CN102827778A

CN102827778A - 高产聚苹果酸的菌株及其应用和方法

Info

Publication number: CN102827778A
Application number: CN2012102005000A
Authority: CN
Inventors: 邹祥; 戢运超
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-06-18
Also published as: CN102827778B

Abstract

本发明公开了高产聚苹果酸的菌株，具体为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801，保藏号为CCTCC NO:M2012223；能够利用工业副产物糖蜜为原料，原料成本低，并且聚苹果酸产率高；还公开了该菌株的在生产聚苹果酸中的应用和生产聚苹果方法，具有工艺简单，成产成本低的优点，具有广泛的应用前景。

Description

高产聚苹果酸的菌株及其应用和方法

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体涉及高产聚苹果酸的菌株，还涉及该菌株的应用及其方法。

背景技术

聚苹果酸（Polymalic acid，PMLA）以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。由于PMLA在侧链上具有悬挂羧基，容易与其他官能团反应而制备PMLA衍生物，与聚乳酸等材料相比，PMLA在体内易代谢性、易修饰性等方面表现出更好的优势，在药物制剂、食品包装、农业等方面应用前景广阔。聚苹果酸还可以水解为单体，即L-苹果酸，又名2-羟基丁二酸，是重要的有机酸和生物炼制平台化合物。L-苹果酸具有天然果实的酸味特征，味觉自然丰厚，可作为酸味剂在食品及医药中广泛应用。L-苹果酸的酸感强度约相当于柠檬酸的1.2倍，产热量更低，可以替代柠檬酸作为食品添加剂加以应用。

目前聚苹果酸主要通过由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵生产，主要以淀粉和葡萄糖为原料，其原料价格高，在一定程度上限制了工业应用。糖蜜是制糖工业的主要副产物，糖蜜中主要以蔗糖为主，能够被出芽短梗霉利用，但是利用效率低，聚苹果酸的产率低，无法在工业上大规模应用。因此，急需一种高产聚苹果酸的菌株，能够利用价格低廉的糖蜜为原料，利用效率高，聚苹果酸产量高，为聚苹果酸的生产提供一条新型经济工艺路线。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高产聚苹果酸的菌株，具有较好的利用蔗糖能力，能够以制糖工业的主要副产物糖蜜为糖源，利用效率高，聚苹果酸产量高。

为实现上述发明目的，技术方案为：

高产聚苹果酸的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801，保藏号为CCTCC NO: M 2012223。

本发明的目的之二在于提供出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸中的应用，技术方案为：

所述出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223在生产聚苹果酸中的应用。

本发明目的之三在于提供利用出芽短梗霉FMT1801生产聚苹果酸的方法，工艺简单，原料价格低，聚苹果酸产量高。技术方案为：

为了实现上述为目的，本发明的技术方案为：

利用所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基，在温度为23-30℃震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40-100g/L、NH₄NO₃1-5 g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、ZnSO₄ 0.005-0.3g/L、MgSO₄ 0.005-0.3g/L、玉米浆0.05-3 g/L和CaCO₃ 10-50 g/L；

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于发酵培养基，在温度为23-30℃震荡培养96小时以上，离心收集液体，得发酵液；所述发酵培养基为糖蜜50-200g/L、氮源1-5g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、ZnSO₄ 0.005-0.3g/L、MgSO₄ 0.005-0.3g/L、玉米浆0.05-3g/L和CaCO₃ 10-50 g/L；

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻，离心收集沉淀，得到聚苹果酸。

优选的，所述步骤a中，所述出芽短梗霉FMT1801按出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100-1000接种，在转速为180-300 rpm培养36-96小时。

更优选的，所述种子培养基为葡萄糖60-80g/L、NH₄NO₃ 2-4g/L、KH₂PO₄ 0.05-0.2g/L、ZnSO₄ 0.05-0.2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、玉米浆1-2g/L和CaCO₃ 20-40 g/L。

优选的，所述活化种子液按活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20接种，在转速为180-1000 rpm条件下培养96-200小时。

更优选的，所述发酵培养基为糖蜜100-150g/L、氮源2-4g/L、KH₂PO₄ 0.05-0.2g/L、ZnSO₄ 0.05-0.2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、玉米浆0. 5-2g/L和CaCO₃ 20-40 g/L。

优选的，所述步骤c是加入相当于发酵液体积1-5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻12-36小时，在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。

更优选的，所述步骤c是加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的乙醇溶液，4℃冷冻24小时；在转速为3500rpm的条件下离心45分钟。

最优选的，所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠。

本发明使用的发酵菌株为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801，将出芽短梗霉FMT1801制备成OD₆₀₀= 0.4左右的菌液，即出芽短梗霉FMT1801种子液，备用。

本发明有益效果在于：本发明公开了高产聚苹果酸的菌株为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801为发酵菌株，保藏号为CCTCC NO: M 2012223，该菌株具有较好的利用蔗糖的能力，还能以工业副产物糖蜜为糖源，通过发酵产生浓度高的聚苹果酸，原料成本低，聚苹果酸产量高，具有较好的经济效益。本发明中糖蜜为制糖工业的主要副产物因此原料来源广泛，价格低廉，同时由于出芽短梗霉FMT1801发酵的终产物为聚苹果酸，解决了传统路线发酵终产物为苹果酸，抑制菌种活性，降低产量的问题，因而能够获得高浓度的聚苹果酸发酵液，发酵液中聚苹果酸最高达29g/L。

本发明使用的出芽短梗霉FMT1801菌株生产的聚苹果酸能直接分泌到胞外，用体积分数为95%的乙醇溶液即可沉淀，容易提取，工艺步骤简单，适合大规模工业生产。

菌种保藏

本发明中出芽短梗霉FMT1801（Aureobasidium pullulans FMT1801）是从出芽短梗孢NRRL Y2311经过自然分离获得能高效利用蔗糖为碳源产生聚苹果酸的菌株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2012223，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年6月12日，分类命名为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1

