CN105566462B - 出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用 - Google Patents

出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用，出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，基因组序列如SEQ ID NO.3所示；通过敲除和过表达出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1发现，敲除后出芽短梗霉的生物量及代谢产物聚苹果酸均降低，而过表达后聚苹果酸产量得到提高，证明了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1参与调控聚苹果酸的合成，因此氮响应转录因子Gat1可用于提高出芽短梗霉的聚苹果酸产量，对进一步提高出芽短梗霉聚苹果酸产量具有重要意义。

Description

出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，还涉及出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高聚苹果酸产量中的应用。
背景技术
聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可用于生物医学材料、营养强化剂、食品包装等领域，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单体为L-苹果酸，是一种优良的食品酸化剂，市场年需求在10万吨以上。
聚苹果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)代谢产生，研究发现发酵过程氮源对聚苹果酸合成及细胞生长具有显著影响，且在氮限制条件下有利于聚苹果酸合成，但是对于该机制并不十分清楚，如氮响应转录因子Gat1是否参与调控聚苹果酸合成尚未报道。因此，有必要对氮响应转录因子Gat1进行研究，探究氮源对聚苹果酸合成影响的原因，以进一步提高聚苹果酸的产量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1；本发明的目的之二在于提供含有编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体；本发明的目的之三在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用；本发明的目的之四在于提供含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因组序列如SEQ ID NO.3所示。
2、含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体。
优选的，所述过表达载体由以下方法构建：扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPE1 的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框，连入pk2-bar-gus的EcoRI酶切位点处，得过表达载体。
优选的，扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列的引物如SEQ IDNO.26和SEQ ID NO.27所示；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框的引物如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示。
3、所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
4、所述含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明成功获得了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因，并获得了该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，基因组序列如SEQ ID NO.3所示；对基因功能研究发现，敲除出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因后出芽短梗霉的生物量降低，同时聚苹果酸产量也降低；而过表达出芽短梗霉氮响应转录因子 Gat1后聚苹果酸产量明显提高，约为10-30％，对进一步提高聚苹果酸产量具有重要意义，同时对提高出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖等的发酵产量也具有指导意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为pk2-gus和pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc载体图谱(A：pk2-gus；B：pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc)。
图2为出芽短梗霉敲除转化子的PCR引物设计原理图及验证结果。
图3为pBARGPE1 和pk2-bar-gus的载体结构图(A：pBARGPE1 载体结构图；B：pk2-bar-gus 载体结构图)。
图4为出芽短梗霉Gat1过表达菌株的PCR验证。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、克隆出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因
根据出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)全基因组测序结果，利用生物信息学软件设计氮响应转录因子Gat1基因组扩增引物，上游引物为Gat1-F：5’-atgacatcgccgcgcacc-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-ttacaaactcatggtaagccattccc-3’(SEQ ID NO.2)，然后以出芽短梗霉 (A.pullulans CCTCC M2012223)基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸 10min；25℃保温10min。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片段，回收产物连接 pMD 19-T Vector，经测序获得如SEQ ID NO.3所示序列，其开放阅读框序列如SEQ ID NO.4 所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例2、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因敲出
(1)出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因敲除载体的构建
利用同源重组的方法，以潮霉素抗性标记hyg替换掉氮响应转录因子Gat1中1074bp的一段序列，包括从ATG开始的894bp和ATG上游的180bp，以破坏其表达。具体是以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因组为模板，使用phata Max Super-FidelityDNA polymerse高保真Taq酶，以5arm-F：5’-agtggatcccccggggaattcccatactgtcccatttctcg-3’(SEQ ID NO.6)；5arm-R：5’-cagtaggttagctggggttgc-3’(SEQ ID NO.7)扩增上游同源臂5arm，同时以 3arm-F：5’-gtttagaggtaatccttcttcaaacgacgtgccgactgc-3’(SEQ ID NO.8)；3arm-R： 5’-acagctatgacatgattacggcaaccattcgtgtaggagcag-3’(SEQ ID NO.9)为引物扩增下游同源臂3arm；获得的上游同源臂5arm如SEQ ID NO.10所示，下游同源臂3arm如SEQ ID NO.11所示。
再以pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc载体为模板(图1中B)(参见文献“涂光伟，王永康，冯俊，李晓荣，郭美锦，邹祥.农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株.生物工程学报，2015，31(7)：1063-1072”)以HYGL-F： 5’-caaccccagctaacctactggtcgacagaagatgacattgaag-3’(SEQ ID NO.12)和HYGL-R：5’-acagctatgacatgattacgtgctccatacaagccaacc-3’(SEQ ID NO.13)扩增潮霉素抗性标的左端HYG-L (如SEQ ID NO.14所示)；同时以HYGR-F：5’-agtggatcccccggggaattacctgcctgaaaccgaact-3’ (SEQ ID NO.15)和HYGR-R：5’-aagaaggattacctctaaacaagtgt-3’(SEQ ID NO.16)扩增潮霉素抗性标的右端HYG-R(如SEQID NO.17所示)，其中HYG-L的右端和HYG-R的左端有 427bp的同源序列。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收备用。
使用一步克隆试剂盒(ClonExpressTM MultiS One Step Cloning Kit)将上游同源臂5arm 和潮霉素抗性标记的左端HYG-L连接至pk2-gus的EcoRI酶切位点处(图1中A)。具体原理是：将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)，这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。具体操作是：将pk2-gus载体在EcoRI酶切位点处酶切线性化，在5arm的正向PCR引物5arm-F(SEQ ID NO.6)5’端引入线性化载体pk2-gus上游末端20bp序列，使得5arm的PCR产物 5’端带有和线性化载体pk2-gus上游末端对应的完全一致的序列(20bp)；同理在HYG-L的正向引物HYGL-F(SEQ ID NO.12)5’端引入5arm片段的下游末端20bp序列，使得HYG-L 的PCR产物5’端带有和5arm下游末端完全一致的20bp序列；在HYG-L的反向引物HYGL-R (SEQ IDNO.13)5’端引入线性化载体pk2-gus下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR 产物3’端带有和线性化载体pk2-gus下游末端完全一致的20bp序列；然后以线性化载体 pk2-gus和插入片段5arm、HYG-L的PCR产物配制重组反应体系，37℃反应30min实现将片段5arm和HYG-L顺序拼接并克隆至载体pk2-gus的EcoRI酶切位点处。构建敲除载体 pk2-gus-5arm-HygL，转化E.coli DH5α感受态细胞；采用同样的方法，将潮霉素抗性标记的右端HYG-R和下游同源臂3arm连接至pk2-gus的EcoRI酶切位点处，构建敲除载体 pk2-gus-HygR-3arm(图1)，转化E.coli DH5α感受态细胞。然后分别以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R引物PCR验证转化子，经测序验证无误后备用。
(2)敲除载体遗传转化出芽短梗霉
将构建好的敲除载体pk2-gus-5arm-HygL和pk2-gus-HygR-3arm测序无误后，同时转化根癌农杆菌(A.tumefaciens)AGL-1感受态细胞，分别以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R 引物PCR验证农杆菌转化子，验证无误即获得含有敲除载体AGL-1-pk2-gus-5arm-HygL和 AGL-1-pk2-gus-HygR-3arm的根癌农杆菌。挑取含有敲除载体的根癌农杆菌单菌落于YCK培养基(YCK培养基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨5，牛肉膏5，蔗糖5，MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.0，固体加2％琼脂，115℃高温蒸汽灭菌30min。灭菌后加卡那霉素(50mg/mL)1000μL，羧苄青霉素(50mg/mL)1000μL)中28℃培养，同时挑取出芽短梗霉单菌落于HC培养基(HC 培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母提取物3，牛肉膏1，蛋白胨10，麦芽浸出物3，pH 5.7；115℃高温蒸汽灭菌30min)中25℃培养。将上述处理好的农杆菌和出芽短梗霉按体积比1:1混合， 25℃共培养48h后转膜至含有头孢他啶和潮霉素B的M100平板上培养5～7天至转化子长出。将长出的转化子挑至M100平板(M-100培养基(g/L)：葡萄糖10，KNO3 3，M-100SS 62.5mL，加ddH2O至1L，固体加1.5％琼脂，115℃高温蒸汽灭菌30min。灭菌后加入头孢他啶(500 mg/mL)1000μL和潮霉素B(50mg/mL)2000μL)上复筛，以P5/P6引物做菌液PCR，若 P5/P6引物验证正确，则提取基因组。以基因组做模板，分别以P1/P2、P3/P4、P7/P8和P9/P10 引物PCR验证，具体引物序列如表1所示，检测结果如图2所示。结果显示，PCR产物大小与预期相符，表明Gat1基因中1074bp的序列被成功敲除，成功得到了出芽短梗霉的Gat1 基因破坏株ΔGat1，命名为出芽短梗霉敲除转化子。同时将验证正确的出芽短梗霉敲除转化子在不含潮霉素B的平板上连续传3代，考察其遗传稳定性。
表1、出芽短梗霉敲除转化子检测引物
(3)发酵试验
将上述获得的出芽短梗霉敲除转化子在摇瓶发酵96小时，然后提取聚苹果酸。结果显示，出芽短梗霉敲除转化子的聚苹果酸发酵产量为9.48±0.25g/L，比原始菌株降低了49.1％；出芽短梗霉敲除转化子的生物量为8.79±0.08g/L，比原始菌株降低了36.6％。表明敲出Gat1 基因后能够影响出芽短梗霉的生物量和聚苹果酸的产量(发酵方法和聚苹果酸提取方法见公开号为102827778A的中国专利)。
实施例3、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因过表达
(1)Gat1过表达载体构建
以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)cDNA为模板，OE-BamHI-F： 5’-aattggatccatgacatcgccgcgcacc-3’(SEQ ID NO.28)和OE-SmaI-R： 5’-ccccccgggttacaaactcatggtaagccattccc-3’(SEQ ID NO.29)为引物扩增出芽短梗霉Gat1基因编码区的基因组序列，分别在CDS的5’端和3’端引入BamH I和Sma I酶切位点，扩增获得 BamHI-Gat1CDS-XmaI。以真菌过表达载体pBARGPE1 为基础(图3中A)，将BamH I-Gat1CDS-Sma I经BamH I和Sma I酶切后与经BamH I和Sma I酶切的pBARGPE1 载体连接，获得出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因过表达载体，命名为pBARGPE1 -Gat1(图3中B)。然后以pBARGPE1 -Gat1为模板，以gpdA.Gat1.trpC-F： 5’-acagctatgacatgattacgcaggtattgctgttatctgatgagt-3’(SEQ ID NO.30)和gpdA.Gat1.trpC-R： 5’-catcttctgtcgacgaatttcagaggttttcaccgtcatc-3’(SEQ IDNO.31)为引物扩增出Gat1表达框 gpdA-Gat1-trpC，其含有构巢曲霉gpdA强启动子和trpC终止子。将扩增产物连接pMD19-T Vector，经测序验证正确后备用。
将载体pk2-bar-gus使用EcoRI内切酶酶切线性化，在设计引物时分别在正向引物gpdA.Gat1.trpC-F(SEQ ID NO.30)的5’端引入线性化载体pk2-bar-gus上游末端20bp序列，在反向引物gpdA.Gat1.trpC-R(SEQ ID NO.31)的5’端引入线性化载体pk2-bar-gus下游末端20bp序列，使得gpdA-Gat1-trpC的PCR产物5’端和3’端分别带有和线性化载体 pk2-bar-gus上/下游末端完全一致的20bp序列，使用一步克隆试剂盒(ClonExpressTM MultiSOne Step Cloning Kit)将gpdA-Gat1-trpC连接至pk2-bar-gus的EcoRI酶切位点处，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子PCR验证并测序无误，即为Gat1的过表达载体 pk2-bar-gus-gpdA-Gat1-trpC，含有构巢曲霉gpdA强启动子、trpC终止子和草铵膦抗性标记bar。
(2)过表达载体pk2-bar-gus-gpdA-Gat1-trpC遗传转化出芽短梗霉
构建好的过表达载体pk2-bar-gus-gpdA-Gat1-trpC测序无误后，转化根癌农杆菌(A.tumefaciens AGL-1)感受态细胞，将根癌农杆菌和出芽短梗霉细胞培养后，按体积比1:1 混合，25℃共培养48h后转移至含有头孢他啶和草铵磷(5mL/50mL培养基)的M100平板上培养5～7天至见转化子长出。将长出的转化子挑至M100平板上复筛，以gpdA-F： 5’-ggtggggagagcaggaaaata-3’(SEQ ID NO.32)和gpdA-R：5’-gcagagagaagggctgagtaataag-3’ (SEQ ID NO.33)为引物PCR验证，结果如图4所示。结果显示能得到632bp大小的条带，表明gpdA-Gat1-trpC成功整合进出芽短梗霉的基因组中，同时将验证正确的过表达株在不含草铵膦的平板上连续传3代，考察其遗传稳定性，得到出芽短梗霉过表达菌株OE::gat1。
(3)发酵验证
将出芽短梗霉过表达菌株OE::gat1摇瓶发酵96小时，聚苹果酸发酵产量为20.72±1.80 g/L，比原始菌株提高了11.2％；过表达菌株OE::Gat1的细胞生物量为19.18±1.74g/L，比原始菌株提高了38.43％。5L发酵罐试验表明，OE::Gat1转化子发酵72小时，聚苹果酸产量为 48.7±1.55g/L，比对照组提高了28.9％(发酵方法和聚苹果酸提取方法见公开号为102827778A 的中国专利)。
结果表明，出芽短梗霉过表达gat1后能够提高聚苹果酸的产量，表明氮响应转录因子 Gat1参与并调控聚苹果酸合成。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因，其特征在于：其编码区的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因，其特征在于：其基因组序列如SEQ ID NO.3所示。
4.含有权利要求3所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体。
5.根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于：所述过表达载体由以下方法构建：扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPE1的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框，连入pk2-bar-gus的EcoRI酶切位点处，得过表达载体，所述pk2-bar-gus如说明书附图3中B所示。
6.根据权利要求5所述的过表达载体，其特征在于：扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列的引物如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框的引物如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示。
7.权利要求1所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
8.权利要求4~6任一项所述的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
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