CN1265422A - 产生果糖转移酶的新菌株及其生产所述酶的方法 - Google Patents

Abstract

筛选到一株出芽短梗霉菌株FW9901,在30℃下液态发酵48小时达到果糖转移酶(Ftase)分泌高峰,摇瓶最高达到440U/毫升,发酵罐水平最高酶活性为272U/毫升;该酶的最适宜的反应温度为55℃,最适宜的反应pH值为5.5。利用所产酶以62.5%(W/V)蔗糖为原料在55℃下合成低聚果糖,低聚糖产率高达68.70%,大大超过55—60%的最高水平,酶效率比前人结果高出100倍,由此将相应节约低聚糖产品生产中的酶成本100倍;反应时间以48小时为宜,该酶最佳反应条件为:0.1U/g(蔗糖),55℃。

Description

产生果糖转移酶的新菌株及其生产所述酶的方法

本发明属于新的微生物和微生物发酵工程领域，具体地说，本发明涉及一种新的出芽短梗霉菌株，以及利用该微生物菌株高产量地制备果糖转移酶的发酵方法，还涉及果糖转移酶高效地催化蔗糖合成果寡糖的方法。

80年代以来，随着人们对健康食品和低热值食品需求的日益增加，许多功能性食品添加剂和甜味剂替代品应运而生，低聚糖或寡糖就是重要一类，如异麦芽低聚糖、大豆低聚糖、果寡糖、甘露寡糖、海藻寡糖等。其中果寡糖(FOS)一枝独秀。果寡糖(FOS)为由3-10个单糖组成的低聚碳水化合物，主要是通过微生物的转移酶由蔗糖合成的。在合成中，酶的来源不同催化果糖的连接方式也不一样，出芽短孢霉和黑曲霉果糖转移酶(Ftase)只产生1F-型FOS，而麦角和石刁柏FTase则形成1F-和6G-FOS.FOS是由蔗果三糖(GF2)，蔗果四糖(GF3)和1F-呋喃果糖基蔗果四糖(GF4)组成的果糖低聚化合物，其中果糖与蔗糖是以belta(2→1)键方式结合的[1-3]。FOS合成酶系有2种来源：一是来自植物如石刁柏[10-12]、甜菜[13]、洋葱[5，6，14]、菊芋[15-18]及其它植物[19-27]，二是来自微生物如曲霉属[2，28-30，57]、出芽短孢霉属[49，31-36]、节杆菌属[37，38]和镰孢霉属等[7，8，39-43]。植物来源酶系因量少无法用于工业化生产。1984年Meiji Seika公司利用黑曲霉TFase[2，13]，90年代初Cheil Foods&Chemicals公司利用固定化出芽短孢霉[49，50]先后成功实现了FOS工业化生产。

对于人体和动物而言，FOS具有许多优良生物学和生理学效应[3，51，51，52，56，60]：(1)FOS甜度为蔗糖三分之一，可用作限制甜味的食品原料；(2)FOS无能量，且不被人体消化酶利用，对糖尿病人是安全的；(3)FOS具有非致龋齿性，不能被口腔Streptcoccus mutans利用形成有机酸和不可溶性葡聚糖，避免龋齿和牙斑出现；(4)FOS刺激双岐菌生长，抑制引起腹泻病原菌的生长，人体日食用4g FOS有显著的双岐菌促进效果；(5)通过与肠道病原菌特异性糖基结合位点结合，使病原菌失去或减少与寄主动物肠壁细胞特异性识别、结合的机会，抑制沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌在肠道的定居和繁殖；(6)FOS能诱导动物消化道微生物多聚碳水化合物水解酶的产生；(7)可以直接或间接正向刺激动物体内免疫活性；(8)降低血清胆固醇、磷脂和甘油三酯和血糖浓度；(9)降低结肠癌发生率。大量饲养试验表明，应用FOS可以大大减少畜牧业生产抗生素使用量和病害防治成本，在绿色动物食品生产中可以大有作为。给断乳仔猪料添加0.25％和0.50％FOS饲喂30天，使动物体重比对照分别提高36％和73％[55]。另据报道FOS使兔日增重较对照提高6.4％，而饲料消耗反下降7.8％[54]；果寡糖可以大大降低仔猪腹泻率[55]。日粮中0.75％FOS使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12％，且在断水断粮1天应激下，FOS处理的肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照要低4倍[53]；FOS使兔死亡率降低32％[54]；FOS还可以减少动物粪便臭味[51，52]，与其它化学和活菌添加剂相比，FOS在产品制造与应用方面也具有优势：(1)产品耐高温、耐胃酸，有利于制造与应用；(2)不象活菌制剂那样存在保持菌体活力的限制；(3)相对于活菌制剂而言，果寡糖制造成本相对低廉，且具有剂量效应；(4)不论那种来源的低聚糖产品均安全无毒副作用，在动物体内不累积；(5)其使用不象抗生素和化学试剂那样受停止用药期限的限制。FOS可以作为食品和饲料原料广泛应用，由于具有多方面生物学效应而足以与其它传统甜味剂和食糖抗衡，或与其它甜味剂混合使用。因而将具有很大市场需求量。高纯度FOS是有效的双岐菌促进因子，作为微生态调节剂必将大有用武之地。

果糖转移酶的酶学性质

有多例FTase纯化和酶学性质研究报道[11，21，57]。一般，微生物来源的酶比植物来源的酶分子量更大，温度稳定性更好。该酶pH适性范围5-6.5，温度适性范围50-60℃，便于商业化生产，FOS合成反应通常在700-850克/升高蔗糖浓度下进行。据报道[66]一种节杆菌FTase分子量为49KDa，pI为4.7，酶反应最适pH为5.5，pH稳定范围为4.5-9.0，最适温度为60℃，温度稳定范围上限为70℃。另一株[67]节杆菌FTase分子量为40KDa，酶反应最适pH为6.0，温度为50℃。关于该酶的激活剂和抑制剂研究报道不多，美国龙舌兰FTase受Ca，Mg，Co和Li等离子激活，而受Ag，Pb，Hg，Al和Sn等离子抑制[20]。出芽短孢霉FTase受Hg，Cu和Pb等离子抑制，目前尚未发现其激活剂。每分钟转移1mol果糖或产生1mol葡萄糖所需酶量为一个FTase酶活性单位[29，58]。微生物FTase特异性主要取决于蔗糖的belta-D-果糖呋喃苷残基，有些带有末端果糖的底物如棉子糖和菊二糖也适宜于FOS合成[57]。1-蔗果三糖、蔗果四糖和1F-呋喃果糖基蔗果四糖均可以作为果糖供体和受体，许多能够产生FOS的微生物同时也产生FOS水解酶类[39，57，58]。在FOS生产时，应抑制FOS水解酶类活性。

酶法合成生产果寡糖

FTase制备  FTase一般是通过真菌有氧深层发酵生产的，具体发酵参数因菌种而异，已经公认，蔗糖总是菌体生长和产酶的最好碳源，pH宜保持在5.5以上，最适生长温度是30℃[29，58]。出芽短孢霉FTase产酶条件研究报道较多[32，48]，在生长停滞期之后，胞内酶和胞外酶的营养需求和产酶进程非常一致，外加镁离子能够提高胞内酶产量，这对于利用固定化细胞进行FOS生产有着重要意义。

FOS工业化生产  依靠果糖转移酶进行FOS工业化生产有2条具体技术路线：一是利用酶制剂进行分批生产，二是利用固定化酶或细胞进行连续生产，Meiji Seika公司利用海藻酸钙凝胶作为载体固定黑曲霉细胞建立了FOS连续生产系统，Cheil Foods & Chemicals公司利用海藻酸钙凝胶作为载体固定出芽短孢霉细胞建立了FOS连续生产系统，固定化细胞寿命50℃下3个月[49]。反应体系中推荐的蔗糖浓度很高为600--850克/升。此外与FTase固定化有关的吸附剂和离子交换剂研究很多[33，35，46，49，50]。从生产实践角度看，固定化酶反应柱比固定化细胞反应柱更好，其方法更为简单，单位体积的生产率更高，但其运转稳定性不如后者[49]。在实际决策时应该综合考虑各种方法的优缺点。在分批生产途径中必须增加去掉反应产物中酶的工序，因此利用固定化方法进行连续生产的途径更为可取。

提高果寡糖产率的途径  在FTase合成生产FOS中遇到的一个主要突出问题是该酶的活性受到反应副产物葡萄糖的严重抑制，目前商品FOS含有大量蔗糖和葡萄糖，实际上是多种糖的混合物，其中葡萄糖占36-38％，蔗糖10-12％，蔗果三糖21-28％，蔗果四糖21-24％，蔗果五糖3-6％。产品中FOS纯度很低，最高为55-60％(DW)[29，32，49，50]。在反应体系中加入葡萄糖异构酶或葡萄糖氧化酶能够降低葡萄糖含量、提高主产物FOS产量，其中以葡萄糖氧化酶效果为好，但是增加生产成本，而在FTase和葡萄糖异构酶复合酶体系中葡萄糖异构酶的主要动力学参数发生变化以致不能有效地降低体系中葡萄糖含量[34]。无疑，低纯度和高成本是果寡糖生产中的最大限制因子，也是本发明着意解决的主要难题。

本发明的优点：(1)利用本发明的新菌株可以高效价地生产果糖转移酶，(2)本发明的发酵方法生产的果糖转移酶作用效率高，酶∶底物＝1∶1，以往同类研究(Hidaka，H et al.，1988)[59]的比例为6∶1；本发明果寡糖产物中蔗果三糖比例非常高，在总产物中比率高达56.33％，在果寡糖中比率高达82％(表3和4)，这一点明显与所有其他报道不同，其他报道蔗果三糖在总产物中和果寡糖中比率分别为20-30％和40-50％，甚至更低；这一特点对于开发高档果寡糖和高纯度单一果寡糖是十分有益的；本发明合成反应产物中，四糖以上的高级果寡糖比率十分低，在总产物中和果寡糖中比率分别不到0.8％和不到1.2％，以往同类报道的四糖以上的高级果寡糖比率为20-30％。

本发明的目的之一是提供了一株果糖转移酶高产菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)FW9901。

本发明的另一个目的是提供了高产量地生产果糖转移酶的发酵方法。

本发明的再一个目的是提供了果糖转移酶催化蔗糖合成果寡糖的方法，利用该方法可以提高产物得率。

本发明是通过以下所述得以实现的：

定义与技术

果糖转移酶活性：定义每分钟转移1mol果糖所需酶量为一个活性单位，或每分钟产生1mol还原糖所需酶量为一个活性单位(9，50)。酶活性测定条件：pH5.5，温度55℃，底物终浓度20-60％蔗糖。参考反应体系组成：7.5毫升25-80％(w/v)蔗糖溶液；2.3毫升0.1M柠檬酸缓冲液，pH 5.5；0.2毫升酶液，其产生还原糖的能力为5-25mg还原糖/分钟/毫升(反应液)，反应时间15-30min。

产物定性鉴定

采用HPLC方法测定反应体系中所有糖的种类与含量。

一、果糖转移酶高产菌株的筛选

在以高浓度蔗糖(5％)为唯一碳源的查氏培养基上，对不同来源的出芽短梗霉进行初筛，30℃，4天，依照菌落长势挑取优势菌落，作50毫升三角瓶摇瓶产酶筛选试验，30℃，280rpm/分钟，4天后测定果糖转移酶活性，依照活性大小筛选确定1株，定名为出芽短梗霉(Aureobasdium pullulans)FW9901，该菌株已经于2000年1月 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0436。

二、发酵生产果糖转移酶

将FW9901在斜面培养基上，以温度30℃，培养3-5天，然后接种到摇瓶培养基中，以30℃，280-300r/分钟，培养4天，然后接种到发酵罐，25-32℃，500-1200rpm/分钟培养40-70小时；

使用的斜面培养基为(克/升)：蛋白胨，20；蔗糖，20；酵母提取物，10；

使用的摇瓶培养基为(克/升)：K₂HPO₃，5；(NH₄)₂SO₄，6；NaCl，1；MgSO₄.7H₂O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，60；

使用的发酵罐培养基为(克/升)：K₂HPO₃，5；(NH₄)₂SO₄，6；NaCl，1；MgSO₄.7H₂O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，200；聚氧丙烯甘油，0.5；聚氧乙烯氧丙烯甘油，0.5。

上发酵罐研究该菌株的产果糖转移酶特性，接种量4％，在30℃，800r/分钟下培养48小时出现产酶高峰，酶活性达272U/毫升。总糖含量至24小时为6.115％，共消耗66.22％，至48小时仅为3.481％，至72小时为0；pH值在24小时之内即下降近1个单位，后续48小时内仅下降0.25个单位；菌体生物量至48小时达到高峰。显然生物量增加与培养液中糖的消耗成正比例，与pH的下降成正比例。

三、果糖转移酶催化蔗糖合成果寡糖的方法

以蔗糖为底物，依靠果糖转移酶合成果寡糖。反应体系的最终果糖转移酶活性设置2个梯度分别为0.625和1.30U/毫升。对照(CK)和处理体系中蔗糖浓度统一为62.5％(W/V)。CK反应前100℃下灭活20分钟，其余与对照相同。pH值5.5，温度55℃，合成反应时间为72小时。

在本发明条件下，低聚糖产率高达68.70％，大大超过55-60％的最高水平(Jung，K.H.et al.，1989；Yun，J.W.，et al.，1990 an天1992；Hidaka，H et al.，1988)，这是目前报道的最高水平，比最高水平高出15-20％。反应时间以48小时为宜，此时的低聚糖产率结果明显优于24小时，和略高于72小时；2种酶浓度试验结果表明：在0.625U/毫升下，反应48和72小时的低聚糖产率明显高于1.30U/毫升的结果，但在反应时间为24小时时，2种浓度之间对低聚糖产率影响差异不大，有趣的是观察到，不同的酶浓度对不同低聚糖合成的影响并不一致：低浓度(0.625U/毫升)酶有利于产生更多的蔗果三糖，高浓度(1.30U/毫升)酶有利于产生更多的蔗果四糖，2种酶浓度对蔗果三糖合成的影响并无大的差异。此种特性为本研究首次发现。葡萄糖产率与低聚糖产率之间具有显著的负相关关系(r＝-0.9896)，由现有资料建立的直线回归方程为：低聚糖产率＝-1.2898葡萄糖产率+0.9201(r＝-0.9896)；从反应产物的HPLC测定结果来看，反应所得低聚糖种类明显为3种，并没有干扰结果分析的杂峰或拖尾等现象出现(图4)。

                     实施例1

               发酵生产果糖转移酶

以4％的接种量，将FW9901摇瓶母种接种到含有前述发酵培养基的发酵罐，在30℃，800rpm/分钟下培养48小时，此时达到产酶高峰，酶活性为272U/毫升。

                   实施例2

            果糖转移酶的分离和初步纯化

取发酵罐发酵液，在4℃下离心，5000r/分钟，15分钟，弃菌体沉淀，上清为粗酶液，粗酶液活性265U/毫升，比活性156.3U/毫克(蛋白质)，粗酶液经饱和硫酸铵〖75％〗盐析，比酶活提高到1652.6U/毫克(蛋白质)，纯化倍数为10.57。

              表1、反应体系产物/底物(％)^*

	果糖	葡萄糖	蔗糖	蔗果三糖	异蔗果三糖	蔗果四糖	其他低聚糖	低聚糖合计
									1d CK122d CK123d CK12	0.00330.03390.03330.03700.02450.03100.03310.02450.0326	0.01940.27140.28590.06130.18340.21510.05530.18940.2416	0.97730.13760.12130.90160.10510.11340.91160.11360.1102	00.26890.183300.26770.150600.22010.1385	00.23870.269200.29560.307700.27620.2683	00.04930.107000.12380.174600.14750.1896	000000.007600.02870.0192	00.55690.559500.68700.640500.67250.6156

^*1号和2号处理体系酶FTase活性分别为0.625和1.30U/ml。CK和处理体系中蔗糖浓度均为62.5％(W/V)。CK反应前100℃下灭活20min，其余与对照相同。pH值5.5，温度55℃，

              表2、反应产物中各低聚糖比例(％)

处理	蔗果三糖	异蔗果三糖	蔗果四糖	其他低聚糖	低聚糖合计
						1d CK122d CK123d CK12	048.28532.761038.96723.513032.72922.498	042.86248.114043.02848.041041.07143.583	08.85319.124018.02027.260021.93330.799	000001.18704.2683.119	010010001001000100100

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Claims (4)

1.一种果糖转移酶高产菌株，它是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)FW9901 CGMCC No.：0436。

2.生产果糖转移酶的发酵方法，该方法包括将权利要求1所述的菌株经过斜面培养基上培养，然后接种到摇瓶培养基中，再接种到发酵罐发酵生产，回收发酵罐产生的果糖转移酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中发酵罐培养的条件为温度25-32℃，时间40-70小时，转速为500-1200rpm/分钟。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的发酵培养基(克/升)：K₂HPO₃，5；(NH₄)₂SO₄，6；NaCl，1；MgSO₄.7H₂O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，200；，聚氧丙烯甘油，0.5；聚氧乙烯氧丙烯甘油，0.5。