ES2396179T3 - Mutantes que tienen capacidad de producir 1,4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando los mismos - Google Patents

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Abstract

Mutante que muestra elevada producción de 1,4-butanodiol, que es preparado introduciendo o amplificando genesque codifican enzimas que convierten succinato en 4-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol, en unmicroorganismo capaz de producir succinato, en el que el microorganismo capaz de producir succinato es una bacteria, el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato es seleccionado del grupo que consiste engenes que codifican succinil-CoA transferasa, semialdehído de succinato dehidrogenasa, 4-hidroxibutiratodehidrogenasa y 4-hidroxibutirato dehidrogenasa, y el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol es i) un gen que codifica 4-hidroxibutirato-CoA transferasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA; o ii)un gen que codifica fosfotransbutirilasa, un gen que codifica butiril quinasa y un gen que codifica alcoholdehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA.

Description

Mutantes que tienen capacidad de producir 1,4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando los mismos
Sector técnico
La presente invención se refiere a un microorganismo mutante capaz de producir 1,4-butanodiol y un procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando el mismo.
Antecedentes técnicos
Se han sugerido los polímeros biodegradables como alternativa a los polímeros sintéticos, que son una de las causas principales de grave contaminación ambiental. Entre los varios polímeros biodegradables que están siendo desarrollados, el poli-β-hidroxibutirato, un polímero biodegradable almacenado por varios microorganismos en estado de nutrición desequilibrada, tiene diferentes características como biodegradabilidad, resistencia al agua, piezoelectricidad y biocompatibilidad. En particular, el 4-hidroxibutirato, que es un ejemplo de polihidroxialcanoato (PHA) tiene características parecidas a un poliéster y muestra un amplio rango de propiedades comprendidas desde las de un plástico cristalino a una goma altamente elástica. Por lo tanto, se están llevando a cabo en la actualidad importantes investigaciones sobre plásticos biodegradables por vía microbiana.
Además, el 4-hidroxibutirato puede ser fácilmente convertido en diferentes productos químicos que tienen 4 átomos de carbono, tales como 1,4-butanodiol, γ-butirolactona (GBL) y THF. En particular, el 1,4-butanodiol es un importante producto químico industrial en diferentes formas, tales como polímero, disolvente e intermediario en química fina. Si bien la mayor parte de los productos químicos que tienen 4 átomos de carbono son sintetizados en la actualidad a partir de 1,4-butanodiol, anhídrido maleico y otros, los crecientes costes de producción provocados por el incremento de precio del petróleo requiere el desarrollo de otro proceso para compensar y sustituir el proceso convencional de producción química. Se ha sugerido como alternativa un proceso biológico.
Como es sabido, el succinato, ácido dicarboxílico con cuatro átomos de carbono, es un tipo de ácido orgánico producido cuando se cultiva un microorganismo en condiciones anaeróbicas. En la actualidad, se están utilizando varios microorganismos como células productoras de succinato y su coste de producción se ha reducido debido a un proceso efectivo de fermentación y al desarrollo de un proceso de separación y purificación. Asimismo, se puede producir 4-hidroxibutirato a partir de succinato y varios ácidos orgánicos que tienen 4 átomos de carbono pueden ser derivados del 4-hidroxibutirato.
La publicación PCT nº WO 2005/052135 es un ejemplo de solicitud de patente que da a conocer un procedimiento para la producción eficaz de succinato, en el que un mutante bacteriano de Rumen produce succinato en alta concentración sin producir otros ácidos orgánicos y un procedimiento de preparación de succinato utilizando el mutante. Además, se da a conocer un procedimiento para la preparación de un mutante de E. coli capaz de producir succinato en alta concentración en la solicitud de patente de Corea nº 10-2004-60149 y un procedimiento para la preparación de succinato utilizando un nuevo gen se da a conocer en las solicitudes de patentes de Corea nº 10-2005-0076301, nº 10-2005-0076317 y nº 10-2005-0076348.
Tal como se ha explicado en lo anterior, existe una elevada demanda de un mutante capaz de producir 1,4-butanodiol, importante producto químico industrial que tiene 4 átomos de carbono, así como un procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol.
Materia de la invención
Problema técnico
La presente invención está dirigida a dar a conocer un microorganismo mutante capaz de producir 1,4-butanodiol con elevada eficiencia, así como un procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando el mismo.
Solución técnica
En un aspecto, se introduce o amplifica un microorganismo capaz de producir succinato y preferentemente un mutante que muestra elevada producción de 1,4 butanodiol, en el que un gen que codifica una enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato y un gen que codifica una enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1,4 butanodiol y se da a conocer un procedimiento para la preparación de 1,4 butanodiol utilizando los mismos, de acuerdo con las reivindicaciones independientes.
Se dan a conocer realizaciones preferentes en las reivindicaciones dependientes.
En otro aspecto, se da a conocer un gen butil-CoA dehidrogenasa de la SEQ ID NO: 8 ó 9, que produce de manera efectiva 1,4-butanodiol a partir de 4-hidroxibutil-CoA y un vector recombinante que presenta los mismos.
A continuación, se describirá la invención de manera más detallada.
Como resultado de los esfuerzos para preparar 1,4-butanodiol, utilizando un microorganismo capaz de producir succinato, los presentes inventores han desarrollado un microorganismo mutante que produce 1,4-butanodiol por inducción o amplificación de un gen asociado con la biosíntesis de 4-hidroxibutirato y/o un gen asociado con la biosíntesis de 1,4 butanodiol en el microorganismo capaz de producir succinato y han descubierto que el microorganismo mutante produce de manera efectiva 1,4-butanodiol. Este descubrimiento ha conducido a la presente invención.
El término “amplificación” que se utiliza en esta descripción significa un incremento en el nivel de expresión del gen en comparación con el nivel de expresión original. Si no hay gen que amplificar en un microorganismo antes de mutación, el como mínimo un gen puede ser introducido en el microorganismo y luego puede ser amplificado. Si existe un gen a amplificar en un microorganismo antes de la mutación, el como mínimo un gen puede ser introducido en el microorganismo por el mismo procedimiento descrito anteriormente o bien un gen originalmente presente en el microorganismo puede ser manipulado por una técnica de ingeniería genética para aumentar la expresión del gen. Por ejemplo, cuando una expresión de amplificación de un gen se encuentra presente en un microorganismo a mutar, un promotor original para la realización de la expresión del gen puede ser sustituido por un promotor más potente, amplificando de esta manera la expresión del gen.
El microorganismo capaz de producir succinato puede mostrar una elevada producción de succinato, siendo el microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacterias, por ejemplo, bacteria Rumen, Corynebacterium species, Brevibacterium species y E. coli.
La bacteria Rumen puede tener un gen en activo que codifica lactato dehidrogenasa (ldhA) y piruvato-formato liasa (pfl) y produce succinato en alta concentración sin otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.
El término “inactivación” que se utiliza en esta descripción significa que un gen no es transcrito debido a mutación o que el ARNm transcrito no ha sido traducido apropiadamente en la proteína original. Para desactivar un gen, la mutación puede ser llevada a cabo prescindiendo de un gen o cambiando una secuencia de ácido nucleico de un gen.
Además, la bacteria Rumen puede tener genes inactivos que codifican lactato dehidrogenasa (ldhA), piruvato formato liasa (pfl), fosfotransacetilasa (pta) y acetato quinasa (ackA) y producen succinato en elevada concentración sin sustancial producción de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.
De manera alternativa, la bacteria Rumen puede tener genes inactivos que codifican lactato dehidrogenasa (ldhA), piruvato-formato liasa (pfl) y fosfopiruvato carboxilasa (ppc) y producen succinato en elevada concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en situación anaeróbica.
La bacteria Rumen puede ser seleccionada a través del grupo que consiste en Mannheimia sp., Actinobacillus sp. y Anaerobiospirllum sp., pero la presente invención no está limitada a estos ejemplos. Es preferible Mannheimia sp. y Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP), LPK4 y LPK7 (KCTC 10626BP) son más preferibles.
La E. coli puede tener genes inactivos que codifican glucosa fosfotransferasa (ptsG) y piruvato quinasa (pykA y pykF), y producen succinato en alta concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en estado anaeróbico. En particular, el mutante de E. coli es preferentemente W3110GFA que se ha dado a conocer en la publicación de patente de Corea nº 10-2006-0011345.
Entre los microorganismos antes mencionados que producen succinato en alta concentración la bacteria Rumen puede ser preparada según un procedimiento que se da a conocer en la publicación PCT nº WO 2005/052135. Es decir, un gen de dehidrogenasa láctica (ldhA) y un gen de piruvato-formato de liasa (pfl) son inactivados en Mannheimia succiniciproducens 55E, construyendo de esta manera una cepa mutante, es decir, Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP). Entonces, en las cepas de LPK se inactivan independientemente genes de fosfotransacetilasa (pta) y gen de acetato quinasa (ackA), así como un gen de fosfopiruvato carboxilasa (ppc), construyendo de esta manera cepas mutantes (Mannheimia sp. LPK7 y LPK4) que son cultivadas a continuación en condiciones anaeróbicas para producir succinato con alto rendimiento.
Además, entre los microorganismos que producen succinato en alta concentración se puede construir E. coli por un procedimiento que se da a conocer en la publicación de patente de Corea nº 10-2006-0011345. Es decir, la cepa mutante de E. coli W3110GFA es conseguida por inactivación de un gen que codifica glucosa fosfotransferasa (ptsG) y dos genes que codifican piruvato quinasa (pykA y pykF) en cepa W3110 transformada con un vector de expresión recombinante que expresa un bacteriófago operón rojo (exo-beta-gama). Entonces, cuando la cepa W3110GFA mutante de E. coli es cultivada en condiciones anaeróbicas, se puede confirmar que la productividad del mutante es superior a la cepa madre W3110.
Un gen de una enzima que convierte el succinato en 4-hidroxibutirato y un gen con una enzima asociada con la conversión del succinato semialdehído en succinato se puede derivar de Clostridium kluyveri, y un gen de una enzima que convierte el 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol se puede derivar de Clostridium acetobutylicum. Si bien Clostridium kluyveri y Clostridium acetobutylicum no producen 4-hidroxibutirato y 1,4-butanodiol, las enzimas clonadas en estas cepas juegan un importante papel en la producción de 4-hidroxibutirato y 1,4-butanodiol.
Además, el gen de la enzima que convierte el succinato en 4-hidroxibutirato es seleccionado entre el grupo que consiste en un gen que codifica succinil-CoA transferasa (Cat1), un gen que codifica succinato semialdehído dehidrogenasa (SucD), un gen que codifica 4-hidroxibutirato dehidrogenasa (hbD) y un gen que codifica 4-hidroxibutirato dehidrogenasa (GHB). Preferentemente, el gen que codifica Cat1 tiene una secuencia base de SEQ ID NO: 1, el gen que codifica SucD tiene una secuencia base de SEQ ID NO: 2, el gen que codifica 4hbD tiene una secuencia base de SEQ ID NO: 3, y el gen que codifica GHB tiene una secuencia base de SEQ ID NO: 4.
Por ejemplo, un microorganismo mutante de acuerdo con la presente invención puede tener un gen que codifica Cat1, un gen que codifica SucD y un gen que codifica 4hbD, o un gen que codifica Cat1, un gen que codifica SucD y un gen que codifica GHB, pero la presente invención no está limitada a estos ejemplos.
Además, la utilización efectiva del succinato es muy importante para conseguir el objetivo de la presente invención y, por lo tanto, semialdehído succínico dehidrogenasa (GabD) asociado con la conversión de semialdehído succínico en succinato se puede eliminar de E. coli recombinante de los microorganismos que producen succinato en elevada concentración. Por lo tanto, el microorganismo mutante, según la presente invención puede tener también un gen inactivo asociado con la conversión de semialdehído de succinato en succinato, que es preferentemente un gen que codifica GabD succínico. El gen que codifica GabD tiene una secuencia base de SEQ ID NO: 10, pero la presente invención no está limitada a la secuencia
Asimismo, para transportar de manera efectiva succinato en un microorganismo, se puede amplificar la enzima de la proteína de transporte C4-dicarboxilato (DctA) asociada con el transporte de succinato. De este modo, el microorganismo mutante puede tener además un gen que codifica Dct4 asociado con el transporte de succinato, que es introducido en su interior o amplificado y un gen que codifica Dct4 tiene preferentemente una secuencia base de SEQ ID NO: 11.
Los genes de enzimas que convierten 4-hidroxibutirato en 1 ,4-butanodiol son genes que codifican 4-hidroxibutirato-CoA transferasa y alcohol dehidrogenasa reduciendo 4-hidroxibutirato-CoA o genes que codifican fosfotransbutirilasa butiril quinasa y alcohol dehidrogenasa reduciendo 4-hidroxibutirato-CoA.
El gen que codifica 4-hidroxibutirato-CoA transferasa puede tener una secuencia base de SEQ ID NO: 5, que puede ser sustituida por fosfotransbutirilasa (ptb; SEQ ID NO: 6) y butiril quinasa (BuK; SBQ ID NO: 7) para convertir 4-hidroxibutirato en 4-hidroxibutirato-CoA.
El alcohol dehidrogenasa puede ser butil-CoA dehidrogenasa derivado de Clostridium acetobutylicum, y el gen que codifica butil-CoA dehidrogenasa tiene preferentemente una secuencia base de SEQ. ID NO: 8 ó 9 (CAP0035 o CAP0162). Los genes de SEQ. ID. NO: 8 y 9 son muy útiles para producir 1,4-butanodiol en el microorganismo mutante según la presente invención. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un gen que codifica butil-CoA dehidrogenasa y un vector recombinante que lo contiene.
El término “vector” significa un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN enlazada operativamente a una secuencia de control adecuada para expresar ADN en un huésped adecuado. En la presente invención, el vector puede comprender un vector plásmido, un vector bacteriófago, un vector cósmido, un vector de Levadura de Cromosoma Artificial (YAC) y preferentemente un vector plásmido. Por ejemplo, el vector plásmido puede comprender una constitución que comprende (a) un origen de replicación para replicación efectiva para tener varias cientos de copias en una célula huésped, (b) un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar una célula huésped transformada con el vector plásmido y (c) un lugar de enzima de restricción en el que es capaz de ser insertado un fragmento de ADN extraño. Si bien no hay lugar de enzima de restricción adecuado, el vector puede ser ligado fácilmente con el ADN extraño utilizando un adaptador oligonucleótido sintético o un enlazador de acuerdo con un método convencional.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un microorganismo capaz de producir succinato y preferentemente un microorganismo mutante que muestra elevada producción de 1,4-butanodiol, en el que es inactivado un gen que codifica GabD y la totalidad de un gen que codifica Cat1, un gen que codifica SucD, un gen que codifica 4hbD (o GHB), un gen que codifica 4-hidroxibutirato-CoA transferasa y un gen que codifica butil-CoA dehidrogenasa son introducidos o amplificados.
Además, la presente invención proporciona un microorganismo capaz de producir succinato y preferentemente un microorganismo mutante que muestra elevada producción de 1,4-butanodiol en el que un gen que codifica 4-hidroxibutirato-CoA (o un gen que codifica fosfobutirilasa y un gen que codifica butiril quinasa) y un gen que codifica butil-CoA dehidrogenasa son introducidos o amplificados y un método de preparación de 1,4-butanodiol que utiliza el mismo.
La presente invención proporciona además un método para la preparación de 1,4-butanodiol que comprende el cultivo del mutante en un medio que contiene una fuente de carbono y obteniendo 1,4-butanodiol del cultivo.
Efectos ventajosos
Tal como se ha descrito en lo anterior, la presente invención proporciona un microorganismo capaz de producir succinato en elevada concentración, y más particularmente un mutante que muestra elevada producción de 1,4butanodiol, que es un producto químico que tiene 4 átomos de carbono con un amplio rango de importantes aplicaciones en la química industrial y un método biológico para la preparación de 1,4-butanodiol que utiliza el mismo.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático de una ruta para la producción de 4-hidroxibutirato a partir de succinato;
La figura 2 es un diagrama esquemático de una ruta para producir 1,4-butanodiol a través del 4-hidroxibutirato producido a partir de succinato; y
La figura 3 muestra resultados de análisis GC de producción de 1,4-butanodiol.
Formas de la invención
A continuación, se describirá la presente invención en más detalle mediante ejemplos. Se comprenderá claramente por los técnicos en la materia que los ejemplos se facilitan solamente para explicar la presente invención, pero no para limitar su alcance.
Si bien en la presente invención el método de preparación de 1,4-butanodiol utiliza la bacteria Rumen, tal como los mutantes Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP), LPK7 y LPK4, que tienen un gen inactivo derivado de la cepa Mannheimia sp. y produce succinato en elevada concentración, E. coli y el mutante E. coli W3110GFA, se comprenderá también de manera evidente por los técnicos en la materia que pueden producir 1,4-butanodiol al generar un mutante que produce succinato en elevada concentración utilizando otra cepa de bacteria Rumen, introduciendo y amplificado un gen asociado con la producción de 1,4-butanodiol.
Además, si bien los siguientes ejemplos proporcionan un medio y método de cultivo específicos, se comprenderá claramente por los técnicos en la materia, tal como se da a conocer en las literaturas (Lee y otros, Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee y otros, Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; y Lee y otros, Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), un medio utilizado en esta invención puede ser diferente de un hidrolizado, tal como suero de la leche o licor de maíz
o se pueden utilizar varios métodos de cultivo, tales como cultivo por lotes de alimentación y cultivo continuo.
Ejemplo 1: método para la preparación de un microorganismo que muestra elevada producción de succinato
1-1. Preparación de bacteria Rumen que tiene elevada producción de succinato
Un microorganismo, la bacteria Rumen, que muestra elevada producción de succinato, de acuerdo con la presente invención, fue preparado según el método que se da a conocer en la publicación PCT nº WO 2005/052135. Es decir, una cepa mutante Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP) fue preparada utilizando un gen de lactato dehidrogenasa (ldhA) y un gen de piruvato-formato liasa (pfl) en Mannheimia succiniciproducens 55E, que es una de las especies de la bacteria Rumen y cepas de mutante (Mannheimia sp. LPK7 y LPK4) fueron preparadas por inactivación de un gen de fosfotransacetilasa (pta), un gen de acetato quinasa (ackA) y un gen de fosfopiruvato carboxilasa (ppc) en la cepa LPK.
1-2. Preparación de E. Coli que muestra elevada producción de succinato
Se preparó un microorganismo, E. coli, que muestra elevada producción de succinato, de acuerdo con la presente invención por el método que se da a conocer en la publicación de patente de Corea nº 10-2006-0011345. Es decir, una cepa mutante de E. coli W3110GFA fue producida por inactivación de un gen que codifica glucosa fototransferasa (ptsG) y dos genes que codifican piruvato quinasa (pykA y pykF) en una cepa W3110, que fue transformada con un lector de expresión recombinante pTrcEBG que expresa un bacteriófago operón rojo (exo-betagama).
Ejemplo 2: Clonado de la enzima de conversión de 1,4-Butanodiol
2-1. Clonación de genes que codifican las enzimas de conversión de 4-Hidroxibutirato (Cat1, SucD y 4hbD) Los presentes inventores amplificaron los genes Cat1, sucD y 4hbD por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados basados en una secuencia de gen (L21902) conocida a efectos
de clonar operónes para genes que codifican Cat1, SucD y 4hbD derivados de Clostridium kluyveri DSM 555. Los cedabores utilizados para PCR fueron los siguientes. SEQ ID NO 12: Cat1f-SacI 5'-tttcccgagctc TGTGAGGCGATTAAATGAGTAAAGGGATAAAG SEQ ID NO 13: 4hbDb-Xabl gc tctaga tta gat aaa aaa gag gac att tca caa tat gg Para construir el vector de expresión pTacLac4HB1, se insertó el operón para los genes amplificados cat1, sucD y
4hhD en el vector de expresión pTacLacI, que fue escindido con SaciiXbal. El vector pTacLacl fue construido por fraccionamiento del vector pTac99A (Park y Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003) con SspI, y ligando el vector escindido con pTrc991 (Amersham Pharmacia Biotech), que fue escindido también con Sspl. El vector pTacLacl tiene la misma secuencia que pTrc99A, y pierde un lugar de reconocimiento de enzima de restricción Ncol (lugar de restricción) presente en el pTrc99A de los lugares de multiclonado (MCS). En este caso, MCS empezó con un lugar EcoRI.
2-2. Clonado de un gen que codifica DctA asociado con el transporte de succinato Para clonar un gen que codifica DctA asociado con el transporte de succinato en E. coli W3110, se amplificó un gen
DctA por ADN-PCR utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados basándose en una secuencia de genes conocida (NC_000913). Los cebadores utilizados para PCR fueron los siguientes. SEQ ID NO 14: DctAf-EcoRI ggaattc ATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGC SEQ ID NO 15: DctAb-Xbal gc tctaga tta aga gga taa ttc gtg cgt ttt gcc Para construir el vector de expresión p10499DctA, se fraccionó el gen amplificado DctA con EcoRI/XbaI y a
continuación se insertó en el vector de expresión p10499A (Park y otros (2002) FEMS Microbiol. Lett 214:217-222). 2-3. Clonado del gen que codifica la enzima de conversión de 4-Hidroxibutirato en 1,4-Butanodiol Para clonar genes que codifican butil-CoA dehidrogenasa de SEQ ID NOs: 8 y 9, que son enzimas que convierten
ácido butírico en butanol en Clostridium acetobutylicum, se amplificaron genes cap0035 y cap0162 por ADN-PCR utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados basados en una secuencia de genes conocida (NC_003030). Los cebadores utilizados para PCR fueron los siguientes.
SEQ ID NO: 16: CAP0035f-SacI tttcccgagctc atgaaagttacaaatcaaaaa
SEQ ID NO: 17: CAP0035b-Xbal gc tctaga tta aaa tgc ttt tat ata gat SEQ ID NO: 18: CAP0162f-EcoRI GGAATTC atgaaagtcacaacagtaaag SEQ ID NO: 19: CAP0162b-Xbal gc tctaga tta agg ttg ttt ttt aaa Para construir vectores de expresión pTacLacCAP35 y pTacLacCAP162, se insertaron los genes amplificados
cap0035 y cap0162, independientemente en vectores de expresión pTacLacl, que fueron escindidos con SacI/Xbal y
EcoRI/Xbal. Para convertir 4-hidroxibutirato en 4-hidroxibutirato-CoA, se amplificó por ADN-PCR un operón del gen Cat2 de SEQ ID NO: 5 utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados basados en la secuencia de SEQ ID NO: 5. Los cebadores para PCR fueron los siguientes.
SEQ ID NO: 20: cat2f-EcoRI ggaattcATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAG SEQ ID NO: 21: cat2b-BamHI cg ggatcc tta aaa tct ctt ttt aaa ttc att cat taa tg Para construir el vector de expresión pTacLacCat2, el gen cat2 amplificado fue insertado en el vector de expresión
pTacLacI, que fue escindido con EcoRI/BamHI. Para convertir 4-hidroxibutirato en 4-hidroxibutirato-CoA, se amplificaron por ADN-PCR operónes para genes ptb y
buk de SEQ ID NOs: 6 y 7 utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados basándose en las secuencias de SEQ ID NOs: 6 y 7. Los cebadores utilizados para PCR fueron los siguientes. SEQ ID NO: 22: ptbf-RcoRI ggaattc ATGATTAAGAGTITTAATGAAATATCATG SEQ IDNO: 23: bukb-Xbal gc tctaga tta ttt gta ttc ctt agc ttt ttc ttc tcc Para construir un vector de expresión se insertaron en el vector de expresión pTacLacl, operónes para los genes
amplificados ptb y buk, siendo escindido el vector con EcoRl/Xbal, obteniendo de esta manera pTacLacPtbBuk. El vector pTacLacPtbBuk fue escindido con Sspl para obtener un fragmento de gen incluyendo un promotor tac, los genes ptb y buk y un terminador de transcripción y el fragmento de gen fue insertado en el vector pBBR1MCS2 (Kovach y otros, Gene. 166:175, 1995) que fue escindido con EcoRV, obteniendo de esta manera el vector pMCS2TacPtbBuk.
Ejemplo 3: Producción de 1,4-BDO
Los vectores pTacCAP162 y pMCS2Tacptbbuk fueron transformados simultáneamente con E. coli XLI-Azul por electroporación y a continuación aplicado sobre una placa LB conteniendo 100 ug/ml de ampicilina y 50 ug/ml de quinamicina y se cultivaron durante una noche a 37ºC. La colonia cultivada fue inoculada en un tubo de 15ml (Falcon, USA) que tenía 3 ml de medio líquido LB conteniendo 100 ug/ml de ampicilina y fue cultivado en un inculador con agitación en una noche a 200rpm y 37ºC. Las células incubadas fueron inoculadas en un medio líquido reciente LB conteniendo 100 ml de glucosa al 2% y 100 ug/ml de ampicilina y a continuación se cultivó en un incubador con agitación a 200 rpm y 37ºC. Cuando OD600 alcanzó 0,7, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir expresión de proteína y las células fueron cultivadas durante una noche.
Después de ello, el cultivo fue centrifugado y el sobrenadante fue retirado del mismo. A continuación, la pastilla de células fue lavada con medio MR una vez, se resuspendió en un medio MR conteniendo 50 ml de glucosa al 2% y gama-butirolactona al 2% y 1 nM de IPTG, y se evaporó utilizando una mezcla de gas de H2 al 5%, CO2 al 5% y resto N2 durante 30 minutos para conseguir condiciones anaeróbicas. El cultivo fue desarrollado en un incubador con agitación a lo largo de la noche durante 3 días a 200 rpm y 37°C, y a continuación se centrifugó obten iendo un sobrenadante. El sobrenadante obtenido fue concentrado dos veces y utilizado como muestra de análisis GC para análisis para confirmar la producción de 1,4-butanodiol. El análisis fue llevado a cabo en las siguientes condiciones y los resultados se muestran en la figura 3.
Columna: AT-Cera (0,53 mm ID x 15 ml, 1,2 um u.f. capilar) Velocidad caudal de gas: Columna (He): 4,0 ml/min Temperatura estufa: valor inicial & tiempo: 50°C, 5 min Velocidad programada: 10ºC/min Valor final & tiempo: 250°C, 5 min Temperatura del inyector: 250ºC Temperatura del detector: 250ºC Proporción división inyector: 20/1 Volumen inyector: 1,0 ul Tal como se muestra en la figura 3, se confirmó que se había producido 1,4-butanodiol.
<110> LG CHEM, LTD. Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Mutantes que tienen capacidad de producir 1,4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando los mismos
<130> F2008-0085PC (X08029)
<150> KR10-2007-0091081 <151>2007-09-07 <160>23
<170> Kopatentin 1.71 <210>1 <211>1617
<212> ADN
<213> gen que codifica Cat1
<400> 1
<210> 2
<211> 1419
<212> ADN
<213> gen que codifica SucD
<400> 2
<210> 3
<211> 1116
<212> ADN
<213> gen que codifica 4hbD
<400> 3
<210> 4
<211> 1460
<212> ADN
<213> gen que codifica GHB
<400> 4
<210> 5
<211> 1290
<212> ADN
<213> gen que codifica 4HB-CoA transferasa
<400> 5
<210> 6
<211> 906
<212> ADN
<213> gen que codifica Ptb
<400> 6
<210> 7
<211> 1068
<212> ADN
<213> gen que codifica Buk
<400> 7
<210> 8
<211> 2577
<212> ADN
<213> gen que codifica Butil-CoA dehidrogenasa (CAP0035)
<400> 8
<210> 9
<211> 2589
<212> ADN
<213> gen que codifica Butil-CoA dehidrogenasa (CAP0162)
<400> 9
<210> 10
<211> 1449
<212> ADN
<213> gen que codifica GabD
<400> 10
<210> 11
<211> 1287
<212> ADN
<213> gen que codifica DctA
<400> 11
<210> 12
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador Cat1f-SacI
<400> 12 tttcccgagc tctgtgaggc gattaaatga gtaaagggat aaag 44
<210> 13
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 4hbDb-Xabl
<400> 13 gctctagatt agataaaaaa gaggacattt cacaatatgg
<210> 14
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador DctAf-EcoRl
<400> 14 ggaattcatg aaaacctctc tgtttaaaag c 31
<210> 15
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador DctAb-XbaI
<400> 15 gctctagatt aagaggataa ttcgtgcgtt ttgcc 35
<210> 16
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CAP0035f-SacI <400> 16 tttcccgagc tcatgaaagt tacaaatcaa aaa
<210> 17
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CAP0035b-XbaI
<400> 17 gctctagatt aaaatgcttt tatatagat
<210> 18
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CAP0162f-EcoRI
<400> 18 ggaattcatg aaagtcacaa cagtaaag
<210> 19
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CAP0162b-XbaI
<400> 19 gctctagatt aaggttgttt tttaaa
<210> 20
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador cat2 f-EcoRI
<400> 20
ggaattcatg gagtgggaag agatatataa agag
34
<210> 21
5
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador cat2b-BamHI
10
<400> 21
cgggatcctt aaaatctctt tttaaattca ttcattaatg
40
<210> 22
<211> 37
<212> ADN
15
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador ptbf-EcoRI
<400> 22
ggaattcatg attaagagtt ttaatgaaat tatcatg
37
20
<210> 23
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
25
<223> cebador bukb-XbaI
<400> 23
gctctagatt atttgtattc cttagctttt tcttctcc
38

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Mutante que muestra elevada producción de 1,4-butanodiol, que es preparado introduciendo o amplificando genes que codifican enzimas que convierten succinato en 4-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol, en un microorganismo capaz de producir succinato,
    en el que el microorganismo capaz de producir succinato es una bacteria,
    el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4-hidroxibutirato es seleccionado del grupo que consiste en genes que codifican succinil-CoA transferasa, semialdehído de succinato dehidrogenasa, 4-hidroxibutirato dehidrogenasa y 4-hidroxibutirato dehidrogenasa, y
    el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1,4-butanodiol es i) un gen que codifica 4hidroxibutirato-CoA transferasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA; o ii) un gen que codifica fosfotransbutirilasa, un gen que codifica butiril quinasa y un gen que codifica alcohol dehidrogenasa que reduce 4-hidroxibutirato-CoA.
  2. 2.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que la bacteria es seleccionada entre el grupo que consiste en bacteria Rumen, Corynebacterium species, Brevibacterium species y E. coli.
  3. 3.
    Mutante, según la reivindicación 2, en el que la bacteria Rumen tiene genes inactivos que codifican i) lactato dehidrogenasa (ldhA) y piruvato-formato liase (pfl); ii) lactato dehidrogenasa (ldhA), piruvato-formato liasa (Pfl), fosfotransacetilasa (pta) y acetato quinasa (ackA); o (iii) lactato dehidrogenasa (ldhA), piruvato-formato liasa (Pfl) y fosfopiruvato carboxilasa (Ppc), y producen succinato con elevada concentración sin producción sustancial de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.
  4. 4.
    Mutante, según la reivinidcación 2 ó 3, en el que la bacteria Rumen es seleccionada entre el grupo que consiste en Mannheimia species, Actinobacillus species y Anaerobiospirillum species.
  5. 5.
    Mutante, según la reivindicación 4, en el que la bacteria Rumen es seleccionada entre el grupo que consiste en Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) y Mannheimia species LPK (KCTC 10558BP), LPK4 y LPK7 (KCTC 10626BP).
  6. 6.
    Mutante, según la reivindicación 2, en el que el E. coli tiene genes inactivos que codifican fosfotransferasa (ptsG) y piruvato quinasa (pykA y pykF), y producen succinato en la concentración sin reducción sustancial de otros ácidos orgánicos en condiciones anaeróbicas.
  7. 7.
    Mutante, según la reivindicación 6, en el que el mutante de E. coli es W3110GFA.
  8. 8.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la enzima que convierte succinato en 4hidroxibutirato se deriva de Clostridium kluyveri.
  9. 9.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la enzima que convierte 4-hidroxibutirato en 1,4butanodiol se deriva de Clostridium acetobutylicum.
  10. 10.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que el alcohol dehidrogenasa es butil-CoA dehidrogenasa derivado de Clostridium acetobutylicum.
  11. 11.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que el mutante tiene un gen inactivo asociado con la conversión de semialdehído de succinato en succinato.
  12. 12.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que el gen asociado con la conversión de semialdehído de succinato en succinato es un gen que codifica semialdehído succínico dehidrogenasa.
  13. 13.
    Mutante, según la reivindicación 1, en el que un gen que codifica la proteína de transporte de C4-dicarboxilato (DctA), asociado con el transporte de succinato es introducida adicionalmente o amplificada en el mutante.
  14. 14.
    Método para la preparación de 1,4-butanodiol, que comprende:
    recultivar el mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un medio que contiene una fuente de carbono, y
    obtener 1,4-butanodiol del medio.
ES08793214.1T 2007-09-07 2008-08-13 Mutantes que tienen capacidad de producir 1,4-butanodiol y procedimiento para la preparación de 1,4-butanodiol utilizando los mismos Active ES2396179T5 (es)

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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3214179B1 (en) 2007-03-16 2021-03-03 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
US7947483B2 (en) * 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
EP2245137B1 (en) 2008-01-22 2017-08-16 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
EP2262901B1 (en) 2008-03-05 2018-11-21 Genomatica, Inc. Primary alcohol producing organisms
EP3514242A3 (en) 2008-09-10 2019-08-28 Genomatica, Inc. Microrganisms for the production of 1,4-butanediol
KR20120068763A (ko) 2009-04-30 2012-06-27 게노마티카 인코포레이티드 아이소프로판올, ｎ-부탄올 및 아이소부탄올 생산 유기체
CA2759994C (en) 2009-04-30 2019-06-11 Genomatica, Inc. Organisms for the production of 1,3-butanediol
WO2010141920A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
EP3199511B1 (en) 2009-06-04 2020-01-29 Genomatica, Inc. Process of separating components of a fermentation broth
DK2462221T3 (en) 2009-08-05 2017-05-22 Genomatica Inc SEMISYNTHETIC TEREPHTHALIC ACID BY MICRO-ORGANISMS PRODUCING MUCONIC ACID
US8715971B2 (en) * 2009-09-09 2014-05-06 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol and 1,4-butanediol
KR20180014240A (ko) 2009-10-23 2018-02-07 게노마티카 인코포레이티드 아닐린의 제조를 위한 미생물
US8530210B2 (en) 2009-11-25 2013-09-10 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
CA2783096A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 Genomatica, Inc. Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol
CA2787314A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of p-toluate and terephthalate
CA2788596A1 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Metabolix, Inc. Process for producing a monomer component from a genetically modified polyhydroxyalkanoate biomass
US9023636B2 (en) 2010-04-30 2015-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene
JP2013535203A (ja) 2010-07-26 2013-09-12 ジェノマティカ・インコーポレイテッド 芳香族、２，４−ペンタジエノエートおよび１，３−ブタジエンを生合成するための微生物および方法
CN102191237A (zh) * 2011-03-25 2011-09-21 福建省麦丹生物集团有限公司 一种增强l-苯丙氨酸合成代谢途径的方法
US20140114082A1 (en) 2011-06-08 2014-04-24 Metabolix, Inc. Biorefinery Process For THF Production
US9353386B2 (en) 2011-06-15 2016-05-31 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network Ag Means and methods for producing propanediol
AU2012272856A1 (en) 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
BR112014002859A2 (pt) 2011-08-10 2017-06-13 Metabolix Inc purificação pós-processamento para produção de gama-butiro lactona
KR101587618B1 (ko) * 2011-12-07 2016-01-22 한국과학기술원 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법
KR20130094115A (ko) * 2012-02-15 2013-08-23 삼성전자주식회사 1,4-부탄디올의 생산을 위한 변형 미생물
CN104685058B (zh) 2012-06-04 2020-07-07 基因组股份公司 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
KR20140014648A (ko) 2012-07-25 2014-02-06 삼성전자주식회사 1,4-부탄디올의 고효율 생산을 위한 변형 미생물
KR102023618B1 (ko) 2012-07-27 2019-09-20 삼성전자주식회사 1,4-ｂｄｏ 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 1,4-ｂｄｏ의 제조방법
US9657316B2 (en) 2012-08-27 2017-05-23 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 1,4-butanediol related thereto
US9932611B2 (en) 2012-10-22 2018-04-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing succinate related thereto
US10150976B2 (en) 2012-12-17 2018-12-11 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing adipate, 6-aminocaproate, hexamethylenediamine or caprolactam related thereto
EP2970068B1 (en) 2013-03-15 2021-07-28 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths
KR101581504B1 (ko) 2013-03-18 2015-12-31 지에스칼텍스 주식회사 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
EP2818551B1 (en) * 2013-06-28 2017-04-05 Samsung Electronics Co., Ltd Corynebacterium, in which a gene encoding CoA independent succinate semialdehyde dehydrogenase and a gene encoding L-lactate dehydrogenase are attenatued and method of producing C4 compounds, e.g. 4-hydroxybutyrate
KR102097065B1 (ko) 2013-08-23 2020-04-03 삼성전자주식회사 4-히드록시부티레이트 생산 균주 및 이를 이용한 4-히드록시부티레이트의 혐기적 생산 방법
KR101748930B1 (ko) * 2015-02-09 2017-06-20 지에스칼텍스 주식회사 다이올 생산용 재조합 미생물
CN104926930B (zh) * 2015-06-30 2018-02-06 西南大学 出芽短梗霉二羧酸转运蛋白及其重组载体和应用
CA3151149C (en) * 2015-10-13 2024-03-26 Lanzatech Nz, Inc. Genetically engineered bacterium comprising energy-generating fermentation pathway
CN105647953A (zh) * 2016-03-18 2016-06-08 黑龙江大学 高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
CN112877269B (zh) * 2020-01-15 2021-12-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产赖氨酸的微生物以及赖氨酸的生产方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6117658A (en) * 1997-02-13 2000-09-12 James Madison University Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units
GB0219062D0 (en) * 2002-08-15 2002-09-25 Rockwool Int Method and environment for growing plants
US7470530B2 (en) 2003-11-27 2008-12-30 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Rumen bacteria variants and process for preparing succinic acid employing the same
KR100630819B1 (ko) * 2004-04-23 2006-10-02 한국과학기술원 신규 루멘 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의제조방법
GB0409704D0 (en) * 2004-04-30 2004-06-02 Nokia Corp A method for verifying a first identity and a second identity of an entity
KR20060001134A (ko) * 2004-06-30 2006-01-06 삼성전기주식회사 고주파 ｉｄ 리더간 통신 기능을 갖는 고주파 ｉｄ 리더
KR100656590B1 (ko) 2004-07-30 2006-12-11 한국과학기술원 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산 및 아미노산의제조방법
KR20070096348A (ko) 2006-03-23 2007-10-02 주식회사 엘지화학 1,4―ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ〔１，４―ＢＤＯ〕생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 １，４―ＢＤＯ의 제조방법
US7947483B2 (en) * 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol

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