2013-02-04 |
BR112012004594A2 (pt) | 2016-06-21 |
EP3103876A1 (en) | 2016-12-14 |
EP2473600B1 (en) | 2016-06-29 |
MX2012002532A (es) | 2012-04-11 |
EP2473600A1 (en) | 2012-07-11 |
US8999685B2 (en) | 2015-04-07 |
US20150024446A1 (en) | 2015-01-22 |
WO2011028643A1 (en) | 2011-03-10 |
DK2473600T3 (en) | 2016-10-03 |
US20110053233A1 (en) | 2011-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102597224B (zh) | 用于在丝状真菌中改善苹果酸产生的方法 | |
CN103917649A (zh) | 用于生产c4-二羧酸的重组微生物 | |
EP2582829B1 (en) | Methods for improved c4-dicarboxylic acid production in filamentous fungi | |
CN103492551A (zh) | 用于生产c4-二羧酸的微生物 | |
CN105492604A (zh) | 受调节的pepc表达 | |
CN101952303A (zh) | 提高目标蛋白质的表达产率的方法 | |
CN103003298B (zh) | 在丝状真菌中产生c4二羧酸 | |
CN103080126A (zh) | 具有c4-二羧酸转运蛋白活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 | |
CN103068989B (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸 | |
CN103068988A (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150715 Termination date: 20180827 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |