CN109628472A - 一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体 - Google Patents

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CN109628472A CN201811402942.7A CN201811402942A CN109628472A CN 109628472 A CN109628472 A CN 109628472A CN 201811402942 A CN201811402942 A CN 201811402942A CN 109628472 A CN109628472 A CN 109628472A
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杨俊换
杨武
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Abstract

本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域，本发明从高产油卷枝毛霉WJ11克隆获得二羧酸转运体dit基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将dit基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑Dit，最终实现了dit基因在卷枝毛霉MU402中的表达，过表达菌株Mc‑Dit胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mc‑Dit菌株油脂总脂肪酸含量提了33.76%，胞内油脂含量最多可以达到细胞干重的17.67%。

Description

一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体
技术领域
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术过量表达二羧酸转运体(dit)基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂产量。
背景技术
现在，人民生活水平日益提高，越来越多的人重视身体健康与生活质量。膳食油脂的营养成分与慢性病的发生密切相关，油脂中重要的活性多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、α-亚麻酸（ALA）、紫草酸（十八碳四烯酸、SDA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），可以调节体内脂质代谢，预防多种慢性疾病的发生。γ-亚麻酸为人体必需脂肪酸，是人体合成活性多不饱和脂肪酸的前体物质，需要从膳食中获得。目前工业化的γ-亚麻酸大多来源于植物，如月见草、玻璃苣油和黑加仑籽油。然而植物因受产地、气候的影响，生长周期短、产量不稳定，不能满足市场需求。因此，寻找新型油脂资源成为当前研究的热点。产油微生物由于其油脂含量高，生长周期短，碳源利用广谱等特点备受关注，通过微生物产生的油脂以及其衍生品来代替部分植物资源，可能在未来生物产油产业中发挥重要作用。产油微生物细胞工厂是指利用产油微生物，发酵过程中通过添加过量的碳源，如碳水化合物、碳氢化合物等，使得微生物胞内脂肪酸以甘油三酯的方式大量储存在自身体内，进而将细胞转变成工厂。
卷枝毛霉是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。卷枝毛霉被用来作为产油微生物研究的模式菌种，然而，本研究中分离获得新菌株WJ11，其所产生的脂质可以占到细胞干重的36%，且其基因组测序已完成，遗产背景与产油机制研究较为深入，同时其基因操作简单，遗传工具较为齐全，比较适于进行细胞工厂制备。卷枝毛霉能够大量产生对人体具有重要生理功能的γ-亚麻酸 (GLA)，这也是其主要的商业价值。
二羧酸转运体(2-oxoglutarate/malate transporter，dit)基因是脂质合成的关键因素之一。产油真菌通常在碳源充足，其它营养成分（如氮、磷、硫等）缺乏的条件下，线粒体中三羧酸循环受阻，导致柠檬酸大量积累在线粒体中，此时柠檬酸被转运到细胞质中由柠檬酸裂解酶裂解产生脂肪酸合成底物乙酰辅酶A和草酸乙酰。乙酰辅酶A为细胞中油脂合成前体物质，进而通过生化反应被用于合成脂肪酸，而脂肪酸则以甘油三酯的形式储存在细胞内，从而形成微生物油脂。据报道，二羧酸转运体能够将细胞质内的苹果酸等二羧酸透过线粒体细胞膜转运到线粒体内，进而促进柠檬酸的转出，为细胞油脂合成起到促进作用，因此二羧酸转运体对于微生物油脂合成与积累具有重要作用。本专利利用卷枝毛霉作为研究微生物产脂的细胞工厂的模式菌株，利用同源重组的基因工程方法来提高卷枝毛霉油脂产量，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导，并且能够用微生物油脂提供高营养价值的多不饱和脂肪酸，符合人民对身体健康和高质量生活的日益增长的要求。
发明内容
本发明提供一种卷枝毛霉重组菌株Mu-Dit，包括二羧酸转运体（dit）基因在卷枝毛霉基因组上的整合并过量表达，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了33.76%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的17.67 %。
本发明的技术方案是：提取卷枝毛霉（Mucor circinelloides）WJ11菌株的mRNA反转出cDNA，设计特异引物PCR扩增二羧酸转运体（dit）基因将该基因连接至整合型质粒pMAT1552上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养，发酵条件为：采用Kendrick培养基， 28 ℃，700 rpm，进气量1 v/vmin-1，pH 6.0。发酵过程中，根据油脂积累规律采集样品，进行油脂含量与组成的测定。
本发明还提供了编码二羧酸转运体（dit）基因，其基因核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明还提供了含有SEQ ID NO: 1的表达载体，能够表达二羧酸转运体（dit）基因，所述载体是卷枝毛霉表达载体。
本发明成功的表达了二羧酸转运体，其蛋白质序列如SEQ ID NO: 2所示。
有益效果
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体；构建了重组菌株Mc-Dit，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了33.76%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的17.67 %。
附图说明
图1是卷枝毛霉重组菌株的PCR验证图，其中 M代表标准蛋白分子量；0代表对照菌株Mc1552；1-3代表卷枝毛霉重组菌株Mc-Dit。图2是卷枝毛霉重组菌株的dit基因mRNA表达水平测定图。
具体实施方式
实施例1：二羧酸转运体（dit）基因信息学分析
根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到二羧酸转运体（dit）基因（000 239.15， 2129bp）（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），通过基因序列进行信息学分析，该序列编码区为1701bp碱基序列，可编码566个氨基酸（其蛋白质序列如SEQ ID NO: 2），预计分子量为60.62kDa，PI 6.56，该序列编码的蛋白与来自Mucor ambiguus的二羧酸转运体（dit）基因（NCBI基因ID：GAN03794.1）和Choanephora cucurbitarum的苹果酸转运体 YflS基因（NCBI基因ID：OBZ90888.1）的同源性分别为67%和75%，因此，初步确定该基因可以编码卷枝毛霉WJ11的二羧酸转运体。
实施例2：重组质粒构建
将卷枝毛霉（Mucor circinelloides）WJ11菌株接种在含100 mL Kendrick培养基（葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酒石酸铵3.3 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，酵母提取物1.5 g/L，CaCl20.076 g/L，FeCl3·6H2O 8 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O 0.1 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.1 mg/L，MnSO4·5H2O 0.1 mg/L）的500 mL带挡板的锥形瓶中，28℃，150 rpm，培养24 h，抽滤收集菌体，提取DNA。根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到二羧酸转运体（Dit）基因（scaffold00239.15, 2129bp）（其核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示），根据基因序列设计特异引物MuDit-F和MuDit-R，以卷枝毛霉DNA为模板进行PCR, MuDit-F：5’– ACTTTTATATACAAAATAACTAAATCTCGAGATGCCAAAAGAGCCGTCTAT–3’，MuDit-R：5’– ACTAGTCGCAATTGCCGCGGCTCGAGTCAACACCAGCCCAAAAGTT–3。’
PCR反应参照PrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara）说明书进行试验，反应条件为95℃变性3 min 后开始循环，然后95 ℃变性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1min，共30个循环后，再于72 ℃延伸10 min，降温至4 ℃保持5 min。扩增得到2129bp的PCR片段，回收片段与pMAT1552载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂1.5%）。经37 ℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L），8~10h后提取质粒进行序列测定，将序列正确的质粒命名为pMAT1552- Dit。
实施例3：卷枝毛霉原生质体制备
将卷枝毛霉Mu402菌株孢子接种到YPG培养基（酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸20 µg/mL，尿嘧啶200 µg/mL，pH 4.5）的平板中，28 ℃，培养1天。取单克隆菌丝点植于YPG培养基的平板，28℃培养3~4天孢子即可长好。取孢子生长良好的平板，每个平板加入5~6 mL的YPG培养基，用灭菌的涂布棒刮取孢子，将孢子悬浮液收集于灭菌的50mL离心管中，用血球计数板计算浓度并用pH 4.5的YPG调整孢子浓度为1×107个/mL。取12.5 mL上述孢子悬液于灭菌的250 mL锥形瓶中，置于4 ℃冰箱过夜使孢子充分吸水膨胀。将锥形瓶置于30 ℃，250 rpm的摇床培养至孢子萌发。1100rpm离心后用5mL pH 6.5的PS缓冲液[18.22 g山梨醇与20 mL PBS缓冲液（NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO4 10 mM，KH2PO4 2 mM）]洗两次，将培养基洗去。用5ml PS缓冲液重悬，并加入终浓度为4 mg/mL的裂解酶和0.06 U/mL的壳聚糖酶，置于30 ℃，60 rpm的摇床孵育90 min以除去细胞壁。100×g离心后用0.5 M 4 ℃预冷的山梨醇洗两次，加入800 μL 0.5 M的山梨醇轻轻吹吸重悬沉淀，得到原生质体，分装100 μL/管以备使用。
实施例4：重组菌株Mc-Dit构建
取100 μL上述制备好的原生质体与1 μg质粒pMAT1552- Dit或pMAT1552混匀电击转化，电击结束后立即加入1 mL预冷的YPGS（0.5 mol/L 山梨醇，酵母提取物3 g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20 g/L），26 ℃，100 rpm孵育1 h，100×g离心除去YPGS，以YNBS[山梨醇91.1g/L，谷氨酸1.5 g/L，(NH4)2SO4 1.5 g/L，酵母基本氮源0.5 g/L，葡萄糖10 g/L，调pH 4.5，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]重悬后均匀涂布于MMC选择培养基上[酪蛋白氨基酸10 g/L，酵母基本氮源0.5 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L调pH 3.2，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]，28℃避光培养3~4天。随机挑取8个选择性平板上长出的单菌落菌丝于新的MMC平板，28℃培养2-3天收集孢子，将大约200-300个孢子分别接种于MMC和含尿嘧啶的MMC平板中，28℃培养2-3天计数，重复上述筛选步骤直到两个平板中孢子生长数量基本相同则说明得到稳定遗传的转化子。稳定遗传的转化子菌丝在YPG培养基平板，30 ℃培养5~7天后收取孢子，调整孢子浓度为1×107个/mL，-80 ℃保存于30%甘油管中。最终获得了卷枝毛霉重组菌株Mc-Dit和对照菌株Mc1552。将涂布后摇瓶培养的剩余菌体用布氏漏斗真空抽滤分离得到，提取卷枝毛霉基因组DNA（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行），以此为模板以1552-F和1552-R为引物(该对引物为质粒中插入目的基因位点上下游600bp位置)，进行PCR验证。
1552-F: 5’– CCTCGGCGTCATGATGTTTTTGTGTACCT–3’
1552-R：5’– GGGATGTCTGCTGCTACCATGTCTCAT–3’
反应体系及扩增条件，95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。PCR验证结果如图1，卷枝毛霉重组菌株Mc-Dit得到的片段为2729bp，而对照菌株Mc1552在相应位置片段为600bp，说明质粒已成功转化进入卷枝毛霉中。
实施例6：二羧酸转运体基因表达水平测定
参照Trizol使用说明书提取3、24、48、27h发酵样品的mRNA, 并用ReverTra Ace qPCRRT Kit (Roche)反转为cDNA, 利用RT-qPCR 方法测定二羧酸转运体的表达水平，利用2-DDCt方法处理数据，测定过程采用的试剂盒为SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Roche)，扩增引物序列为：
WJ11-Dit-F 5’–CCATAAAGTGTCTTTGGCTATTACGCACC–3’，
WJ11-Dit-R 5’–ACCAAGAGCTCCAAAATAAGCGAGC–3’。
内参基因为actin，其扩增引物序列为：
actin-F 5’–GATGAAGCCCAATCCAAGA–3’，
actin-R 5’–TTCTCACGGTTGGACTTGG–3’。
扩增条件为：95ºC 预热10min, 之后 95 ºC 30s，59ºC 10s, 72ºC 30s(45循环)。dit基因表达结果如图2所示。在Mc-Dit 中，dit基因成功表达，24h后基因表达量降低，但是与对照相比基因表达水平仍处于较高水平。
实施例7：卷枝毛霉重组菌株Mc- Dit脂肪酸组成及含量测定
待测样品制备：在2 L发酵罐中采用Kendrick培养基培养卷枝毛霉重组菌株Mc-Dit。发酵条件为 28℃，700 rpm，进气量1 v/v min-1，pH维持6.0。根据卷枝毛霉产油规律，收集全发酵液样品，用布氏漏斗真空抽滤，分离发酵液和菌体，收集发酵液于-20℃保存待用，用蒸馏水洗涤菌体3遍，然后冷冻干燥备用。
采用酸处理与反复冻融结合的破壁方式，用有机溶剂提取重组菌Mc-Dit干菌体中油脂，参照方法（Folch J, Lees M, Sloane-Stanley G, et al. A simple method forthe isolation and purification of total lipids from animal tissues. BiolChem, 1957, 226, 497-509），并作适当修改，具体方法如下：①将冷冻干燥后的菌体研磨后，称取20 mg干重菌体于5 mL的玻璃瓶中，加入2 mL 4 M盐酸；②80 ℃水浴1 h，-80 ℃15min，重复一次；③恢复至室温后，加入1 mL甲醇和1 mL氯仿，并用微量进样器加入100 μL浓度为2.02 μg/μL内标C15:0；④置于混匀仪中旋转萃取0.5 h，3000 rpm离心3 min，收集氯仿层于新的5 mL的玻璃瓶中；⑤向原玻璃瓶中再次加入1 mL氯仿，重复④的过程并合并氯仿层；⑥氮气吹干；⑦加入1 mL 10%的盐酸甲醇溶液，60℃水浴3 h，期间每隔半小时震荡30sec；⑧冷却至室温后加入2 mL正己烷和1 mL饱和NaCl溶液，漩涡震荡混匀，4000 rpm离心3min，吸取正己烷层1 mL，转移至气相瓶得到脂肪酸甲酯溶液。
采用气相色谱分析，以商业化的脂肪酸甲酯标准品（37种脂肪酸甲酯混标）为标样来对脂肪酸甲酯进行分析。气相色谱为美国安捷伦的GC-6890N，测量条件：气相色谱条件：不分流进样，色谱柱是DM-FFAP（30m×0.32mm，0.22μm），氢离子火焰检测器，载气为氮气，气化室温度和检测器温度均为250℃，进样量1μL。升温程序：初温80℃，先以8℃/min的升温速率升至200℃，再以1℃/min升温速率升至205℃，最后以4℃/min的升温速率升至240℃，保持5min。以十五烷酸（C15：0）作为参照，记录各个脂肪酸组成峰面积的大小，计算总脂肪酸的含量。结果如表1，过表达菌株Mc-Dit胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mc-Dit菌株油脂总脂肪酸含量提高了33.76%，胞内油脂含量最多可以达到总脂肪酸的17.67%。
表1 发酵培养对照型和dit过表达型菌株油脂含量
由此可确定卷枝毛霉WJ11中000 239.15基因所编码的蛋白质为二羧酸转运体，该蛋白质在重组菌株Mc-Dit成功表达，并且，该蛋白质参与卷枝毛霉油脂合成过程，过表达该转运体可以有效提高该菌株胞内油脂的产量。
序列表
<110> 山东理工大学
<120> 一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2129
<212> DNA
<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)
<400> 1
atgccaaaag agccgtctat tgccatttct accgagatac ccaacgaaag cacctgctta 60
ttgcctgtgg acagcactaa cacaacattg gagctgagag aatcaacaaa caaacaaggt 120
acacatttgt tgttgcgggt aaacatataa acattgcaac ttatgcaact gttgtaggca 180
ttgtagctgc tgttgtgtat cgcaaattca tagcctccaa gctgttcagt ctgctgccat 240
cgcttgccct gggatcagct atttggtttg gcgtgactcc atcagaggaa ctcacattga 300
catccattcg attgctcgca gtgtttacaa ggttcgtctg ggcagccatt gctggtggtt 360
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gtcataggtt tagcatatgc cattttgctc tcaggtacca ccttaaacac caactaatgt 780
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agtgggaaac attgttttgg ttgggcgggt ttgtaacgat tgccactcaa ctctctgaag 1680
caggagcatc tggctatatt ggccataaag tgtctttggc tattacgcac ctcaaattgc 1740
ccgctgtgcc tgccttggct attgcttatt tccttacgac attcatgttc tcttccctga 1800
gcgctcatac cgtggcattt gtagctacct ttttggatgc agggcattca ttaggtgcca 1860
acccaatgat actgacttgc ttgctcgctt attttggagc tcttggtggt tgcatggtat 1920
gatgtcgatt cgcgcagagt gcaacttaat aagcgactaa tttgaataca tagacaaact 1980
tttctacagg aagcttggcc atgtattatg ctccaggtta tgtttctcgt tcgaaatggt 2040
ttgtcgttgg tggacagata gcattgctct acctcgtcat ctactttact tttggtatgg 2100
gctggtggaa acttttgggc tggtgttga 2129
<210> 2
<211> 566
<212> PRT
<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)
<400> 2
Met Pro Lys Glu Pro Ser Ile Ala Ile Ser Thr Glu Ile Pro Asn Glu
1 5 10 15
Ser Thr Cys Leu Leu Pro Val Asp Ser Thr Asn Thr Thr Leu Glu Leu
20 25 30
Arg Glu Ser Thr Asn Lys Gln Gly Ile Val Ala Ala Val Val Tyr Arg
35 40 45
Lys Phe Ile Ala Ser Lys Leu Phe Ser Leu Leu Pro Ser Leu Ala Leu
50 55 60
Gly Ser Ala Ile Trp Phe Gly Val Thr Pro Ser Glu Glu Leu Thr Leu
65 70 75 80
Thr Ser Ile Arg Leu Leu Ala Val Phe Thr Ser Cys Ile Phe Ala Leu
85 90 95
Ile Thr Thr Ser Val Asp Ile Ser Val Leu Val Leu Thr Ala Leu Thr
100 105 110
Leu Leu Ser Ser Thr His Ser Phe Val Cys Glu Asp His Val Thr Gly
115 120 125
Met Ser Thr Glu Cys Arg Leu Cys Gly Glu Ile Asn Pro Ile Thr Glu
130 135 140
Ala Pro Phe Glu Cys Asn Gly Gly Lys Glu Ala Phe His His Ser Leu
145 150 155 160
Glu Gly Phe Ser Ser Ser Val Val Trp Leu Ile Phe Ala Ala Phe His
165 170 175
Leu Gly Lys Ala Val Glu Val Thr Gln Leu Gly Lys Arg Ile Ser Leu
180 185 190
Phe Met Ile Arg Ser Phe Gly Lys His Val Ile Gly Leu Ala Tyr Ala
195 200 205
Ile Leu Leu Ser Glu Leu Leu Leu Ala Pro Val Val Pro Ser Asn Thr
210 215 220
Ala Arg Gly Gly Gly Ile Val Leu Pro Val Val His Ser Ile Ala Thr
225 230 235 240
Thr Leu Gly Ser Thr Pro Ser Gln Asn Pro Lys Ile Gly Gly Phe Leu
245 250 255
Met Leu Ile Gly Ala His Ser Asn Leu Leu Ser Ala Ser Met Tyr Leu
260 265 270
Thr Gly Met Ala Pro Asn Pro Val Val Leu Ala Lys Ala Asn Thr Leu
275 280 285
Tyr Pro Asp Leu Gln Phe Asn Phe Met Thr Trp Ile Thr Gly Ser Ser
290 295 300
Val Pro Ala Leu Val Ser Ala Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Ala Trp
305 310 315 320
Ser Cys Gly Ile Phe Lys Ser Lys Glu Glu Ser Ala Gln Val Glu Glu
325 330 335
Gly Gln Gln Leu Lys Ala Ser Gly Asp Asp Ile Val Gln His Ala Ser
340 345 350
Lys Glu Leu His Ala Met Gly Ser Met Ser Ser Lys Glu Leu Gln Leu
355 360 365
Cys Ser Val Leu Cys Val Cys Leu Val Met Trp Val Thr Ser Gly Tyr
370 375 380
Thr Lys Ile Asp Ser Thr Leu Val Ala Leu Ile Gly Ile Val Ala Leu
385 390 395 400
Leu His Met Gly Thr Ile Arg Trp Lys Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn
405 410 415
Ala Trp Glu Thr Leu Phe Trp Leu Gly Gly Phe Val Thr Ile Ala Thr
420 425 430
Gln Leu Ser Glu Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ile Gly His Lys Val Ser
435 440 445
Leu Ala Ile Thr His Leu Lys Leu Pro Ala Val Pro Ala Leu Ala Ile
450 455 460
Ala Tyr Phe Leu Thr Thr Phe Met Phe Ser Ser Leu Ser Ala His Thr
465 470 475 480
Val Ala Phe Val Ala Thr Phe Leu Asp Ala Gly His Ser Leu Gly Ala
485 490 495
Asn Pro Met Ile Leu Thr Cys Leu Leu Ala Tyr Phe Gly Ala Leu Gly
500 505 510
Gly Cys Met Thr Asn Phe Ser Thr Gly Ser Leu Ala Met Tyr Tyr Ala
515 520 525
Pro Gly Tyr Val Ser Arg Ser Lys Trp Phe Val Val Gly Gly Gln Ile
530 535 540
Ala Leu Leu Tyr Leu Val Ile Tyr Phe Thr Phe Gly Met Gly Trp Trp
545 550 555 560
Lys Leu Leu Gly Trp Cys
565

Claims (5)

1.一种用于提高卷枝毛霉产油量的二酸酸转运体基因（dit），其特征是，如SEQ ID NO:1所示的核酸，其特征在于编码一种卷枝毛霉二羧酸转运体。
2.含有权利要求1所述核酸的表达载体，其特征是，能够表达卷枝毛霉二羧酸转运体，所述载体为卷枝毛霉表达载体。
3.含有权利要求2所述载体的重组微生物，其特征是，能够表达卷枝毛霉二羧酸转运体。
4.根据权利要求3所述重组微生物，其特征是，所述微生物为卷枝毛霉。
5.一种来源于卷枝毛霉的二羧酸转运体（Dit），其特征是，蛋白质序列如SEQ ID NO: 2所示。
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