生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖60g/L、硝酸铵2 g/L、KH₂PO₄ 0.05g/L、ZnSO₄ 0.05g/L， MgSO₄ 0.05g/L、玉米浆0.05g/L和CaCO₃ 20 g/L在温度为25℃、转速为250 rpm条件下震荡培养48 小时，得活化种子液。

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜100 g/L、硝酸钾2 g/L、KH₂PO₄ 0.05g/L、ZnSO₄ 0.05g/L、MgSO₄ 0.05g/L、玉米浆0.5g/L和CaCO₃20 g/L，在温度为25℃、转速为220 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻24小时，转速为4000rpm离心30分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。

本实施例中，聚苹果酸产量为29 g/L，制得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80℃条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为32.9 g/L。

实施例2

生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖80g/L、硝酸铵4 g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、ZnSO₄ 0.2g/L， MgSO₄ 0.2g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃ 40 g/L在温度为25℃、转速为180rpm条件下震荡培养96 小时，得活化种子液。

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜150g/L、硝酸钠4 g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、ZnSO₄ 0.2g/L、MgSO₄ 0.2g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃ 40 g/L，在温度为23℃、转速为180 rpm条件下震荡培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积3倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻12小时，转速为3500rpm离心45分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。

本实施例中，聚苹果酸产量为27.9 g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤2次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在85℃条件下水解10小时，得到苹果酸，苹果酸产量为31.7 g/L。

实施例3

生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801 种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖 100 g/L、硝酸铵5 g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、ZnSO₄ 0.3g/L， MgSO₄ 0.3g/L、玉米浆3 g/L和CaCO₃ 50g/L在温度为28℃、转速为300 rpm条件下震荡培养36 小时，得活化种子液。

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜200 g/L、硝酸铵5 g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、ZnSO₄ 0.3g/L、MgSO₄ 0.3g/L、玉米浆3g/L和CaCO₃ 50 g/L，在温度为30℃、转速为300rpm条件下震荡培养150小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积4倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻36小时，转速为5000rpm离心5分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。

本实施例中，聚苹果酸产量为26g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤1次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在90℃条件下水解9小时，得到苹果酸，苹果酸产量为29.5g/L。

实施例4

生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801 种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖40 g/L、硝酸铵0.005 g/L、KH₂PO₄ 0.005g/L、ZnSO₄ 0.005g/L、 MgSO₄ 0.005g/L、玉米浆0.5g/L和CaCO₃ 10g/L，在温度为23℃、转速为250 rpm条件下震荡培养72小时，得活化种子液。

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于含3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15，发酵培养基配方为糖蜜50 g/L、氯化铵1 g/L、KH₂PO₄ 0.005g/L、ZnSO₄ 0.005g/L、MgSO₄ 0.005g/L、玉米浆0.005g/L和CaCO₃ 10 g/L，在温度为28℃、转速为500 rpm，通气量为1:0.8条件下培养200小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻24小时，转速为4500rpm离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。

本实施例中，聚苹果酸产量为21.2g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在70℃条件下水解15小时，得到苹果酸，苹果酸产量为24.1g/L。

实施例5

生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖 70 g/L、硝酸铵3 g/L、KH₂PO₄ 0.1g/L、ZnSO₄ 0.15g/L， MgSO₄ 0.1g/L、玉米浆1g/L和CaCO₃ 30 g/L在温度为25℃、转速为220 rpm条件下震荡培养48 小时，得活化种子液。

b. 发酵

将步骤a所得活化种子液接种于含5L发酵培养基的10L发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜120 g/L、硝酸钾3 g/L、KH₂PO₄ 0.1g/L、ZnSO₄ 0.15g/L、MgSO₄ 0.1g/L、玉米浆1g/L和CaCO₃ 30 g/L，在温度为25℃、转速为1000 rpm，通气量为1:1.6条件下培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。

c. 聚苹果酸提取

将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻24小时，在3000rpm条件下离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。

本实施例中，聚苹果酸产量为34.4g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤1次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在85℃条件下水解10小时，得到苹果酸，苹果酸产量为39g/L。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.高产聚苹果酸的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）FMT1801，保藏号为CCTCC NO: M 2012223。

2.权利要求1所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸中的应用。

3.利用权利要求1所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸的方法，其特征在于，具体步骤为：

a．种子活化

将出芽短梗霉FMT1801接种于种子培养基，在温度为23-30℃震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40-100g/L、NH₄NO₃1-5 g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、ZnSO₄ 0.005-0.3g/L、MgSO₄ 0.005-0.3g/L、玉米浆0.05-3 g/L和CaCO₃ 10-50 g/L；

b. 发酵

c. 聚苹果酸提取

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤a中，所述出芽短梗霉FMT1801按出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100-1000接种，在转速为180-300 rpm培养36-96小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子培养基为葡萄糖60-80g/L、NH₄NO₃ 2-4g/L、KH₂PO₄ 0.05-0.2g/L、ZnSO₄ 0.05-0.2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、玉米浆1-2g/L和CaCO₃ 20-40 g/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤b中，所述活化种子液按活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20接种，在转速为180-1000 rpm条件下培养96-200小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为糖蜜100-150g/L、氮源2-4g/L、KH₂PO₄ 0.05-0.2g/L、ZnSO₄ 0.05-0.2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、玉米浆0. 5-2g/L和CaCO₃ 20-40 g/L。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤c是加入相当于发酵液体积1-5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4℃冷冻12-36小时，在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤c是加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的乙醇溶液，4℃冷冻24小时；在转速为3500rpm的条件下离心45分钟。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于：所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠。