KR100823855B1 - ５탄당 및 당 알콜의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대사적으로 유전자 조작된 미생물 숙주를 사용하여 헥소스와 같은 용이하게 구입할 수 있는 기질로부터, 펜토스 포스페이트 경로로부터 유래된 5탄당 및 당 알콜 뿐만 아니라 또 다른 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure R1020027009341
펜토스 포스페이트 경로, 5탄당, 당 알콜, 크실리톨, 아라비톨 포스페이트 데하이드로게나제, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제

Description

５탄당 및 당 알콜의 제조{Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols}
본 발명은 재조합 숙주를 발효시켜 알도(aldo)- 및 케토(keto)- 5탄당 및 당 알콜을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 조작되어 펜토스 포스페이트 경로의 중간체 또는 크실리톨, D-아라비톨, D-아라비노스, D-릭소스, 리비톨, D-리보스, D-리불로스, D-크실로스 및/또는 D-크실룰로스중 하나 이상의 생산이 증가된 재조합 숙주 및 이러한 숙주를 사용한 상기 중간체의 제조 방법에 관한 것이다.
5탄당 및 5탄당 알콜은 감미제로서 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 크실리톨은 비-우식성 대용 감미제로서 광범위하게 사용되고 있다. D-리불로스 및 D-크실룰로스, 및 크실리톨 이외의 당 알콜은 또한 유리된 모노사카라이드 형태의 감미제로서 또는 올리고사카라이드의 성분으로서의 잠재력을 갖고 있다. 이와 관련하여, 슈크로스의 밀접한 구조적 유사체인 글루코실-크실룰로스는 슈크로스 및 D-크실룰로스로부터 용이하게 합성될 수 있다[문헌참조: Kitaoka, K., et al., Oyo Toshitsu Kagaku 41(2):165-72(1994)].
5탄당 및 5탄당 알콜은 또한 약제 및 기능성 식품 성분 등의 유기 합성 및 효소 합성을 위해 유용하다. D-아라비노스 및 D-크실로스 둘 다는, (뉴클레오사이드/뉴클레오타이드의 천연 당 성분인) D-리보스와 구조적으로 매우 밀접하고 많은 약물 및 약물 제형의 성분이다.
5탄당 및 당 알콜은 세균 및 진균류와 같은 미생물의 증식을 위한 탄소원으로서 유용하다. 추가로, 이들은 5탄당 및 당 알콜을 기질로하는 효소의 연구 분석에 생화학적 시약으로서 및 당 및 당 알콜의 크로마토그래피 분석의 표준물로서 유용하다.
당은 재조합되지 않은 미생물 또는 동물 숙주에 의해 효소적으로 합성될 수 있는 경우 "천연적으로 생산되는" 것으로 일컬어진다. 천연적으로 생산되는 5탄당 및 이의 상응하는 알콜의 전구체는 흔히 펜토스 포스페이트 경로(PPP)의 당 중간체이다. 5-인산화되거나 인산화되지 않은 형태의 이들 중간체 그 자체는 또 다른 다양하게 유용한 화합물의 화학적 전구체로서 가치가 있다. 이들은, 예를 들어, 뉴클레오타이드 및 리보플라빈(PPP 대사물인 D-리보스-5-포스페이트로부터 유도됨), 및 폴레이트, 유비퀴논 뿐만 아니라 다양한 방향족 아미노산(PPP 대사물인 D-에리트로스-4-포스페이트로부터 유도됨)을 포함한다. 이들 아미노산은 이어서 플라보노이드 및 알칼로이드의 전구체가 된다. 따라서, 6탄당과 같은 원료의 목적하는 PPP 당 중간체(예를 들어, 리보스-5-P, 리불로스-5-P 또는 크실룰로스-5-P)로의 전환을 증가시키고 또한 이어서 목적하는 다운스트림 대사물의 생산을 증진시키는 방법 및 숙주가 경제적으로 중요한 가치가 있다. 이들 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 그 자체로서 또는 추가의 대사적 또는 화학적 반응에서 유용한 생산물을 제조하기 위한 전구체로서 추출되거나 분리되어 사용될 수 있다.
미국 특허 제5,798,237호(Picataggio, S.K. et al.)에는 크실로스 이소머라제 유전자 및 크실룰로키나제 유전자가 유전자 조작되어 크실로스를 포함하는 리그노셀룰로스성 바이오매쓰를 젖산으로 발효시키는 능력이 부과된 재조합 락토바실러스(Lactobacillus)가 보고되어 있다.
제프리(Jeffries)등은 크실로스로부터 에탄올을 효율적으로 생산하기 위해 효모에서 크실로스 발효의 유전자 조작을 보고하였다[문헌참조: Jeffries, T.W. et al., "Genetic Engineering of Xylose Fermentation in Yeasts," http://calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/bioprocessing/xoferm/xoferm.html]. 이러한 효모는 탄소가 5탄당 크실로스로부터 2개의 탄소 최종 생성물 알콜인 에탄올로 전환되도록 하는 능력으로 인해 동정되었고 이러한 능력은 가장 가능하게는 축적된 PPP 중간체로부터 탄소의 유출을 촉진시키는 방향으로 작용하는 PPP 트랜스케톨라제 효소가 관여하는 경로를 통해 이루어진다.
문헌[참조: Aristidou, A. et al., WO 99/46363]은 피리딘 뉴클레오타이드 연결 데하이드로게나제 반응의 커플링이 NAD 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 말릭 효소의 과발현에 의해 개선된 효모가 크실로스로부터 에탄올을 보다 효율적으로 생산할 뿐만 아니라 크실로스로부터 크실리톨의 생산이 증가된 것으로 보고하였다.
그러나, 해당과정으로부터 또는 에탄올 생산으로부터 탄소의 흐름을 PPP로 역전환시켜 PPP 중간체 및 이로부터 유도된 당 또는 당 알콜을 축적시키도록 미생물을 변형시키는 방법에 관해서는 거의 연구되지 않았다. 예를 들어, 미국 특허 제5,281,531호(Miyagawa, K. et al.)는 글루코네이트 오페론(글루코네이트 흡수 및 대사에 관여하는 단백질을 암호화하고 있음)을 부분적으로 또는 완전히 변형시켜 글루코네이트 오페론을 고도로 발현하는 바실러스 숙주에서 D-리보스를 생산하는 방법을 보고하였다. 특히, gntR 유전자는 결실되거나 불활성화되고 프로모터는 다른 프로모터로 대체된다.
D-리보스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 발효에 의해 글루코스로부터 생산되었다[문헌참조: 미국 특허 제3,607,648호]. 천연으로부터 분리된 몇몇 세균으로 글루코스를 발효시켜 D-크실룰로스 및 D-리불로스를 생산하는 방법이 또한 문헌[참조: 캐나다 특허 제840981호]에 기술되어 있다.
미국 특허 제3,970,522호(Sasajima, K. -I. et al.)는 2-데옥시글루코스 산화 활성이 높은 바실러스 균주에서 D-리보스를 생산하는 방법을 보고하였다. 한 균주에서, 바실러스에는 또한 하나 이상의 트랜스케톨라제 및 D-리불로스 포스페이트 3-에피머라제가 결실되어 있다.
오니시(Onishi)등은 크실리톨을 생산하기 위한 다단계 방법을 개발하였는데 여기서, 글루코스는 처음 호삼투성(osmophilic) 효모에 의해 D-아라비톨로 발효된다. 이어서 상이한 균주에 의해 D-아라비톨은 2번째 발효되어 D-크실룰로스로 전환된다. 마지막으로, 3번째 균주에 의한 3번째 발효에서, D-크실룰로스는 발효에 의해 크실리톨로 환원된다[문헌참조: Onishi, H. and Suzuki, T., Appl. Microbiol. 18:1031-1035(1969)].
하르키(Harkki)등은 글루코스를 크실리톨로 전환시키기 위한 1단계 발효 방법을 개발하였고 처음으로 단일 숙주내에서 글루코스로부터 크실리톨을 제조하기 위해 직접적으로 PPP를 변형시키기를 제한하였다[문헌참조: 미국 특허 제5,631,150호].
상기 많은 미생물학적 방법은 천연으로부터 분리된 세균 균주를 사용한다. 대부분은 미생물의 당 또는 당 알콜을 생산하는 고유 능력을 추가로 개선시키고 발효에 의해 생산되는 유용한 생성물의 스펙트럼의 범위를 확대시키기 위한 방법을 교시하고 있지 않다. 하르키(Harkki)등의 문헌[참조: 미국 특허 제5,631,150호]이 숙주를 대사적으로 조작하는 몇몇 방법 및 당해 숙주에서 특히, PPP의 산화적 분기점의 유전자들을 과발현시켜 크실리톨을 생산하는 방법을 기술하고 있지만, PPP를 거치는 대사적 유출을 증진시키는 추가의 방법이 5탄당 뿐만 아니라 임의의 PPP 유도 생성물 또는 생성물의 전구체를 생산하기 위해 이로울 것이다.
발명의 요약
글루코스의 크실리톨로의 생전환을 연구하면서 본 발명자는 크실리톨을 생산하는 2개의 새로운 경로를 발견하였다. 본 발명자는 또한 예상치않게 광범위한 5탄당(알도스 및 케토스 둘 다) 및 크실리톨을 포함한 당 알콜의 생산이, 탄소원으로서 글루코스와 같은 6탄당을 사용하고 PPP의 하나 이상의 효소적 단계 또는 또 다른 목적하는 효소적 단계가 유전학적으로 제거되거나 첨가되거나 개선되거나 달리 대사적 조작방법에 의해 변형된 미생물 숙주를 사용하여 증진될 수 있다는 것을 밝혔다. 특히, 본 발명은 6탄당 탄소의 PPP로의 유입이 증가된 숙주를 제공하고 이를 사용하여 목적하는 당 또는 당 알콜, 특히, 크실리톨을 생산하기 위한 일련의 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 유전학적으로 변형된 숙주에서 연속적으로 크실룰로스-5-포스페이트를 크실리톨-1-포스페이트로 전환(예를 들어, 크실리톨-1-포스페이트 데하이드로게나제를 사용함)시킴에 의해 크실리톨을 생산하는 새로운 경로에 관한 것이다. 크실리톨-1-포스페이트는 예를 들어, 적합한 포스파타제에 의해 크실리톨로 전환된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 유전학적으로 변형된 숙주에서 아라비니톨을 생산하는 방법에 관한 것이고 당해 아라비니톨은 아라비톨-5-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 리불로스-5-포스페이트로부터 생산된다. 본 발명은 또한 비.서브틸리스 glcUgdh 오페론을 과발현시켜 글루코스 및 글루코스로부터 유도된 중간체의 펜토스 포스페이트로의 유입을 증가시키는 새로운 글루코스 취득 메카니즘에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전학적으로 변형되어 glcUgdh 오페론의 발현이 증진된 숙주에 관한 것이다.
유전자 변형 뿐만 아니라 본 발명자는 본 발명의 방법에 따른 특정 숙주에 의한 광범위한 5탄당 탄수화물의 생산을 추가로 증진시키고 조정하는데 사용될 수 있는 발효 조건을 밝혔다.
본 발명은 단일 미생물 숙주의 유전학적으로 변형되고 조작된 경로에서 6탄 당(바람직하게는 글루코스)을 발효시켜 5탄당 및 당 알콜, 특히, 크실리톨 뿐만 아니라 또 다른 PPP 중간체 또는 이로부터 유도된 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제(XPDH) 또는 아라비톨 포스페이트 데하이드로게나제(APDH)를 암호화하는 정제되고/되거나 분리된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터 및 이를 발현하고 유지하기 위한 숙주 및 재조합 미생물 숙주에서 크실리톨 및/또는 아라비톨을 생산하기 위한 이러한 작제물의 용도에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 정제되고/되거나 분리된 XPDH 또는 APDH 단백질, 또는 당해 숙주에 의해 생산되는 당해 단백질을 포함하는 제제 및, 특히, 크실리톨 및/또는 아라비톨을 생산하기 위한 당해 XPDH 또는 APDH의 용도에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 당해 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 XPDH 또는 APDH를 생산하는 방법, 이를 발현시키기 위한 본 발명의 재조합 벡터 및 숙주, 특히, 펜토스 포스페이트 중간체 및 이로부터 유도된 생성물, 예를 들어, 크실리톨 또는 아라비톨 각각을 생산하기 위한 유전학적으로 변형된 숙주의 용도에 관한 것이다.
도 1은 플라스미드 p131에서의 비. 서브틸리스 rpi 유전자 영역에 대한 제한 지도를 나타낸다.
도 2는 플라스미드 p131:Cm-2의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pBS의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pBS(AR2T)의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 5는 플라스미드 pBS(AR2T)-Kan의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 6은 플라스미드 pGT21의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 7은 플라스미드 pGT23의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 8은 플라스미드 pGT24 및 pGTK24의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 9는 플라스미드 pGTK24(MXD2)의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 10은 플라스미드 pTKT:E1의 작제 방법 및 구조를 나타낸다.
도 11은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 pAOS 63의 유전자 지도를 나타낸다.
도 12는 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 pAOS 67의 유전자 지도를 나타낸다.
도 13은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 pAOS 64의 유전자 지도를 나타낸다.
도 14는 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 pAOS 66의 유전자 지도를 나타낸다.
도 15는 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B995의 유전자 지도를 나타낸다.
도 16은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1068의 유전자 지도를 나타낸다.
도 17은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1154의 유전자 지도를 나타낸다.
도 18은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1449의 유전자 지도를 나타낸다.
도 19는 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1003의 유전자 지도를 나타낸다.
도 20은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1187의 유전자 지도를 나타낸다.
도 21은 적절한 발현 카세트 및 표시된 제한 부위를 갖는 B1011의 유전자 지도를 나타낸다.
도 22는 상이한 농도의 글루코스상에서의 PGI1, PGI1, IDP2 결핍 균주의 증식을 나타낸다.
도 23은 플라스미드 pGTK74의 작제 방법을 나타낸다.
도 24A는 플라스미드 pGTK74(LRXPDH)의 작제 방법이고 도 24B는 플라스미드 pGTK74(BHDH2)의 작제 방법을 나타낸다.
도 25A는 플라스미드 pGTK24(GDOP)의 작제 방법이고 도 25B는 플라스미드 pGTK74(GDOP)의 작제 방법을 나타낸다.
도 26은 BD170[pGTK24(GDOP)]로 형질전환된 비. 서브틸리스 및 형질전환되지 않은 대조군 균주(BD170)에서의 글루코스 취득(1% 글루코스) 속도(분당 cpm)를 나타낸다.
도 27A는 발현 벡터 pGTK74(APDH)의 작제 방법을 나타내고 도 27B는 발현 벡터 pGTK74(BHDH)의 작제 방법을 나타낸다.
많은 당은 D-배위 및 L-배위 둘 다로 존재할 수 있다. 달리 언급되지 않고 열거된 당 또는 알콜이 D-배위 및 L-배위로 존재할 수 있는 경우 열거된 당 또는 당 알콜은 D-배위를 언급한다.
본 발명은 글루코스 또는 또 다른 적합한 탄소원을 대사적으로 이용하고 특히, 이를 발효시킴에 의한 D-배위의 당, 및 상응하는 당 알콜, 특히, 5탄당 및 당 알콜 및 가장 특히, 크실리톨을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 글루코스와 같은 탄소원의 펜토스 포스페이트 경로 중간체인 리불로스-5-P, 크실룰로스-5-P 및 리보스-5-P 및 이로부터 유도된 생성물로의 유입을 개선시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용할 유전학적으로 변형된 숙주 및 이러한 숙주를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라, 목적하는 당 또는 당 알콜은 유전학적으로 변형되기 전의 숙주에서 동일한 조건 및 동일한 시간동안 당 또는 당 알콜을 생산하는 것과 비교하여 목적하는 당 또는 당 알콜의 생산이 증진되는 방식으로 유전학적으로 변형된 미생물 숙주에서 전구체로부터 당 또는 당 알콜이 대사적으로 생산된다. 증진된 생산은 생산량 또는 생산 비율의 증가 또는 비생산성(specific productivity)의 증가를 반영할 수 있다. 이러한 유전학적 변형은 예를 들어, 숙주내에서 목적하는 생성물을 분해시키거나 이용하는 효소 또는 목적하는 생성물의 생성을 감소하거나 억제하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 불활성화(무작위 돌연변이 유발 또는 유전자 파괴)시킴에 의해 성취될 수 있다. 이러한 불활성화는 일반적으로 표적 유전자의 발현 생성물이 숙주에서 결핍되도록 하거나 불활성화된 유전자의 기능과 작동적으로 연결된 유전자의 발현 생성물이 결핍되도록 한다. 단백질 또는 효소와 같은 물질의 "결핍"이란 숙주가 불활성화되기 전에 숙주에서 발현되는 수준과 비교하여 단백질 또는 효소의 수준이 감소되었음을 의미하고 유전자를 불활성화시킨 결과 단백질 또는 효소가 완전히 결핍된 숙주를 포함한다.
이러한 유전학적 변형은 또한 예를 들어, 특히, 유전학적으로 변형된 숙주의 배양동안에 생성되는 목적하는 생성물의 양을 증진시키는 단백질 및 특히 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 과발현시켜 성취될 수 있다. 숙주는 또한 유전학적으로 변형되어 목적하는 당 또는 당 알콜의 생성이 증진되고 이의 분해가 감소된 조합된 변형 둘 다를 포함할 수 있다. 추가로, 적합한 조건하에서 유전학적으로 변형된 미생물 숙주를 배양하여 본 발명의 숙주내에서 목적하는 당 또는 당 알콜의 생산을 추가로 증진시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 합성이 증진될 수 있는 당(탄수화물)의 예는 특히, 천연적으로 생산되는 D-배위의 당, 특히, D-배위의 5탄당 알도스를 포함한다. 본 발명의 방법은 D-리보스의 특정 생산 방법을 포함하지 않는다[미국 특허 제3,607,648호 및 제3,970,522호].
"대사적 경로"란 숙주 세포내에서 일어나고 하나의 효소적 반응의 생성물이 다음 화학적 반응을 위한 기질이 되는 2개 이상의 일련의 효소적 반응을 의미한다. 대사적 경로의 각 단계에서, 중간체 화합물이 형성되고 다음 단계를 위한 기질로서 사용된다. 이들 화합물은 "대사적 중간체"로서 불리운다. 각 단계의 생성물은 또한 "대사물"로 불리운다. 특정 경로의 중간체는 경로의 이름을 붙여 언급될 수 있다. 예를 들어, 펜토스 포스페이트 경로(PPP)의 중간체는 "PPP 중간체"로서 불리울수 있다.
가장 단순한 양태에서, 본 발명은 유전학적으로 변형되어 변형되기 전 동일한 배양 조건하에서 생산되는 당 중간체의 양과 비교하여 주어진 시간동안 하나 이상의 증진된 양의 특이적 PPP 당 중간체를 생산할 수 있는 숙주에 관한 것이다. PPP 당 중간체는 PPP의 중간체인 당을 의미하고 특히, D-리보스-5-포스페이트(D-리보스-5-P), 리불로스-5-포스페이트(리불로스-5-P), D-크실룰로스-5-포스페이트(D-크실룰로스-5-P), D-세도헵툴로스-7-포스페이트(D-세도헵툴로스-7-P), D-글리세르알데하이드-3-포스페이트(D-글리세르알데하이드-3-P) 및 D-에리트로스-4-포스페이트(D-에리트로스-4-P)이다. 본 발명은 또한 조 세포 추출물, 부분적으로 정제(바람직하게는 무세포)되거나 분리된 형태로 당을 제공하기 위한 숙주의 제조 방법 및 열거된 하나 이상의 당을 생산하기 위한 숙주의 사용 방법, 당의 추출 및 정제 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 유전학적으로 변형되어 하나 이상의 특정 당 또는 당 알콜, 특히, 5탄당 또는 당 알콜의 생산량이 증진된 숙주에 관한 것이고 이때 상기된 하나 이상의 PPP 당 중간체는 본 발명의 재조합 숙주에서 대사 전구체이고 이러한 증진된 양은 변형되기 전 동일 배양 조건하에서 생산되는 당 중간체의 양과 비교되는 주어진 시간동안의 양이다. 특히, 숙주는 유전자 조작되어 하나 이상의 D-아라비톨(또한 D-아라비니톨로서 공지됨), D-아라비노스, D-릭소스, 리비톨, D-리보스, D-리불로스, 크실리톨, D-크실로스 및 D-크실룰로스의 생산량이 증진될 수 있다. 본 발명은 또한 조 세포 추출물, 부분적으로 정제(바람직하게는 무세포)되거나 분리된 형태의 당 또는 당 알콜을 제공하기 위한 숙주의 제조 방법, 하나 이상의 열거된 당 또는 당 알콜을 생산하기 위한 상기 숙주의 사용 방법, 상기 당의 추출 방법 및 정제 방법에 관한 것이다.
PPP의 중간체는 또 다른 당의 대사적 전구체일 수 있다. 예를 들어, 많은 미생물(세균 및 효모를 포함한 진균류)이 리불로스 전구체로서 리불로스-5-P를 사용한다. 아라비톨 데하이드로게나제의 리불로스 리덕타제(NADPH) 형태를 소유하거나 소유하도록 유전자 조작된 미생물은 리불로스로부터 D-아라비톨을 생산할 수 있다. 리불로스는 또한 D-아라비노스(L-푸코스 이소머라제를 사용하는 경로에 의해) 및 리비톨(리비톨 데하이드로게나제를 통해)에 대한 전구체로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "리불로스-5-P 유도 생성물"은 리불로스, 리비톨, D-아라비톨 및 D-아라비노스 및 리비톨과 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
크실룰로스-5-P는 또한 크실로스[이것은 D-릭소스(만노스 이소머라제를 통한) 및 D-크실로스(크실로스 이소머라제를 통한)에 대한 전구체이다]를 포함하는 여러 중요한 생성물의 전구체일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "크실룰로스-5-P 유도 생성물"은 크실룰로스, D-릭소스, D-크실로스 및 이의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 유전학적 변형으로 크실룰로스-5-P의 상대적 양이 증가된 균주는 유전학적으로 추가로 변형되어 크실리톨과 같은 크실룰로스-5-P 유도 생성물의 수율이 개선된 균주가 될 수 있다. 유사하게, 리보스-5-P의 양이 증가되거나 리보스-5-P로의 탄소 유입이 증가되도록 변형된 균주는 추가로 변형되어 리보스-5-P 유도 생성물의 생산이 증가 될 수 있고 특히, 뉴클레오타이드 및 리보플라빈, 또는 D-에리트로스 4-P 및 이의 생성물(예: 폴레이트, 유비퀴논 및 다양한 방향족 아미노산)의 생산이 증가될 수 있다. 유사하게, 당 알콜과 같은 생성물에 대해 본원에 기술된 바와 같이, 리보스-5-P를 축적하고 리보스-5-P로의 탄소 유입이 개선된 균주에서 리보스-5-P 유도 생성물의 생산은 추가로 이러한 생성물을 유도하는 연속적이고/다운스트림의 대사 반응을 유전학적으로 변형시켜 개선될 수 있다.
바람직한 양태에서, D-아라비노스, D-릭소스 및 D-크실로스를 제조하는 신규 방법이 제공된다. 추가의 바람직한 양태에서, 5탄당이고 D-케토스인 D-리불로스 및 D-크실로스 둘 다 뿐만 아니라 D-펜토스, 즉, 크실리톨, D-아라비톨 및 리비톨로부터 유도될 수 있는 5탄당 펜티톨 모두를 생산하기 위한 신규 방법이 제공된다. 크실리톨의 생산 방법이 특히 바람직한 양태이다.
본 발명은 또한 글루코스 및 또 다른 탄소원, 특히, 해당 과정에서, 특히, 본 발명의 숙주에서 발효 조건을 조정함에 의해 대사적으로 6탄당 중간체로 전환되는 탄소원의 발효로부터 수득되는 5탄당 탄수화물 생성물의 스펙트럼(서로 비교되는 상대적인 양)을 변화시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 글루코스 및 또 다른 6탄당을 발효시킴으로써 천연적으로 생산되는 D-배위의 5탄당 또는 당 알콜 또는 상기 배위의 당 또는 당 알콜로부터 및 PPP의 중간체로부터 유도되는 당 또는 당 알콜의 수준을 증진시킬 수 있다. 특히, D-리불로스, D-리보스, D-크실룰로스, D-아라비노스, D-릭소스, D-크실로스, D-아라비톨, 리비톨 및 크실리톨이 생산될 수 있지만 또한 PPP 중간체로부터 유도된 또 다른 생성물이 생산될 수 있다.
본 발명의 숙주 및 방법은 미생물 숙주내에서 단일 유전학적 조합 또는 하기의 사항을 성취하기 위해 디자인된 여러 상이한 유전학적 변형을 조합함에 의해 성취될 수 있다:
a) 하나 이상의 효소적 또는 기질 수송 단계, 특히 당 수송 단계의 파괴 또는 활성 저하;
b) 하나 이상의 새로운 목적하는 효소적 또는 당 수송 활성의 도입;
c) 숙주내에 이미 존재하는 하나 이상의 목적하는 효소적 또는 당 수송 활성의 과발현 또는
d) 상기 a) 내지 c)의 조합.
바람직한 양태에서, 본 발명의 숙주는 유전학적으로 변형되어 PPP의 비산화적 부분에서의 하나 이상의 효소적 단계 및/또는 PPP를 통해 간접적으로 탄소 유입에 영향을 미치는 반응에 대한 하나 이상의 효소적 단계가 파괴된다.
본 발명의 유전학적 변형은 당 대사에 영향을 미치는 단백질, 및 특히, 탄수화물 대사에 있어서 여러 주요 영역에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 대상으로 한다. 이러한 관점에서 가장 중요한 영역은 펜토스-포스페이트 경로의 비-산화적 분기점(branch), PPP의 산화적 분기점, 해당 과정(엠브덴-메이어호프(Embden-Meyerhof))의 상부(즉, 알돌라제 이전) 및 원핵 당 취득 시스템(PTS 시스템)이다. 추가로, 폴리올 데하이드로게나제, 알도스 이소머라제 및 케토스 에피머라제 및 당 탈인산화 효소에 의해 촉매되는 다양한 각각의 대사 반응이 표적화될 수 있다.
PPP의 반응은 산화적 분기점에 이어서 비-산화적 분기점을 구성하는 일련의 반응들로 나누어진다. 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제와 같은 옥시도리덕타제에 의해 촉매되는 반응은 산화적 분기점을 구성한다. 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제는 글루코스-6-포스페이트가 6-글루코놀락톤-6-포스페이트(이것은 화학적으로(몇몇 균주에서는 효소적으로) 신속하게 6-포스포글루코네이트로 전환된다)로 전환되는 것을 촉매한다. 이어서 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제는 6-포스포글루코네이트가 리불로스-5-P로 전환되는 것을 촉매한다.
PPP의 비산화적 분기점은 (1) 리보스-5-P 이소머라제(또한 리불로스-5-P 이소머라제로서 공지됨), (2) 리불로스-5-P 3-에피머라제, (3) 트랜스케톨라제 및 (4) 트랜스알돌라제의 촉매 활성을 특징으로 한다. PPP의 비산화적 분기점에서, 리불로스-5-P는 리보스-5-P 이소머라제에 의해 리보스-5-P로 이성체화된다. 리불로스-5-P는 또한 리불로스-5-P 3-에피머라제의 작용으로 크실룰로스-5-P로 에피머화된다. 트랜스케톨라제는 리보스-5-P 및 크실룰로스-5-P를 글리세르알데하이드-3-P 및 세도헵툴로스-7-P로 전환시킨다. 트랜스알돌라제는 글리세르알데하이드-3-P 및 세도헵툴로스-7-P를 기질로하여 이들을 프럭토스-6-포스페이트 및 에리트로스-4-P로 전환시킨다. 이어서, 트랜스케톨라제는 에리트로스-4-P 및 크실룰로스-5-P를 기질로 사용하여 이들을 글리세르알데하이드-3-P 및 프럭토스-6-P로 전환시킨다.
특히, 펜토스 포스페이트 경로의 비산화적 분기점에서 하나 이상이 유전학적으로 변형된 숙주가 본 발명의 바람직한 숙주이다. 바람직하게, PPP의 비산화적 분기점의 하나 이상의 효소는 불활성화되어 PPP의 비산화적 분기점을 통한 탄소의 흐름이 목적하는 화합물의 생성 방향으로 지시될 수 있도록 차단되는 부위에서 파괴된다. 따라서, PPP의 비산화적 분기점을 통한 고유 탄소 흐름이 상기 숙주에서 저하되거나 완전히 차단된다. 이것은 바람직하게 리불로스-5-P 이소머라제, 리불로스-5-P 3-에피머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 파괴함으로써 성취된다. 하기에서 상세하게 논의되는 바와 같이, 무작위 화학적 돌연변이 유발 및 선별, 또는 유전자 파괴와 같은 표적화된 돌연변이 유발 기술에 의해 파괴될 수 있다.
리불로스-5-P 및 리불로스-5-P 유도 생성물의 생산을 증진시키기 위해, 특히, 리보스-5-P 이소머라제 유전자를 파괴하거나 불활성화시키는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 추가로, 리불로스-5-P 3-에피머라제 유전자를 파괴하거나 불활성화시키는 것이 매우 바람직하다. 상기 숙주를 글루코스와 같은 6탄당 또는 글루코스 또는 이의 6탄당 대사물(예: 글루코스-6-P)로 전환되는 당에서 배양시키는 경우, PPP로의 탄소 흐름이 리불로스-5-P 단계에서 막히거나 방해되어 상기 중간체가 축적하게 되고 리불로스-5-P에서 리불로스-5-P 유도 생성물로의 탄소 흐름이 증가되어 숙주내에 리불로스-5-P 유도 생성물이 생산될 수 있다. 특정 단계에서 "막히거나" 또는 "방해됨"에 의한 생산은 상기 단계에서 숙주에 의한 화합물의 사용율 또는 분해율이 상기 화합물의 합성율보다 적어 화합물의 양이, 동일한 조건하에 숙주를 성장시키는 경우 이러한 방식으로 변형되지 않은 숙주와 비교하여 증가된다는 것을 의미한다.
크실룰로스-5-P 및 크실룰로스-5-P 유도 생성물의 생산을 증진시키기 위해, 리보스-5-P 이소머라제를 암호화하는 유전자를 파괴시키거나 불활성화시키는 것이 매우 바람직하다. 리불로스-5-P 3-에피머라제를 암호화하는 유전자는 바람직하게 온전한 상태로 남아있거나 이러한 유전자의 추가의 복사물(동종성 또는 이종성이지만 바람직하게는 동일 종 기원의 동종성 복사물)이 도입되어 크실룰로스-5-P로의 탄소 흐름을 증진시킨다. 크실룰로스-5-P를 생산하는 능력이 증가된 숙주를 작제하는 경우 추가로 트랜스케톨라제 유전자를 불활성화시키는 것이 특히 바람직하다. 숙주를 글루코스와 같은 6탄당 또는 글루코스-6-P와 같은 이의 6탄당 대사물에서 배양하는 경우, PPP로의 탄소 흐름이 크실룰로스-5-P 단계에서 막히거나 방해되어 중간체가 축적하게 되고 크실룰로스-5-P에서 크실룰로스-5-P 유도 생성물로의 탄소 흐름이 증가되어 숙주에서 이를 생산할 수 있다.
리보스-5-P 이소머라제 및 트랜스케톨라제 및/또는 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자의 불활성화는 PPP에서 유출되어 해당 과정 중간체 방향으로의 탄소 흐름을 차단하거나 상당히 감소시킨다. 또한, 심지어 리보스-5-포스페이트 이소머라제 유전자의 불활성화 없이도 트랜스케톨라제 유전자를 불활성화시키거나 추가로 트랜스알돌라제 유전자를 불활성화시켜 상기 효소적 단계에서 PPP에서 해당 과정으로의 탄소 손실을 차단할 수 있지만, 리보스-5-P 및 이로부터 유도된 생성물의 생산이 허용된다.
리보스-5-P 이소머라제가 불활성화된 상기 논의된 바와 같은 유전자의 불활성화에 대한 결과는 변형되지 않은 숙주와 비교하여 리불로스-5-P 및 크실로스-5-P중 하나 또는 둘 다를 축적시키게 되거나 리불로스-5-P 또는 크실룰로스-5-P가 합성 경로에서 대사 전구체인 하나 이상의 대사 생성물이 축적하게 된다.
에스. 세레비지애의 트랜스케톨라제 유전자 또는 이. 콜리내 D-리보스 5-포스페이트 이소머라제 유전자의 경우에서 처럼 트랜스케톨라제 또는 D-리보스 5-포스페이트 이소머라제의 여러 동위 효소를 암호화하는 다중 유전자가 숙주내에 존재하는 경우 이들 효소를 암호화하는 유전자 모두가 불활성화되는 것이 바람직하다. D-리불로스 5-포스페이트 에피머라제를 암호화하는 유전자는 수행 목적(즉, 크실룰로스-5-P로의 탄소 유입의 필요성)에 따라 불활성화되거나 과발현될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위해 가장 바람직한 방법은 선택된 숙주내에서 D-리보스 5-포스페이트 이소머라제 및 트랜스케톨라제 유전자 모두를 불활성화시키는 것이다.
본 발명의 숙주는 또한 이미 숙주내에 존재하고 특정 5탄당 및 당 알콜의 상호 전환을 촉매하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 목적하는 유전자를 과발현시키도록 디자인될 수 있다. 또한, 본 발명의 숙주는 이전에 결핍되어 있었던 목적하는 효소 활성을 발현하도록 디자인될 수 있다. 본 발명의 숙주 및 방법에서 도입시키고/시키거나 과발현시키기 위한 표적물인 상기 유전자의 예는 크실리톨 데하이드로게나제, 아라비톨 데하이드로게나제 또는 리비톨 데하이드로게나제와 같은 폴리올 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자들을 포함한다. 유사하게, 천연 당에 작용하는 다양한 이소머라제 및 에피머라제를 암호화하는 유전자가 상기 그룹에 속하는 것으로 사료된다. 이러한 이소머라제 및 에피머라제의 예는 L-푸코스 이소머라제[참조문헌: Garcia-Junceda E., et al., Bioorg. Med. Chem. 3:1349-1355(1995)], D-만노스 이소머라제[참조문헌: Allenza, P., et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25:171-182(1990)], D-크실로스 이소머라제[문헌참조: Bhosale, S.H., et al., Microbiol. Rev. 60:280-300(1996)], 케토스 3-에피머라제[문헌참조: Ishida, Y.,et al., J. of Fermentation and Bioengineering 83:529-534(1997)]이다.
새로 도입되거나 과발현시키기 위한 유전자는 본 발명의 특정 수행 목적에 따라 선택될 것이다. 예를 들어, 크실리톨이 표적 생성물인 경우와 숙주가 크실룰로스를 생산하는 경우, 크실리톨 데하이드로게나제 유전자가 발효 동안에 또는 적어도 생산 주기(발효 단계와 별도인 경우)동안에 숙주 세포내에서 발현될 필요가 있다. D-크실로스가 표적 생성물인 경우와 숙주가 크실리톨을 생산하는 경우, 많은 공지된 D-크실로스 이소머라제 유전자중 하나가 발효 또는 생산 주기 동안 발현되어야만 한다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 숙주는,
(A) D-크실로스, D-크실룰로스, D-크실로스 및 D-크실룰로스의 혼합물, 및 주요 성분으로서, D-크실로스 또는 D-크실룰로스를 포함하는 중합체 및 올리고머를 제외한 탄소원상에서 재조합 숙주를 증식시키는 단계,
(B) 아라비톨이 중간체가 아닌 대사 경로에 의해 하나 이상의 펜토스 포스페이트 경로 중간체를 크실리톨로 전환시켜 상기 숙주에서 크실리톨을 생산하는 단계,
(C) (B) 단계에서 생산되는 상기 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 크실리톨을 생산하는데 사용된다.
바람직한 양태에서, 상기 경로는 크실리톨의 생산에 있어서 중간체 대사물로서 리불로스-5-포스페이트를 사용한다. 특히 바람직한 양태에서, 상기 경로는 크실리톨을 생산하는데 있어서 중간체 대사물로서 리불로스-5-포스페이트, 크실룰로스-5-P 및 크실리톨-1-P를 사용한다. 크실리톨-1-P는 또한 크실리톨-5-P로서 공지되어 있다.
또한, 또 다른 바람직한 양태에서, 상기 경로는 크실리톨을 제조하는데 있어서 중간체 대사물로서 (1) 리불로스-5-P, (2) 리불로스 및 (3) 하나 이상의 크실룰로스 및 크실로스를 사용한다.
따라서, 바람직한 양태에서, 크실리톨은 본 발명의 숙주에서 실시예 24에서 하기와 같이 예시된 바와 같은 경로에 의해 생산된다:
a) 리불로스-5-P는 리불로스-5-P 3-에피머라제와 같은 효소에 의해 크실룰로스-5-P로 에피머화되고,
b) 크실룰로스-5-P는 크실리톨-5-포스페이트 데하이드로게나제(또한 크실리톨-1-포스페이트 데하이드로게나제 또는 단순히 XPDH로서 공지되어 있다) 또는 리비톨-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 효소에 의해 D-크실리톨-5-포스페이트(D-크실리톨-1-포스페이트)로 환원되고,
c) D-크실리톨-5-포스페이트(D-크실리톨-1-포스페이트)는 당 포스파타제에 의해 크실리톨로 탈인산화된다.
크실룰로스-5-P를 축적하고 크실룰로스-5-P를 크실리톨-5-P로 환원시킬 수 있는 크실리톨-5-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 효소를 발현하는 유전자가 도입된 숙주가 특히 바람직하다.
D-크실리톨-5-포스페이트는 당해 기술 분야에서 L-크실리톨-1-포스페이트와 동일한 화합물로 이해되고 있고 또한 그 반대인 경우에도 마찬가지이므로, 본원에서 사용되는 바와 같이 이들은 상호 혼용될 수 있다. 추가로, 당해 기술 분야에서, 크실리톨-5-P를 제조하거나 이를 사용하는 크실리톨-5-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 효소가 명칭이 크실리톨-1-포스페이트 데하이드로게나제 또는 단순히 XPDH인 효소와 동일한 것으로 이해되고 이러한 명칭은 상호 혼용될 수 있다.
또한 또 다른 바람직한 양태에서, 크실리톨은, 리불로스-5-포스페이트가 리불로스로 탈인산화되고(예를 들어, 리불로스-5-P 포스파타제에 의해), 리불로스가 크실로스로 에피머화되고(예를 들어, 타가토스 에피머라제에 의해), 크실룰로스가 크실리톨로 환원되거나(예를 들어, 크실리톨 데하이드로게나제에 의해) 또는 크실룰로스가 먼저 부분적으로 크실로스로 이성체화된 다음 크실룰로스와 크실로스가 크실리톨로 환원되는 실시예 9에 예시된 경로에 의해 숙주에서 생산된다.
따라서, 글루코스가 크실리톨로 전환되는데 관여하는 경로 및 효소적 반응은 크실리톨-포스페이트 경로, 크실리톨-데하이드로게나제 경로, 타가토스 에피머라제 경로 및 아라비톨 경로를 포함한다.
크실리톨-포스페이트 경로에서, 리불로스-5-P는 크실룰로스-5-P로 전환된다. 크실룰로스-5-P는 이어서 크실리톨-5-P로 전환되고 이는 크실리톨로 전환된다.
크실리톨-데하이드로게나제 경로에서, 리불로스-5-P는 크실룰로스-5-P로 전환된다. 크실룰로스-5-P는 크실룰로스로 전환되고 이는 크실리톨로 전환된다.
타가토스 에피머라제 경로에서, 리불로스-5-P는 리불로스로 전환된다. 리불로스는 크실룰로스로 전환되고 이어서 크실리톨로 전환된다.
아라비톨 경로에서, 아라비톨은 크실룰로스로 전환되고 이어서 크실리톨로 전환된다.
D-만노스 이소머라제는 D-크실룰로스와 D-릭소스의 상호 전환을 촉매하는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: Stevens, F.J., et al., J. Gen. Microbiol. 124:219-23(1981)]. 따라서, D-크실룰로스 생산 숙주에서 만노스 이소머라제에 대한 유전자를 발현시킴으로써 글루코스 발효 생성물로서 D-릭소스를 수득할 수 있다.
L-푸코스 이소머라제는 또한 D-리불로스를 D-아라비노스로 전환시키는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: Bartkus, J.M., et al., J. Bacteriol. 165:704-709(1986)]. 본 발명의 D-리불로스 생산 숙주(예를 들어, 비. 서브틸리스 GX2)에 서 적합한 유전자(예를 들어, 이. 콜리 fucI, GenBank 승인 번호 제U29581호)가 발현되어 숙주가 D-글루코스를 D-리불로스를 거쳐 D-아라비노스로 전환시킬 수 있도록 해준다.
본 발명의 숙주를 디자인하는데 있어서, 당 취득 시스템을 포함한 헥소스 대사의 초기 단계, 해당 과정의 상부(즉, 헥소키나제/글루코키나제 및 알돌라제 작용 사이의 임의의 부위) 및 PPP의 산화적 분기점을 명심하는 것이 중요하다. 이들 영역은 본 발명을 수행하기 위해 유전학적으로 변형될 필요가 없다. 그러나, 본 발명의 숙주는 유전학적으로 변형되어 이러한 영역에 하나 이상이 변형됨으로써 PPP의 산화적 분기점으로 및 PPP의 비산화적 분기점으로의 탄소 흐름을 최대화하여 목적하는 발효 생성물의 수율을 추가로 개선시킬 수 있다.
보다 특히, 해당 과정과 PPP 사이에서 탄소 흐름을 조절하는 효소를 암호화하는 유전자를 파괴시키는 것이 본 발명의 숙주에게 매우 요망될 수 있다. 이러한 유전자는 해당 과정의 상부(즉, 트리오스 포스페이트 이소머라제 단계 이전)에 존재하는 효소 활성을 암호화할 수 있다. 이러한 유전자의 파괴 및 이에 의해 암호화된 효소의 결핍은 탄소가 해당 과정을 거쳐 헥소스 포스페이트 풀(pool) 외부로 유출되는 것을 차단하여, 해당 과정의 대사물질인 6탄당 및 특히, PPP의 산화적 분기점으로 이동할 수 있는 글루코스 6-포스페이트(글루코스-6-P)를 축적시킨다.
트리오스 포스페이트 이소머라제 단계 이전의 효소 활성을 붕괴시키거나 이의 활성을 감소시키기 위해 표적물이 되는 해당 과정의 효소는 글루코스-6-포스페이트 합성 이후의 효소들, 특히 글루코스 6-이소머라제(또한, 포스포글루코이소머라제로서 공지됨), 포스포프럭토키나제 및 알돌라제이다. 이러한 변형을 위해 바람직한 표적물은 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 및/또는 포스포프럭토키나제 유전자이다. 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자의 활성이 감소되거나 결핍된 미생물 균주는 글루코스상에서 불량하게 증식하는 경향이 있기 때문에 프럭토스가 발효동안에 보조 기질로서 사용될 수 있다. 또한 발효는 생산 균주가 프럭토스 집적 배지상에서 증식하는 단계와 목적하는 PPP 당 또는 이로부터 유도된 생성물이 축적되는 생산 단계동안만 글루코스가 주입되는 단계를 포함한 2단계로 수행될 수 있다. 글루코키나제 유전자 또는 헥소키나제 유전자의 활성 저하는, 이들 효소가 PPP의 산화적 분기점의 첫번째 효소인 글루코스-6-데하이드로게나제의 기질인 글루코스-6-P를 생산하여 PPP의 산화적 분기점으로의 유입을 증가시키는 것이 바람직한 경우에는 바람직하지 않다. 또한, 해당 과정 효소의 세포내 활성은 돌연변이 유발, 프로모터를 변화시키고/시키거나 화학 억제제를 사용함에 의해 저하될 수 있고, 목적하는 돌연변이체는 효소 분석 또는 기질 증식 스크리닝 분석을 기초로 선별된다. 해당 과정의 효소 각각의 존재 또는 부재의 특징을 규명하기 위한 시험관내 효소 분석은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
PPP로의 탄소 유입을 증가시키기 위한 대안적인/상보적인 방법은 PPP의 산화적 분기점의 첫번째 효소인 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 과발현시키는 것이다. 특히, 이종성 젖산 발효균(예: 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)) 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) (GenBank 승인번호 제M60615호) 기원의 유전자가 적합한데 그 이유는 이들이 많은 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제에 전형적인 알로스테릭 억제에 대한 민감성이 저하되어 있기 때문이다[문헌참조: Sugimoto S. & Shio, I., Agric. Biol. Chem. 51:101-108(1987)]. PPP의 산화적 분기점의 두번째 효소인 6-포스포글루코네이트를 암호화하는 유전자의 과발현이 본 발명의 범위내에 있는 것으로 사료된다. 당해 효소의 높은 활성은 세포가 6-포스포글루코네이트를 축적시키고 글루콘산을 배양 배지로 분비시키는 것을 방해할 수 있다.
본 발명을 수행하기 위해 유리하게 불활성화될 수 있는 또 다른 그룹의 유전자는 숙주 세포에 의한 당 취득을 조절하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 세균 숙주에서, 선택적인(키나제 기본) 당 취득 시스템을 도입하는 것과 연계된 돌연변이 유발에 의해 야생형 당 취득 시스템(PTS 시스템으로서 공지됨)을 불활성화시켜 세포의 전체 대사 균형 및 에너지 균형을 개선시킬 수 있다. 또한 본 발명의 범위내에서 소위 "조인자 불균형"이라는 현상을 일으키는 경향이 있는 숙주에서, PPP의 산화적 분기점의 효소와 조인자(전형적으로, NADP+)에 대해 경쟁하는 효소를 불활성화시키는 대안이 고려중이다. 조인자 불균형은 하기에 추가로 논의된다.
따라서 본 발명의 미생물 숙주내에서 발현되거나 과발현되는 것이 유리한 유전자 세트는 본 발명의 특정 수행 양태에 의존할 것이다. PPP의 산화적 분기점의 유전자 및, 특히 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제의 유전자를 과발현시키는 것이 유용하지만 대부분의 수행 양태에 있어서 반드시 요구되지는 않는다. 조인자 불균형 현상이 일어날 수 있는 특 정 숙주(많은 효모)에서, 이종성 또는 동종성 트랜스하이드로게나제의 발현이 유리할 수 있다. 또한, 트랜스하이드로게나제의 효과는 상이한 조인자(NADPH 및 NAD)를 사용하지만 바람직하게 세포질에서 동일한 반응을 촉매하는 한쌍의 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 숙주에 제공함으로써 성취될 수 있다.
본 발명이 세균 숙주에서 수행되고 이의 고유 PTS-기본 당 취득 시스템이 불활성화되는 경우 특히, 글루코키나제 또는 헥소키나제 효소를 과발현시키는 것이 유용하다. 몇몇 숙주에서, 동종성 또는 이종성 당-포스페이트 포스파타제의 발현 또는 과발현이 요구될 수 있거나 한편 5탄당 포스페이트를 상응하는 천연(즉, 탈인산화된) 당으로 상당히 전환시키는데 요구될 수 있다. 크실리톨 데하이드로게나제, D-아라비톨 데하이드로게나제, 리비톨 데하이드로게나제, L-푸코스 이소머라제, D-만노스 이소머라제, D-크실로스 이소머라제, 케토스 3-에피머라제등을 암호화하는 유전자를 포함하는 다수의 다른 유전자들이 본 발명의 특정 수행 양태에 있어서 사용될 수 있다.
상기된 변형과 같은 미생물 숙주내 특정 공지된 효소의 활성을 저하시키거나 증진시키는 것을 목적으로 하는 특이적 유전학적 변형 뿐만 아니라, 미지의 효소/메카니즘을 통해 작용하는 돌연변이를 본 발명을 수행하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 펜토스/펜툴로스 생산 재조합 숙주의 발효 생성물의 범위가 본 발명에서 밝혀진 바와 같은 특정 돌연변이 선별/스크리닝 프로토콜을 적용하여 매우 강력하고 특이적으로 변화될 수 있다.
본 발명이 글루코스를 PTS 시스템을 통해 취득하고 인산화시키는 세균 숙주에서 수행되는 경우 글루코스 취득 시스템을 변형시키는 것이 유리하다. PTS 시스템이 작용하기 위해서는 해당 과정의 생성물인 포스포에놀피루베이트가 계속적으로 공급되어야 한다. PTS 시스템이 글루코키나제 또는 헥소키나제 기본 글루코스 취득 시스템 및 인산화 시스템으로 대체되는 경우, 포스포에놀피루베이트보다는 ATP가 글루코스 취득 및 인산화를 위한 에너지를 공급한다. 포스포에놀피루베이트 같지 않게 ATP는 PPP의 산화적 분기점에 의해 생성되는 NADPH를 사용하는 호흡 연쇄 반응을 통해 재보충될 수 있다. 따라서, 이러한 시스템은, PPP를 통해 헥소스-포스페이트를 펜토스 포스페이트로 전환시키는 본 발명의 미생물 숙주 세포들에게 보다 우수한 에너지 균형을 제공함에 따라서 보다 높은 수율의 목적하는 5탄당을 수득한다. PTS 기본 글루코스 취득 및 인산화 시스템을 키나제 기본 시스템으로 대체하기 위한 기술은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[문헌참조: Flores, N., et al., Nature Biotechnology 14:620-623(1996)]. 본 발명은 또한 변형된 글루코스 취득 메카니즘에 관한 것이고, 이러한 기작은 비. 서브틸리스 glcUgdh 오페론을 과발현시켜 글루코스로부터 유도된 중간체 및 글루코스가 펜토스 포스페이트로 유입되는 것을 증가시킨다. 이러한 숙주는 특히, 예를 들어, 상기된 바와 같이 크실리톨을 제조하는 방법에 있어서, 하나 이상의 펜토스 포스페이트 전환 중간체의 생산 수준이 증진된 숙주를 사용하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 본 발명은 또한 유전학적으로 변형되어 glcUgdh 오페론의 발현이 증진된 숙주에 관한 것이다.
트랜스하이드로게나제 활성이 매우 낮거나 없고 호흡 연쇄 반응을 통해 NADPH를 재산화시키기 위한 기구가 없는 숙주에서 PPP의 활성은 때때로 "조인자 불균형"으로서 언급되는 현상을 나타낼 수 있다. 조인자 불균형은 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제에 대한 세포내 NADP+의 공급을 제한하기 때문에, PPP의 산화적 분기점을 통한 탄소 유입을 감소시킨다. 이러한 경우에, 또 다른 부분의 세포 메카니즘에서 NADP+ 에 대한 수요를 감소시키거나 세포가 예를 들어, NAD+(NADH는 NADPH 보다 더욱 효율적으로 호흡 연쇄 반응을 통해 재산화된다)에 의해 NADPH를 재산화시킬 수 있도록 하는 추가의 유전학적 변형이 본 발명의 방법을 수행하기 위해 숙주에 가해질 수 있다.
따라서, 트랜스하이드로게나제 유전자의 발현은 상기된 바와 같은 본 발명의 특정 숙주의 수행능을 증가시키는데 유용하다. 또한, 동일한 기질에 작용하지만 2개의 상이한 조인자(NADH 및 NADPH)를 사용하는 한 쌍의 데하이드로게나제를 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있다. 이러한 쌍은 NADH-NAD+과 NADPH-NADP+ 둘 다의 풀의 산화 환원 상태를 평형화시키는 "쿠애지-트랜스하이드로게나제"로서 작용한다[문헌참조: Aristidou et al., WO 99/46363]. 특히 적합한 쌍의 데하이드로게나제는 NADH- 및 NADPH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제이다. 예를 들어, 효모에서, NADPH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH1 유전자에 의해 암호화됨)는 야생형 염색체 유전자로부터 충분히 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 하나의 유전자, 즉 NADH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자[예를 들어, 효모 GDH2 유전자(문헌참조: Miller, S.M., et al., Mol. Cell Biol. 11:6229-47(1991); Boles, E., et al., Eur. J. Biochem. 217(1):469-77)(1993)]의 과발현은 숙주 세포내에서 조인자 불균형을 완화시키는데 충분하다[문헌참조: Aristidou et al., WO 99/46363].
PPP를 통한 유입은 PPP의 산화적 분기점의 효소와 NADP+에 대해 경쟁하는 세포 효소를 불활성화시켜 증가될 수 있다. 예를 들어, NADP-의존성 시트레이트 데하이드로게나제 유전자 IDP2[문헌참조: Loftus, T.M., et al., Biochemistry 33:9661-9667(1994)]를 불활성화시켜 PPP를 통한 대사물의 유입에 대한 효과를 자극할 수 있다.
NADPH는 또한 숙주세포에게 적합한 공동 기질 및 NADPH를 사용하여 공동 기질을 환원시킬 수 있는 효소를 제공하여 재산화될 수 있다. 이러한 공동 기질의 전형적인 예는, NAD(P)H-의존성 크실로스 리덕타제에 의해 크실리톨로 환원될 수 있는 크실로스이다. 적합한 크실로스 리덕타제를 암호화하는 유전자는 다수의 미생물로부터 클로닝되었다[문헌참조:Amore, R., et al., Gene 109(1):89-97(1991); Billard, P., et al. Gene 162(1):93-97(1995)].
조인자 불균형 조건하에서 PPP의 산화적 분기점을 통한 유입이 감소되는 문제점에 대한 또 다른 해결책은 본 발명의 숙주내에서 조인자로서 NAD+를 사용할 수 있는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 및/또는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 이종성 유전자를 발현시키는 것이다. 이러한 성질을 갖는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 적합한 예는 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 류코노스톡 메센테로이드 기원의 zwf 유전자이다[문헌참조: Ma, J.F., et al., J. Bacteriol. 180(7):1741-1749; Lee, W.T., et al., J. Biol. Chem. 266:13028-13034(1991)]. 또한, 본 발명을 수행하는데 유용한 NAD+-특이적 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제가 공지되어 있다[문헌참조: Ohara, H., et al., Bioschi. Biotech. Biochein. 60(4):692-693(1996)].
조인자(NADH)의 산화된 형태 보다 환원된 형태가 제한되는 경우 미생물 세포에서 조인자 불균형이 "역전"될 수 있다. 본 발명의 범위내에서, 상기 문제점은 전형적으로 5탄당 알콜이 상응하는 케토 5탄당의 효소적 환원에 의해 형성되는 표적 생성물인 경우 일어난다. 이 경우에, NADH에 대해 경쟁하는 효소들을 암호화하는 야생형 유전자를 불활성화시키는 것이 유용하다. 효모내에서 특히 적합한 예는 글리세롤 생산에 관여하는 한 쌍의 NADH-의존성 데하이드로게나제 GPD1 및 GPD2이다[문헌참조: Ansell R., et al., EMBO J. 16:2179-2187(1997)]. 비. 서브틸리스에서, 바람직한 유전학적 변형은 아세토인 리덕타제 유전자를 불활성화시켜 당 알콜 생산을 위한 NADH의 공급을 개선시키는 것이다.
몇몇 숙주(예를 들어, 효모)에서 본 발명을 수행하는데 유리한 또 다른 유전학적 변형은 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 DOG1 유전자와 같은 당-포스페이트 포스파타제 유전자를 발현 또는 과발현시키는 것이다[문헌참조: Sanz, P., et al., Yeast 10:1195-202(1994)]. 상기 유전자는 리보스 5-포스페이트 및 리불로스 5-포스페이트와 같은 5탄당에도 활성인 포스파타제를 암호화하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명자는 상기 효소가 또한 크실룰로스 5-포스페이트에 대해 활성임을 밝혔고 본원에서, DOG1의 과발현이 5탄당 및 상응하는 폴리올, 특히 리비톨의 축적을 증가시킴을 기술하였다. 본 발명을 수행하는데 유용한 또 다른 유형의 포스파타제는 "저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제"라는 명칭하에 공지되어 있다[문헌참조: Chernoff, J. and Li, H.C., Arch. Biochem. Biophys. 240:135-145(1985)]. 본 발명자는 우연히 이들 효소가 또한 5탄당 포스페이트에 활성임을 발견하였다. 에스. 세레비지애의 LPT1 유전자의 과발현[문헌참조: Ostanin K., et al., J. Biol. Chem. 270:18491-18499(1995)]은 5탄당 및 당 알콜의 생산을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명을 수행하는데 적합한 상기 부류의 또 다른 유전자가 효모 자이고사카로마이세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii)로부터 분리되었고 본원에 기술되어 있다. 본 발명자에 의해 밝혀진 바와 같이 비. 서브틸리스와 같은 특정 숙주의 세포가 D-리보스 5-포스페이트, D-리불로스 5-포스페이트 및 D-크실룰로스 5-포스페이트를 포함하는 다수의 5탄당 포스페이트를 용이하게 탈인산화시키기 때문에, 당해 숙주에서 포스파타제의 발현이 필요하지 않을 수 있다.
본 발명을 수행하는데 유용한 또 다른 유형의 유전학적 변형은 5탄당을 상응하는 당 포스페이트로 전환시키는 키나제를 암호화하는 유전자의 활성을 불활성화시키거나 감소시키는 것이다. 이러한 유용한 유전학적 변형의 예는 크실룰로키나제를 암호화하는 유전자를 불활성화시키는 것이다. 본 발명자는 본원에서 상기 유전자를 불활성화시켜 크실룰로스 및 상응하는 폴리올인 크실리톨의 수율을 증가시 킬 수 있음을 밝혔다. 유사하게, 리불로스 또는 리비톨이 표적 생성물인 경우 리불로키나제를 불활성화시키는 것이 유용하다.
본 발명의 재조합 균주에 의해 생산되는 5탄당과 같은 생성물의 범위는 발효 조건에 의해 조절되거나 추가로 변형될 수 있다. 가장 중요한 것은 배양 배지에 용해된 산소의 농도가 케토스 및 상응하는 당 알콜 사이의 균형에 영향을 미친다는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 비. 서브틸리스 균주가 고도로 통기된 조건하에서 배양되는 경우 이들은 주요 5탄당 발효 생성물로서 펜툴로스를 생산한다. 폴리올은 미세호기성 조건하에서의 주요 발효 생성물이다.
새로운 재조합 미생물 숙주를 제조하기 위한 유전학적 방법 뿐만 아니라 본 발명은 당해 숙주의 발효 조건을 조정하여 생성물 범위를 조절하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따라, 본 발명의 숙주에 의해 생산되는 당 대 상응하는 당 알콜의 비율은 미생물 배양물의 통기를 조정하여 광범위한 범위내에서 변화될 수 있다.
목적하는 생성물의 생산 또는 생성물의 선별을 위해 발효가 최적화되거나 안되든간에 본 발명의 방법에 있어서 숙주의 발효를 위한 탄소원은 몇몇 단계가 공통된, 즉 글루코스의 대사를 위한 해당 과정 또는 PPP 경로가 겹치는 경로에 의해 대사될 수 있는 글루코스 또는 또 다른 6탄당이 될 수 있다. 이러한 또 다른 당의 예는 프럭토스 및 만노스를 포함한다. 본 발명의 범위내에서 탄소원으로서 유용한 것으로 간주되는 것은 6탄당, 예를 들어, 슈크로스, 락토스, 말토스, 라피노스, 이눌린, 전분등을 포함하는 올리고당 및 다당류이다. 이들 탄소원은 별도로 사용되거나 혼합물 형태, 예를 들어, 전위당 또는 고-프럭토스 시럽 형태로 사용될 수 있다. 펜토스는 또한 기질 당 혼합물의 일부로서 사용될 수 있다. 본 발명의 구성에서, 펜토스의 역할은 제한되어 주요 기질로서 보다는 공동 기질(예를 들어, NADP+의 재생을 위한 "전자 구인체"로서 작용한다)로서 사용된다.
추가의 양태에서, 재조합 XPDH 유전자 서열을 사용하는, XPDH 유전자를 발현하거나 과발현하는 숙주가 작제된다. 이러한 서열은 본 발명자에 의해 엘. 람노수스(L. rhamnosus) 및 알. 할로두란스(R. halodurans)에서 동정되었다. 씨. 디피실(C. difficile) 기원의 유사한 서열(서열 51, 52 및 53)이 또한 이러한 관점에서 유용할 것이다. 당해 숙주는 특히, 크실룰로스-5-P가 XPDH에 의해 크실리톨-1-P로 전환되고 이어서 크실리톨-1-P가 포스파타제에 의해 크실리톨로 전환되는 경로에서 크실리톨을 생산하는데 유용하다. 실시예(실시예 28)에 나타낸 바와 같이, 상기 균주의 배양액은 크실리톨을 함유하지만 크실리톨은 대조군 균주의 배양 배지에서 검출되지 않는다.
또 다른 양태에서, 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자가 최초로 클로닝되었고 상기 유전자 발현용 숙주가 작제되었다. 이. 아비움(E. avium) 기원의 서열은 전형적인 리보솜 결합 부위에 이어서 352개 코돈(서열 68)의 개방 판독 프레임을 함유한다. 추론된 아미노산 서열은 서열 69로 제공된다. 이러한 효소는 가역적으로 작용하여 D-아라비톨-5-포스페이트를 D-크실룰로스-5-포스페이트로 전환시키거나 이와 반대로 전환시킨다. 따라서, 본 발명의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제는 D-크실룰로스-5-포스페이트를 D-아라비톨 5-포스페이트로 전환시켜 D-아라비톨(CAS 번호 488-82-4)(또한 D-아라비니톨로 공지됨)을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 본래에 소르비톨 데하이드로게나제로서 보고된 서열이지만 본 발명자에 의해 비. 할로두란스 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제인 것으로 밝혀진 서열 70과 같은 서열을 사용하여 사용될 수 있는 또 다른 서열을 동정할 수 있다.
본 발명이 수행될 수 있는 숙주의 범위는 세균 및 진균류를 포함한다. 진균류는 바람직하게 효모이다. 특히, 사카로마이세스 세레비지애 효모 또는 바실러스 서브틸리스 그람 양성 세균과 같은 GRAS 상태의 미생물 종이 본 발명의 숙주로서 적합하다. 또 다른 적합한 숙주는 예를 들어, 사카로마이세스 속, 자이고사카로마이세시 속, 캔디다(Candida) 속 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 수많은 효모 종[예를 들어, 자이고사카로마이세스 로욱시, 캔디다 우틸리스(Candida utilis) 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)], 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 페니실리움(Penicillium) 속 또는 트리코더마(Trichoderma) 속등의 필라멘트형 진균류[예를 들어, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roqueforti), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)] 또는 에스케리치아, 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스, 젖산 세균등의 다양한 종과 같은 세균[예를 들어, 에스케리치아 콜리, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyliquefaciens), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) 및 뉴로스포라(Neurospora), 뮤코르(Mucor) 및 피사리움(Fisarium) 종]이다.
본 발명을 수행하기 위해 바람직한 유전학적 변형 기술은 재조합 DNA 기술(유전자 조작)이다. 이러한 기술은 2가지 유형의 작업을 위해 주로 사용된다. 첫번째 유형의 작업은 선별된 숙주에서의 작용성 야생형 유전자를 불활성화시키는 것이다. 또 다른 정반대의 작업은 본 발명의 숙주에서 불충분한 수준으로 발현되거나 발현되지 않는 효소를 암호화하는 이종성 유전자를 도입하고 발현시키는 것이다. 변형된 후자 작업은 최적 이하의 수준으로 야생형 균주에서 발현되는, 숙주의 동종성 유전자를 과발현시키는 것이다.
본 발명의 숙주의 야생형 유전자의 표적화된 불활성화는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자에 대해 특이적인 안티-센스 RNA를 숙주 세포내에서 생산할 수 있다. 전사 활성화 인자 또는 항-종결인자 등과 같이 표적 유전자의 발현을 위해 요구되는 "보조" 유전자를 돌연변이시킬 수 있다. 유전자의 염색체성 야생형 복사물 및 동일 유전자의 시험관내 작제된 불활성화된 복사물간의 동종성 재조합을 기초로 하는 유전자 불활성화("유전자 파괴"로서 공지됨) 기술이 본 발명의 "유전자 불활성화 작업"을 수행하기 위한 바람직한 방법이다. 이러한 기술은 당해 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 표적 유전자의 시험관내 불활성화를 위한 바람직한 방법은 상기 유전자의 클로닝된 복사물을 포함하는 플라스미드를 작제하는 것이다. 이어서 암호화 서열은 파괴되거나 암호화 서열의 일부가 선별 유전자 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자 또는 숙주의 영양 요구성 돌연변이를 보충하는 유전자)를 암호화하는 DNA로 대체된다. 이어서 작제된 플라스미드 또는 이의 일부를 사용하여 선별된 숙주를 형질전환시켜 항생제에 대한 내성을 부여하거나 원영양주가 되게 한다. 재조합 DNA 방법에 추가로, 무작위 화학적 돌연변이, 방사선 유도 돌연변이 또는 자연 돌연변이 유발에 이어서 표적 돌연변이체의 선별을 기초로 하는 통상적인 유전학적 기술이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 이종성 유전자의 발현 또는 동종성 유전자의 과발현은 다수의 방법에 의해 성취될 수 있다. 바람직한 방법은 선별된 숙주에서 작용하는 프로모터에 이어서 (과-) 발현될 유전자의 암호화 영역 및 전사 종결 시그날을 포함하는 소위 "발현 카세트"를 시험관내에서 작제하는 것이다. 물론, 발현될 유전자의 고유 프로모터가 선별된 숙주에서 활성인 경우, 암호화 서열 및 이의 양쪽의 5' 및 3' 영역 둘다를 포함하는 변형되지 않은 유전자는 특정 변형없이 상기 "카세트"를 제공할 수 있다. 이어서 발현 카세트는 숙주에 의해 안정하게 유지되거나 염색체로 통합되는 다중 복합물의 플라스미드의 일부로서 본 발명의 숙주에 도입될 수 있다.
많은 상이한 프로모터는 이러한 발현 카세트에서 유용할 수 있다. 바람직하게, 이러한 프로모터는 이들이 사용되는 숙주에서 배지 강도에 대해 강력해야만 한다. 프로모터는 조절될 수 있거나 항상성일 수 있다. 바람직하게, 글루코스에 의해 억제되지 않거나 배양 배지내 존재하는 글루코스에 의해 단지 약하게 억제되는 프로모터가 사용되어야만 한다. 많은 적합한 프로모터중 몇개를 언급한다면 비.서브틸리스 tsr 유전자(프럭토스 바이포스페이트 알돌라제를 암호화함)의 프로모터 또는 사카로마이세스 세레비지애 효모 기원의 GAPDH(글리세르알데하이드-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화함)의 프로모터[문헌참조: Bitter G.A., Meth. Enzymol. 152:673-684(1987)]와 같은 해당 유전자의 프로모터를 언급할 수 있다. 또 다른 강력한 프로모터, 예를 들어, 제빵용 효모의 ADHI 프로모터[문헌참조: Ruohonen L., et al., J. Biotechnol. 39:193-203(1995)], 포스페이트 고갈 유도 프로모터, 예를 들어, 효모의 PHO5 프로모터[문헌참조: Hinnen, A., et al., in Yeast Genetic Engineering, Barr, P.J., et al. eds, Butterworths(1989)], 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 기원의 알칼린 포스파타제 프로모터[문헌참조: Lee. J. W. K., et al., J. Gen. Microbiol. 137:1127-1133(1991)]를 언급할 수 있다. 파아지, 및 게놈 DNA의 발현 라이브러리를 작제하여 예를 들어, 에스. 세레비지애 기원의 상응하는 유전자와 유사한 임의의 목적하는 당 대사 유전자가 보상될 수 있다.
본 발명의 미생물 균주의 유용한 특징은 공지된 기능을 갖는 유전자를 불활성화시키거나 과발현시켜 성취되는 것에 제한되지 않는다. 이들 균주의 특징은 바람직하게 화학적으로 무작위 유도되거나 자발적인 돌연변이 유발에 이어서 개선된 성질을 갖는 균주의 선별에 의해 성취된다. 예상치않게 본 발명자에 의해 발견된 특히 효율적인 하나의 선별 방법은 트랜스케톨라제 유전자내 돌연변이를 함유한, 증식 성질이 개선된 균주의 돌연변이체를 수득하는 것을 기초로 한다. 상당 비율의 상기 돌연변이체가 모균주보다 글루코스를 상이한 범위의 5탄당으로 전환시킨다는 것이 밝혀졌다. 특히, D-크실룰로스의 수율이 상기 방법을 통해 상당히 증가될 수 있다. 돌연변이체는 다양한 당 및 PPP 중간체의 분석 및 또한 PPP 효소 활성의 분석으로 특징화될 수 있다. PPP 효소들의 활성은 예를 들어, 문헌[참조: Alexander, M.A. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 29:282-288(1988)]에 기술된 바와 같은, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
숙주내에서 본 발명의 방법에 의해 생산되는 발효 생성물은 별도로(분리된 형태) 또는 또 다른 발효 생성물, 또는 또 다른 당 또는 당 알콜의 혼합물(즉, 추출물 또는 부분적으로 정제된 형태)로서 수득될 수 있다. 5탄당 및 이의 당 알콜의 정제 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, D-크실로스는 셀룰로스 가공의 부 주류로부터 분리될 수 있고 수소화시켜 크실리톨을 생산할 수 있다. 이들 화합물(배양 배지 기원의 D-리보스-5-포스페이트, 리불로스-5-포스페이트, D-크실룰로스-5-포스페이트, D-리불로스, D-크실룰로스, D-아라비노스, D-릭소스, D-크실로스, D-아라비톨, 리비톨 및 크실리톨을 포함)의 정제 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고 다양한 형태의 칼럼 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 흡착, 역상 등) 및 결정화를 포함한다. 난가용성인 바륨 또는 칼슘 염을 침전시켜 5탄당 포스페이트를 정제하는데 사용할 수 있다.
클로닝된 XPDH 유전자 및 단백질
크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제(XPDH)를 암호화하는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 유전자가 클로닝되고 해독되었다. 플라스미드 pBK(LRXPDH)상에 제공된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 서열 48에 나타낸다. 당해 서열은 349개 아미노산(서열 49)의 개방 판독 프레임을 포함하고 통상적이지 않은 개시 코돈 TTG로 시작한다.
엘. 람노수스 XPDH 서열의 추론된 아미노산 서열은 여러개의 다른 중간-크기의 데하이드로게나제, 특히, 예를 들어, 비. 할로두란스 및 씨. 디피쿨 기원의 서열과 상동성이지만 이의 기질은 공지되어 있지 않거나 실수로 잘못 할당되어 있다. 예를 들어, 서열 50은 비. 할로두란스 기원의 XPDH의 아미노산 서열(GenBank PID:g1072799)이지만 소르비톨 데하이드로게나제인 것으로 목록화되어 있다. 서열 51 내지 53은 부연 설명되어 있지 않다. 서열 51은 엘. 람노수스 XPDH와 약간의 상동성을 나타내는 씨. 디피실 기원의 서열이다. 서열 52는 씨. 디피실과 유사한 서열이다. 서열 53은 씨. 디피실 기원의 추가로 유사한 서열이다. 씨. 디피실 효소는 엘. 람노수스 XPDH와 다음과 같은 상동성을 갖는다; 서열 51: 52% 동일한 잔기, E-값(NCBI WWW 인터넷 사이트에서 제공된 BLAST 알고리듬에 의해 계산됨) e-109, 서열 52: 37% 동일한 잔기, E-값(NCBI WWW 인터넷 사이트에서 제공된 BLAST 알고리듬에 의해 계산됨) e-68, 서열 53: 37% 동일한 잔기, E-값(NCBI WWW 인터넷 사이트에서 제공된 BLAST 알고리듬에 의해 계산됨) e-65.
XPDH로서 작용하는 것으로 실험적으로 입증된 비. 할로두란스 효소의 상동성은 보다 낮은 수치의 상동성을 갖는다; 서열 50: 36% 동일한 잔기, E-값(NCBI WWW 인터넷 사이트에서 제공된 BLAST 알고리듬에 의해 계산됨) e-63.
클로닝된 APDH 유전자 및 단백질
아라비톨 포스페이트 데하이드로게나제(APDH)를 암호화하는 이. 아비움 유전자가 클로닝되고 해독된다. 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 68에 나타낸다. 서열은 349개의 아미노산(서열 69)의 개방 판독 프레임을 포함한다.
이. 아비움 APDH 서열의 추론된 아미노산 서열은 여러개의 중간 크기의 데하이드로게나제의 서열, 특히, 예를 들어, 비. 할로두란스의 소르비톨 데하이드로게나제인 것으로 보고된 서열(서열 70)과 상동성이다.
폴리뉴클레오타이드
달리 언급되지 않는다면, 본원의 DNA 분자의 서열 분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열은 실시예에 기술된 바와 같이 결정되고, 이와 같이 결정된 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열을 해독하여 예상된다. 따라서, 상기 방법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오타이드 서열은 약간의 오류를 포함할 수 있다. 자동 분석에 의해 결정된 뉴클레오타이드 서열은 통상적으로 약 35% 이상, 예를 들어, 55% 이상, 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상 또는 95% 이상 동일하다. 보다 통상적으로, 이들은 서열 분석된 DNA 분자의 실질적인 뉴클레오타이드 서열과 약 80% 또는 90% 동일하다. 실질적인 서열은 당해 기술분야에 널리 공지된 수동식 DNA 서열 분석법을 포함한 또 다른 방법에 의해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 실질적인 서열과 비교하여, 결정된 뉴클레오타이드 서열중 1개의 삽입 또는 결실은 뉴클레오타이드를 해독하는데 있어서 프레임을 이동시켜 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 예상되는 아미노산 서열은 이러한 1개의 삽입 또는 결실된 부위에서 상이해지기 시작하여, 서열 분석된 DNA 분자에 의해 실질적으로 암호화된 아미노산 서열과 완전히 상이해진다.
핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 "뉴클레오타이드 서열"은 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해서는 데옥시리보뉴클레오타이드의 서열을 의미하고 RNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해서는 리보뉴클레오타이드의 상응하는 서열(A, G, C 및 U)을 의미하는데 여기서, 명시된 데옥시리보뉴클레오타이드 서열중의 티미딘 데옥시리보뉴클레오타이드(T)가 리보뉴클레오타이드 우리딘(U)로 대체된다.
"작용성"이란 뉴클레오타이드 서열이 동일 활성, 예를 들어, 기술된 효소와 동일한 반응을 구동시키는 효소를 암호화하는 또 다른 상동성 뉴클레오타이드 서열과 동일한 기능을 수행함을 의미한다.
도면 및 서열 목록에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 같은 본원에 제공된 정보를 사용하여, XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드 또는 이들의 융합 단백질의 키메릭 작제물을 암호화하는 본 발명의 핵산 분자가 염색체 DNA 또는 출발 물질로서 mRNA를 사용한 cDNA를 클로닝하기 위한 표준 클로닝 방법 및 스크리닝 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 본 발명의 실례로서 실시예에 기술된 XPDH 또는 APDH 핵산 분자가 엘. 람노수스 기원의 염색체 DNA 라이브러리에서 발견되었다.
지적된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA 형태, 또는 예를 들어, 클로닝하여 수득되거나 합성으로 제조된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함한 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있다. 일본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 쇄로서 공지된 암호화 쇄일 수 있거나, 안티-센스 쇄로서 언급되는 비-암호화 쇄일 수 있다.
"분리된" 핵산 분자(들)는 이의 천연 환경으로부터 추출된 핵산 분자, 즉, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터내에 함유된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가의 예는 이종성 숙주 세포내 유지된 재조합 DNA 분자 또는 용액중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 추가로 합성으로 제조된 분자를 포함한다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 본 발명의 XPDH 또는 APDH, 또는 이들을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(ORF)를 포함하는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 가공되어 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드 또는 이의 전사체에 추가의 활성 또는 기능을 제공하거나, 숙주 생산후에 XPDH 또는 APDH를 정제하는데 도움이 될 기능을 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩타이드는 융합된(마커를 함유하는) 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 펩타이드와 같은 마커 서열과 융합될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 마커 서열은 무엇보다 pQE 벡터(Qiagen, Inc)내에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩타이드이고, 이들 대부분은 시판되고 있다. 문헌[참조: Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)]에 기술된 바와 같이 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질에 대한 간편한 정제법을 제공한다. "HA" 태그는 문헌[참조: Wilson et al., Cell 37:767-778(1984)]에 기술된, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 또 다른 펩타이드로서 정제에 유용하다.
한 양태에서, XPDH 또는 APDH 암호 서열은 시그날 서열을 암호화하는 서열에 작동적으로 연결되고 해독되는 경우 시그날 서열은 생산된 XPDH 또는 APDH를 세포내 또는 세포외의 목적하는 위치로 이동하게 한다. 이러한 시그날 서열은 XPDH 또는 APDH가 세균 숙주 또는 진핵 숙주 세포에서 생산되느냐에 따라 세균성 또는 진핵성일 수 있다.
본 발명은 서열 48 또는 서열 68에 나타낸 바와 같이 XPDH 또는 APDH에 대한 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 목적하는 이의 단편 및 상기된 서열과 실질적으로 상이하지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 여전히 서열 49 또는 서열 69에 나타낸 바와 같은 XPDH 또는 APDH 단백질 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 물론, 유전자 코드는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 당해 분야의 기술자는 통상적으로 이러한 축퇴성 변이체를 제조할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기된 핵산 분자 뿐만 아니라 상기 서열과 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체와의 동일계 하이브리드화에 의한 유전자 맵핑 및, 예를 들어 노던 블롯 분석에 의해 다양한 종에서 XPDH 또는 APDH 유전자 발현을 검출하기 위한 프로브로서 유용하다.
본 발명은 추가로 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 말단으로부터다양한 잔기가 결실되었지만 판독 프레임을 보유하여 여전히 XPDH 또는 APDH 촉매 활성을 갖는 XPDH 또는 APDH를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서 이러한 폴리뉴클레오타이드는 완전한 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 다양한 잔기가 결실되었지만 XPDH 또는 APDH의 촉매 활성을 보유하고 있는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하고 있다.
따라서, 본 발명은,
(1) 서열 49의 아미노산 서열을 갖는 엘, 람노수스 XPDH 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 특히, 서열 48의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 69의 아미노산 서열을 갖는 이. 아비움 APDH 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 특히 서열 68의 폴리뉴클레오타이드 서열;
(2) XPDH 또는 APDH 서열의 유용한 펩타이드 단편(이러한 유용한 단편은 촉매적으로 활성인 XPDH 또는 APDH 단백질이고 효소 작용성인 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및
(3) 상기한 바와 같이 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드를 암호화하지만 N-말단 메티오닌이 없는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본원에 기술된 분리된 핵산 분자의 단편은 목적하는 성질을 보유하거나 목적하는 성질 또는 활성을 보유한 폴리펩타이드를 암호화하고 있다. 상기된 바와 같이 분리된 핵산 분자의 단편은 길이가 약 15개 이상의 뉴클레오타이드(nt), 및 보다 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오타이드 및 심지어 보다 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오타이드인 단편이고 이것은 본원에서 논의된 바와 같이 프로브 및 프라이머로서 유용하거나 융합 단백질 작제물에 목적하는 모티프 또는 도메인을 제공한다. 물론, 길이가 50 내지 300개의 뉴클레오타이드, 또는 600개의 뉴클레오타이드와 같은 보다 큰 단편이 또한 본 발명에 있어서 유용하고 서열 48 또는 68에 제시된 DNA의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 49 또는 69에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 모두는 아니지만 이의 대부분에 상응하는 단편이다. 서열 48 또는 68의 서열과 비교하는 경우 길이가 20개 이상의 뉴클레오타이드인 단편은 예를 들어, 서열 48 또는 68에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로부터 20개 이상의 연속적인 염기를 포함하는 단편이다.
특히, 본 발명은 서열 48 또는 68에 제시된 부분을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 서열 49 또는 69에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 아미노 말단 메티오닌이 없는 XPDH 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 고려된다. 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 또한 제공되고, 이러한 폴리펩타이드는 서열 49 또는 69에 제시된 아미노산 서열의 2번 위치에서 시작하고 아미노 말단 메티오닌이 없는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기된 본 발명의 핵산 분자내 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 바람직하게는 전부에 하이브리화하고 특히 서열 48 또는 68 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"은 50% 포름아미드, 5 x SSC(750mM NaCl, 75mM 삼나트륨 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 변성되고 절단된 연어 정자 DNA 20g/ml을 포함하는 용액중에서 42℃에서 밤새 항온처리함에 이어서 여과기를 약 65℃에서 0.1 x SSC중에서 세척함을 의미한다.
폴리뉴클레오타이드의 "일부"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리뉴클레오타이드의 약 15개 이상의 뉴클레오타이드(nt) 및 보다 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오타이드 및 심지어 보다 바람직하게는 약 30 내지 70(예를 들어, 50개)개의 뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 상기 논의되고 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 프로브 및 프라이머로서 유용하다.
"길이가 20개 이상의 뉴클레오타이드"인 폴리뉴클레오타이드의 일부는 예를 들어, 참조 폴리뉴클레오타이드(예: 서열 48 또는 68에 제시된 뉴클레오타이드 서열)의 뉴클레오타이드 서열 기원의 20개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 의미한다. 물론, 단지 폴리 A 서열, 또는 상보적인 일련의 T(또는 U) 잔기에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산 일부에 하이브리드화시키기 위해 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함되지 않는데, 그 이유는 이러한 폴리뉴클레오타이드가 특이성이 결여되어 있고 폴리(A) 연속 배열 또는 이의 상보체(예를 들어, 실질적인 임의의 이본쇄 cDNA 클론)를 함유하는 임의의 핵산 분자와 하이브리드화하기 때문이다.
지적된 바와 같이, XPDH 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 폴리펩타이드 그 자체를 암호화하는 서열; 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 및 프레-, 또는 프로- 또는 프레프로- 단백질 서열과 같은 추가의 서열(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열을 암호화하는 서열); 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 mRNA 프로세싱, mRNA의 리보솜 결합 및 이의 안정성에 중요한 역할을 하는 전사되지만 해독되지 않는 서열과 같은 인트론 및 5' 및 3' 비암호화 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 비암호화 서열과 함께 상기 언급된 추가의 암호화 서열의 부재 또는 존재하에, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열; 추가의 작용성을 제공하는 아미노산과 같은 추가의 아미노산을 암호화하는 추가의 암호화 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것이다.
변이체 및 돌연변이 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 추가로 XPDH의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호화하는, 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 천연 대립 형질 변이체와 같이 천연적으로 유발될 수 있다. "대립 형질 변이체"는 유기체의 염색체상에 해당 위치에 존재하는 여러 다른 형태들의 유전자중 하나를 의미한다[문헌참조: Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York(1985)]. 비천연적으로 유발되는 변이체는 당해 기술 분야에 공지된 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
이러한 변이체는 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성되는 변이체를 포함한다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 관여할 수 있다. 변이체는 암호화 영역, 비암호화 영역 또는 둘 다에서 변형될 수 있다. 암호화 영역의 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 발생시킬 수 있다. 특히, 이들중에 바람직한 변형은 XPDH 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 성질 및 활성을 변형시키지 않는 사일런트 치환, 부가 및 결실이다. 또한 이와 관련하여 바람직한 것은 보존적 치환이다.
본 발명의 추가의 양태는 폴리펩타이드(이의 아미노산 서열은 서열 49 또는 69에 제시된 전체 아미노산 서열과 35% 이상, 및 보다 바람직하게는 55%, 65%, 75%, 85% 및 95% 이상 동일하다)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 특히, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 여기에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 상기와 같이 하이드리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 염격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 T 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하지 않는다.
현실적인 과제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예를 들어, 서열 48에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 35%, 55%, 75%, 85% 또는 95% 이상 동일한지의 여부는 통상적으로 베스트피트 프로그램(Bestfit program)[Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711]과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 베스트피트는 문헌[참조: Smith and Waterman, Advances in Applied Mathmatics 2:484-489(1981)]의 국부적 상동성 알고리듬을 사용하여 2개의 서열간의 가장 최적의 상동성을 나타내는 절편을 검색한다. 베스트피트 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 참조 서열과 95% 동일한지의 여부를 결정하는 경우, 동일성 %가 완전한 길이의 참조 뉴클레오타이드 서열을 대상으로 계산될 수 있고 참조 서열중 총수의 5% 이하의 뉴클레오타이드 수의 상동성 차이가 허용될 수 있도록 계수를 설정한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 변이체는 이들이 XPDH 또는 APDH 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는지에 상관없이, 서열 48 또는 68에 나타낸 핵산 서열과 35%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자를 포함한다. 이것은 특정 핵산 분자가 XPDH 또는 APDH 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는다 해도 당해 기술 분야의 기술자라면 예를 들어, 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 핵산 분자를 사용하는 방법을 인지할 수 있기 때문이다. XPDH 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자는, 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 XPDH 또는 APDH 유전자 또는 이의 대립 형질 변이체를 추출하고, (2) 중기 염색체 전개에 대해 동일계 하이브리드화하여 XPDH 또는 APDH 유전자의 정확한 염색체 위치를 제공하고 노던 블롯 분석으로 특정 조직내 mRNA 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
물론, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 당해 기술 분야의 통상적인 기술자는 서열 48 또는 68에 나타낸 핵산 서열과 동일한 상동성 서열을 갖는 대다수의 핵산 분자가 XPDH 또는 APDH 효소 활성(즉, 촉매 활성)을 각각 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 것이라는 것을 즉시 인지할 것이다. 사실, 이들 뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체 모두는 동일한 폴리펩타이드를 암호화하고 있기 때문에, 상기된 비교 분석을 수행하지 않더라도 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 추가로, 축퇴성 변이체가 아닌 핵산 분자에 대해서, 적당수의 핵산 분자가 XPDH 또는 APDH 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 것이라는 것은 당해 기술 분야에서 인지될 것이다. 이것은 당해 기술자가 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 단백질 기능에 상당한 영향을 미치지 않을 것 같거나 전혀 영향을 미칠 것 같지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 하나의 지방족 아미노산을 다른 지방족 아미노산으로 대체하는 것)에 대해서 완전히 파악하고 있기 때문이다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 본 발명의 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 재조합 기술에 의한 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 생산 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 증식시키기 위한 선택 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 친전물로 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적절한 팩키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 팩키징하여 숙주세포로 형질 도입될 수 있다.
암호화된 단백질을 발현하기 위해, 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 삽입체가 목적하는 숙주에서 전사를 지시할 수 있는 적당한 프로모터에 작동적으로 연결되어야만 한다. 유용한 원핵 프로모터의 예는 몇가지를 지칭한다면 비. 서브틸리스 degQ 프로모터, 및 특히 이의 돌연변이인 degQ36, 파아지 람다 PL 프로모터, 이. 콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 어얼리 앤드 레이트 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터를 포함한다. 또한 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 또 다른 적합한 프로모터는 당해 기술자에게 공지되어 있다. 발현 작제물은 추가로 전사 개시 부위, 전사 종결 부위 및 전사된 영역에서 해독을 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 암호화 부분은 바람직하게 개시 코돈에서 해독이 개시되고 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)은 해독될 폴리펩타이드의 말단에 적당하게 위치할 것이다.
지적된 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 이러한 마커는 진핵 세포 배양을 위해서는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 유전자를 포함하고 비. 서브틸리스, 이. 콜리 및 또 다른 세균에서 배양하기 위해 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 적당한 숙주에 대한 대표적인 예는 세균 세포, 예를 들어, 비. 서브틸리스, 이. 콜리, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 숙주는 미생물 세포, 특히 세균 세포 및 효모 세포이다. 경우에 따라, 포유동물 세포가 유전자를 클로닝하기 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
벡터중에서, 세균용으로 바람직한 것은 퀴아겐으로부터 시판되는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타겐(Stratagene)으로부터 시판되는 pBS 벡터, 파아지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마샤로부터 시판되는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5이다. 또 다른 적합한 벡터가 당해 기술자에게 명백해질 것이다.
작제물은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 또 다른 방법에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다[문헌참조: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology(1986)].
폴리펩타이드 및 단편
본 발명은 추가로 서열 49의 아미노산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 분리되거나 정제된 XPDH 폴리펩타이드, 또는 특히 상기된 바와 같이 상기된 핵산 분자에 의해 암호화된 당해 폴리펩타이드의 일부를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 추가로, 특히 상기된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 바와 같은 XPDH 단백질의 융합 단백질을 제공하고 여기서, XPDH 아미노산 서열은 시그날 서열에 융합되거나 정제동안에 또는 이어지는 취급 및 저장동안에 숙주 세포내에서의 안정성 및 지속성을 개선하기위한 폴리펩타이드에 융합된다. 또한, 펩타이드 잔기가 폴리펩타이드에 첨가되어 예를 들어, 상기된 바와 같은 정제를 용이하게 할 수 있다. 상기 영역은 폴리펩타이드를 최종적으로 제조하기 전에 제거될 수 있다. 무엇보다 분비시키거나 배출시키고 안정성을 개선시키고 정제를 용이하게 하기위해 펩타이드를 폴리펩타이드에 첨가하는 것은 당해 기술 분야에 익숙한 것이고 통상적인 기술이다.
상기된 바와 같은 XPDH 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실애파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는 정제를 위해 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 사용된다.
본 발명의 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드는 천연적으로 정제된 생성물, 화학 합성 과정의 생성물 및 예를 들어, 세균 및 효모와 같은 미생물 세포, 및 특히, 비. 서브틸리스 및 사카로마이세스, 및 또한 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물을 포함하고, 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 몇몇 경우에 숙주 매개 프로세싱 결과로서 처음 부분에서 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.
XPDH 또는 APDH 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 다양한 응용, 특히 XPDH 또는 APDH의 화학적 성질 및 생물학적 성질을 이용하기 위한 응용을 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
변이체 및 돌연변이 폴리펩타이드
단백질 공학을 사용하여 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드의 특징을 개선시키거나 변화시킬 수 있다. 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 부가를 포함하는 신규 돌연변이 단백질 또는 "뮤테인" 또는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩타이드는 예를 들어, 활성이 증진되거나 안정성이 증가될 수 있다. 추가로, 이들은 적어도 특정 정제 및 저장 조건하에서 상응하는 천연 폴리펩타이드보다 고수율로 정제될 수 있거나 보다 우수한 가용성을 나타낼 수 있다.
N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이
예를 들어, 세포외 도메인을 갖는 막 연합 단백질 또는 성숙한 형태의 분비된 단백질을 포함하는 많은 단백질에 있어서, 실질적인 생물학적 기능의 상실 없이 하나 이상의 아미노산이 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다는 것은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
그러나, 단백질의 N-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실되어 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 상실된다 하더라도 또 다른 생물학적 활성은 여전히 보전될 수 있다. 따라서, 일반적으로 XPDH 또는 APDH 단백질의 전부 또는 일부를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 단백질의 능력은, 완전한 단백질 또는 세포외 도메인의 대다수의 잔기가 아닌 일부가 N-말단으로부터 제거되는 경우 보전될 것이다. 완전한 단백질의 N-말단 잔기가 결실된 특정 폴리펩타이드가 상기 면역학적 활성을 보유할 것인지에 대한 여부는 본원에 기술된 통상적인 방법 및 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 서열 49 또는 69의 아미노산 서열중 아미노 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩타이드를 제공한다.
그러나, 단백질의 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실되어 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능을 변형시키거나 상실시킨다 하더라도, 또 다른 생물학적 활성은 여전히 보전될 수 있다. 따라서, 일반적으로 단백질의 완전한 형태 또는 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하는 단축된 단백질의 능력은, 완전한 단백질 또는 성숙한 형태의 단백질의 대다수의 잔기가 아닌 일부가 C-말단으로부터 제거되는 경우 보전될 것이다. 완전한 단백질의 C-말단 잔기가 결실된 특정 폴리펩타이드가 상기 면역학적 활성을 보유할 것인지에 대한 여부는 본원에 기술된 통상적인 방법 및 당해 기술분야에 공지된 또 다른 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명은 또한 아미노 말단 및 카복실 말단 둘 다로부터 하나 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 돌연변이
상기 논의된 말단 결실된 형태 단백질외에도, 당해 기술 분야의 기술자라면 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향을 미치지 않으면서 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드의 몇몇 아미노산 서열이 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당해 분야의 기술자는 활성을 결정하는 중요한 영역이 단백질상에 존재함을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 추가로 실질적인 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드 활성을 나타내고 XPDH 또는 APDH 효소 활성을 보유한 영역과 같은 XPDH 또는 APDH 단백질의 영역을 포함하는 변이된 XPDH 또는 APDH 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 돌연변이는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 전형적인 치환을 포함하고 아미노산의 변화가 표현형을 변화시키지 않을 가능성에 대한 가이드를 문헌[참조: Bowie, J, U, et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science 247:1306-1310(1990)]에서 발견할 수 있다.
따라서, 서열 49 또는 69의 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비보존성 아미노산 잔기(바람직하게는 하나의 보존성 아미노산 잔기 및 보다 바람직하게는 하나 이상이지만 10개 미만의 보존성 아미노산 잔기(들))로 치환되는 것 및 상기 치환된 아미노산 잔기(들)가 유전자 코드에 의해 암호화될 수 있거나 암호화될 수 없는 것; 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙되거나 가용성인 세포외 폴리펩타이드가 또 다른 화합물[예를 들어, 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예: 폴리에틸렌 글리콜)]과 융합되는 것; 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩타이드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 사용되는 리더 서열 또는 분비 서열과 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유사체 및 동족체가 본원의 교시로부터 당해 기술 분야의 기술 범위내에 있는 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명의 XPDH 또는 APDH는 천연 돌연변이 또는 인공 조작에 의한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 지적된 바와 같이, 단백질의 폴딩 또는 활성에 상당한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환(하기에 나타낸 바와 같음)과 같이 특성이 최소로 변화되는 것이 바람직하다.
방향족 페닐알라닌
트립토판
타이로신
소수성 류신
이소류신
메티오닌
발린
극성 글루타민
아스파라긴
염기성 아르기닌
라이신
히스티딘
산성 아스파르트산
글루타민산
소형 알라닌
세린
트레오닌
글라이신

본 발명의 XPDH 또는 APDH 단백질에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위 지시된 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 동정될 수 있다[문헌참조: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)]. 후자 방법은 분자내 잔기마다 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 수득한 돌연변이 분자는 이어서 수용체 결합 또는 시험관내 증식 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 분리된 형태로 제공된다. "분리된 폴리펩타이드"란 이의 천연 환경으로부터 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 재조합 숙주 세포내에서 생산되고/되거나 함유된 폴리펩타이드는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다. 또한 "분리된 폴리펩타이드"는 재조합 숙주 세포로부터 부분적으로 또는 완전히 정제된 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 재조합적으로 생산되는 XPDH 폴리펩타이드는 실질적으로 문헌[참조: Hausman and London, J. Bacteriol 169(4):1651-1655(1987)]에 기술된 바와 같이 엘. 람노수스 고유 XPDH 단백질을 정제하는데 사용되는 방법에 의해 정제될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 분석에 충분한 정도로 또는 제제중에 단백성 물질이 99%를 차지하는 정도로 정제된다.
본 발명자는 XPDH 유전자, APDH 유전자 및 미생물 숙주내에서 크실리톨 및/또는 아라비톨을 생산하기 위한 상기 유전자들의 재조합적 용도를 밝혔다. 특히, XPDH 효소는, XPDH에 의해 크실룰로스-5-P를 크실리톨-1-P로 전환시킴에 이어서 예를 들어, 포스파타제를 사용하여 크실리톨-1-P를 크실리톨로 전환시키는 경로에서 유용하다. 이러한 크실리톨은 바람직하게 세포로부터 분비되고 정제되고 분리된 형태로 회수된다. 또 다른 양태에서, XPDH 동족체(예: 서열 50, 51, 52 및 53)는 또한 XPDH의 대용물로서, 특히, 크실리톨을 재조합적으로 생산하기 위한 본 발명의 방법에 유용하다. 또한, 특히 APDH 활성은 아라비톨 생산 방법에 유용하고 예를 들어, 서열 70의 APDH 유사체가 이를 대신하여 사용될 수 있다.
본 발명은 서열 49 또는 69의 서열을 갖는 폴리펩타이드와 35% 이상, 보다 바람직하게는 55% 또는 75% 이상, 여전히 보다 바람직하게는 85%, 95% 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 포함하고 또한 30개 이상의 아미노산 및 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는, 상기 폴리펩타이드의 일부를 포함한다.
실질적인 과제로서, 임의의 특정 폴리펩타이드가 예를 들어, 서열 49 또는 69의 아미노산 서열과 35%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% 또는 99% 이상 동일한지의 여부는 베스트피트 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 참조 서열과 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 베스트피트 또는 임의의 다른 서열 배열 프로그램을 사용하는 경우, 동일성 %가 완전한 길이의 참조 아미노산 서열에 대해 계산되고 참조 서열중 아미노산 잔기 총수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 계수를 설정한다.
XPDH 또는 APDH 활성을 나타내는 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어, 당해 활성에 대한 분석 또는 효소의 기질 또는 생성물과 같은 대사물질에 대한 분석에서 시험관내 또는 생체내 활성을 제공하는데 사용될 수 있고, 다중 효소 시스템과 연계하여 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기의 실시예에서 보다 상세하게 기술된다. 하기 실시예는 목적을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 범위을 제한하고자 하는 것은 아니다.
상기된 논의는 하기와 같이 부분적으로 요약되고 본원에 제공된 실시예에 의해 보충된다:
실시예 1, 2 및 3은 리보스-5-P 이소머라제 활성이 저하되거나 제거된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 2 및 3은 트랜스케톨라제 활성이 저하되거나 제거된 세균 숙주를 예 시한다.
실시예 5는 리불로스-5-P 3-에피머라제 활성이 증진되거나 변형된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 6은 크실룰로스-5-P의 크실룰로스로의 전환이 증진되거나 변형된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 7은 크실리톨 데하이드로게나제 활성이 증진되거나 변형된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 9는 타가토스 에피머라제 활성이 리불로스의 크실룰로스로의 전환을 위해 증진되거나 변형된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 10은 글루코스 PTS (PEP-의존성 수송) 시스템 활성이 변경되거나 ATP-의존성 키나제 기본 헥소스 취득 시스템 및 인산화 시스템으로 대체되거나 보충된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 11은 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및/또는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 활성이 증진되거나 변형된 세균 숙주를 예시한다.
실시예 12는 트랜스케톨라제 및 크실룰로키노스 활성이 제거되고 크실리톨 데하이드로게나제 활성이 도입된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 13은 5탄당 포스페이트의 축적이 증진된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 14, 15, 17, 20 및 22는 폴리올 및/또는 펜토스의 축적이 증진된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 15는 생산되는 크실리톨 및 리비톨의 비율이 상이한 기질 특이성을 갖는 크실리톨 데하이드로게나제에 의해 변화된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 16 및 17은 5탄당 포스페이트에 작용하는 탈인산화 효소가 도입되고 폴리올 및 펜토스의 축적이 증진되고 폴리올 및 펜토스의 비율이 변화되고 PPP로의 글루코스 유입이 증진된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 18은 글루코스-포스페이트 이소머라제 활성이 저하되거나 제거된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 19는 트랜스케톨라제 및 글루코스-포스페이트 이소머라제 활성이 제거된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 20은 6-포스포프럭토-2-키나제 활성이 제거된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 21은 NADP+의 재생산을 위한 전자 구인력이 증진되거나 변형된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 21 및 22는 NADPH+의 재생산을 위한 세포 조인자 균형이 변형된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 23은 통상적인 돌연변이 유발에 의해 폴리올 및 펜토스의 생산이 증진된 효모 숙주를 예시한다.
실시예 25는 락토바실러스 람노수스 기원의 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제(XPDH)의 클로닝을 기술한다.
실시예 26은 발현 벡터 pGTK74(LRXPDH) 및 pGTK74(BHDH)에 대한 작제 방법을 기술하고 있다.
실시예 27은 엘. 람노수스 및 알. 할로두란스 기원의 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자(XPDH)의 발현을 기술하고 있다.
실시예 28은 XPDH를 발현하는 재조합 비. 서브틸리스 균주에 의한 크실리톨의 생산 방법을 예시하고 있다.
실시예 29는 비. 서브틸리스 glcUgdh 오페론의 과발현을 기술하고 있다.
실시예 30은 엔테로코커스 아비움 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제를 정제하고 이의 부분적인 서열 분석을 기술하고 있다.
실시예 31은 비. 서브틸리스에서 이. 아비움 및 비. 할로두란스 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제의 발현을 기술하고 있다.
실시예 32는 재조합 비. 서브틸리스 균주에 의한 아라비톨의 생산 방법을 기술하고 있다.
실시예 1
D-리보스-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 비. 서브틸리스 rpi 유전자의 클로닝
연구를 개시하는 시점에서, 비. 서브틸리스의 게놈 서열이 아직 완전하게 분석되지 않았다. 또한, 비. 서브틸리스가 하나 이상의 D-리보스-포스페이트 이소머라제 유전자를 함유하고 있는지 공지되어 있지 않다(이. 콜리는 2개를 함유하고 있는 것으로 공지되어 있다). 따라서, rpi 유전자(들)을 클로닝시키는 전략은 PCR 보다는 차라리 이. 콜리에서 D-리보스 영양 요구성 돌연변이의 기능적 보완을 기초로 하였다. 현재, rpi 유전자(들)를 클로닝시키는데 바람직한 방법은 하기에 예시 된 방법 보다는 PCR 기본 기술을 사용하는 것이다. 그러나, 본 실시예에 기술된 방법은 본 발명을 수행하는데 매우 적합하다.
유전자 라이브러리는 비. 서브틸리스(ATCC 6051)의 DNA로부터 작제하였다. 상기 균주의 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A로 부분적으로 절단하고 크기가 3kb를 초과하는 단편을 예비 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 또 다른 언급이 없는 경우, 당해 기술 분야에 널리 공지된 표준 유전자 조작 방법을 본 발명을 지지하는 연구 전반에 걸쳐 사용하였다[문헌참조: Maniatis, T., et al.,(1982, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory]. 이어서, 이러한 분획물을 사용하여 ZAP 발현 예비 분해된 벡터/기가팩 클로닝 키트(Stratagene, USA)를 사용하는 비. 서브틸리스 유전자 라이브러리를 작제하였다. 에스케리치아 콜리 AS11 균주[rpiA-, 유전자 보관 센터(Genetic Stock Center)(인터넷 주소: http://cgsc.biology.yale.edu)에서 구입한 D-리보스 영양 요구성 균주)를 제조업자가 제안한 균주대신에 사용하는 것을 제외하고는 제조업자의 지침에 따라 라이브러리를 플라스미드로 전환시켰다. AS11 균주에서 플라스미드 형태의 라이브러리 적정량을 표준 이. 콜리 최소 배지(M9)를 함유한 플레이트에 옮겼다. 이러한 배지상에서 증식한 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한 절단 분석으로 분석하였다. 이들의 대부분은 제한 분석에 의해 부분적으로 일치하는 것으로 나타났다. 대부분의 풍부한 그룹에 속하는 클론중 하나(기호 p131 , 도 1)를 보다 집중적으로 제한 절단 분석한 결과 비. 서브틸리스 염색체의 서열 분석된 일부로부터 유래된 것임을 밝혔다. 이러한 영역은 이. 콜리의 rpiB 암호 영역과 매우 상동성인 개방 판독 프레임을 함유하였다.
실시예 2
rpi- 및 tkt- 돌연변이를 함유한 비. 서브틸리스 균주의 작제
클로르람페니콜 내성 유전자를 플라스미드 pMK4[바실러스 유전자 보관 센터(BGSC, Ohio, USA)]로부터 분리하였다. pMK4를 DraI 및 EcoRI로 분해하고 1.9kb 단편을 예비 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해물로부터 분리하고 추가로 Sau3A로 분해시켰다. 상기 분해물로부터 정제된 0.83kb 단편을 정제하고 4개의 모든 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에 DNA-폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하였다. 상기 단편을 SfuI로 분해된 플라스미드 p131(실시예 1)과 연결시키고 클레노우 단편으로 유사하게 처리하였다. 이. 콜리를 상기 연결 혼합물로 형질전환시킨 후 클로람페니콜 내성 유전자에 의해 파괴된 비. 서브틸리스 rpi 유전자를 함유하는 플라스미드 p131-Cm2를 분리하였다(도 2).
p131-Cm2를 EcoRI 및 PstI로 분해시키고 분해물을 사용하여 비. 서브틸리스 균주 BD170(trpC2, thr-5, BGSC로부터 구입함)를 형질전환시키고 천연 컴피턴스의 비. 서브틸리스를 사용하여 클로람페니콜에 내성이 되도록 하였다. 형질전환 프로토콜은 소위 "파리스 방법(Paris method)"[문헌참조: Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood and Cutting, eds., John Wiley and sons, Chichester, NY(1990), pp. 148-149]에 따랐다. 주형으로서 각각의 클론으로부터의 염색체 DNA 제제[문헌참조: Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood and Cutting, eds., John Wiley and sons, Chichester, NY(1990), p65] 및 프라이머로서 한쌍의 올리고뉴클레오타이드 oCA5(서열 1) 및 oBS-RPI3(서열 2)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 형질전환체를 스크리닝하였다. 본 실시예 및 후속 실시예에서 사용되는 표준 PCR 조건은 또 다른 언급이 없는 경우, 93℃ 3분에 이어서 60℃에서 45초, 72℃에서 3분 및 93℃에서 30초의 25회 사이클이었다. 본 분석에 의해 양성인 형질전환체(대략적으로 1.35kb의 PCR 생성물을 생성함)를 추가로 클로닝하고 수득한 서브 클론의 염색체 DNA를 상이한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머[oBS-RPI5(서열 3)] 및 oBS-RPI3(서열 2)]를 사용하는 PCR로 분석하였다. 예상되는 크기(야생형 비. 서브틸리스에서 1.25kb인 것과는 대조적으로 약 2.1kb)의 DNA 단편을 생성하는 하나의 클론을 선별하고 D-리보스 영양 요구성에 대해 시험하였다. 실질적으로 상기 클론은 D-리보스에 대해 영양 요구성임이 밝혀졌고 이것으로 단지 하나의 D-리보스 포스페이트 이소머라제 유전자가 비. 서브틸리스에 존재함을 강하게 제안하였다. 이러한 클론을 GX1로 명명하였다.
트랜스케톨라제를 암호화하는 비. 서브틸리스의 tkt 유전자를 비. 서브틸리스 염색체 DNA의 공지된 서열을 기준으로 PCR하여 클로닝하였다. 올리고뉴클레오타이드 oBS-TKT5(서열 18)를 센스 프라이머로서 사용하고 oBS-TKT3(서열 19)을 안티-센스 프라이머로서 사용하였다. PCR 단편을 표준 연구 벡터 pUC19에 클로닝하여 플라스미드 pUC(TKT)를 수득하였다. 이어서 에리트로마이신 내성 유전자를 플라스미드 pDG647(BGSC로부터 구입)의 1.6kb BamHI 단편의 형태로 pUC(TKT)의 MluI 부위로 삽입하였다. 플라스미드 pUC(TKT) 및 pTKT:E1의 작제 방법은 도 10에서 설명한다.
플라스미드 pTKT:E1을 SalI 및 SmaI로 분해시키고 수득한 분해물을 사용하여 비. 서브틸리스 균주 BD170 및 GX1을 형질전환시킴으로써 에리트로마이신에 내성이 되도록 하였다. 무작위 세트의 형질전환체 클론을, 프라이머로서 oBS-TKT5 및 oBS-TKT3을 사용하는 PCR로 분석하고 약 4kb DNA 단편을 생성하는 클론을 선별하였다. 이러한 과정에 의해 BD170으로부터 유도된 비. 서브틸리스 균주를 GX4로 명명하고 GX1의 유사한 유도체를 GX5로 명명하였다.
실시예 3
D-리불로스 생산성 비. 서브틸리스 균주의 작제
본래의 프로토콜에 사용된 Na-사르코실이 Na-도데실설페이트로 대체되는 것을 제외하고는 실시예 2에 언급된 방법을 사용하여 염색체 DNA를 균주 GX1에서 분리하였다. 당해 DNA를 사용하고 천연 컴피턴스 기본 방법(실시예 2)을 사용하여 D-리보스-생산성 비. 서브틸리스 균주 31094(미국 특허 제3,970,522호)를 형질전환시켰다. 형질전환체를 실시예 2에 기술된 PCR 방법을 사용하고 또한 이들 균주에 의한 글루코스 발효 생성물을 연구하여 스크리닝하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍인 oBS-RPI5 및 oBS-RPI3을 사용한 PCR에서 예상되는 크기의 단편을 생성하고 글루코스를 5탄당으로 전환시키는 능력을 보유한 하나의 클론을 선별하였다. 균주 ATCC 31094의 rpi-파괴된 유도체를 GX2로 명명하였다.
실시예 4
비. 서브틸리스의 재조합 균주를 사용한 리불로스 생산
비. 서브틸리스 균주 ATCC 31094, GX2, GX4 및 GX5를 LB 배지[(박토-트립톤(Difco) 1%, 효모 추출물(Difco) -.5%, NaCl 1%]에서 밤새 예비-배양하고 추가로 10% 글루코스를 함유하는 동일 배지에 OD600 초기값이 1이 되도록 접종하였다. 20ml 들이 시험관에서 약 10ml의 배양물을 회전식 진탕기에 수평선상에서 약 30°각도로 기울여 위치시키고 3일동안 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 발효액내 탄수화물을 HPLC로 분석하였다. 굴절 지수 검출기를 장착한 히타치(Hitachi) 665A-12 액체 크로마토그래피상에서 HPLC 분석을 수행하였다. 바이오-래드 HPX87P 7.8 x 200mm 칼럼을 사용하였다. 칼럼을 70℃에서 물로 평형화시키고 분당 0.9ml의 속도로 물을 사용하여 용출시켰다. HPLC용 표준 용액을 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입한 시약으로부터 제조하였다. 이들 용액을 중량이 일정해질때까지 NaOH 펠렛에 대해 진공 건조시킨 시럽으로부터 또는 무수 결정 당으로부터 직접 제조하였다(크실룰로스 및 D-리불로스).
표 1에 제공된 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, rpi-돌연변이는 비. 서브틸리스 균주에 의해 생산된 5탄당의 범위를 급작스럽게 변화시킨다. D-리보스는 더이상 생산되지 않고 D-리불로스가 발효의 주요 생성물이 된다. 모 균주에서 검출하기가 어려운 D-크실룰로스 생산은 D-크실룰로스 수율이 D-리불로스의 수율보다 더욱 저하된다 하더라도 명백하게 나타난다. 유전자 파괴에 의해 수득된 tkt 돌연변이 GX4 및 GX5는 균주 ATCC 31049 및 GX2가 화학적으로 유도된 tkt 돌연변이를 함유함으로써 정량적으로 유사한 범위의 5탄당을 생산하였다. 그러나, GX4 및 GX5는 ATCC 31094 및 이의 유도체보다 다소 느리게 증식하였다. 가장 있음직하게, 이것은 균주 ATCC 31094에서 "보충"(compensatory) 돌연변이가 축적됨으로써 설명된다. 따라서, 이들 균주를 글루코스 풍부 배지에서 여러 회에 걸쳐 배양하여 동일 배지상에서 보다 대량으로 신속하게 증식하는 클론을 서브클로닝하고 선별함으로써 GX4 및 GX5의 발효 특성을 개선시킬 수 있다.
tkt arid rpi 유전자가 돌연변이된 비. 서브틸리스 균주에 의한 글루코스로부터 5탄당의 생산(mg/ml)
균주명 관련 유전자형 크실룰로스 리불로스 리보스
ATCC 31094 tkt- 측정 불가(*) 2.31 1.23
GX2 tkt-, rpi 0.44 4.54 0.00
GX4(**) tkt 측정 불가 1.4 1.2
GX5(**) tkt, rpi 측정 불가 0.8 측정 불가
*n.d. - 신뢰성 검출 한계치 이하(이러한 한계치는 비. 서브틸리스 발효 배지에 대해 약 0.15 - 0.25mg/ml이다) (**) 발효 시간 - 5일

실시예 5
D-리불로스-5-포스페이트 에피머라제를 과발현하는 비. 서브틸리스 균주의 작제
비. 서브틸리스-pBS(AR2T)에서 D-리불로스-5-포스페이트 에피머라제를 과발현시키는 벡터를 하기의 성분으로부터 작제하였다:
플라스미드 pGDV1[문헌참조: Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood and Cutting, eds., John Wiley and Sons, Chichester, NY, pp. 82- 83](BGSC에서 구입) 기원의 그람-양성 레플리콘 및 클로람페니콜 내성 마커;
플라스미드 pMOB[문헌참조: Strathmann, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1247-1250(1991)] 기원의 이. 콜리 레플리콘 및 암피실린 내성 마커;
플라스미드 pDG783[문헌참조: Guerot-Fleury et al., Gene 167:335-336(1995)] 기원의 카나마이신 내성 유전자;
올리고뉴클레오타이드 oALDOP5(서열 4) 및 oALDOP3(서열 5)을 사용한 PCR에 의해 클로닝된 비. 서브틸리스 알돌라제 유전자(tsr, 또한 fba로서 공지됨)의 프로모터;
올리고뉴클레오타이드 oRPE5(서열 6) 및 oRPE32(서열 7)를 사용한 PCR에 의해 클로닝된, 이. 콜리 기원의 D-리불로스-5-포스페이트 에피머라제 유전자의 암호화 서열;
또한 올리고뉴클레오타이드 oENOT5(서열 8) 및 oENOT3(서열 9)를 사용한 PCR에 의해 클로닝된, 비. 서브틸리스의 해당 과정 오페론의 전사 종결 인자.
플라스미드 pBS(AR2T)-Kan의 작제는 도 3, 4 및 5에서 설명한다.
비. 서브틸리스 균주 GX2를 실시예 2 및 3에 기술된 방법을 사용하여 pBS(AR2T)-Kan으로 형질전환시켰다. 무작위로 선택된 2개의 형질전환체의 약 50ml 배양액을 250ml 들이 삼각 플라스크(회전식 진탕기, 37℃, 25mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 배지)중에서 밤새 증식시켰다. 비. 서브틸리스 균주 GX2를 대조군으로서 사용하였다. 카나마이신이 제거된 것을 제외하고는 동일한 조건하에서 증식시켰다. 세포의 추출물을 제조하고 D-리불로스 5-포스페이트 에피머라제의 활성을 공지된 방법[문헌참조: Sasajima, K. and Yoneda, M., Agr. Biol. Chem. 38:1297-1303(1974)]을 사용하여 측정하였다. 형질전환체는 야생형 대조군(0.3 내지 0.4U/mg단백질) 보다 약 30 내지 50배 높은 수준(10 내지 20U/mg단백질)으로 D-리불로스 5-포스페이트 에피머라제를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 알돌라제 프로모터의 활성에 대한 글루코스의 효과는 별도의 실험에서 이후에 연구되었다(실시예 8). 상기 프로모터[다중 카피 플라스미드 pGT24(MXD2)에서 크실리톨-데하이드로게나제 유전자의 발현을 조절하는]는 배양 배지내에 글루코스가 존재하여 중간정도로 억제된다(약 3 내지 10배).
D-리불로스 5-포스페이트 에피머라제를 과발현하는 비. 서브틸리스 균주에 의한 5탄당의 생산
pBS(AR2T)-Kan으로 형질전환된 GX2를 실시예 4에 기술된 조건하에서 배양하였다. 모 균주 GX2를 대조군으로서 사용하였다. D-리불로스-5-포스페이트 에피머라제 발현 효과로서 배양한지 3 내지 7일후 배양액중의 D-크실룰로스 및 D-리불로스의 비율을 계산하였다. 실질적으로 이러한 비율은 단지 중간정도이지만 증가하였다(통상적으로 약 2배, 약 5 내지 7%에서 10 내지 12%, 표 2).
실시예 6
D-크실룰로스의 생산량이 증가된 비. 서브틸리스 돌연변이체의 선별
pBS(AR2T)-Kan으로 형질전환된 GX2(25mg/I 카나마이신을 함유한 LB에서 증식시킴)의 하루밤 동안의 배양물 0.1 내지 1ml(90mm 페트리 플레이트당)을 선별 플레이트(D-크실로스 10% 및 카나마이신 25mg/1이 첨가된 LB)상에 접종하였다. 상기 플레이트를 약 1일동안 37℃에서 배양하였다. 플레이트상에 출현한 별개의 콜로니(통상적으로- 10개 내지 100개)를 서브클로닝하여 정제하고 LB-글루코스 배지에서 배양시키고 생산되는 5탄당의 범위를 HPLC로 분석하였다. 상기 과정에 의해 선별된 몇몇 돌연변이체가 모 균주보다 급격하게 증가된 고수준의 D-크실룰로스를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 매우 유사한 결과는 또한 항생제가 크실로스 함유 선별 배지로부터 제거된 것을 제외하고는 동일한 선별/스크리닝 과정을 거친 GX2 균주에서 수득되었다. 이들 실험의 결과는 표 2에 요약되어 있다. 균주 GX2중 하나의 D-크실룰로스 과생산 돌연변이체를 비. 서브틸리스 GX7으로 명명하고 다음 연구에 사용하였다.
pBS(AR2T)-Kan으로 형질전환된 비. 서브틸리스 균주 GX2 및 GX2의 D-크실로스-내성 돌연변이체 균주에 의한 글루코스로부터 D-리불로스 및 D-크실룰로스의 생산
비. 서브틸리스 균주 크실룰로스 g/l 리불로스 g/l 크실룰로스:리불로스 비율 %
실험 1
GX2 0.9 14.2 7
GX2[pBS(AR2T)-Kan] 0.8 6.9 12
GX2[pBS(AR2T)-Kan]-돌연변이체 클론 X2 4.3 8.1 53
GX2[pBS(AR2T)-Kan]-돌연변이체 클론 X3 4.3 8.0 54
GX2[pBS(AR2T)-Kan]-돌연변이체 클론 X4 5.1 9.4 54
실험 2
GX2 0.3(*) 10.7 2.4(*)
GX2-돌연변이체 클론 27(균주 GX7) 6.8 21.6 31
(*) 대략적인 수치. 이러한 낮은 범위에서 D-크실룰로스 농도의 측정은 단지 반-정량적이다.

실시예 7
크실리톨 데하이드로게나제를 과발현하는 비. 서브틸리스 균주의 작제
플라스미드 pGTK24(MXD2)를 2단계로 작제하였다. 처음에, 비. 서브틸리스 알돌라제 유전자의 프로모터를 함유하는 일반적인 목적의 이. 콜리-비. 서브틸리스 발현 벡터 pGTK24 및 에놀라제 유전자의 전사 종결 인자를 작제하였다. 하기의 유전자 조작 방법을 사용하여 플라스미드 pGTK24를 작제하였다:
이. 콜리의 복제 오리진을, 주형으로서 pUC19를 사용하고 프라이머로서 2개의 올리고뉴클레오타이드 oOR15(서열 10) 및 oORI32(서열 11)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 단편을 EcoRI 및 BclI로 분해시키고 동일 효소에 의해 분해된 pGDV1에 연결시켰다. 수득한 플라스미드를 pGT21로 명명하였다.
pGT21을 SalI 및 EcoRI로 분해시키고 한쌍의 합성 올리고뉴클레오타이드 oPLI5(서열 12) 및 oPLI3(서열 13)에 연결시켜 플라스미드 pGT22를 수득하였다.
비. 서브틸리스 해당 과정 오페론(에놀라제 유전자)의 전사 종결 인자를, 주형으로서 비. 서브틸리스의 염색체 DNA를 사용하고 2개의 올리고뉴클레오타이드 oENOT5(서열 8) 및 oENOT3(서열 9)를 사용하는 PCR에 의해 분리하였다. PCR 생성물을 BamHI 및 HIndIII로 분해하고 동일 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 pGT22의 폴리링커 영역에 클로닝하였다. 수득한 플라스미드를 pGT23으로 명명하였다.
플라스미드 pGT23을 SalI 및 EcoRI의 혼합물로 분해하고 알돌라제 프로모터를 함유하는 PCR 단편에 연결하고 동일 효소로 분해하였다[PCR 주형: 비. 서브틸리스 염색체 DNA, PCR 프라이머: oALDOP5(서열 4) 및 oALDOP3(서열 5)]. 수득한 작제물(플라스미드 pGT24)은 전사 개시 및 종결 시그날, 유일한 EcoRI 부위에 이어서 여러 다른 유일한 제한 절단 부위(XbaI, XhoI, BamHI)의 바로 전방에 위치한 리보솜 결합 부위를 제공하는 작은 크기의 간편한 셔틀(이. 콜리 - 비. 서브틸리스) 벡터이다. pGT24의 알돌라제 프로모터는 SalI 및 EcoRI 제한 절단 부위를 사용하여 임의의 다른 프로모터와 용이하게 교환할 수 있다. 클로람페니콜 내성 마커는 이. 콜리 및 비. 서브틸리스 둘다에서 선별 가능하다.
플라스미드 pGTK24는 클로람페니콜 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 대체된 pGT24의 유도체이다. 이것은 프라이머로서 2개의 올리고뉴클레오타이드 oKAN5(서열 14) 및 oKAN3(서열 15)를 사용하는 PCR에 의해 플라스미드 pDG783의 카나마이신 내성 유전자를 증폭시키고 PCR 생성물을 ScaI 및 BamHI로 분해시키고 BclI 및 SnaBI로 분해된 pGT24에 연결함으로써 성취되었다.
플라스미드 pGT24 및 pGTK24의 작제는 도 6, 7 및 8에서 설명된다. 합성의 제2 단계에서, 그람 음성 세균 모르가넬라 모르가니 ATCC 25829 기원의 크실리톨 데하이드로게나제(XDH) 유전자의 암호화 서열을 이러한 유전자의 공지된 서열(GenBank 승인번호 제L34345호)을 사용하는 PCR에 의해 클로닝시켰다. 상기 PCR에서 사용되는 센스 및 안티 센스 올리고뉴클레오타이드는 oMXD52(서열 16) 및 oMXD32(서열 17)이었다. XDH 유전자의 PCR 증폭된 암호화 서열을 발현 벡터 pGTK24의 프로모터와 전사 종결 인자사이에 삽입하였다(도 9에서 상세하게 나타냄). 수득한 플라스미드 pGTK24(MXD2)는 EcoRI 부위에 삽입된 추가의 99bp DNA 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 하기와 같은 서열을 갖는 당해 DNA 단편은 명백하게 이. 콜리 염색체의 rpoBC 영역으로부터 기원한 것이다:
GAATTCTATGTGGTTATCGAAGGCGGTATGACCAACCTGGAACGTCAGCAGATCCTGACTGAAGAGCAGTATCTGGACGCGCTGGAAGAGTTCGGTGAC.
본 발명자의 지식을 최대한 활용한 결과, 이러한 단편은 단지 클로닝 인공물로서 pGTK24(MXD2)에서 어떠한 기능적 역할을 하지 않는다. 이것은 이. 콜리 또는 비. 서브틸리스에서 크실리톨 데하이드로게나제 유전자의 발현에 대한 영향이 강한것 같지는 않다. pGTK24(MXD2)를 상기된 방법에 의해 비. 서브틸리스 균주 BD170 및 GX7(실시예 6)에 도입하고 이때, 비. 서브틸리스 균주 BD170은 GX7을 형질전환시키기 위한 중간 숙주로서 사용하였다).
형질전환되지 않은 균주 BD170 뿐만 아니라 균주 BD170[pGTK24(MXD2)]을 LB 또는 10% 글루코스를 함유하는 LB에서 밤새 증식시키고 세포 추출물을 제조하고 XDH 활성을 측정하였다. XDH 활성을 측정하기 위한 분석 조건은 30℃, 50mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.2mM NADH 및 10mM D-크실룰로스이었다. 340nm에서 흡광도의 변화를 기록하였다. 활성 1유니트는 상이한 흡광 계수 NADH/NAD+이 6.25 x 104 M-1cm-1과 동일한 것으로 가정하는 분석 조건하에 분당 기질 1몰의 환원을 촉매하는 효소의 양으로서 정의하였다. 하기 수준의 XDH 활성은 2개의 배지, 즉, LB-0.5U/mg단백질, LB-글루코스 0.05-0.15U/mg단백질상에서 증식된 균주 BD170[pGTK24(MXD2)]에서 측정하였다. 따라서, 글루코스는 알돌라제 프로모터의 활성을 3 내지 10배 억제시키는 것으로 나타났다. 2개의 배지중 하나에서 증식시킨 균주 BD170에서 어떠한 XDH 활성이 검출되지 않았다.
실시예 8
크실리톨 데하이드로게나제를 발현하는 비. 서브틸리스 균주에 의한 5탄당 및 당 알콜의 생산
상이한 발효 조건하에서 통기 조건을 다양하게 하고 보다 장시간동안 배양하는 것을 제외하고는 근본적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 10% 글루코스를 함유하는 LB 배지에서 플라스미드 함유 비. 서브틸리스 균주 GX7[pGTK24(MXD2)]을 배양하였다. 통기 수준의 변화는 정량적이고 배양 용적 및 진탕 조건을 다양하게 하여 성취되었다. "고(high)" 통기는 진탕기 플랫폼에 30° 각도로 고정된 20ml 시험관내 3ml의 배양물을 200rpm에서 진탕시켜 성취되며, "중(medium)" 통기는 동일 조건하에 10ml의 배양물을 배양하여 성취되고, "저(low)" 통기 조건은 시험관이 수직으로 고정되는 것을 제외하고는 중 통기와 동일하였다. 이들 실험의 결과는 표 3에 요약되어 있다.
표 3에 제시된 데이타는 발효 조건을 조정하고 세균 세포내에서 적합한 폴리올 데하이드로게나제를 발현시킴으로써 당업자가 재조합 비. 서브틸리스에 의해 생산되는 5탄당/당 알콜의 특성에 따라 이를 광범위하게 조절할 수 있다는 것을 명백하게 보여준다. 표 3의 결과를 한 예로 들면, 당업자는 발효 생성물 혼합물중에서 케토 당이 당 알콜로 전환되는 수율이 근본적으로 0에서 약 80%의 범위까지 다양할 수 있다는 것을 알 수 있다.
비.서브틸리스 균주 GX7의 배양 배지에서 D-크실룰로스 및 크실리톨의 축적에 대한 XDH의 발현 및 통기 조건의 영향
균주 통기 수준 발효 시간(일수) 크실룰로스 g/l 크실리톨 g/l 크실리톨/크실룰로스 비율
GX7 고 10 6.6 < 0.1 -
중 10 11.1 0.15 0.01
저 10 1.6 <0.1 -
고 > 저 3 + 7(*) 2.9 0.46 0.16
저 23 8.6 0.7 0.08
GX7[pGTK24(MXD2)] 클론 1 고 10 3.4 0.1 0.03
중 10 4.5 0.54 0.12
저 10 0.21 0.34 1.62
고 내지 저 3 + 7(*) 2.5 2.2 0.88
저 23 1.4 3.7 2.64
GX7[pGTK24(MXD2)] 클론 고 10 6.3 0.16 0.03
중 10 7.5 1.4 0.19
저 10 0.38 0.55 1.45
고 내지 저 3 + 7(*) 2.6 2.1 0.81
저 23 1.4 5.2 3.71
(*) 고도로 통기된 조건하에서 발효 3일후에 낮은 통기 조건하에서 7일

발현 벡터 pGTK24(MXD2)가 재조합 비. 서브틸리스 세포내에서 단지 중간 수준의 XDH를 제공한다는 것을 주지해야 한다. 알돌라제 프로모터보다 강한 프로모터의 사용은 XDH의 발현 수준 및 D-크실룰로스-크실리톨 생전환의 효능을 증가시킬 것이다. 당해 시스템은 보다 정확하게 발효 조건(특히, 용존 산소 농도, 글루코스 농도 및 유가식 발효에서 주입 속도)을 조절하여 추가로 개선될 수 있다. 당해 실시예에 기술된 실험에서 글루코스의 크실리톨로의 느린 전환 속도는 단순한 배치식 발효를 사용하여 설명된다. 당해 속도는, 보다 높은 밀도로 B. 서브틸리스를 배양하는 유가식 발효(예를 들어, 세포 밀도는 바실러스에 있어서 리터당 약 100g 이상의 무수 세포 중량일 수 있다)를 사용하거나 고체상 캐리어상에 고밀도로 세포를 고정화시켜 개선될 수 있다.
실시예 9
비. 서브틸리스를 사용한 글루코스 발효에 의한 또 다른 5탄당 및 당 알콜의 생산
본 발명은 실시예 1 내지 8에서 설명한 바와 같이 글루코스의 5탄당으로의 생전환에 대한 일반적인 효능 및 유동성을 확립하였다. 추가로 동일한 개념을 연장하여 D-리불로스, D-크실룰로스 및 크실리톨이외의 5탄당을 생산하고 수득하는데 적용시킬 수 있고 이것은 이들 연구에 모델로서 사용된다.
그러한 연장 적용은 본 발명의 실험에 사용되는 크실리톨 데하이드로게나제 유전자 대신에 리비톨 데하이드로게나제 유전자를 대용하는 것이다. 예를 들어, 크렙시엘라 아에로게네스의 리비톨 데하이드로게나제 유전자[문헌참조: Loviny, T., et al. Biochem. J, 230:579-585(1985)]를 GX2 균주에서 발현시키고 생산된 리비톨을 수거하고 경우에 따라, 분리한다. 리비톨 생산은 상기에서 나타낸 바와 같이 발효 동안에 통기 조건을 조절하거나 조정하여 극대화된다. 상기 실시예에서, 리비톨 데하이드로게나제에 대한 유전자로 형질전환된 균주를 사용하여 글루코스를 D-리불로스 또는 리비톨로의 탄소 흐름으로 유입시킨다. 생산되는 리비톨을 공지된 방법을 사용하여 분리한다.
크렙시엘라 테리게나 기원의 D-크실룰로스-형성 아라비톨 데하이드로게나제 유전자[미국 특허 제5,631,150호] 또는 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) 기원의 D-리불로스 형성 아라비톨 데하이드로게나제 유전자[문헌참조: Hallborn, J., et al., Yeast 11:839-847(1995), Genbank 서열 승인번호 제Z46866호]와 같은 2개의 효소중 하나를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 비. 서브틸리스 균주를 사용한 발효에 의해 아라비톨을 글루코스로부터 생산할 수 있다. 전자 경우에, 형질전환을 위한 바람직한 숙주는 GX7과 같은 D-크실룰로스-생산 균주이고 후자 경우에는 GX2와 같은 D-리불로스 생산 균주이다. 생산되는 아라비톨은 공지된 방법을 사용하여 분리한다.
리불로스를 생산하는 숙주(예를 들어, 바실러스 서브틸리스 ATCC 31904, GX2 또는 GX7)를 추가로 변형시켜 숙주내에서 케토스 3-에피머라제(이 효소는 또한 타가토스 에피머라제로서 공지됨)를 암호화하는 유전자를 (과)발현시킬 수 있다. 이렇게 변형시킨 결과로서 이들 숙주내에서의 크실룰로스의 생산이 증가한다. 슈도모나스 시코리(Pseudomonas cichorii) 기원의 적합한 케토스 3-에피머라제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 기관(GenBank, 승인번호 제AB000361호)으로부터 입수한다.
유사하게, 리불로스를 생산하는 숙주, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 ATCC 31094, GX2 또는 GX7은 추가로 효율적인 크실리톨 생산을 위해 변형될 수 있다. 이 경우에, 크실리톨 데하이드로게나제(예를 들어, 모르가넬라 모르가니 기원의 크실리톨 데하이드로게나제, GenBank 승인번호 제L34345호)를 암호화하는 유전자 및 케토스 3-에피머라제를 암호화하는 유전자(예를 들어, 이전의 문단에서 기술된 유전자)가 상기 숙주에서 동시에 발현되어야만 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 케토펜토스-생산성 비. 서브틸리스 균주에서 많은 공지된 알도스 이소머라제 유전자중 하나를 발현시킴에 따라서, 예를 들어, D-크실로스 쪽으로 발효(D-크실룰로스 생산성 균주 GX7에서 매우 다수의 공지된 D-크실로스 이소머라제 중 임의의 하나를 발현시킴)를 진행시켜야만 한다.
유사하게, D-릭소스는 D-크실룰로스 생산성 바실러스 숙주에서 D-만노스 이소머라제 유전자를 발현시켜 생산된다[문헌참조: Stevens, F.J., et al., J. Gen. Microbiol. 124:219-23(1981); Allenza, P., et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25:171-182(1990)]. D-릭소스는 공지된 방법을 사용하여 분리된다.
L-푸코스 이소머라제를 암호화하는 유전자, 예를 들어, 이. 콜리 유전자 fucI(이의 서열은 승인번호 제U29581호하에 GenBank에 발견된다)는 D-리불로스-생산성 균주 GX2에서 발현된다. 이를 통해 보다 통상적인 L-아라비노스의 독특한 입체이성질체인 D-아라비노스를 생산할 수 있다[문헌참조: Garcia-Junceda, E., et al., Bioorg. Med. Chem. 3:1349-1355(1995)].
실시예 10
바실러스 서브틸리스에서 펜토스-포스페이트 경로로의 글루코스 탄소 유입의 증진 및 글루코스 취득 시스템의 변형
예를 들어, 포스포글루코이소머라제, 포스포프럭토키나제 및 프럭토스 바이포스페이트 알돌라제 유전자내 돌연변이를 포함하는 비. 서브틸리스에서 해당과정 경로의 상부를 파괴하는 수많은 돌연변이가 공지되어 있다[문헌참조: Sonenshein, L., et al., eds., Bacillus subtilis and other Grain-Positive Bacteria, American Society for Microbiology, 1993, p. 173]. 이러한 돌연변이는 상응하는 유전자(pgi, fruB, fbaA(tsr), iolJ)의 공지된 서열 및 유전자 파괴 기술을 사용하 여 임의의 바실러스 서스틸리스 균주중에서 비교적 용이하게 작제될 수 있다.
비. 서브틸리스에서 글루코스 특이적 PTS 시스템은 바람직하게, 무작위 돌연변이 유발 또는 바람직하게는 재조합 DNA 기본 기술(유전자 파괴)을 통해 ptsG 유전자를 돌연변이시켜 불활성화시킬 수 있다. 후자 기술의 용도는 ptsG 유전자의 DNA 서열의 유용성에 의해 단순화된다[참조: 인터넷 사이트 주소(http://genomeweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList/)].
많은 글루코키나제 및 헥소키나제 유전자가 공지되어 있고 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비. 서브틸리스의 동종성 글루코키나제(glcK 유전자에 의해 암호화됨)는 본 명세서에서 이미 기술한 기술을 사용하여 과발현시킬 수 있다. 헥소키나제는 기질로서 글루코스 및 프럭토스 둘 다를 수용한다는 잇점을 갖는다. 예를 들어, 헥소키나제 I 및 II를 암호화하는 널리 공지된 효모 HXK1 또는 HXK2 유전자를 PTS-결핍 균주에서 사용하고 발현시킬 수 있다.
변형된 글루코스 취득 시스템을 갖는 세균 숙주에서 추가의 글루코스 수송 능력은 2개의 방식으로 성취될 수 있다. 첫째, 글루코스 기본 배지상에서 신속하게 증식하는 클론의 선별은, 적합한 돌연변이 유발 기술(예를 들어, 화학적 또는 UV 유도성 돌연변이 유발)과 연계하여 용이하게 목적하는 성질을 갖는 돌연변이체를 제공하는 매우 강력한 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 또 다른 유기체[바람직하게는, 원핵(예를 들어, 자이모모나스 모빌리스의 glf 유전자)][문헌참조: Weisser, P., et al., J. Bacteriol. 177(11):3351-3354(1995)] 기원의 동종성(예를 들어, glcT1 유전자에 의해 암호화됨) 또는 이종성 글루코스 수송체/촉진체를 바실러스 숙주에서 발현시킬 수 있다.
실시예 11
PPP의 산화적 분기점의 증가된 용량
본 발명의 숙주의 PPP의 용량은 경로의 주요 효소, 즉, 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제(및, 임의로, 포스포글루콜락토나제)를 암호화하는 동종성 또는 이종성 유전자를 과발현시켜 증가시킬 수 있다. 본 발명의 양태에서, 글루코스를 유일하게 6-포스포글루코네이트를 거쳐 대사시키는 유기체(예를 들어, 이종성 발효 젖산 세균) 기원의 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자를 사용한다. 이러한 유전자의 적합한 예는 자이모모나스 모빌리스의 zwf 유전자이다[문헌참조: Barnell, W.O., et al., J. Bacteriol. 172(12):7227-7240(1990)].
실시예 12
사카로마이세스 세레비지애의 TKL1 및 TKL1,2 결핍 균주에 대한 유전학적 작제; 크실리톨 데하이드로게나제(XDH) 암호화 유전자의 형질전환 및 크실룰로키나제(XK) 암호화 유전자의 결실
TKL1 및 TKL2 암호화 유전자 둘 다가 파괴된[문헌참조: Schaaff-Gerstenschlager, I., et al., Eur. J. Biochem. 217:487=492(1993)] 사카로마이세스 세레비지애 균주 W303-1B[문헌참조: Thomas, B.J. and Rothstein, R., Cell 56:619-630(1989)]를 샤프-게르슈타인슐래저 아이 박사(Dr. I. Schaaff-Gerstenschlager)로부터 구하였다. 상기 균주를 H1055로서 재 명명하였다.
전반적으로 하기의 일반적인 방법을 상이한 효모 균주를 작제하는데 사용하였다:
목적하는 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 절단해내고 에펜도르프 튜브(약 200 내지 300 l)에 넣었다. 아가로스를 두터운 살균된 유리 막대를 사용하여 파쇄하였다. 10mM 트리스HCl pH 7.5, 1mM EDTA-완충액(TE) 200 l를 첨가하였다. 임의로, 파쇄된 아가로스/TE를 4℃에서 밤새 방치하여 수율을 개선시켰다. 300 l의 페놀을 첨가하고 1분동안 볼텍싱한 후 즉시 액체 질소에 동결시켰다. 동결된 튜브를 실온에서 15분동안 원심분리하였다. 수상을 깨끗한 튜브로 옮기고 클로로포름-이소아밀알콜(24:1) 300 l를 사용하여 추출하고 0.5분동안 볼텍싱하고 3분동안 원심분리하였다. 수상을 깨끗한 튜브로 옮겼다. DNA를 3M 나트륨 아세테이트 10분의 1 및 냉각된 에탄올 94% 2.5배의 용적으로 밤새 -20℃(또는 30분동안 -70℃)에서 침전시켰다. 침전물을 4℃에서 15 내지 20분동안 원심분리하였다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켰다. DNA를 TE 또는 물에 용해시켰다. 또한, 매뉴얼[QIAquick Spin Handbook for QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen GmbH, Germany]의 지침에 따라 QIA퀵(QIAquick) 방법을 사용하였다.
에스케리치아 콜리를 바이오-래드 유전자 펄서 장치의 지침에 따라 전기천공하여 형질전환시켰다. 모든 효모를 리튬 아세테이트 방법[참조: Hill, J., et al., Nucl. Acids Res. 19:5791(1991); Gietz, D., et al., Nucl. Acids Res. 20:1425(1992)]을 사용하여 형질전환시켰다. 작제된 모든 효모 및 플라스미드는 첨부 1 및 2에 목록되어 있다.
모든 효모를 통상적으로, 30℃에서 호기적 진탕 플라스크 및 250rpm의 진탕기내 효모 추출물 1%, 펩톤 2%(YP)중에서 또는 지적된 탄소원(D는 글루코스이고 F는 프럭토스이다)을 함유하는 필수 아미노산 및 염기를 갖는 변형된 효모 합성 완전 배지[문헌참조: SC; Sherman et al., Methods in yeast genetics. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY, USA(1983)]중에서 배양하였다. 효모 최소 배지는 효모 질소 염기(Merck, Germany) 6.7g/l, 지적된 바와 같은 탄소원 및 균주 영양 요구성인 관계로 요구되는 아미노산 및 염기를 함유한다. TKL 1,2 결핍 균주는 방향족 아미노산 없이 증식할 수 없다.
유일하게 TKL 1 암호화 유전자가 파괴된 효모 균주를 작제한다. 균주 CEN.PK2-1D[H1346으로 재 명명됨][문헌참조: Boles, E., et al., Mol. Microbiol. 20:65-76(1996)]를 숙주 균주로서 사용하였다. TKL1 암호화 유전자의 파괴된 단편을 함유한 플라스미드를 기관[Jorg Hauf(Darmstadt, Germany)]로부터 구입하고 B1087로서 재 명명하였다. 이것은 URA3 암호화 유전자에 의해 파괴된 TKL1 암호화 유전자를 보유한 pUC19 벡터이다[문헌참조: Schaaff-Gerstenschlager, I. and Zimmermann, F.K., Curr. Genet. 24:373-376(1993)]. 플라스미드 B1087을 SacI 및 BamHI로 분해하여 아가로스 겔로부터 분리된 파괴 단편을 방출시켰다. H1346 균주를 단편으로 형질전환시키고 형질전환체를 우라실이 없는 플레이트상에서 선별하여 URA 3 양성 클론을 수득하였다. 결실되어 있다는 것을 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 수득한 균주를 H1764로서 재 명명하였다.
피치아 스티피티스 기원의 크실리톨 데하이드로게나제(XDH)를 암호화하는 XYL2 유전자[문헌참조: Kotter, P., et al., Curr. Genet. 18:493-500(1990)]을 pMA91 발현 벡터[문헌참조: Mellor, J., et al.; Gene 24:1 - 14(1983)]의 BglII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pAOS63(도 11)을 수득하였다. 발현 카세트, 즉 PGK 프로모터와 종결 인자 사이의 XYL2 유전자를 pMA91 벡터로부터 HindIII 단편으로서 분리하고 클레노우 효소로 처리하고 효모 다중 카피 벡터 pRS423[문헌참조: Christianson, T.W., et al., Gene 110:119-122(1992)]의 EcoRV 부위로 클로닝하여 플라스미드 pAOS67(도 12)를 수득하거나, YEp24H[문헌참조: Aalto, M., et al., EMBO Journal 12:4095-4104(1993)]의 PvuII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pAOS64(도 13)을 수득하였다.
피. 스티피티스로부터 기원하는, PGK1 프로모터하에 크실로스 리덕타제(XR)를 암호화하는 XYL1 유전자 및 변형된 ADH1 프로모터[문헌참조: Ruohonen, L., et al., J. Biotechnol 39:193-203(1995)]하에 크실리톨 데하이드로게나제(XDH)를 암호화하는 XYL2 유전자 둘 다를 함유한 벡터 pAOS66(도 14)를 BamHI로 분해하고 XYL2 유전자에 대한 발현 카세트를 함유한 2.2kbp 단편을 아가로스로 겔로부터 분리하고 클레노우 효소로 평활 말단화시켰다. 플라스미드 B713(세균 클로닝 벡터 블루스크립트 KS(+) 다중 클로닝 부위의 HindIII 부위내 1.2kbp 단편으로서 URA3 유전자(Stratagene, CA, USA; URA3은 오로티딘-5'-P 데카복실라제를 암호화한다)을 NcoI로 분해시키고 클레노우 효소로 처리하고 XYL2 발현 카세트를 벡터에 연결하였다. 숙주 균주의 URA3 위치에 표적화시키기 위해 URA3 서열이 양쪽 말단에 플랭킹되어 있는, 변형된 ADH1 프로모터와 ADH1 종결인자 사이에 XYL2 유전자를 갖는 수득한 플라스미드 B995(도 15)를 PvuII 및 HindIII 효소로 분해하였다. HindIII-단편을 QIA퀵 방법(Qiagen GmbH, Germany)을 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다. TKL 1,2 결핍 효모 균주 H1055를 단편으로 형질전환시키고 형질전환체를 YPD 플레이트상에서 밤새 증식시킴에 이어서 레플리카를 FOA(5-플루오로오로트산) 플레이트상에 도말시켜 ura 음성 형질전환체를 선별하였다[문헌참조: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Methods in yeast genetics, 1994, pp. 188-189]. 세포 조 추출물(세포 추출물 준비용 및 XDH 활성 측정용, 실시예 15 참조)로부터 XDH 활성을 측정하고 서던 블롯에 의해 형질전환체내 통합을 확인하였다. 수득한 통합 균주를 H1506으로서 명명하였다.
트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)의 XYL2 동족체는 벡터 pAJ401내에 작제된 cDNA 라이브러리로부터 유도되고[문헌참조: Saloheimo, A., et al., Mol. Microbiol. 13:219-228(1994)] 이때 cDNA는 PGK1 프로모터와 종결 인자사이에 연결하였다. 폴리(A)+ mRNA는 여러개의 식물 다당류를 함유하는 배지상에서 배양된 티. 레에세이 Rut-C30으로부터 분리하였다[문헌참조: Stalbrand, H., et al., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097(1995)]. ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고 이를 플라스미드 pAJ401[문헌참조: Margolles-Clark, E., et al., Appl. Environ. Microbiol. 62:3840-3846(1996)]에 연결하였다. 피치아 스티피티스 기원의 크실로스 리덕타제(XR) 암호화하는 XYL1 유전자를 다중 카피 플라스미드 pMA91[문헌참조: Hallborn, J., et al., Bio/Technology 9:1090-1095(1991)]상에 보유하고 있는 에스. 세레비지애 균주 H475를 약 120g의 cDNA 뱅크 DNA로 형질전환시켰다. 3.7 x 105 개의 독립 클론의 효모 cDNA 뱅크를 수득하였다. 효모 뱅크를 20g/l의 글루코스를 함유한 SC-leu-ura 배지에 수거하고 20g/l의 크실로스를 함유한 SC-leu-ura 플레이트(5 x 105 세포/플레이트)에 도말하여 XR 및 XDH 암호화 유전자 둘 다가 세포내 존재하는 경우 순수한 크실로스 플레이트상에 증식하는 능력에 대해 스크리닝하였다. cDNA 뱅크 플라스미드를 크실로스 플레이트상에서 증식하는 9개의 콜로니로부터 분리하고 H475를 4개의 클론으로 재형질전환시키고 순수한 크실로스상에서 증식하는 능력을 재입증하였다. 6개의 클론의 5' 말단을 서열분석하고 클론의 4개가 피치아 스티피티스의 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 XYL2 유전자와 상동성임을 보여주었다.
PGK 프로모터 및 종결 인자 사이에 위치하는, pAJ401(B1073)내 티. 레에세이의 XYL2 동족체의 발현 카세트를 BamHI 및 HindIII를 사용하여 벡터로부터 분리하고(약 2.5kbp 단편), 단편을 QIA퀵 방법을 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다. 단편을 YEplac 195의 각각의 부위에 연결하여 플라스미드 B1070을 수득하고 이를 숙주 H1052로 형질전환시키는데 사용하여 효모 균주 H1748을 수득하였다. 통합 카세트를 작제하기 위해 단편을 HindIII 및 BamHI로 분해된 플라스미드 B955에 연결시켰다. 플라스미드 B955[문헌참조: Toikkanen, J. and Keranen, S., submitted for publication(1999)]는 각각 폴리링커 영역의 SacI-XbaI 부위 및 XhoI-Asp718 부위에 있는 암호화 영역으로부터 염기쌍 71 번 내지 450번 및 781번 내지 1135번인 2개 단편의 URA3 유전자를 보유한 블루스크립트 SK(-) 벡터이다. 클로닝 벡터에서 잔여 폴리링커 부위인 HindIII 및 BamHI를 사용하여 점착성 말단 연결에 의해 2개의 URA3 단편사이에 XYL2 발현 카세트를 도입하였다. 수득한 플라스미드 B1068(도 16)의 크기는 6.2kbp이었다. 발현 카세트(5' URA3 71 내지 450bp - XYL2 발현 카세트 5'-3'-URA3 781 내지 1135 3')를 SacI-Asp 718로 분해시켜 블루스크립트 SK(-)로부터 분리하고 아가로스 겔로부터 분리하였다. 1g의 단편을 사용하여 TKL1,2 결핍 균주 H1055를 형질전환시켰다. 형질전환체를 선별하고 상기된 바와 같이 확인하여 H1741로서 명명하였다.
개방 판독 프레임(ORF) YLR070c는 피. 스티피티스의 XYL2 유전자와 고도로 상동성이고 크실리톨 데하이드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 것을 밝혀졌다[문헌참조: Richard, P., et al., FEBS Letters 457:135-138(1999)]. ORF YLR070c를 올리고뉴클레오타이드 쌍 oSCXYL21(서열 20) 및 oSCXYL22(서열 21)를 사용하는 PCR에 의해 효모 W303-1B(H1104로서 재명명됨)의 게놈성 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 BamHI로 분해하고, 아가로스 겔로부터 정제하여 pMA91 발현 벡터의 PGK 프로모터와 종결인자 사이의 BglII 부위에 연결시켰다. 수득한 클론 B1163을 사용하여 효모 균주 H1104를 형질전환시킴으로써 균주 H1886을 수득하였다.
크실룰로키나제(XK) 암호화 유전자(XKS1, ORF YGR194c)를 올리고뉴클레오타이드 쌍 oSCXKS11(서열 22) 및 oSCXKS12(서열 23)를 사용하는 PCR에 의해 효모 균주 H1104의 전체 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 EcoRV로 분해하고 아가로스 겔로부터 정제하였다. XK 암호화 단편을 PvuII 부위에서 클로닝 벡터 pRSETC(Invitrogen, The Netherlands)에 연결시켜, 플라스미드 B1025를 수득하였다. 처음에 B1025 기원의 XKS1의 1kbp EaeI 단편을 pZErOTM-1 벡터(Invitrogen)의 호환성 NotI 부위로 이동시킴에 이어서 ScaI로 분해하여 XKS1 서열 중간으로부터 500bp의 단편을 제거하여 결실 카세트를 작제하였다. ScaI로 결실된 XKS1 단편을 NsiI 단편으로서 당해 벡터로부터 블루스크립트 SK(-)의 PstI 부위로 이동시켰다. pFA6-kanMX2 플라스미드[문헌참조: Wach, A., et al., Yeast 10:1793-1808(1994)] 기원의 Kan MK2 단편을 벡터로부터 PvuII-SpeI 단편으로서 분리하고 XKS1 서열의 BstEII 부위로 평활 말단 연결시켜 클로닝함으로써 플라스미드 B1154(도 17)를 수득하였다. B1154의 파괴 카세트를 올리고뉴클레오타이드 쌍 oSCXKS13(서열 24) 및 oSCXKS14(서열 25)를 사용하는 PCR로 증폭시켰다. 상기 단편을 사용하여 게놈(H1506)으로 통합된 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 보유하는 TKL1,2 결핍 균주로 형질전환시켰다. 크실룰로키나제 결핍 형질전환체를 항생제 G418 200mg/l을 함유하는 YPD 플레이트에 스크리닝하였다. 파괴를 PCR 및 서던 블롯으로 확인하였다. 수득한 균주를 H1854로서 명명하였다.
실시예 13
사카로마이세스 세레비지애의 트랜스케톨라제 결핍 균주내 5탄당 포스페이트의 축적
당 포스페이트를 TKL1,2 결핍 균주(H1055) 및 숙주 균주(H1104)로부터 측정하였다. 세포를 SCD 배지상에서 증식시켜 광학 밀도(OD) 600이 1.4(H1055) 및 4.0(H1104)가 되도록 증식시키고 수거하고 물로 1회 세척하고 ml당 습윤 질량이 0.2g인 밀도가 되도록 PBS 완충액(포스페이트 완충된 식염수, 150mM NaCl, pH 6.7)에 현탁시켰다. 글루코스를 20g/l의 농도로 첨가하고 20분후에 세포를 냉각 메탄올중에서 신속하게 퀀칭시키고 메탄올/클로로포름 방법으로 추출하였다[문헌참조: de Koning, W., and van Dam, K., Anal. Biochem. 204:118-123(1992)].
효소 분석을 수행하여 5탄당 포스페이트를 정량하였다. 크실룰로스-5-포스페이트, 리불로스-5-포스페이트 및 리보스-5-포스페이트를 기본적으로 베르크메이어(Bergmeyer)에 의해 문헌[참조: Methods in enzymatic analysis, Vol. 3(1974) Verlag Chemie, Academic Press]에 기술된 바와 같이 측정하였다. 리보스-5P 0.15mM, NADH 0.22mM, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 이소머라제(TPI) 25U, 글리세롤-3P 데하이드로게나제(G3PDH) 0.85U를 사용하여 0.1M TEA(트리에탄올 아민) 완충액(pH 7.2)중에서 크실룰로스-5-포스페이트를 측정하였다. 최종농도가 1.2U/ml인 트랜스케톨라제(TKL) 효소(Sigma, USA)로 반응을 개시하였다. 340nm에서 흡광도의 감소를 모니터하였다. 트랜스케톨라제를 제외한 효소를 제조원[Boehringer Mannheim(Germany)]로 부터 구입하였다. 리불로스-5-포스페이트를 크실룰로스-5-포스페이트로 전환시키는 크실룰로스-5P 에피머라제(Sigma, USA)를 사용하여 반응을 개시하는 것을 제외하고는 리불로스-5-P를 크실룰로스-5P에 대해 기술된 바와 같이 측정하였다. 크실룰로스-5P 에피머라제의 최종 농도는 2U/ml이었다. 과량으로 리보스-5P를 사용하는 것 대신에 크실룰로스-5P(Sigma)를 첨가하는 것을 제외하고는, 크실룰로스-5P 처럼 리보스-5P를 측정하였다. 당 포스페이트의 세포내 농도를 간세도(Gancedo) 및 세라노(Serrano)에 따라 계산하였다[문헌참조: Gancedo, C. and Serrano, R., The Yeasts, vol 3, eds. Rose A.H. and Harroson J.S., pp 205-260, Academic Press Ltd., London,(1989)]. 결과는 표 4에 나타낸다.
TKL1,2 결핍 균주 H1055 및 숙주 균주 H1104내 5탄당 포스페이트의 축적
균주 크실룰로스-5-P(mM) 리불로스-5-P(mM) 리보스-5-P(mM)
TKL1,2 결핍 균주(H1055) 0.50 0.38 0.71
숙주 균주(H1104) 0.02 0.14 0.34
상기 특정 양태에서, 크실룰로스-5P(X5P) 수준은 TKL 결핍 균주에서 25배 높고 리불로스-5P(Ru5P) 및 리보스-5P(Ri5P)의 농도는 숙주 균주와 비교하여 2 내지 3배 높았다. 실험은 5탄당 포스페이트가 TKL 결핍 균주에서 숙주 효모 균주와 비교하여 보다 높은 수준으로 축적한다는 것을 기술하고 있다.
실시예 14
사카로마이세스 세레비지애의 트랜스케톨라제 결핍 균주에 의한 폴리올 및 펜토스의 생산
숙주 균주 H1104 및 TKL1,2 결핍 균주 H1055를 효모 최소 배지에서 배양하였다. 예비 배양물을 SCD 배지에서 OD 600이 3 내지 5가 되도록 증식시키고 세포를 원심분리에 의해 수거하여 물로 1회 세척하고 효모 최소 배지상에서의 배양 실험을 위해 OP 600이 0.1이 되도록 재현탁시켰다. 지정된 시점에서 배양동안에 샘플을 채취하고 OD600을 측정하고 원심분리에 의해 세포를 제거하여 증식 배지 샘플을 베링거 만하임의 D-소르비톨/크실리톨 비색 방법을 사용하여 폴리올에 대해 분석하였다. 결과는 표 5에 나타낸다. 본 분석 키트에 사용되는 소르비톨 데하이드로게나제(SDH)는 D-소르비톨 및 크실리톨을 산화시키고 예를 들어, 정량적으로는 아니지만 보다 낮은 속도로 또 다른 폴리올(예를 들어, 리비톨, 이디톨 및 알리톨)을 산화시킨다. OD 600의 1.0은 무수 세포 중량 0.3g/l에 상응한다.
TKL 1,2 결핍 균주 H1055 및 숙주 균주 H1104에 의해 생산되는 폴리올
무수 세포 중량 g당 폴리올 g1)
균주 8시간2) 23시간 29시간 47시간 53시간 71시간 77시간 95시간 101시간
숙주 균주 H1104 0 0.005 0.008 0.008 0.008 0.008 0.006 0.009 0.009
TKL 1,2 결핍 균주 H1055 0.046 0.081 0.098 0.131 0.140 0.148 0.146 0.178 0.173
1) 베링거 만하임 D-소르비톨/크실리톨 키트로 측정된 폴리올 2) 증식 배지 샘플을 채취할 시점(h)
숙주 균주 H1104와 비교하여 TKL1,2 결핍 균주 H1055에서 폴리올의 생산이 15 내지 20배 증가하는 것으로 관찰되었다.
29h, 53h 및 101h의 증식 배지 샘플을 또한 HPLC로 분석하였다. 분석 전에, 샘플을 동결건조에 의해 5배 농축시켰다. CarboPac PA-10 칼럼과 함께 DIONEX-DX500 기기를 사용하였다[30℃, 유속 1ml/분; 용출제 A = 물, B = 100mM NaOH, C = 300mM Na-아세테이트/100mM NaOH, D = 300mM NaOH; 농도 구배 용출은 다음과 같았다: 21시간째에서 A 100%, 40시간째에 B 100%, 60시간째에 B 50% + C 50%, 60.10시간째에 C 100%, 64시간째에 C 100%, 64.10시간째에 D 100%, 67시간째에 D 100%, 67.10시간째에 A 100%, 82시간째에 A 100%]. 리불로스 및 크실룰로스를 사용되는 분석 조건하에 공동 용출시켰다. 결과는 표 6에 나타낸다.
TKL1,2 결핍 균주 H1055 및 숙주 균주 H1104에 의해 생산되는 폴리올(크실리톨 및 리비톨) 및 5탄당
29시간1) 53시간 101시간
균주 Xol + Rol2) Ribo3) Ribu + Xylu4) Xol + Rol Ribo Ribu + Xylu Xol + Rol Ribo Ribu + Xylu
TKL 1,2 결핍 H1055 0.095 0.067 0.413 0.144 0.094 0.497 0.157 0.122 0.532
숙주 H1104 -- -- -- -- -- -- 0.004 0.001 0.013
1) 증식 배지 샘플 채취 시점(h);2) 크실리톨 + 리비톨 g/g 무수 세포 중량;3) 리보스 g/g 무수 세포 중량;4) 리불로스 + 크실룰로스 g/g 무수 세포 중량

HPLC 결과는 폴리올 생산이 숙주 균주와 비교하여 TKL1,2 결핍 균주에서 40 인자 만큼 증가하였다는 것을 보여준다. 추가로, 5탄당의 생산이 상당히 증가하는데 리보스에 대해서는 175배이고 리불로스 + 크실룰로스에 대해서는 40배로 각각 증가하였다. 1 내지 2% 미만의 폴리올은 아라비톨, 만니톨 또는 소르비톨(후자는 또 다른 실험에 측정됨, 데이타는 나타내지 않는다)이고 TKL 1,2 결핍 균주에 의해 생산되는 폴리올이 리비톨 및 크실리톨임을 밝혀졌다.
실시예 15
피치아 스티피티스 기원의 크실리톨 데하이드로게나제(XDH) 암호화 유전자가 다중 카피 플라미스미드에 함유되어 있거나 게놈에 통합되어 있거나, 트리코더마 레에세이 기원의 크실리톨 데하이드로게나제 암호화 유전자가 게놈에 통합되어 있 는 사카로마이세스 세레비지애의 트랜스케톨라제 결핍 균주에 의한 폴리올 및 펜토스의 생산
a) 피치아 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드에 함유하는 사카로마이세스 세레비지애의 TKL1 결핍 균주에 의한 폴리올의 생산
트랜스케톨라제 활성이 결핍된 효모 균주는 이의 합성 전구체로서 방향족 아미노산에 대해 영양 요구성이고 에리트로스-4-포스페이트가 TKL1,2 결핍 균주에서 합성되지 않는다. 글루코스 일부가 또한 세포의 유지를 지지할 수 있는 경우 이로울수 있다. 이것은 트랜스케톨라제의 주요 이소 형태인 TKL1만이 파괴된 균주에서 가능하다.
TKL1 결핍 균주 H1764 및 등가의 숙주 균주 H1346(별첨 I, 표 32 참조)을 피. 스티피티스(pAOS67; 도 12) 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유한 다중 카피 벡터로 형질전환시켜 균주 H1765 및 H1766을 각각 수득하였다. 수득한 균주를 플라스미드 선별을 위해 히스티딘이 없는 SCD 배지에서 배양하였다. 지정된 시점에서 샘플을 채취하고, 세포를 원심분리하여 베링거 만하임 D-소르비톨/크실리톨 키트를 사용하여 폴리올에 대해 증식 배지를 분석하였다. 결과는 표 7에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 다중 카피 벡터 pAOS67를 함유한 TKL1 결핍 균주 H1765 및 숙주 균주 H1766에 의한 폴리올(크실리톨 + 리비톨) 생산
무수 세포 중량 g당 폴리올 g
균주 13시간1) 19시간 37시간 69시간
TKL 1 결핍 pAOS67 H1765 0.010 0.016 0.014 0.014
숙주 pAOS67 H1766 0.006 0.008 0.007 0.005
1) 증식 배지 샘플의 채취 시점(h)
70시간의 전체 배양 시간에 걸쳐 야생형과 비교하여 TKL1 결핍 균주에서 폴리올의 생산(무수 세포 중량 g당 폴리올 g)이 2배 증가된다는 것이 관찰되었다. 이러한 실험은 트랜스케톨라제 이소형태들중 하나인 TKL 1이 결핍된 효모 균주에서 폴리올의 생산이 증가됨을 지적한다.
b) 피치아 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드상에 함유하고 있는 사카로마이세스 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주에 의한 폴리올 및 펜토스의 생산
숙주 균주 H1104 및 TKL1,2 결핍 균주 H1055를 피. 스티피티스(pAOS67, 도 12) 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유한 다중 카피 벡터를 사용하여 형질전환시킴으로써 각각 균주 H1160 및 H1057을 수득하였다(별첨 I, 표 32). 수득한 균주를 효모 최소 배지에서 배양하였다. 예비 배양물을 플라스미드 선별을 위해 히스티딘 부재 SCD 배지상에 OD600값이 3 내지 5가 되도록 증식시키고, 세포를 원심분리하여 수거하고 물로 1회 세척하고 효모 최소 배지상에서의 배양 실험을 위해 OD600이 0.1이 되도록 재현탁시켰다. 샘플을 배양동안에 지적한 시점에서 채취하고, 세포를 원심분리하여 제거하고 베링거 만하임의 D-소르비톨/크실리톨 키트 및 HPLC를 사용하여 증식 배지 샘플을 폴리올에 대해 분석하였다(실시예 14 참조). 결과는 표 8에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 다중 카피 벡터 pAOS67를 각각 함유하는, TKL1,2 결핍 균주 H1055 및 숙주 균주 H1104, 및 등가의 균주 H1057 및 H1160에 의한 폴리올(크실리톨 + 리비톨)의 생산
29시간1) 53시간 101시간
균주 폴리올2) 크실리톨3) 리비톨3) 폴리올 크실리톨 리비톨 폴리올 크실리톨 리비톨
균주 H1104 0.008 -- -- 0.008 -- -- 0.009 -- --
TKL1,2 결핍 H1055 0.098 -- -- 0.140 -- -- 0.173 -- --
숙주 pAOS67 H1160 0.025 -- -- 0.030 -- -- 0.031 -- --
TKL1,2 결핍 pAOS67 H057 0.346 0.043 0.331 0.463 0.051 0.441 0.738 0.077 0.611
1) 증식 배지 샘플을 채취하기 위한 시점(h) 2) 베링거 만하임 소르비톨/크실리톨 키트로 측정된 폴리올 리비톨 + 크실리톨(g/g 무수 세포 중량) 3) HPLC(DIONEX DX 500 CarboPack PA-10)에 의해 측정된 크실리톨 및 리비톨(g/g 무수 세포 중량)

실시예 14에서 논의된 바와 같이, 폴리올 생산의 15 내지 40배 증가는 숙주 균주 H1104와 비교하여 TKL1,2 결핍 균주 H1055에서 관찰하였다. 피. 스티피티스의 XDH 암호화 유전자를 TKL1,2 결핍 균주의 다중 카피 플라스미드상에서 발현시키는 경우 추가로 약 5배가 증가하였다. 폴리올의 분획물은 크실리톨 및 리비톨로 구성되고 주로 리비톨로 구성되며, 상기 실험에서 폴리올의 10 내지 15%가 크실리톨이었다.
증식 배지 샘플을 또한 HPLC를 사용하여 5탄당에 대해 분석하였다(실시예 14 참조). 결과는 표 9에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 다중 카피 벡터 pAOS67을 각각 함유하는 TKL1,2 결핍 균주 및 숙주 균주인 H1057 및 H1160에 의해 생산되는 폴리올(크실리톨 및 리비톨) 및 5탄당
29시간1) 53시간 101시간
균주 Xol + Rol2) Ribo3) Ribu + Xylu4) Xol + Rol Ribo Ribu + Xylu Xol + Rol Ribo Ribu + Xylu
TKL1,2 결핍 pAOS67 H1057 0.374 0.033 0.224 0.492 0.049 0.310 0.688(220)5) 0.079(130) 0.385(75)
숙주 pAOS67 H1160 -- -- -- -- -- -- 0.0031 0.0006 0.0050
1) 증식 배지 샘플을 채취할 시점(h) 2) 크실리톨 + 리비톨 g/g 무수 세포 중량(표 8의 결과) 3) 리보스 g/g 무수 세포 중량 4) 리불로스 + 크실룰로스 g/g 무수 세포 중량 5) 숙주 균주와 비교하여 TKL1,2 결핍 균주에 의한 생산 증가(x 배)
TKL1,2 결핍 균주에서의 비율 증가는 폴리올(리비톨 + 크실리톨), 리보스 및 리불로스 + 크실룰로스 각각에 대해 40배, 175배 및 40배인 반면에 XDH 암호화 유전자 존재하에 각각의 증가는 220배, 130배 및 75배이고 이것은 폴리올 및 크실룰로스 + 리불로스 쪽으로의 비율이 전환되었음을 입증하는 것이다.
다중 카피 벡터에서 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자의 과발현은 단독의 TKL1,2 결핍 균주와 비교하여 폴리올 및 5탄당의 비율을 상당히 변화시켰다. 5탄당의 양은 1.4배 내지 2배 감소하는 반면에, 폴리올은 4배 증가한다(표 10 참조).
TKL1,2 결핍 균주 H1055 및 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 다중 카피 벡터 pAOS67을 함유한 균주인 H1057에서 폴리올(크실리톨 및 리비톨) 및 5탄당의 비율
29시간1) 53시간 101시간
균주 Xol + Rol(%)2) Ribo(%)3) Ribu + Xylu(%)4) Xol + Rol(%) Ribo(%) Ribu + Xylu(5) Xol + Rol(%) Ribo(%) Ribu + Xylu(%)
TKL1,2 결핍 pAOS67 H1057 59 5 35 58 6 36 60 7 33
TKL1,2 결핍 H1055 17 12 72 20 13 68 19 15 66
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h) 2) 생산되는 폴리올 및 5탄당의 총 %에서의 크실리톨 및 리비톨 비율 3) 생산되는 폴리올 및 5탄당의 총 %에서의 리보스 비율 4) 생산되는 폴리올 및 5탄당의 총 %에서의 리불로스 및 크실룰로스 비율
c) 상이한 기질 특이성 나타내는 XDH 효소를 암호화하는 유전자를 발현시킴에 의한 TKL1,2 결핍 균주에서 생산되는 폴리올 비율의 변화
피. 스티피티스, 트리코더마 레에세이 및 에스. 세레비지애의 크실리톨 데하이드로게나제를 이의 당 기질에 대한 특이성 관점에서 조사하였다. 각각의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피벡터 pAOS67, B1070 및 B1163에서 각각 발현시켰다(실시예 12 참조). 효모 균주 H1104(pAOS67, B1163) 및 H1052(B1070)를 보유한 각각의 다중 카피 벡터 H1160, H1886 및 H1748 각각을 적당한 선별 마커(각각, 히스티딘, 류신 및 우라실)가 없는 SCD 배지에서 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 수거하고 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 동일 완충액중에서 약 75mg/ml 무수 중량에 상응하는 500mg/ml 습윤 중량의 농도로 세포를 재현탁시켰다. 상기 현탁액 1ml을 4℃에서 15분동안 1g 유리 비드(0.5 mmØ)와 함께 볼텍싱하고, 에펜도르프 원심분리기(13,000rpm)에서 원심분리하고 상등액을 분석하였다. XDH 활성을 50mM Pipes KOH pH 7.0, 0.2mM NADH를 함유한 배지에서 분석하였다. 1mM의 최종 농도에서 D-크실룰로스 또는 D-리불로스를 첨가하여 반응을 개시하였다. 340nm에서 NADH의 흡광도에 따라 활성을 측정하였다. 결과는 표 11에 나타낸다.
1mM의 농도에서 D-크실룰로스 및 D-리불로스에 대한 3개의 진균류 XDH 효소의 특이적 활성. D-크실룰로스의 활성이 100%가 되도록 활성을 정상화한다.
크실룰로스 리불로스
피치아 스티피티스 XDH 100 25
트리코더마 레에세이 XDH 100 5
사카로마이세스 세레비지애 XDH 100 10
상기 실시예는 티. 레에세이 및 에스. 세레비지애 기원의 XDH 효소가 피. 스티피티스 기원의 XDH 효소보다 D-크실룰로스에 대해 보다 높은 특이성을 갖는다는 것을 기술한다.
피. 스티피티스 및 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자 동족체를 실시예 12에 기술한 바와 같이 TKL1,2 결핍 균주 H1055의 게놈에 통합시켜, 각각 균주 H1506 및 H1741을 수득하였다. 세포를 SCD 배지에서 배양하고 지정된 시점에서 샘플을 채취하였다. 세포를 원심분리하고 증식 배지 샘플에서 폴리올(크실리톨 및 리비톨)에 대해 분석하였다. 베링거 만하임의 D-소르비톨/크실리톨 키트를 사용하여 총 폴리올을 분석하고, 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 기원의 정제된 리비톨 데하이드로게나제(RDH) 0.07 U/ml을 첨가하여 리비톨의 양을 정량적으로 측정하였다[문헌참조: Bergmeyer H.U., "Methods in Enzymatic Analysis," in Verlag Chemie Vol 3', Academic Press(1974), pp. 1356-1358]. 단독의 RDH로 리비톨을 측정하고 총 폴리올의 양으로부터 리비톨의 양을 공제하여 크실리톨의 양을 수득하였다. 리비톨에 대한 분석 조건은 다음과 같았다: 트리스HCl pH 8.7 450mM, NAD 5mM 및 리비톨 데하이드로게나제 0.07U/ml을 함유한 200 ℓ시약에 샘플을 첨가하고 물로 총 용적이 250ℓ가 되게 하였다. 용액을 37℃에서 20분동안 항온처리하였다. 샘플을 첨가하기 전과 항온처리 후의 흡광도 차이를, 정확한 동일 조건하에서 측정된, 제로 대조군을 포함하는 표준 곡선과 비교하였다. 코바스 미라 플러스 자동화 분석기(Cobas Mira Plus automated analyzer)(Roche)를 사용하여 모든 분석을 수행하였다. 결과는 표 12에 나타낸다.
피. 스티피티스(H1506) 또는 티. 레에세이(H1741)의 XDH 암호화 유전자가 게놈으로 통합된 상태로 이를 함유하는 TKL1,2 결핍 균주 H1055에 의해 생산된 크실리톨 및 리비톨(g/g 무수 세포 중량)
24시간1) 44시간 68시간 106시간
균주 Xol2) Rol2) Xol/Rol3) Xol Rol Xol/Rol Xol Rol Xol/Rol Xol Rol Xol/Rol
H1506 피. 에스 XDH 0.097 0.093 1.0 0.141 0.194 0.7 0.161 0.335 0.5 0.075 0.375 0.2
H1741 티. 알 XDH 0.086 0.069 1.2 0.128 0.119 1.1 0.158 0.133 1.2 0.203 0.142 1.4
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h) 2) 크실리톨(Xol) 또는 리비톨(Rol) g/g 무수 세포 중량 3) 크실리톨/리비톨 비율

상기 실험은 폴리올 생성물 범위가 적당한 폴리올 데하이드로게나제를 선택함으로써 어떻게 조절될 수 있는지의 여부 및 폴리올 데하이드로게나제가 시험관내 측정에 의해 어떻게 특징화될 수 있는지의 여부를 기술하고 있다. 적합한 데하이드로게나제 암호화 유전자를 과발현시킴으로써 Xol/Rol 비율이 목적하는 방향으로 조작될 수 있다.
d) XK 암호화 유전자가 불활성화된 TKL1,2 결핍 균주에 의한 폴리올 생산
피. 스티피티스 XDH 암호화 유전자 H1506이 염색체에 통합되어 있는 TKL1,2 결핍 균주의 크실로키나제(XK) 암호화 유전자를 파괴하여, 실시예 12에서 기술한 바와 같은 균주 H1854를 수득하였다.
세포를 2일동안 SCD 배지상에서 증식시켰다. 예비 배양물을 신선한 배양 배지에 1:50의 비율로 희석시키고 추가로 20시간동안 증식시켰다. 세포를 원심분리하여 수거하고 물로 1회 세척한 다음 물 1ml에 현탁시켰다. SCD 배지상에서 세포를 OD 600 값이 0.2가 되도록 첨가하여 배양을 개시하였다. 100시간의 배양 시간후 샘플을 수거하고 OD 600 값을 측정하고 세포를 원심분리하여 제거하고 RDH와 함께 D-소르비톨/크실리톨 베링거 만하임 키트 및 특이적 리비톨 분석법을 사용하여 증식 배지 샘플의 크실리톨 및 리비톨을 분석하였다(이전 실시예 참조). 결과는 표 13에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되어 있는 TKL1,2 결핍 균주(H1506) 및 추가로 XK 암호화 유전자가 불활성화된 상기 균주(H1854)에 의한 크실리톨 및 리비톨의 생산(g/g 무수 세포 중량)
균주 크실리톨1) 리비톨1) 크실리톨/리비톨2)
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH H1506 0.154 0.726 0.21
TKL1,2 결핍 XK 결핍 피. 스티피티스 XDH H1854 0.375 0.542 0.69
1) 크실리톨 또는 리비톨 g/g 무수 세포 중량 2) 크실리톨/리비톨 비율

XK 결핍 균주 H1854는 H1506 균주와 비교하여 크실리톨을 보다 많이 생산하고 리비톨을 보다 적게 생산한다. 크실리톨의 비율은 18%에서 40%로 증가한다. 리비톨 및 크실리톨의 총량은 상기 실험에서 상당히 변화되지 않지만 비율이 크실리톨 쪽으로 증가한다. 이러한 실험은 XK 암호화 유전자를 파괴함으로써 폴리올의 비율이 변화된다는 것을 기술하고 있다.
실시예 16
사카로마이세스 세레비지애 기원의 DOG1 암호화 유전자 및 에스. 세레비지애 및 자이고사카로마이세스 로욱시 기원의 LTP1 동족체의 클로닝
벡터 YEplac 181내 2-데옥시글루코스-6-포스페이트 포스파타제(DOG1) 암호화 유전자 DOG1[B1016으로서 재명명된 YEp11HP(문헌참조: Sanz, P. et al, Yeast 10:195-1202(1994))]를 산즈(Sanz) 박사로부터 구입하였다. B1016 플라스미드 기원의 DOG1 유전자를 올리고뉴클레오타이드 쌍인 oDOG11(서열 26) 및 oDOG12(서열 27)를 사용하는 PCR로 증폭시켰다. PCR 단편을 HindIII로 분해시키고 아가로스 겔로부터 정제하였다. 단편을 블루스크립트 M13[B609 별첨 I, 표 33]내 변형된 ADH9 프로모터와 ADH1 종결인자 사이의 HindIII 부위에 연결하였다. 수득한 클론을 BamHI 및 PvuII로 분해하고 ADH1 프로모터-DOG1-ADH1 종결인자를 함유하는 BamHI 단편을 아가로스 겔로부터 추출하고 YEplac 195 다중 카피 벡터[문헌참조: Gietz and Sugino, Gene 74:527-534(1988)]의 BamHI 부위에 클로닝시켜 플라스미드 B1020을 수득하였다. 플라스미드 B1020을 사용하여 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈(H1506)에 통합되어 있는 TKL1,2 결핍 균주를 형질전환시킴으로써 균주 H1520을 수득하였다. DOG1 부재 동일 벡터(YEplac 195)를 함유한 대조군 균주를 H1524로서 명명하였다. 또한 플라스미드 B1020을 사용하여 숙주 균주 H1104를 형질전환시킴으로써 균주 H1514를 수득하였다.
자이고사카로마이세스 로욱시 게놈 라이브러리를 작제하기 위해, 제트. 로욱시의 염색체 DNA를 표준 방법을 사용하여 분리하고 Sau3A로 부분적으로 분해하고 2kb를 초과하는 DNA 단편을 예비 아가로스 겔 전기영동으로 이러한 분해물로부터 분리하였다. 케이. 사스나우스카스(K. Sasnauskas)[Institute of Biotechnology, Vilnius, Lithuania]로부터 구입한 이. 콜리-에스. 세레비지애 셔틀 벡터 pL3[문헌참조: Ianushka, A.P., Genetika. 24(5):773-80(1998)]을 BamHI로 분해하고, 송아지 장 포스파타제로 처리하고 제트. 로욱시 염색체 DNA의 Sau3A 단편에 연결하였다. 이러한 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜리 균주 HB101[Stratagene, La Jolla USA]을 형질전환시켰다. 약 20,000개의 형질전환체를 수득하고 60 내지 70%의 클론이 제트. 로욱시 DNA 삽입체를 함유하고 있는 것으로 평가되었다. 형질전환체를 풀(pool)시키고 플라스미드 DNA를 여러개의 당해 풀로부터 표준 방법에 의해 분리하였다. 연구 균주인 에스. 세레비지애에서 여러 표준 영양 요구성 돌연변이(HIS3, URA3, ADE1)를 보충하는 능력에 의해 라이브러리의 특성을 조사하였다.
제트. 로욱시의 게놈성 라이브러리를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애의 TKL1 결핍 균주(H1764, 실시예 12 참조)를 형질전환시킴으로써 10,000개의 독립 클론을 수득하였다. 본 발명자는 TKL1 결핍 균주 H1764는 D-크실룰로스 0.3% 이상의 농도를 함유하는 2% 갈락토스 플레이트상에서 증식할 수 없다는 것을 관찰하였다[이것은 아마도 독성 농도의 5탄당 포스페이트가 축적되기 때문이다]. 독립 클론을 0.5% D-크실룰로스[라이브러리 플라스미드를 선별하기 위한 류신 부재의 2% 갈락토스, 0.5% 크실룰로스 및 3% 크실로스를 갖는 합성 완전 배지]로 도말하고 이들 플레이트상에서 증식하는 보충된 클론을 스크리닝하였다.
제트. 로욱시 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 7일후에 상기된 플레이트상에서 증식할 수 있는 6개의 양성 클론을 수득하였다. 라이브러리 플라스미드를 효모 콜로니로부터 분리하고 제한 절단 효소 분해 및 서열 분석에 의해 분석하였다. 제한 절단 효소 패턴 및 서열 데이타에 따르면, 6개의 플라스미드가 제트. 로욱시의 2개의 상이한 게놈 단편을 함유하고 있다. 게놈성 단편 둘 다는 에스. 세레비지애의 TKL1 암호화 유전자와 고도로 상동성인 ORF를 함유한다. 2개의 ORF를 제트. 로욱시의 TKL1 및 TKL2로서 명명하였다.
게놈 클론의 서열[2개의 TKL 유전자로부터 280bp 하부]을 분석하여 160개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 길이가 483bp인 또 다른 ORF가 존재함을 밝혔다. 이들 2개의 ORF[각각, 제트. 로욱시의 TKL1로부터 하부에 있는, PPPase 1로서 명명된 각 게놈 클론 기원의 ORF(서열 38) 및 제트. 로욱시의 TKL2 하부에 있는 PPPase 2로서 명명된 각 게놈 클론 기원의 OFR(서열 40)]간의 동일성은 94%이었다. 주형으로서, 제트. 로욱시의 PPPase 1(서열 39) 및 PPPase 2(서열 41)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 사용함에 의한 블래스트 연구[문헌참조: Altschul, S.F. et al, http://www.ncbi.nlm.nih.goviblast/(1997)]를 통해 효모를 포함하는 또 다른 종으로부터 여러 동족체를 수득하였다(표 14). 모든 이들 상동성 아미노산 서열의 특징은 1) 상동성 유전자가 암호화하는 단백질이 단백질-타이로신-포스파타제(EC 3.1.3.48) 및/또는 산 포스파타제(EC 3.1.3.2) 단백질 계열에 속한다는 것이고 2) 당해 유전자가 암호화하는 단백질의 크기가 약 17 내지 20kDa이고 3) 당해 유전자가 암호화하는 단백질이 단백질의 아미노 말단 부위에서 저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제의 공통된 활성 부위 모티프 CXXXXXR(여기서, C = 시스테인, X = 임의의 아미노산 및 R = 아르기닌)를 공유한다는 것이다.
또 다른 효모중에서, 제트. 로욱시의 PPPase 1 및 PPPase 2와 가장 상동성인 유전자
효모 ORF 단백질 동일성 % 승인 번호
캔디다 알비칸스(Candida albicans) 581)(59)2) AL033501
사카로마이세스 세레비지애 LTP1 저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제 57(58) 예를 들어, P40347, U11057, L48604, AAA80146, CAA89190, AAB68124
쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) stp1 소형 타이로신 포스파타제 50(50) P41893, A55446, AAA61930
1) 제트. 로욱시 PPPase 1와의 동일성 2) 제트. 로욱시 PPPase 2와의 동일성
에스. 세레비지애 기원의 LTP(저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제) 암호화 유전자를 함유하는 과발현 플라스미드를 작제하기 위해, 발현 벡터 pMA91을 HindIII로 분해하고 PGK1 프로모터와 종결인자를 함유한 1.8kb 단편을 아가로스 겔로부터 분리하였다. 프로모터-종결인자 카세트를 HindIII로 다중 클로닝 부위에서 선형화된 YEplac195 벡터에 연결하여 플라스미드 B1181을 수득하였다. 발현 벡터내 프로모터-종결인자 단편의 배향은 HindIII-PGK1 프로모터-PGK1 종결인자 EcoRI이다. 에스. 세레비지애 기원의 LTP1 암호화 유전자(YPR073C)를 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 쌍 oScLTP5(서열 28) 및 oScLTP3(서열 29)을 사용하는 PCR을 통해 H475의 게놈 DNA(별첨 I, 표 32)로부터 증폭시켰다. PCR 반응은 30회, 95℃에서 45초, 45℃에서 45초 및 72℃에서 2분, 72℃에서 최종 10분 연장이었다. PCR 생성물을 QLA퀵 PCR 정제 키트(Qiagen, Germany)로 정제하고 BglII(PCR 합성 동안에 단편으로 도입된 부위)로 분해하고 B1181의 BglII 부위에 연결하여 플라스미드 B1449(도 18)를 수득하였다. 플라스미드를 사용하여 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합된 에스. 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주(H1741)를 형질전환시켰다(실시예 12 참조). B1449 플라스미드를 함유하는 효모 형질전환체를 H2422로서 명명하였다. 대조군 균주를 수득하기 위해 과발현 플라스미드 B1181을 사용하여 H1741로 형질전환시킴으로써 수득한 균주를 H2421로 명명하였다.
제트. 로욱시 기원의 PPPase 2 암호화 유전자를 함유한 과발현 플라스미드를 작제하기 위해, 발현 벡터 B1181을 사용하였다. 주형으로서 PPPase 2 유전자를 함유하는 제트. 로욱시의 게놈 단편 및 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 쌍의 oZrPPPase5(서열 30) 및 oZrpPPase3(서열 31)을 사용하여 PCR 단편을 작제하였다. PCR 반응(30회, 95℃에서 45초, 45℃에서 45초 및 72℃에서 2분, 72℃에서 최종적으로 10분 연장)후에 PCR 생성물을 QIA퀵 PCR 정제 키트로 정제하고 BamHI(PCR 합성동안에 단편으로 도입된 부위)로 분해하고 B1181의 BglII 부위에 연결시켜 플라스미드 B1450을 수득하였다. 플라스미드를 사용하여 티.레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈으로 통합된 에스. 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주(H1741)를 형질전환시켰다(실시예 12 참조). B1450 플라스미드를 함유한 효모 형질전환체를 H2424로서 명명하였다.
실시예 17
포스파타제 DOG1 및 LTP1을 암호화하는 유전자를 과발현하는 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 펜토스 및 펜티톨의 생산 증가
a) 포스파타제를 암호화하는 DOG1 유전자를 과발현하는 TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 및 펜토스의 생산 증가
2-데옥시-글루코스-6-포스파타제를 암호화하는 에스. 세레비지애의 DOG1 유전자를 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈으로 통합된 TKL1,2 결핍 균주(H1506, 표 32)에서 과발현시켰다. DOG1 암호화 유전자를 함유한 다중 카피 벡터(B1020, 표 16 참조)를 사용하여 상기 언급된 균주 및 숙주 균주 H1104를 형질전환시키고 각각 균주 H1520 및 H1514를 수득하였다. 추가로, 공(empty) 벡터 YEplac 195를 사용하여 균주를 형질전환시키고 대조군 균주 H1524를 수득하였다. 또한 B1020을 사용하여 게놈에 통합된 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 TKL1,2 결핍 균주(H1741)를 형질전환시킴으로써 균주 H2425를 수득하였다.
크실룰로스-5-P, 리불로스-5-P, 리보스-5-P 및 2-데옥시글루코스-6-P에 대한 DOG1의 특이성을 20mM 기질 농도를 사용하여 측정하였다. 50mM 이미다졸-HCl, 10mM MgCl2 완충액, pH6.0을 사용하는 것을 제외하고는 효모 세포 추출물을 실시예 15에 기술된 바와 같이 제조하였다. 동일 완충액중의 추출물 10ℓ 및 기질 210ℓ(20mM)을 30분동안 30℃에서 항온처리하였다. 반응을 최종 2%의 TCA로 종료시키고 방출된 포스페이트를 시약으로서 몰리브덴암모늄(15mM), 아연 아세테이트(100mM), pH5.0을 사용하여 측정하였다. 몰리브덴 블루의 형성을 350nm에서 측정하고, 포스페이트 표준법으로 정량하였다[문헌참조: Sanz, P. et al., Yeast 10:1195-1202(1994); Bencini, D.A. et al., Anal. Biochem. 132:254-258(1983)]. 결과는 표 15에 나타낸다.
Figure 112002023121869-pct00001
예비 배양물을, 플라스미드 선별용 우라실 부재 SCD 배지에서 증식시키고 세포를 수거하고 물로 1회 세척하고 동일한 증식 배지에서 OD 600이 약 0.2가 되도록 현탁시켰다. 세포를 250rpm, 30℃에서 진탕기상에 배양하였다. 배양 샘플을 지정된 시점에서 수거하는 동안에 OD 600을 측정하고 원심분리하여 세포를 제거하였다. 증식 배지 샘플을 HPLC를 사용하여 폴리올 및 펜토스에 대해 분석하였다. 워터스 510 HPLC 펌프, 워터스 712 WISP 및 굴절 지수 검출기(워터스 410 차등 굴절측정기)와의 워터 시스템 인터페이스 모듈 액체 크로마토그래피 혼성 장치를 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 쇼덱스(Shodex)-Pb 칼럼(Shodex SP0810, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan; 80℃, 유속 0.6ml/분, 용출제로서 물)을 사용하여 리보스 및 크실리톨을 동시에 용출시키고 추가로 리비톨을 정량화하였다. 결과는 표 16에 나타낸다.
피. 스티피티스의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되고 DOG1 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드에 함유하고 있는 에스. 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주에 의한 폴리올 및 펜토스(g/g 무수 세포 중량)의 생산
67시간1) 137시간
균주 총합2) 리비톨3) 리보스 + 크실리톨3) 총합 리비톨 리보스 + 크실리톨
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH YEplac195 H1524 0.546 0.412 0.134 0.715 0.544 0.171
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH DOG1(B1020)H1520 0.830 0.608 0.222 1.063 0.772 0.291
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h) 2) 리비톨 + 리보스 + 크실리톨 g/g 무수 세포 중량 3) 리비톨 또는 (리보스 + 크실리톨) g/g 무수 세포 중량
폴리올 및 펜토스의 생산은 배양동안에 소비되는 글루코스와 관련이 있다. 결과는 표 17에 나타낸다.
소비되는 글루코스(g/ℓ)당 생산되는 폴리올 및 펜토스(리비톨, 크실리톨, 리보스; g/l). 또한 무수 세포 중량당 소비되는 글루코스를 보여준다.
균주 22시간1) 67시간
폴리올/glu 농도 %2) glu 농도/g c dw3) 폴리올/glu 농도 % glu 농도/g c dw
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH YEplac 195 H1524 1.0 10.5 2.0 20.3
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH DOG1(B1020) H1520 1.7(70)4) 11.3 2.8(40) 19.8
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h) 2) 소비되는 글루코스(g/l)당 생산되는 폴리올 및 펜토스(리비톨, 크실리톨, 리보스; g/l) % 3) 무수 세포 중량(g/l)당 소비되는 글루코스(g/l) 4) 대조군 균주 H1524와 비교한 증가 %
폴리올 및 펜토스의 생산은 또한 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되고 DOG1 암호화 유전자를 갖는 다중 카피 플라스미드를 함유한 TKL1,2 결핍 균주 H2425(배양 조건 및 분석 방법에 대해서는 발명의 상세한 설명을 참조하고 HPLC 및 효소 분석은 에스. 세레비지애의 LTP1 암호화 유전자를 사용하는 다음 문단의 실시예를 참조한다)를 사용하여 연구하였다. 결과는 표 18에 나타낸다.
티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되고 다중 카피 플라스미드로부터 DOG1 암호화 유전자를 과발현시키는 TKL1,2 결핍 균주에 의한 펜티톨 및 펜토스의 생산
균주 리비톨1) 크실룰로스1) 리불로스1) 총합1) 리비톨 + 리보스 + 리불로스2)
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH H1741 0.061 0.013 0.058 0.132 0.174
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1181 H2421 0.085 0.013 0.047 0.145 0.170
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1020 DOG1 H2425 0.199 0.032 0.090 0.321 0.643
1) 효소 분석에 의해 측정되는 리비톨, 크실룰로스, 리불로스 또는 리비톨 + 크실룰로스 + 리불로스의 총합(g/g 무수 세포 중량) 2) HPLC에 의해 측정되는 총 리비톨, 리보스 및 리불로스(g/g 무수 세포 중량)
본 실시예는 다중 카피 플라스미드로부터 발현된 DOG1 포스파타제가 TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 및 펜토스의 생산을 1.5 내지 4배 증진시킨 다는 것을 기술하고 있다(표 16 참조). 표 18의 결과는 또한 크실룰로스 및 리불로스 생산이 2 내지 3배 증가됨을 기술하고 있다. 글루코스의 생성물로의 전환이 상당히 증진된다(표 17 참조). 즉, 글루코스로부터 생성물의 수율이 증가하여 PPP로의 유입이 증가된다는 것을 입증한다.
b) 포스파타제를 암호화하는 LTP1 유전자를 과발현하는 TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 및 펜토스 생산의 증가
티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합된 TKL1,2 결핍 균주(H1741)를 저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제(LTP1, 실시예 16 참조)로 형질전환시켜 균주 H2422를 수득하고 LTP1 암호화 유전자가 없는 대조군 플라스미드 B1181로 형질전환시켜 균주 H2421(실시예 16 참조)을 수득하였다. 우라실 부재의 SCD 배지에서 단일 콜로니로부터 균주를 배양하였다. 30℃에서 42시간동안 배양한 후에, 원심분리하여 세포를 제거하고 배양 배지 상등액을 수거하였다. 펜토스 및 펜티톨을 HPLC(하기 참조) 또는 COBAS Mira 자동화 분석기(Roche)를 사용하는 효소 분석에 의해 상등액 샘플로부터 분석하였다.
실시예 15의 "c" 부분에 기술된 바와 같이 리비톨 및 크실리톨을 측정하였다. 100mM KH2PO4, pH 7.0 및 0.2mM NADH를 함유하는 반응에서 리비톨 데하이드로게나제(0.07 U/ml)에 의한 NADH의 감소를 분석하여 37℃에서 20분 항온처리 동안에 샘플로부터 리불로스를 측정하였다. 소르비톨 데하이드로게나제(0.2U/ml)가 또한 반응에 사용된다는 것을 제외하고는, 리불로스의 양을 측정하는 것과 마찬가지로 배합된 크실룰로스 및 리불로스의 양을 측정하였다. 배합된 리불로스 및 크실룰로스 양으로부터 리불로스의 양을 공제하여 크실룰로스 양을 수득하였다. 효소 분석에 사용된 리비톨 데하이드로게나제를 이전에 기술된 프로토콜[문헌참조: Bergmeyer, 1974]에 따라 클렙시엘라 뉴모니애(E-87293, VTT 균주 콜렉션)로부터 정제하였다.
워터스 510 HPLC 펌프, 워터스 712 WISP 및 굴절 지수 검출기(워터스 410 차등 굴절측정기)를 장착한 워터 시스템 인터페이트 모듈 액체 크로마토그래피 혼성 장치를 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 사용되는 아미넥스(Aminex) HPX-87H 이온 축출 칼럼(300mm x 7.8mm, Bio-Rad)을 55℃에서 수중의 5mM H2SO4로 평형화시키고 샘플을 0.3ml/분의 유속에서 수중의 5mM H2SO4로 용출시켰다. 표준 용액을 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입한 무수 결정 당으로부터 제조하였다. 결과는 표 19 내지 21에 나타낸다.
효소 분석에 의해 측정되는 바와 같이 LPT1 암호화 유전자를 과발현시킨 균주에 의한 리비톨, 크실리톨, 리불로스 및 크실룰로스(g/g 무수 세포 중량)의 생산
균주 리비톨 크실리톨 크실룰로스 리불로스 총합
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH(H1741) 0.061 측정 불가1) 0.013 0.058 0.132
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1181 (H2421) 0.085 측정 불가 0.013 0.047 0.145
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1449 LTPI (H2422) 0.061 0.014 0.033 0.126 0.234
1) 신뢰 가능한 검출 한계 이하
효소 분석에 의해 측정되는 바와 같이 LTP1 암호화 유전자를 과발현하는 균주에 의한 상이한 펜티톨 및 펜토스의 비율(%)
균주 리비톨 크실리톨 크실룰로스 리불로스
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH(H1741) 46 측정 불가1) 10 44
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1181 (H2421) 59 측정 불가 9 32
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1449 LTP1 (H2422) 26 6 14 54
1) 신뢰 가능한 검출 한계 이하
HPLC에 의해 측정되는 바와 같이 LTP1 암호화 유전자를 과발현하는 균주에 의한 리비톨, 리불로스, 크실룰로스 및 리보스(g/g 무수 세포 중량)의 생산
균주 크실룰로스 리비톨 + 리보스 + 리불로스
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH(H1741) 측정 불가1) 0.174
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1181(H2421) 측정 불가1) 0.170
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B 1449 LTPI(H2422) 0.082 0.384
1) 신뢰 가능한 검출 한계 이하
표 19 내지 21의 결과는 LTP1 암호화 유전자를 과발현하는 균주(H2422)가 LTP1 암호화 유전자가 과발현되지 않는 균주(H1741 및 H2421) 보다 많은 크실룰로스(각각 2.5 배 및 2.5배) 및 리불로스(각각 2.2배 및 2.7배)를 생산하였다는 것을 보여준다. H2422는 또한 이러한 특정 실험에서 크실리톨을 생산하지 않는 H1741 및 H2421과 같지 않게 크실리톨(14mg/g 무수 세포 중량)을 생산하였다. 균주 H2422 내 펜토스 및 펜티톨(리비톨, 크실리톨, 크실룰로스 및 리불로스)의 총양이 이러한 특정 실험에서 H1741 및 H2421과 비교하여 생산이 80 내지 100% 증가한다는 것을 보여주었다.
또한, 상이한 펜토스 및 펜티톨의 비율은 H2422-균주에서 변하였다(표 20). H1741(44%) 및 H2421(32%) 균주와 비교하여 리불로스(54%)를 보다 많이 생산하였다. "크실룰로스 + 크실리톨"에서도 동일하게 관찰된다. H2422는 펜토스 및 펜티톨의 총양으로부터 20%의 "크실룰로스 + 크실리톨"을 생산하는 반면에, H1741 및 H2421은 단지 각각 펜토스 및 펜티톨 총양의 10% 및 9%로 생산하였다. 또 다른 펜토스 및 펜티톨과 비교하여 리비톨 양은 H1741(46%) 및 H2421(59%) 균주와 비교하여 H2422에서 감소(26%)한다.
42시간의 배양 기간동안에 소비되는 글루코스를 측정하고 글루코스의 PPP로의 유입이 증가된다는 것을 입증하였다. 대조군 균주 H2421은 소비되는 글루코스의 1.0%를 펜티톨과 펜토스로 전환시키지만, LTP1 암호화 유전자가 과발현되는 균주(H2422)에서는 소비되는 글루코스의 전환이 1.7%인데 이것은 70%의 증가한 것을 입증하였다.
당해 실시예는 티. 레에세이 기원의 통합된 XDH 암호화 유전자를 보유한 사카로마이세스 세레비지애의 TKL 1, 2 결핍 균주에서 LTP1 암호화 유전자의 과발현이 1.6 내지 1.8 인자만큼 펜티톨 및 펜토스의 생산을 증진시킴을 밝힌다. 더욱이, 펜티톨 및 펜토스의 비가 크실로스, (크실리톨) 및 리불로스 생산 쪽으로 변하였다. 생성물로의 글루코스의 전환은 PPP로의 유입이 증진된 결과로서 70% 증가하였다.
실시예 18
감소된 해당 과정 활성을 연구하기 위한 사카로마이세스 세레비지애의 균주 및 균주의 작제
포스포글루코이소머라제(PGI1) 암호화 유전자가 파괴된 에스. 세레비지애의 2개의 상이한 균주를 볼레스 엑카르트(Boles, Eckard) 박사(Dusseldorf, Germany)로부터 구입하고 H1053[문헌참조: EBY22, Boles, E., et al., Eur. J. Biochem. 217:469-477(1993)] 및 H1054[문헌참조: EBY44, Boles, E., et al., Mol. Gen. Genet. 243:363-368(1994)]로 재명명하였다.
포스포글루코스 이소머라제의 활성이 보다 낮은 에스. 세레비지애의 균주를 작제하기 위해, PGI1 프로모터가 부분적으로 결실된 플라스미드를 볼레스 엑카르트 박사[문헌참조: Rose, M., et al., Eur. J. Biochem. 199:511-518(1991)]로부터 구입하였다. PGI1 결핍 균주 H1054를 HpaI로 선형화된 프로모터가 부분적으로 결실된 플라스미드 pBR4 및 pBR5로 형질전환시켰다. 류신 원영양체를 선별하였다. 수득한 균주를 각각 H1768 및 H1770으로 명명하였다.
6-포스포프럭토-L-키나제(PFK26 및 PFK27)를 암호화하는 유전자 결핍 균주를 뮬러 수잔(Muller, Susanne)(Darmstadt, Germany)로부터 구입하고 H1347로 재명명하였다. 균주를 피치아 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유한 효모 다중 카피 벡터 pAOS64(실시예 12 참조)로 형질전환시켜 수득한 균주를 H1759로 명명하였다.
균주 H1055(TKL1,2 결핍 균주) 및 H1053(PGI1 결핍 균주)를 교배하기 위해 YPF 플레이트에 하나의 배치로서 혼합하였다. 2일후 배치에서 접합체를 조사하였다. YPE 및 SCD-tyr-phe 플레이트의 배치로부터 단일 콜로니를 스트리킹(streaking)하였다. 각 유형의 플레이트로부터 24개의 거대 콜로니를 각각의 플레이트상에 스트리킹함으로써 옮겼다. 모든 48개의 콜로니가 대조구 균주 H5 및 H6와 함께 교배 유형 시험에 의해 2배체임을 입증하였다(별첨 I, 표 32). 4개의 콜로니를 추가로 최소 배지 플레이트[YNB(효모 질소 염기 6.7g/ℓ; Merck, Germany) + 2% 글루코스]상으로 단일 콜로니를 스트리킹하여 옮겼다. 4개의 플레이트로부터 단일 콜로니를 2일동안 예비 포자 형성 플레이트(5% 글루코스)상에 하나의 배치로서 스트리킹하였다. 배치를 추가로 포자 형성을 촉진시키기 위한 고갈 조건을 위해 포자 형성 플레이트(환원된 C- 및 N-공급원 함유)로 옮겼다. 9일 후 플레이트의 4배체를 조사하였다. 40 내지 50%의 4배체를 갖는 2개의 배치를 무작위 포자 분리를 위해 선별하였다. 달팽이 효소 글루쿨라제를 수중에서 1 대 10으로 희석하고 매치-헤드(match-head) 크기의 반을 차지하는 포자 형성 플레이트로부터 효모 현탁액을 효소 희석물 200ℓ와 혼합하였다. 진탕기에서 2시간동안 혼합물을 항온처리하였다. 1ml의 물을 첨가하고 혼합물을 왕성하게 볼텍싱하였다. 희석액 -3, -4 및 -5를 3일동안 YPE상에 도말하였다. 440개의 콜로니를 따내어 2일동안 SC+2% 프럭토스 + 0.05% 글루코스 플레이트상에 스트리킹하였다. 스트리킹을 YPD(PGI1 결핍 돌연변이가 증식하지 못함) 및 SC+2% 프럭토스 + 0.05% 글루코스-tyr-phe(TKL1,2 결핍 돌연변이가 증식하지 못함) 플레이트상에서 복제하였다. 4개의 양성 후보물(YPD 및 SC+2% 프럭토스 + 0.1% 글루코스-tyr-phe상에서 증식하지 못함)을 수득하였다. 서던 블롯팅에 의해 후보물이 파괴된 PGI1 및 TKL1,2를 보유하고 있는지 조사하였다. 염색체 DNA를 BglII(TKL1), ClaI(TKL2) 또는 BglI(PGI1)으로 분해하고, 사용되는 프로브는 PGI1 유전자(+100 내지 +1640 뉴클레오타이드), TKL1 유전자(+115 내지 +1060) 및 TKL2 유전자(+810 내지 +1870)으로부터 기원하였다. 모든 프로브를 PCR로 작제하고 디곡시게닌 표지된 dNTP 혼합물(베링거 만하임, 독일)로 표지시키고 QIA퀵 칼럼으로 정제하였다. 블롯은 모 균주와 비교하여 패턴이 변화되지 않았음을 보여주었다. 4개의 콜로니중에서, I 구성원을 추가의 실험을 위해 선택하고 H1451로 명명하였다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 상기 언급된 균주 H1451에 도입하기 위해, 플라스미드 pAOS67을 SalI 효소로 분해하고 클레노우 효소로 처리하고 이어서 작은 새우 알칼린 포스파타제로 처리하였다. pFA6-kanMX2 플라스미드[문헌참조: Wach, A., et al., Yeast 10:1793-1808(1994)] 기원의 kanMX2 단편을 SalI 및 SpeI로 분리하고, 겔 전기영동으로 정제하고 페놀-액체 질소 방법으로 겔로부터 추출하였다. 정제된 단편을 클레노우 효소로 처리하여 평활 말단을 생성시켰다. kanMX2 단편을 pAOS67 SalI 부위에 클로닝시켰다. 게넨티신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pAOS67을 B1003(도 19)으로서 명명하고 TKL1,2;PGI1 결핍 균주 H1451에 도입하여 균주 H1453을 수득하였다.
실시예 19
PGI1 및/또는 TKL1,2 활성이 없는 사카로마이세스 세레비지애 균주내에서 글루코스의 펜티톨로의 전환 증가
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자 및 카나마이신 내성 마커 유전자(pAOS67+kanr, 도 19)를 함유는 다중 카피 플라스미드 B1003을 사용하여 TKL1,2;PGI1 결핍 균주 H1451을 형질전환시킴으로써 균주 H1453을 수득하였다(별첨 I, 표 32). 수득한 균주 및 다양한 대조군 균주를 2% 프럭토스 및 0.15% 글루코스를 함유하는 합성 완전 배지상에서 증식시켰다. 지적된 바와 같이 배양 동안에 샘플을 채취하고, OD 600을 측정하여 증식을 모니터하고, 세포를 원심분리하여 제거하고, 베링거 만하임 D-소르비톨/크실리톨 키트를 사용하여 증식 배지 샘플의 폴리올(크실리톨 및 리비톨의 일부; 실시예 14 참조)을 분석하고 베링거 만하임 GOD-페리드 키트(Perid kit)를 사용하여 글루코스를 분석하였다. 결과는 표 22에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드상에 함유하고 있는 TKL, PGI1 결핍 균주에 의한 폴리올의 생산
초기 증식 단계(OD 600 약 1.5) 후기 증식 단계(OD 600 약 4.0)
균주 폴리올(mg/g dw)1) 폴리올(mg/g 글루코스)2) 폴리올(mg/g dw) 폴리올(mg/g 글루코스)
PGI1 결핍 H1054 0 0 33 26(3)
TKL1,2 결핍 H1055 측정 불가3) 측정 불가 50 29(3)
TKL1,2 결핍 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1057 32 15(2)4) 110 72(7)
TKL1,2 및 PGI1 결핍 H1451 86 56(6) 96 83(8)
TKL1,2 및 PGI1 결핍 B1003 피. 스티피티스 XDH H1453 203 128(13) 266 190(19)
1) mg/g 무수 세포 중량으로 생산된 폴리올 2) mg/g 소비된 글루코스로 생산된 폴리올 3) 측정 불가 4) 폴리올로 전환된 글루코스의 비율 %
상기 결과는 XDH 암호화 유전자를 함유한 TKL1,2 결핍 균주와 비교하여 글루코스의 폴리올로의 전환이 약 3 내지 6배 높은 XDH 암호화 유전자를 함유한 TKL1,2;PGI1 결핍 균주에서의 수율이 글루코스 g당 폴리올 약 0.2g임을 보여준다. 상기 특정 균주는 서서히 증식하고 따라서 이의 폴리올 생산 또한 느리다. 본 실시예는 해당과정을 차단하고(PGI1 결핍) 펜토스 포스페이트 경로를 차단(TKL1,2 결핍)하여 사카로마이세스 세레비지애에서 글루코스의 폴리올로의 전환을 증진시킴을 기술하고 있다.
실시예 20
해당 과정에서의 부분적인 차단은 사카로마이세스 세레비지애에서 펜토스 포 스페이트 경로로 탄소(글루코스)가 유입되도록 한다.
a) 포스포글루코이소머라제의 활성 감소는 폴리올의 생산을 증가시킨다
포스포글루코이소머라제(PGI1) 암호화 유전자의 전장의 암호화 영역 및 다양한 길이의 이의 프로모터를 함유하는 플라스미드 계열을 볼레스 엑카르드 박사[Dusseldorf, Germany]로부터 구입하였다. 이들 플라스미드로 PGI1 결핍 효모 균주를 형질전환시켜 다양한 PGI1 활성을 나타내는 형질전환체를 수득한다[문헌참조: Rose, M., et al., Eur. J. Biochern. 199:511-518(1991)]. 로즈(Rose)등에 의해 작제된 PGI1-프로모터 결실체를 사용하였다. 센트로머성 플라스미드(pMR206 계열)상에 연속 프로모터 결실체를 갖는 8개의 상이한 플라스미드를 PstI 및 DraI로 분해하였다. 상이한 크기의 프로모터를 갖는 PGI1 유전자를 함유한 단편을 통합 플라스미드 YIplac128[문헌참조: Gietz and Sugino, Gene74:527-534(1998)]에 서브클로닝하였다. 수득한 플라스미드 pRB1 내지 pRB8을 HpaI로 선형화하고 이들을 별도로 사용하여 균주 H1054를 형질전환시키고, 포스포글루코스 이소머라제의 특이적 활성을 측정하였다[문헌참조: E. Boles, personal communication]. 완전한 PGI1 활성의 10%가 글루코스상에서의 증식을 지속시킨다는 것을 염두해 두고 PGI1 활성이 감소된 효모 균주를 작제하기 위해 8%의 PGI1 활성을 제공하는 플라스미드(pRB4) 및 5%의 PGI1 활성을 제공하는 플라스미드(pRB5)를 선별하였다. 플라스미드 pRB4 및 pRB5를 PGI1 결핍 균주 H1054에 도입하여 각각 균주 H1768 및 H1770을 수득하였다(별첨 I, 표 32). 균주를 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유한 다중 카피 플라스미드 pAOS67(도 12)로 형질전환시켜 각각 균주 H1772 및 H1774를 수득하였다. 이들 균주를 0.05% 글루코스를 포함한 2% 프럭토스상에 증식시키고 비교하기 위해 다중 카피 플라스미드 pAOS67를 함유한 PGI1 완전 결핍 균주(H1117)를 배양에 포함하였다. 지정된 시점에서 샘플을 채취하고 OD600을 측정하여 증식을 모니터하였다. 원심분리하여 세포를 제거하고 D-소르비톨/크실리톨 베링거 만하임 키트를 사용하여 증식 배지 샘플의 폴리올(크실리톨 및 리비톨의 일부; 실시예 14 참조)을 분석하였다. 결과는 표 23에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드상에 함유한 PGI1 활성이 감소한 에스. 세레비지애 균주에 의한 폴리올의 생산
폴리올1)
균주 47시간2) 72시간 125시간
PGI1 활성이 감소된 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1772 16 15 18
PGI1 활성이 감소된 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1772 15 17 25
PGI1 활성이 감소된 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1774 17 17 21
PGI1 활성이 감소된 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1774 18 21 21
PGI1 결핍 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1117 8 9 10
1) 베링거 만하임 D-소르비톨/크실리톨 키트에 의해 측정된 크실리톨 + 리비톨의 일부(mg/g 무수 세포 중량) 2) 증식 배지 샘플을 채취한 시점(h)
본 실시예는 PGI1 활성이 감소된 효모 균주가 PGI1 활성이 완전히 없는 균주와 비교하여 폴리올의 생산을 약 2배 증진시킴을 기술하고 있다.
b) 6-포스포프럭토-2-키나제 활성이 없는 에스. 세레비지애 균주에서의 폴리올의 생산
프럭토스-2,6-비스포스페이트(F2, 6P)는 6-포스포프럭토-1-키나제의 강력한 활성화 인자이고 프럭토스-1,6-비스포스페이트-포스포하이드롤라제의 강한 억제제이고, 따라서 해당 과정의 중요한 조절제인 것으로 밝혀졌다. 에스. 세레비지애에서, F2,6P는 2개의 6-포스포프럭토-2-키나제 암호화 유전자 PFK26 및 PFK27에 의해 합성된다. 특히, F2,6P는 당의 신속한 소비를 위해 필요하다[문헌참조: Boles, E., et al., Mol. Microbiology 20:65-76(1996)]. 본 발명자의 관심은 이들 2개의 유전자가 결실되어 해당과정으로의 유입이 감소한 결과로서 글루코스를 PPP로의 유입을 증가시켜 폴리올의 생산이 증가될 것인지에 대해 연구하는 것이었다.
PFK26, PFK27 결핍 균주를 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유하는 다중 카피 벡터(pAOS64)로 형질전환시켰다. 20g/ℓ 글루코스를 함유한 합성 완전 배지에서 세포를 배양하고 우라실을 플라스미드 선별을 위해 제거하였다. OD600을 측정하여 세포 증식을 모니터하고, 배양 배지 샘플의 생산된 폴리올을 베링거 만하임의 D-소르비톨/크실리톨 키트로 분석하였다. 결과는 표 24에 나타낸다.
피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드에 함유한 PFK26, PFK27 결핍 균주에 의한 폴리올(리비톨의 일부 + 크실리톨)의 생산(mg/g 무수 세포 중량)
폴리올 mg/g 무수 세포 중량
균주 23시간1) 32시간 47시간
PFK26, 27 결핍 pAOS64 XDH H1759 4.90 4.89 6.71
PFK26,27 결핍 H1347 2.62 2.38 2.72
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h)
본 실시예는 폴리올이 PFK26,27 결핍 균주에서 생산될 수 있고 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자의 과발현이 폴리올의 생산을 2 내지 3배 증진시킨다는 것을 기술하고 있다.
c) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제의 활성이 감소하여 폴리올의 생산 및 펜토스 포스페이트 경로로의 유입을 증가시킨다
요오드아세테이트(IA) 양의 증가는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 점진적으로 억제시켜 글루코스의 해당과정 하부로의 유입을 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 피. 스티피티스(H1057) 기원의 XDH 암호화 유전자를 갖는 pAOS67 다중 카피 플라스미드를 함유한 TKL1,2 결핍 균주 H1055를 25MIA의 존재하에 배양하였다[문헌참조: Fluka Chemie AG, Switzerland]. 증식 배지는 플라스미드 선별용 히스티딘 부재 SCD 및 7.65g/ℓKNO3이었다. 지정된 시점에서 샘플을 채취하고, OD600을 측정하고, 세포를 원심분리하여 제거하고, 증식 배지 샘플의 폴리올을 베링거 만하임 D-소르비톨/크실리톨 키트로 분석하고 베링거 만하임 GOD-페리드 키트로 글루코스를 분석하였다. 결과는 표 25에 나타낸다.
요오드아세테이트 존재하에, 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 다중 카피 플라스미드에 함유하는 TKL1,2 결핍 균주에 의한 폴리올의 생산
소비된 글루코스로부터 생성된 폴리올 %
28시간 45시간 52시간 69시간 77시간 93시간 100시간
요오드아세테이트 존재하의 TKL1,2 결핍 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1057 0.45 0.74 0.57 0.72 0.87 0.93 1.13
요오드아세테이트 부재하의 TKL1,2 결핍 pAOS67 피. 스티피티스 XDH H1057 0.30 0.48 0.45 0.53 0.65 0.66 0.87
폴리올 생산에 있어서 약 30%의 증가가 요오드아세테이트 존재하에 관찰되고 이것은 소비된 글루코스의 1.2%가 폴리올(크실리톨 + 리비톨의 일부)로 대사되었다는 것이다. 본 실시예는 요오드아세테이트에 의한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제의 활성 감소는 펜티톨의 생산을 증진시키고 글루코스의 펜토스 포스페이트 경로로의 유입을 증진시킴을 기술하고 있다.
실시예 21
산화환원 균형이 변형된 에스. 세레비지애 균주의 작제
플라스미드 YEpMSP3-T[문헌참조: Boles, E., et al., Eur. J. Biochem. 217:469-477(1993)] 기원의 NAD-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH2) 암호화 유전자를 SstI-XbaI 단편으로서 YEplac195 다중 카피 플라스미드[문헌참조: Gietz, R.D and Sugino, A., Gene 74:527-534(1988)]에 클로닝하여 플라스미드 B1007을 수득하였다. B1007 플라스미드를 사용하여 피. 스티피티스 및 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유하는 TKL1,2 결핍 균주(각각 H1506 및 H1741)를 형질전환시킴으로써 각각 균주 H1499 및 H1743을 수득하였다.
또 다른 방법을 선택(실시예 18 참조)하여 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합된 PGI1; TKL1,2 결핍 균주를 작제하여 플라스미드상에 추가의 유전자를 발현시키기 위해 유용한 선별 마커를 수득하였다. 에스. 세레비지애의 HIS3 유전자를 PGI1 암호화 유전자에 통합시켜 PGI1 유전자를 파괴하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍 oPGI11(서열 32) 및 oPGI12(서열 33)를 사용한 PCR로 PGI1 유전자를 증폭시키고 블루스크립트 SK(-) 벡터의 SalI - PstI 부위에 클로닝하여 플라스미드 B1186을 수득하였다. 벡터 pRS423 기원의 HIS3 유전자를 DrdI 단편으로서 블루스크립트 SK(-)의 EcoRV 부위에 클로닝시켜 플라스미드 B1185를 수득하였다. PGI1 함유 벡터 B1186을 EcoRI 및 BstBI로 분해하고, 따라서 PGI1 개방 판독 프레임이 제거된 700bp 단편을 HIS3-블루스크립트 SK(-) 벡터 B1185 기원의 EcoRI-ClaI 단편으로서 HIS3 유전자로 대체하여, 플라스미드 B1187(도 20)을 수득하였다. PGI1-HIS3-PGI1 단편을 SalI-MunI 분해하여 B1187로부터 분리하고, 아가로스 겔로부터 정제하여 이를 사용하여 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합된 TKL1,2 결핍 균주(H1741)를 형질전환시켰다. 형질전환체내에 올바르게 통합되어 있음을 PCR, 서던 블롯, 히스티딘 없이 증식할 수 있는 능력 및 글루코스상에서 증식할 수 없는 능력으로 입증하였다. 수득한 균주를 H1857로서 명명하였다. GDH2 암호화 유전자(B1007)를 함유한 상기된 플라스미드를 사용하여 H1857 균주를 형질전환시킴으로써 균주 H1915를 수득하였다. 대조군 균주를 수득하기 위해, 벡터 YEplac195를 사용하여 균주 H1857을 형질전환시킴으로써 균주 H1916을 수득하였다.
PGK1 프로모터하에 피. 스티피티스 기원의 XR 암호화 유전자 및 변형된 ADH1 프로모터하에 피. 스티피티스 기원의 XDH 암호화 유전자를 함유한 효모 발현 벡터 pAOS66(도 14)을 사용하여 PGI1 결핍 균주 H1053을 형질전환시킴으로써 균주 H1115를 수득하였다.
세포질 NADP-의존성 이소시트레이트 데하이드로게나제 암호화 유전자(IDP2)[문헌참조: Loftus, T.M., et al., Biochemistry 33:9661-9667(1994); Sazanov, L.A. and Jackson, J.B., FEBS Letters 344:109-116(1994)]를 파괴하기 위해, 파괴 카세트를 PCR로 작제하고 균주 H1346의 게놈 DNA를 주형 DNA로서 사용하였다. 5' 말단에 대해 올리고뉴클레오타이드 쌍 oIDP21(서열 34) 및 oIDP22(서열 35)를 사용하고 3' 말단에 대해 올리고뉴클레오타이드 쌍 oIDP23(서열 36) 및 oIDP24(서열 37)를 사용하였다. 증폭된 5' 말단의 길이는 415bp이었다. 5' 말단 단편을 SalI 및 HindIII로 분해하고, 3' 말단 단편을 HIndIII 및 PstI로 분해(주의, 3' 말단 단편은 비특이적 HindIII star 활성 부위를 함유하여 단지 158bp의 3' 단편이 된다)하고 p블루스크립트 SK(-) 벡터를 SalI 및 PstI로 분해하였다. 이들 3개의 성분을 1단계로 함께 연결하여, 크기가 약 3.8kbp인 플라스미드(B1009)를 수득하였다. 1170 bp 단편으로서 URA3 유전자를 Hind III로 분해하여 플라스미드 B713[문헌참조: Toikkanen, J., et al., Yeast 12:425-438(1996)]으로부터 분리하고, 아가로스 겔로부터 정제하고 HindIII 부위에서 플라스미드 B1009에 연결하여, 플라스미드 B1011(도 21)을 수득하였다. IDP2가 파괴된 단편을 SalI 및 Not I로 분해하여 플라스미드 B1011로부터 분리하였다. 단편을 사용하여 PGI1 결핍 균주 H1053을 형질전환시킴으로써 균주 H1576을 수득하였다.
실시예 22
세포 산화환원 균형이 변형된 사카로마이세스 세레비지애 균주내에서 글루코스로부터 펜티톨 및 펜토스 생산의 증가
a) NAD-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 암호화 유전자를 과발현하는 에스. 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주의 폴리올 생산 증가
NAD-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 암호화 유전자를 피. 스티피티스 또는 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합된 TKL1,2 결핍 균주에서 과발현시켰다. GDH2 암호화 유전자를 함유하는 플라스미드 B1007(실시예 21 참조)를 사용하여 효모 균주 H1506 및 H1741을 형질전환시킴으로써 각각 균주 H1499 및 H1743을 수득하였다(별첨 I, 표 32). 균주를 20g/ℓ 글루코스를 함유하는 합성 완전 배지(적합한 플라스미드 선별을 위한 우라실 부재)상에서 배양하였다. 지정된 시점에서 샘플을 채취하고, OD600을 측정하고 원심분리하여 세포를 제거하고 리비톨 데하이드로게나제를 분석에 첨가하여 베링거 만하임의 D-소르비톨/크실리톨 키트를 사용하여 증식 배지 샘플로부터 폴리올을 측정하였다. 결과는 표 26에 나타낸다.
피. 스티피티스(P.s) 또는 티. 레에세이(T.r) 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되고 GDH 2 암호화 유전자가 다중 카피 플라스미드에 존재하는 TKL1,2 결핍 균주에 의한 폴리올(리비톨 + 크실리톨)의 생산(g/g 무수 중량)
생산된 리비톨 + 크실리톨(g/g 무수 세포 중량)
균주 24시간1) 44시간 68시간 81시간 106시간
TKL1,2 결핍 H1055 0.093 0.101 0.146 측정 불가2) 0.204
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH H1506 0.190 0.335 0.496 0.504 0.451
TKL1,2 결핍 피. 스티피티스 XDH B1007 GDH2 H1499 0.316 0.396 0.612 0.633 0.830
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH H1741 0.156 0.246 0.291 0.317 0.345
TKL1,2 결핍 티. 레에세이 XDH B1007 GHH2 H1743 측정 불가 0.207 0.287 0.371 0.532
1) 증식 배지 샘플을 채취하는 시점(h) 2) 측정 불가
본 실시예는 GDH2 암호화 유전자가 과발현됨으로써 XDH 암호화 유전자를 함유한 에스. 세레비지애의 TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올(리비톨 + 크실리톨)의 생산이 50 내지 80% 증진됨을 기술하고 있다.
b) NAD-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 암호화 유전자를 과발현하는 에스. 세레비지애의 PGI1;TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 생산의 증가
티.레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 또한 게놈에 통합된 H1857-포스포글루코스 이소머라제(PGI1) 및 트랜스케톨라제(TKL1,2) 결핍 균주에서 NAD-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH2) 암호화 유전자를 과발현시켰다. H1857을 GDH2 암호화 유전자를 함유한 플라스미드 B1007(실시예 21 참조)로 형질전환시키고 공 플라스미드 YEplac195로 형질전환시켜, 각각 균주 H1915 및 H1916을 수득하였다.
균주 H1915 및 H1916을 대수 증식기까지 배양하였다. 세포를 수거하고 히스티딘 및 우라실 부재의 합성 완전 배지에 OD600가 2인 평균 밀도가 되도록 현탁시켰다. 글루코스를 최종 농도가 20g/ℓ이 되도록 첨가하고 샘플을 즉시 채취하였다. 세포를 2.5시간동안 30℃ 진탕기(250rpm)에서 배양하고 제1 샘플을 채취하였다. 이어서 H2O2를 약 0.5mM의 농도로 첨가하고 추가로 1.5시간동안 배양을 계속하고 이때 2번째 샘플을 채취하였다. OD600을 측정하고, 세포를 원심분리하여 제거하고 증식 배지 샘플을 HPLC(워터스 장치, 아미넥스 HPX-87H 이온 축출 칼럼, 실시예 17 참조)로 분석하였다. 결과는 표 27에 나타낸다.
티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되고 GDH2 암호화 유전자가 다중 카피 플라스미드에 함유된 PGI1;TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 및 펜토스의 생산
글루코스 2.5시간 글루코스 + H2O2 1.5시간
균주 (크실룰로스, 리불로스, 리보스 리비톨)mg/g 세포 dw1) (크실룰로스, 리불로스, 리보스 리비톨)mg/g 세포 dw 크실룰로스 mg/g 세포 dw
TKL1,2, PGI1 결핍 티. 레에세이 XDH YEplac195 H1916 8.5 21 0
TKL1,2, PGI1 결핍 티. 레에세이 XDH B1007 GDH2 H1915 15 46 11
1) 폴리올 + 펜토스 mg/g 무수 세포 중량

GDH2 암호화 유전자를 과발현하는 균주 H1915에서 PPP 유래된 화합물(크실룰로스/리불로스/리보스/리비톨)의 생산이 2배 증가하는 것으로 나타났다. 과산화수소의 첨가는 2개 균주에서의 폴리올 및 펜토스 총 생산에 양성 효과를 가졌다. TKL1,2;PGI1 결핍 균주에서 과발현되는 GDH2 암호화 유전자 부재 및 존재 모두에서 2배 증가하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, H2O2는 특히 GDH2 암호화 유전자를 과발현하는 균주에서만 크실룰로스의 생산을 유도하였다.
실험동안에 균주에 의한 글루코스 소비를 측정하고 소비된 글루코스로부터 생산된 폴리올과 펜토스의 비를 표 28에 나타낸다.
소비되는 글루코스(g/ℓ)당 생산되는 폴리올 및 펜토스(리비톨, 리불로스, 크실룰로스; g/l)
균주 글루코스 2.5시간 글루코스 + H2O2 1.5시간
TKL1,2, PGI1 결핍 티. 레에세이 XDH YEplac195 H1916 0.11 0.24
TKL1,2, PGI1 결핍 티. 레에세이 XDH B1007 GDH2 H1915 0.15(36)1) 0.29(21)
1) 대조군 균주 H1916과 비교한 생산 증가 %
본 실시예는 에스. 세레비지애내 산화 환원 효소의 과발현 또는 산화 환원 균형의 변형이 펜토스 포스페이트 경로의 유입을 증가시켜 PGI1;TKL1,2 결핍 균주에 의한 펜티톨 및 펜토스의 생산을 추가로 증가시킴을 기술하고 있다. 추가로 글루코스로부터 생성물의 수율이 증가하고 이것은 PPP로의 글루코스 유입이 증가하였음을 입증하는 것임을 기술하고 있다.
c) NADP-의존성 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 없는 에스. 세레비 지애 균주에서 펜토스 포스페이트 경로로의 글루코스 유입 증가
세포질 NADP-의존성 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDP2)는 이소시트레이트의 케토글루타레이트로의 산화적 탈카복실화와 동시에 NADP의 환원을 촉매한다. 따라서 펜토스 포스페이트 경로(세포의 세포질에 위치함)의 산화적 분기점의 효소들에 의해 사용되는 동일한 조인자 NADP와 경쟁한다. 따라서, IDP2를 암호화하는 유전자의 파괴는, 세포질내 NADPH를 합성하기 위한 요구가 유일하게 이러한 파괴된 균주에서 상기 경로의 효소에 의해 충족될 수 있음으로써, 글루코스의 PPP로의 유입이 증가할 수 있다.
PGI1 결핍 균주의 증식은 0.2% 초과의 글루코스에서 즉시 억제된다. 돌연변이체내 GDH2 암호화 유전자의 과발현은 숙주 균주와 같이 거의 동일하게 높은 수준의 글루코스 존재하에 증식할 수 있는 능력을 회복한다. 본 발명자의 가정을 시험하기 위해, 본 발명자는 PGI1 결핍 균주 H1053 기원의 IDP2 암호화 유전자를 파괴(실시예 21 및 표 32 참조)하고 2% 프럭토스의 존재하에 상이한 농도의 글루코스에서의 증식을 연구하였다. 결과는 도 22에 나타낸다.
PGI1,IDP2 결핍 균주는 PGI1 결핍 균주와 비교하여 0.25% 글루코스에서 보다 높은 세포 밀도로 증식한다. 추가로, 지속적으로 배양한 후에, PGI1 결핍 균주에게 독성 농도인 0.5% 및 1.0%의 글루코스 농도에서 PGI1, IDP 2 결핍 균주의 증식이 관찰된다. 이들 결과는 IDP2 암호화 유전자가 결실되는 경우 PPP로의 글루코스 유입이 증가한다는 상기 가정을 뒷받침한다.
d)NAD(P)H-의존성 크실로스 리덕타제를 과발현하는 에스. 세레비지애 균주에서 글루코스의 펜토스 포스페이트 경로로의 유입 증가
PGI1 결핍 균주 H1053(별첨 1, 표 32 참조)을 피치아 스티피티스 기원의 크실로스 리덕타제(XR) 및 XDH 암호화 유전자를 함유하는 다중 카피 플라스미드 pAOS66(도 14)로 형질전환시켜, 균주 H1115를 수득하였다.
20g/l 프럭토스 및 0.5g/l 글루코스가 보충된 류신 부재 합성 완전 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 세척하고 OD600이 130이 되도록 100mM 인산 완충액(pH 5.0)중에 재현탁시켰다. 총 당 농도가 20g/l인 D-글루코스/D-크실로스 혼합물을 첨가하고 에탄올 생산을 시판되는 효소 키트(베링거 만하임)를 사용하여 측정하였다. 결과는 표 29 및 30에 나타낸다.
다양한 비율로 D-크실로스 및 D-글루코스를 포함하는 2%의 당을 첨가한 후에 에탄올 농도(mM) 대 시간. 글루코스의 양은 칼럼의 상부에 나타낸다
시간(분) 0% 글루코스 0.05% 글루코스 0.10% 글루코스 0.20% 글루코스 2% 글루코스
80 0.43 2.35 3.41 3.47 0.80
140 1.03 3.79 5.82 6.59 0.87
185 1.42 4.73 5.95 8.10 1.25
245 1.85 6.46 7.55 8.58 1.06
315 2.17 7.01 8.62 10.6 1.22
390 2.94 9.80 10.3 13.9 0.48

0.2의 D-글루코스 D-크실로스 비에서 최대 비율로 정상화되는 에탄올 생산 비율
D-글루코스/D-크실로스(g/g) 정상화된 에탄올 생산 비율
0 0.04
0.025 0.037
0.05 0.44
0.1 0.66
0.2 1
0.4 0.38
0.6 0.11
0.8 0
1 0

순수한 당을 단독으로 사용하는 경우와 비교하여 2개의 당 혼합물을 사용하는 경우 에탄올 생산 비율이 보다 높았다. 단독의 글루코스 또는 단독의 크실로스가 존재하는 경우 에탄올 생산은 낮았다. 이것은 조인자가 고갈되기 때문일 것이다. D-글루코스가 펜토스 포스페이트 경로를 통해 대사되는 경우 NADP가 사용된다. D-크실로스가 크실리톨로 전환되는 경우 NADPH가 사용된다. NADP 또는 NADPH의 고갈이 펜토스 포스페이트 경로를 통한 유입을 제한하는데, 즉 에탄올 생산 비율을 제한한다. 2개의 당이 동시에 대사되는 경우에만 조인자가 효율적으로 재생된다. 각각의 글루코스는 2개의 NADP를 2개의 NADPH로 전환시키고 이어서 이것은 D-크실로스로부터 크실리톨을 생산하는데 사용된다. 에탄올 생산 비율은 이의 유일하게 가능한 경로인 펜토스 포스페이트 경로를 통한 유입을 반영한다. 가장 높은 비율의 에탄올 생산은 글루코스와 크실로스의 혼합물이 동시에 발효되어 조인자를 효율적으로 재생하는 경우 관찰된다. 에탄올 생산 비율은 글루코스 분획이 1/3, 즉 크실로스 대 글루코스의 비가 2인 경우 가장 높게 나타난다. 이것은 조인자 재생의 화학양론을 반영하는데, 즉 2개의 크실로스 등가물이 1개의 글루코스 등가물을 위한 조인자를 재생하는데 요구된다.
본 실시예는 펜토스 포스페이트 경로를 통한 글루코스 발효가 크실로스 리덕타제 반응을 필요로하는 NADPH와 같은 NADP 재생 시스템의 존재에 의해 자극된다는 것을 입증한다.
조인자 요구에 따라, 단독의 XR 암호화 유전자를 과발현하는 균주는 글루코스의 PPP 유래된 생성물로의 전환을 증진시키는 유사한 효과를 나타낸다.
유사하게, 글루코스의 폴리올과 펜토스로의 전환은 TKL1,2 결핍 균주 또는 심지어 결핍되지 않은 균주에서도 증진될 것이다. PGI1 결핍 균주에 대해 상기 기술된 바와 같이 이종성 XR 및 XDH 암호화 유전자를 함유하는 TKL1,2 결핍 균주는 크실로스-5-포스페이트를 상기 경로에서 추가로 전환되지 않아 여전히 탄소원으로서 크실로스를 사용할 수 없다. 숙주 균주에서, 크실로스는 크실로스 리덕타제에 의해 NAD(P)H를 산화시킴과 동시에 크실리톨로 환원된다. 크실리톨은 추가로 크실룰로스로 산화되고 크실룰로스는 펜토스 포스페이트 경로 중간체인 크실룰로스-5P로 인산화된다. 그러나, 크실리톨의 크실룰로스로의 전환은 열역학적으로 불완전하여 통상적으로 크실리톨이 크실로스 배양물에 축적된다. XR 암호화 유전자의 발현은, 펜토스 포스페이트 경로에서 주로 생산되는 NADPH에 대한 요구를 증가시킨다. 본 발명자의 가정은 균주가 TKL1,2가 결핍되어 있음으로 탄소에 대한 유일한 출구는 케토스 또는 폴리올이고, 이것은 XR 암호화 유전자를 과발현하는 TKL1,2 결핍 균주에서 폴리올 및 펜토스의 생산을 증가시킨다.
상기된 실시예는 추가로 크실로스 및 글루코스 둘 다로부터 동시에 크실리톨을 생산하는 것에 관한 것이다.
실시예 23
폴리올 및 펜토스의 생산량이 증가된 사카로마이세스 세레비지애의 선별
TKL1,2 결핍 균주 H1055 및 H1741(후자는 티. 레에세이 기원의 XDH 암호화 유전자가 게놈에 통합되어 있다)(별첨 I, 표 32)을 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스)상에서 밤새 증식시켰다. 세포를 수거하고(원심분리 3000rpm, 5분) 밀도가 2 x 108 세포/ml이 되도록 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시켰다. 돌연변이 유발된 세포의 총량은 20ml중에 4.7 x 109이었다. 세포 500ℓ를 대조군용으로 채취하였다. 돌연변이 유발제 600ℓ(에틸메탄설포나이트(EMS), 시그마)을 세포 현탁액에 첨가하였다. 어떠한 돌연변이 유발제도 대조군 세포 현탁액에 첨가하지 않았다. 세포를 60분동안 교반과 함께 30℃에서 배양하였다. 세포를 이어서 수거하고 물 20ml로 1회 세척하고 2회에 걸쳐 5% 삼황화나트륨(각각 20ml)으로 세척하고 물 1ml로 재현탁하였다. 돌연변이 유발된 세포를 2% 갈락토스, 0.1% 크실룰로스, 0.6% 크실로스, 효모 추출물 및 펩톤을 함유하는 플레이트(균주 각각에 대한 9개의 플레이트)상에 도말하였다. 대조군 및 돌연변이 유발된 세포의 희석액(10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 및 10-8)을 생존 시험을 위해 YPD 플레이트상에 도말하였다. 돌연변이 유발후 생존 능력은 약 60%이었다. 배양한지 6일후에 균주 H1055와 H1741에 대한 각각의 20개 및 13개의 콜로니를 플레이트에서 증식시켰다. 추가로 8일 배양한 후에, 추가의 40개 및 21개의 콜로니를 플레이트에서 증식시켰다. 콜로니를 시험관에서 4일동안 30℃ 및 250rpm에서 SCD 배지 3ml중에 배양하였다. 배양물의 OD600을 측정하고, 세포를 원심분리에 의해 제거하고 펜티톨 및 펜토스 생산에 대해 배양 상등액을 HPLC(HPX-87H 칼럼, 바이로 래드, 분석 조건: 55℃, 유속 0.3ml/분, 용출 5mM H2SO4)로 분석하였다. 결과는 표 31에 나타낸다.
균주 H1055 및 H1741, 및 크실룰로스 내성 돌연변이체의 폴리올 및 펜토스 생산(g/g 무수 세포 중량)
균주 리불로스, 리비톨, 리보스(g/g dw) 크실룰로스(g/g dw) 총합 (g/g dw)1) 리불로스, 리비톨, 리보스(% 증가)2) 총합 (% 증가)3)
H1055 0.66 0.66
3 0.80 0.12 0.93 22 40
8 0.37 0.59 0.96 -43 46
9 0.38 0.54 0.92 -42 39
11 0.50 0.50 0.99 -25 50
15 0.90 0.11 1.01 37 53
58 0.45 0.52 0.98 -31 48
61 0.84 0.13 0.97 28 47
62 0.83 0.13 0.96 26 45
63 0.78 0.30 1.09 19 64
72 0.82 0.16 0.99 25 49
73 1.10 0.27 1.37 66 107
74 1.04 0.20 1.24 57 87
H1741 0.50 0.00 0.50
24 0.75 0.08 0.83 -12 65
87 0.56 0.14 0.71 -67 41
1) 총합: 리불로스, 리비톨, 리보스 및 크실룰로스 g/g 무수 세포 중량 2) 모균주 H1055 및 H1741과 비교하여 증가된 리불로스, 리비톨, 리보스 생산 % 3) 모균주 H1055 및 H1741과 비교하여 증가된 리불로스, 리비톨, 리보스 및 크실룰로스 생산%

수득한 몇몇 돌연변이체는 명백하게 보다 많은 펜티톨 또는 펜토스 당을 생산하였다. 특정 실험에서 검출 가능한 양의 크실룰로스가 모 균주에 의해 생산되지 않지만 몇몇 돌연변이체는 증가된 양의 리불로스, 리보스 또는 리비톨 뿐만 아니라 크실룰로스를 생산하였다. 몇몇 돌연변이체에서 비율은 리불로스, 리보스 및 리비톨에서 크실룰로스로 전환되었다. 본 실시예는 글루코스로부터 펜티톨 및 펜토스의 생산이 증가된 에스. 세레비지애 균주를 수득하는데 있어서 통상적인 돌연변이 유발 효능을 기술하고 있다.
실시예 24
크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제 또는 리비톨 포스페이트 데하이드로게나제를 발현하는 재조합 미생물 균주에 의한 크실리톨 또는 리비톨의 생산
크실리톨 5-포스페이트 데하이드로게나제 및 리비톨-포스페이트 데하이드로게나제를 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로부터 정제하였다[문헌참조: Hausman, S.Z. and London, J., J. Bacteriol. 169:1651-1655(1987)]. 유사한 효소가 또한 스트렙토코커스 아비움(Streptococcus avium)과 같은 몇몇 다른 세균에 존재하는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: London, J., FEMS Microbiol. Reviews 87:103-112(1990)]. 이러한 효소를 암호화하는 유전자는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 분리할 수 있다. 이러한 유전자를 크실룰로스 5-포스페이트 및/또는 리불로스 5-포스페이트를 축적하는 본 발명의 숙주(예를 들어, 비. 서브틸리스 균주 GX7 또는 에스. 세레비지애 H1055)에서 발현시키는 경우, 당해 세포내에 상응하는 펜티톨 5-포스페이트를 생산한다. 축적된 크실리톨 5-포스페이트 또는 리비톨 5-포스페이트는 결국에 예를 들어, 크실리톨-5-포스파타제에 의해 탈인산화되고 세포로부터 분비된다. 리불로스 5-포스페이트 에피머라제의 과발현에 의해 크실룰로스 5-포스페이트와 리불로스 5-포스페이트간에 비교적 용이하게 신속한 평형이 이루어진다. 펜티톨 5-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 반응에서의 평형은 숙주 세포내 산화 환원 전위(NADH/NAD+ 비율)에 의존한다. 예를 들어, 효모 세포내에 존재하는 것으로 공지된 적합한 조건(NADH/NAD+의 높은 비율)하에, 평형은 펜티톨 포스페이트를 매우 강하게 선호하는 쪽으로 전환된다. 따라서, 대사물 유입을 보다 우수하게 전체적으로 조절할 수 있고 이것은 하나의 생성물(크실리톨 또는 리비톨)이 궁극적으로 부산물을 최소로 형성하면서 생산된다는 것을 의미한다.
실시예 25
락토바실러스 람노수스 기원의 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제(XPDH) 유전자의 클로닝
XPDH를 근본적으로 하우스만 및 런던의 방법[문헌참조: J. Bacterial. 169(4):1651-1655(1987)]에 의해 엘. 람노수스 ATCC 15820으로부터 정제하였다.
동종성 단백질의 N-말단을 서열 분석한 결과 다음과 같았다: MKASMLEDLNKFSVKEIDIPSPKKD(서열 42). XPDH를 트립신 분해하여 여러 펩타이드를 또한 분리하고 서열 분석하였다. 하기의 서열을 동정하였다: EWTNSIQLVR[서열 43], FGGFEQYVSVPAR[서열 44], GLDEGCTHVINSAK[서열 45].
XPDH의 부분적인 아미노산 서열을 기준으로 몇몇 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 주형으로서 엘. 람노수스의 염색체 DNA를 사용하는 PCR에서 시험하였다. 조합된 2개의 프라이머[oLRXPD 53(ATGAARGCITCIATGTTIGARGATTT, 서열 46, 센스 프라이머) 및 oLRXPD 31(GCRTTIACIARYTGIATIGARTTNGTCCAYTC, 서열 47, 안티센스 프라이머)]를 사용하여 가장 큰 PCR 생성물(약 850bp의 적당한 크기)을 수득하였다. 당해 PCR 생성물을 방사능적으로 32P로 표지시키고 프로브로서 사용하여 엘. 람노수스 염색체 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다.
파아지 기본 벡터(ZAP 익스프레스TM, Stratagene)를 사용하여 라이브러리를 작제하였다. 보다 특히, 미리 분해된(BamHI/CIAP로 처리됨) ZAP 익스프레스TM 벡터 키트를 사용하여 엘. 람노수스 염색체 DNA의 Sau3A을 부분적으로 분해하여 생성된 약 2 내지 5kb의 DNA 단편 분획물을 클로닝하였다. 라이브러리 크기는 105 초과의 1차 재조합체이었다. 라이브러리 작제, 저장 및 스크리닝은 라이브러리를 20%의 글리세롤 존재하에 -70℃에서 동결 저장하는 것을 제외하고는 제조업자의 추천에 따라 수행하였다.
상기된 PCR 생성물에 강하게 하이브리드화 하는 몇몇 플라크를 분리하고, 정제하여 스트라타진에 의해 제공된 방법을 사용하여 파아지미드 형태로 전환하였다. 주형으로서 파아지미드 클론, 센스 프라이머로서 oLRXPD 53(암호화 영역의 5' 말단에 어닐링됨) 및 파아지미드 벡터 부분에서 어닐링하는 2개의 범용 프라이머중 하나를 사용한 PCR에 의해 분리된 파아지미드내 XPDH 유전자의 암호화 영역의 위치를 결정하였다. 이들 실험을 기초로하여 XPDH 유전자(이의 효소는 중간-쇄 데하이드로게나제 계열에 속하고 약 350개의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 쇄를 갖는 것으로 추측된다)의 전장 암호화 서열을 함유하는 하나의 클론(pBK-CMV(LRXPDH)-21)을 선별하였다. 이러한 클론을 제한 절단 맵핑에 사용하였다. 추측된 XPDH 암호화 영역의 하부 약 200bp에 위치하는 KpnI 부위를 동정하였다. 이러한 정보를 토대로, 여전히 전장 XPDH 유전자를 함유하는 플라스미드 pBK-CMV(LRXPDH)-21의 보다 작은 크기의 유도체를 작제하였다. pBK-CMV(LRXPDH)-21을 KpnI로 가수분해하여 2개의 DNA 단편(약 6 및 0.9kb)을 생성시키고, 보다 큰 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 그 자체를 연결하였다. 수득한 플라스미드를 pBK(LRXPDH)로 명명하고 DNA 서열 분석하였다.
플라스미드 pBK(LRXPDH)내 DNA 삽입체의 서열(서열 48)은 덜 통상적인 개시 코돈 TTG로 시작하는 349개 코돈의 개방 판독 프레임을 함유한다. 추론된 N-말단 아미노산 서열은 실험적으로 결정된 XPDH의 N-말단 아미노산 서열과 정확하게 일치한다. 엘. 람노수스 기원의 XPDH의 추론된 1차 서열(서열 49)은 다수의 중간 쇄 데하이드로게나제의 서열과 상동성이다. 특히, 비. 할로두란스 및 클로스트리디움 디피실의 게놈 서열 분석 프로젝트에서 동정된 여러 추정된 데하이드로게나제의 서열과(서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53)의 상동성이 높은 것으로 관찰된다. 이들 하이드로게나제의 서열이 공지되어 있지만, 이들 서열을 갖는 효소의 기질 특이성은 이전에 잘못 부여되거나 부여되지 않았다. 예를 들어, 비. 할로두란스 기원의 효소(서열 8)는 소르비톨 데하이드로게나제(GenBank PID:g10172799)로 명명되었었다.
실시예 26
발현 벡터 pGTK74(LRXPDH) 및 pGTK24(BHDH)의 작제
발현 벡터 pGTK74(LRXPDH) 및 pGTK74(BHDH)를 2단계로 pGTK24로부터 작제하였다.
제1단계에서, pGTK24에 존재하는 비. 서브틸리스 알돌라제 프로모터를 동일 유기체 기원의 변형된 degQ 프로모터로 대체하였다. 야생형 degQ 프로모터와 비교하여 변형된 것중의 하나는 공지된 degQ36 돌연변이를 도입한 것이었다[문헌참조: Msadek T, et al., J. Bacteriol. 173:2366-2377(1991)]. 변형된 degQ 프로모터를 주형으로서 비. 서브틸리스의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 2개의 올리고뉴클레오타이드 oDEGQ5 (서열 54, GGAGTCGACCATGGGAGCACCTCGCAAAAAAGG) 및 DEGQ 3(서열 55, GGAGAATTCACCTCCTTTCAGAGTCCCGGGTATTTGATCTGTTACTAATAGTGTATCGTCTTTCGG)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 상기 PCR의 생성물을 제한 절단 엔도뉴클레아제 SalI 및 EcoRI로 분해하고 동일 효소로 분해된 pGTK24의 큰 단편과 연결하였다. 수득한 플라스미드 작제물을 pGTK74(도 23)로 명명하였다.
제2 단계에서, 엘. 람노수스 XPDH 유전자의 암호화 영역을 주형으로서 엘. 람노수스의 염색체 DNA를 사용하고 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머[oLRXPD 501(서열 56, GGTGAATTCATGAAAGCATCAATGTTGGAAA) 및 oLRXPD 301(서열 57, GGTTCTAGACCATTATAAAATGCCTCCAATTTCACC)]를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 이러한 반응에 의해 생성된 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI로 분해하고 EcoRI 및 XbaI로 분해된 pGTK74에 연결하였다. 수득한 비. 서브틸리스/이. 콜리 셔틀 벡터 pGTK74(LRXPDH)의 작제 도식 및 구조를 도 24A에 설명한다.
유사하게, 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머[oBHDH2 51(서열 58, GGTCAATTGATGAAAGCCCTTAATTTATACGGCATTCAAGAC) 및 oBHDH2 31(서열 59, GCATCTAGAGTATAGTTGATCATCCTCGTGTTCGG)]를 사용하여 엘. 람노수스 XPDH와 상동성인 비. 할로두란스의 암호화 영역을 증폭시켜 발현 벡터 pGTK74(BHDH2)를 작제하였다. 수득한 DNA 단편을 MfeI 및 XbaI로 분해하고 EcoRI 및 XbaI로 가수분해된 pGTK74에 연결하여 발현 벡터 pGTK74(BHDH2)(도 24B)를 수득하였다.
실시예 27
엘. 람노수스 및 비. 할로두란스 기원의 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자의 발현
비. 서브틸리스 균주 BD170을 pGTK74(LRXPDH) 및 pGTK74(BHDH2)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 25mg/ℓ 카나마이신을 함유한 LB에서 밤새 증식시키고, 세포 추출물을 초음파 처리하여 제조하고 XPDH 활성을 측정하였다. XPDH 활성을 측정하기 위한 조건은 크실룰로스 5-포스페이트를 크실룰로스 대신 기질(통상적으로 5mM 농도)로서 사용한다는 것을 제외하고는 크실리톨 데하이드로게나제 활성을 측정하기 위해 사용되는 것과 유사하였다. 활성은 엘. 람노수스 기원의 XPDH에 대해 대략적으로 0.3U/mg 단백질이고 비. 할로두란스 효소에 대해서는 약 0.5U/mg 단백질이었다.
비. 할로두란스 XPDH가 크실룰로스-포스페이트를 환원시키는 입체특이성은 하기 방법에 의해 입증되었다. D-크실룰로스 5-포스페이트 및 NADH간의 반응을 하기의 조건하에 여러 시간동안 37℃에서 수행하였다: 100mM 트리스-HCl 완충액, pH 7.0, 10mM 크실룰로스 5-포스페이트, 10mM NADH, 효소 용해물 5ℓ. 반응 생성물을 알칼린 포스파타제로 탈인산화시키고 HPLC로 분석하였다. 비반응된 크실룰로스 5-포스페이트에 상응하는 크실리톨 및 크실룰로스만이 반응 혼합물에서 발견되고 어떠한 아라비톨도 발견되지 않는 것으로 보아 "비. 할로두란스 기원의 "크실룰로스 5-포스페이트 리덕타제"(서열 50)가 실질적으로 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제임을 입증하였다. 엘. 람노수스 XPDH의 가장 높은 점수의 4개의 상동체중에서, 비. 할로두란스 기원의 효소가 상동성이 가장 적다는 것을 상기해야 한다. 이것은 또 다른 3개의 상동체(서열 51, 52 및 53)가 또한 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제임이 가장 유력시된다는 것으로서 해석될 수 있다.
실시예 28
XPDH를 발현하는 재조합 비. 서브틸리스 균주에 의한 크실리톨의 생산
비. 서브틸리스 균주 GX7을 pGTK74(LRXPDH)로 형질전환시키고 형질전환체를 10일동안 "배지 통기" 조건(실시예 8에서 정의된 바와 같음)하에서 20%의 글루코스를 함유하는 LB배지상의 시험관에서 배양하였다. 이번에는 배양액 적정액을 HPLC로 분석한 결과 약 35g/ℓ의 크실리톨을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 조건하에서 배양된 대조군 균주(형질전환되지 않은 GX7)의 배양 배지에서는 크실리톨이 검출되지 않았다.
실시예 29
비. 서브틸리스 glcUgdh 오페론의 과발현
비. 서브틸리스의 전체 glcUgdh 오페론을 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 oGDH52(서열 60, GGTGAATTCATGGATTTATTATTGGCTCTTCTCCC) 및 oGDH3(서열 61, GGTAGATCTAGACATTACAGCGATGGTGCTGTC)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR로 수득된 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI로 분해하고 EcoRI 및 XbaI로 분해된 pGTK24 또는 동일쌍의 효소로 분해된 pGTK74에 연결하였다. 2개의 발현 벡터[pGTK24(GDOP) 및 pGTK74(GDOP)][각각 도 25A 및 도 25B에서 설명됨]를 이들 실험 결과로서 수득하였다. 플라스미드 둘 다를 사용하여 비. 서브틸리스 균주 BD170을 형질전환시켰다.
비. 서브틸리스 BD170[pGTK24(GDOP)] 및 BD170[pGTK74(GDOP)] 균주를 37℃에서 LB(25mg/ℓ의 카나마이신)에서 밤새 증식시켰다. 배양물을 수거하고 세포 추출물을 상기된 바와 같이 제조하였다. 기질로서 글루코스를 사용하는 글루코스 데하이드로게나제 활성을 30℃의 340nm에서 NAD+ 환원 비율에 따라 측정하였다. 반응 조건은 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM NAD+, 2mM MgCl2, 10mM 글루코스이었다. 2개 유형의 형질전환체는 유사한 수준의 글루코스 데하이드로게나제 활성(약, 1.5 내지 2U/mg 단백질)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 형질전환되지 않은 BD170에서는 어떠한 활성도 측정되지 않았다(야생형 비. 서브틸리스에서, 글루코스 데하이드로게나제는 단지 포자 형성동안에 발현되는 것으로 공지되어 있다).
비. 서브틸리스 BD170[pGTK24(GDOP)]을 고 통기하에 37℃에서 LB(25mg/ℓ 카나마이신)에서 밤새 배양하였다. 배양물 15ml를 원심분리로 수거하고 세포를 빙냉 반응 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 6.5; 150mM NaCl)으로 세척하였다. 세포를 반응 완충액 800ℓ에 재현탁시켰다. 당 취득을 +37℃에서 14C-글루코스(표지되지 않은 상이한 농도의 글루코스 존재하에)를 사용하여 조사하였다. 14C-글루코스를 제로 시간에 첨가하고 적정액(100ℓ)을 매분마다 채취하였다. 적정액을 니트로셀룰로스 필터(0.2m)상에 퇴적시키고 빙냉 반응 완충액 3ml로 세척하였다. 필터를 건조시키고 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 정량하였다. pGTK24(GDOP)로 형질전환된 비. 서브틸리스 균주에서 보다 높은 글루코스 취득 율을 모든 조건하에서 시험하였다. 예를 들어, 1% 글루코스를 함유하는 용액에서, 형질전환된 균주의 취득율은 형질전환되지 않은 야생형 균주에서 보다 약 4배 높았다(도 26).
이들 결과는 식물성 프로모터하에 발현되는 경우 glcUgdh 오페론이 비. 서브틸리스에서도 기능적이고 실질적으로 펜토스 포스페이트 경로로의 글루코스 유입을 증진시키는데 사용될 수 있음을 암시한다.
실시예 30
엔테로코커스 아비움 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제의 정제 및 부분적인 서열 분석
엔테로코커스 아비움 ATCC 35655를 펩톤 10g/ℓ, 효모 추출물 5g/ℓ, 소고기 추출물 10g/ℓ, K2HPO4 2g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, MgSO4 0.02g/ℓ, MnCl2 0.05g/ℓ, 암모늄 시트레이트 2g/ℓ, 트윈 20 1.1ml/ℓ, 크실리톨 20g/ℓ를 함유하는 배지 5ℓ(pH 6.5)에서 30℃에서 배양하였다. 배양이 정지기 초반(통상적으로 발효시킨지 48시간 후)에 도달했을때 배양을 종료하고, 세포를 원심분리(3000g, 20분)하여 분리하고 물로 세척하여 3mM 디티오트레이톨(완충액 A)을 함유하는 20mM 트리스 HCl(pH 7.2)에 재현탁시켰다. 세포를 60분동안 20℃에서 0.3% 라이소자임(w/v)으로 항온처리하고, 초음파 처리(3회 20초)하여 용해시키고 추출물을 원심분리(12,000g, 20분)하여 정화하였다. 수득한 상등액을 동일 완충액으로 평형화된 Toyopearl DEAE 5PW 칼럼(21.5, 159mm)에 적용된 완충액 A에 대해 투석하고, NaCl 선형 농도 구배(0 내지 1M)로 용출시켰다. 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 활성(실시예 27에서 기술된 바와 같이 분석됨)을 함유한 분획물을 풀시키고, 아미콘 PM-30막상에서 10ml로 농축시키고 완충액 A에 대해 투석하였다. 이러한 제제를 추가로 동일한 완충액중에서 Mono Q HR(5/5) 칼럼(Pharmacia LKB) 상에서 NaCl의 선형 농도 구배(0 내지 1M)로 크로마토그래피하여 분획시켰다. 활성 분획물을 풀하고 50mM 트리스 HCl 완충액, pH 8.0, 100mM NaCl, 3mM DTT로 평형화시킨 세파로스 블루 CL6B(Pharmacia) 칼럼(10_50mm)에 적용하고, 동일 완충액중에서 3mM NADH로 용출시켰다. 최종적으로, 세파로스 블루 크로마토그래피 기원의 활성 분획물을 풀하고 30mM 트리스 HCl, pH 7.4, 1.7M(NH4)2SO4로 평형화된 페닐 슈퍼로스 HR 5/5(Pharmacia) 칼럼상에 로딩하고, 30mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.4)으로 용출시켰다. 정제된 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제(약 0.2mg, 기질이 5mM 크실룰로스 5-포스페이트인 특이적 활성 약 12U/mg단백질)를 물에 대해 투석하고 동결건조시켰다.
이. 아비움 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제에 의한 D-크실룰로스 5-포스페이트 환원에 대한 입체특이성을 하기의 과정에 따라 입증하였다. 하기의 조건하에서 여러 시간동안 37℃에서 D-크실룰로스 5-포스페이트 및 NADH간의 반응을 수행하였다: 100mM 트리스-HCl 완충액, pH 7.0, 10mM 크실룰로스 5-포스페이트, 10mM NADH, 효소 1U. 반응 생성물을 알칼린 포스파타제로 탈인산화시키고 HPLC로 분석하였다. 단지 아라비톨 및 크실룰로스(비반응된 크실룰로스 5-포스페이트에 상응함)가 반응 혼합물에서 발견되는 것으로 보아 이. 아비움 기원의 "크실룰로스 5-포스페이트 리덕타제"가 D-아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제임을 입증하였다. 어떠한 다른 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제가 당해 기술 분야에 기술되어 있지 않다.
단백질 서열은 기관[Institute of Biotechnology, University of Helsinki]에 의해 제공된 상업 서비스를 통해 수득하였다. 하기의 4개의 펩타이드 서열을 사용하여 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자를 클로닝하였다:(QYNLCPHR, 서열 62; EIEYIGSR, 서열 63; KQGQFIQVGLFANK, 서열 64; GAINIDEMITK, 서열 65). 다수의 축퇴성 올리뉴클레오타이드를 이들 서열을 기준으로 디자인하고 이. 아비움 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 프라이머로서 시험하였다. 약 0.65kb의 PCR 생성물을 생성하는 프라이머 쌍 oXP-1F(센스 프라이머, CARTATAATTTITGTCCICATMG, 서열 66) 및 oXP-4R(안티 센스 프라이머, ATCATTTCRTCIATRTTIATIGCICC, 서열 67)을 사용하여 최상의 결과를 수득하였다. 이러한 PCR 생성물을 하이브리드화 프로브로서 사용하여 실시예 25에 기술된 바와 같이 엘. 람노수스의 유전자 라이브러리와 동일한 방법으로 작제된 이. 아비움의 유전자 라이브러리를 스크리닝하였다. 몇몇 강하게 하이브리드화하는 파아지 클론을 분리하고, 정제하여 스트라타진에 의해 추천된 방법에 따른 파아지미드 형태로 전환시켰다. 본래의 0.65kb PCR 생성물의 제한 절단 패턴과 부분적으로 일치하는 제한 절단 패턴을 나타내는 하나의 클론을 사용하여 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자를 서열 분석하였다. 서열(서열 68)은 전형적인 리보솜 결합 부위에 이어서 352개 코돈의 개방 판독 프레임을 함유한다. 이. 아비움 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제의 추론된 아미노산 서열(서열 69)은 다수의 중간 쇄 데하이드로게나제와 상동성이다. GenBank에서 "소르비톨 데하이드로게나제"로서 주해되어 있는 비. 할로두란스 기원의 단백질의 추론된 서열(서열 70)과 특히 높은 상동성을 나타낸다는 것이 관찰되었다.
서열 31
이. 아비움 및 비. 할로두란스 기원의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제의 비. 서브틸리스에서의 발현
아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 둘 다를 크실리톨-포스페이트 데하이드로게나제의 발현에 사용되는 것(실시예 26)과 동일한 도구 및 방법을 사용하여 발현시켰다. 간략하게, 2개의 아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제 유전자의 암호화 영역을 효소가 분리된 미생물의 염색체 DNA를 사용하고 적당한 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이. 아비움의 경우에 프라이머는 oAPDH 51 GGTGAATTCATGAGTAAAACAATGAAGGGTGTTTCCAAGC(서열 26) 및 안티센스 프라이머 oAPDH 31 GGTGGATCCTCTAGAATTTTTGGACAGCTTCCTTGATTC(서열 27)이었다. 비. 할로두란스에 대해서는, 센스 프라이머가 oBHDH 5(GAGGGAATTCATGAAAGCATTAGTAAAAACACAACATGGC, 서열 28)이고 안티센스 프라이머는 oBHDH 3(CAAAGATCTAGAAGCTTCGTCCATACGGTCCTCCTTTTCCCTAAT, 서열 29)이었다. 수득한 PCR 생성물을 제한 절단 엔도뉴클레아제 BamHI 및 EcoRI의 혼합물로 분해하고 효소의 동일 혼합물로 가수분해된 pGTK74(도 27A 및 27B)에 연결하였다. 수득한 발현 벡터 pGTK74(APDH)(도 27A) 및 pGTK74(BHDH)(도 27B)를 사용하여 비. 서브틸리스 균주 BD170을 형질전환시키고 이 둘다가 높은 수준으로 "D-크실룰로스 5-포스페이트 리덕타제"를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 비. 할로두란스 기원의 이전의 미지의 효소에 의한 D-크실룰로스 5-포스페이트 환원에 대한 입체특이성은 실시예 30에 기술된 바와 같이 측정하였다. 상기 효소는 실질적으로 D-아라비톨-포스페이트 데하이드로게나제임이 밝혀졌다.
실시예 32
비. 서브틸리스의 재조합 균주에 의한 아라비톨의 생산
플라스미드 pGTK74(APDH)를 사용하여 펜툴로스-생산성 비. 서브틸리스 균주 GX7을 형질전환시켰다. 10% 글루코스를 함유한 LB 액체 배지에서 실시예 8에 기술된 바와 같이 "배지 통기"의 조건하에서 균주를 배양하였다. 약 35 내지 40g/ℓ에 달하는 아라비톨이 배양 배지에 축적되는 것으로 관찰되었다.
별첨 I- 표 32 및 표 33
본 연구에 사용되는 효모 균주
H158 그레고리 페인(Gregory Payne)[Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, Los Angeles, California 90095-3717, USA]으로부터 입수한 GPY55-15B(MAT_, leu2-3, leu2-112, ura3-52, trp1-289, his4-519, prb1, cir+)
H475 H158 + XR 숙주, 피. 스티피티스 XYL1mc
H1104 W303 MAT, ade2-1, his3-11/15, leu2-3/112, trpl-1, ura3-1, can1-100-[Thomas B.J. and Rothstein R., Cell 56, 619-630(1989)]
H1055 H1104 tkl1, tkl2 TKL1,2 결핍
H1057 H1055 + pAOS67 TKL1,2 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1160 H1104 + pAOS67 숙주, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1499 H1506 + GDH2 TKL1,2 결핍, 피. 스티피티스 XYL2int, 에스. 세레비지애 GDH2mc
H1506 H1055 + P.s XDHint TKL1,2 결핍, 피. 스티피티스 XYL2int
H1520 H1506 + DOG1 TKL1,2 결핍, 피. 스티피티스 XYL2int, 에스. 세레비지애 DOG1mc
H1514 H1104 + DOG1 숙주, DOG1mc
H1524 H1506 + YEplac195 TKL1,2 결핍, 피. 스티피티스 XYL2int, YEplac195
H1748 H1052 + T.r XDHmc 숙주, 티. 레에세이 XYL2mc
H1741 H1055 + T.r XDHint TKL1,2 결핍, 티. 레에세이 XYL2int
H1743 H1741 + GDH2 TKL1,2 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, 에스. 세레비지애 GDH2mc
H1854 H1506xk TKL1,2, XKS1 결핍, 피. 스티피티스 XDHint
H1857 H1741 pgi1 TKL1,2, PGI1 결핍, 티. 레에세이 XYL2int
H1886 H1104 + B1163 숙주, 에스. 세레비지애 XYL2 상동체mc(YLR070C)
H1915 H1857 + GDH2 TKL1,2, PGI1 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, 에스. 세레비지애
H1916 H1857 + Yeplac195 TKL1,2, PGI1 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, Yeplac195
H2421 H1741 + B1181 TKL1,2 결핍, 티.레에세이 XYL2int, YEplac195 +PGK1 프로모터 및 종결인자
H2422 H1741 + LTP1 TKL1,2 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, 에스. 세레비지애 LTP1mc
H2424 H1741 + PPPase 2 TKL1,2 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, 제트. 로욱시PPPase2mc
H2425 H1741 + DOG1 TKL1,2 결핍, 티. 레에세이 XYL2int, 에스. 세레비지애 DOG1mc
H1346 CEN.PK2 Mat a leu2-3/112 ura3-52trpl-289 his3dl MAL2-8c SUC2[Boles E., et al., Mol. Microbiol. 20, 65-76(1996)]
H1347 H1346 pfk26 pfk27 PFK26, PFK27 결핍
H1759 H1347 + pAOS64 PFK26, PFK27 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1764 H1346tkl1 TKL1 결핍
H1765 H1764 + pAOS67 TKL1 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1766 H1346 + paOS67 숙주, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1052 ENY.WA-1A MAT ura3-52 leu2-3/112 trpl-289 his3dl MAL2-8c MAL3 SUC3[Boles E. and Zimmermann F.K., Curr. Genet. 23, 187-191(1993)]
H1054 H1052pgil PGI1 결핍
H1117 H1054 + pAOS67 PGI1 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1768 H4/pRB4 감소된 PGI1 활성
H1770 H5/pRB5 감소된 PGI1 활성
H1772 H1768 + pAOS67 감소된 PGI1 활성, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1774 H1770 + pAOS67 감소된 PGI1 활성, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1053 H1052pgil PGI1 결핍
H1115 H1053 + pAOS66 PGI1 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1451 H1053xH1055 pgil, tkl1, tkl2 TKL1,2, PGI1 결핍
H1453 H1451 + XDH TKL1,2, PGI1 결핍, 피. 스티피티스 XYL2mc
H1576 H1053idp2 PGI1, IDP2 결핍
1)mc = 다중 카피 플라스미드 2) int = 게놈으로 통합됨
본 연구에서 효모 유전자 조작을 위해 사용되는 플라스미드 벡터
pUC19 파마시아 바이오텍, 웁살라, 스웨덴
블루스크립트 SK(-) 스트라타진, 미국
블루스크라이브 M13 스트라타진, 미국
pAJ401(URA3)1) Saloheimo A., et al., Mol. Microbiol. 13, 219-228(1994)
pFA6-kanMX2 Wach A., et al. Yeast 10, 1791-1808(1994)
pRS423(HIS3) Christianson T.W., et al., Gene 110-122(1992)
pRSETC 인비트로겐, 네덜란드
pMA91(LEU2) Mellor J., et al., Gene 24, 1-14(1983)
pZErOTM-1 인비트로겐, 네덜란드
YEplac181(LEU2) Gietz R.D. and Sugino A., Gene 74, 527-534(1988)
YEplac195(URA3) Gietz R.D. and Sugino A., Gene 74, 527-534(1988)
YEp24H(URA3) Alto M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7331 - 7336(1997)
YEpMSP3-T YEplac181 + 에스. 세레비지애 GDH2[문헌참조: Boles E., et al., Eur. J. Biochem. 217, 469-477(1993)]
B609 블루스크라이브 M13중의 중간 ADH1 프로모터 및 종결인자[문헌참조: Ruohonen L., et al., J. Biotechnol. 39, 193-203(1995)]
B713 블루스크립트 KS(+) 중의 1.1kb HindIII 단편으로서 URA3 유전자
pAOS63(LEU2) pMA91중의 피. 스티피티스 XYL2
pAOS64(URA3) YEp24H중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 피. 스티피티스 XYL2
pAOS66(LEU2) pMA91중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 피. 스티피티스 XYL1, 및 중간 ADH1 프로모터 및 종결인자를 갖는 피. 스티피티스 XYL2
pAOS67(HIS3) pRS423중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 피. 스티피티스 XYL2
B955 블루스크립트 SK(-) 중의 URA3의 71 내지 450bp 및 781 내지 1135 bp 단편[문헌참조: Toikkanen J. and Keranen S., submitted for publication(1999)
B995 URA3의 NcoI 부위중의 피. 스티피티스 XYL2
B1003(KMX2) pAOS67 + kanr, 가나마이신/G418 내성
B1007(URA3) YEplac195 + GDH2, YEplac195중의 YEpMSP3-T 기원의 에스. 세레비지애 GDH2
B1009 블루스크립트 SK(-) + 블루스크립트 SK(-)중의 에스. 세레비지애 IDP2의 IDP2, 5' 491bp 내지 3' 158 bp 단편
B1011 블루스크립트 SK(-) + IDP2 파괴, IDP2 단편 사이의 B1009 HindIII 부위로 연결된 B713 기원의 URA3 유전자
B1016(LEU2) YEp11Hp + DOG1, HindIII-PstI 단편으로서 YEplac 181[문헌참조:Santz P., et al., Yeast 10, 1195-1202(1994)]중의 DOG1
B1020(URA3) YEplac195 + DOG1, YEplac195중의 중간 ADH1 프로모터 및 종결인자를 갖는 에스. 세레비지애 DOG1
B1025 pRSETC + XKS1
B1068 B955 + XYL2, URA3 단편사이에 B955중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 티. 레에세이 XYL2
B1073(URA3) pAJ401 + XYL2, pAJ401중의 티. 레에세이 XYL2
B1070(URA3) YEplac195 + XYL2, YEplac195중의 티. 레에세이 XYL2
B1087 TKL1 파괴 카세트, URA3로 파괴된 TKL1 유전자를 함유하는 pUC19[문헌참조: Schaaff-Gerstenschlager I. and Zimmermann F.K., Curr. Genet. 24, 373-376(1993)]
B1154 블루스크립트 SK(-) + xks 파괴 카세트, kanMX2 단편으로 파괴된 에스. 세레비지애 XKS1
B1163(LEU2) pMA91 + YLR070C, pMA91중의 에스. 세레비지애 XYL2 상동체
B1181(URA3) YEplac195 + PGK1, Yeplac195 + pMA91 기원의 PGK1 프로모터 및 종결인자
B1185 블루스크립트 + HIS3, 블루스크립트 SK(-)중의 HIS3를 함유하는 pRS423 기원의 DrdI 단편
B1186 믈루스크립트 + PGI1, 블루스크립트 SK(-)중의 에스. 세레비지애 PGI1
B1187 B1186 + 파괴된 PGI1, B1186중의 PGI1의 EcoRI-BstBI 부위로 연결된 B1185 기원의 HIS3
B1449(URA3) B1181 + LTP1, YEplac195중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 에스. 세레비지애 LTP1
B1450(URA3) B1181 + PPPase2, YEplac195중의 PGK1 프로모터 및 종결인자를 갖는 제트. 로욱시 PPPase2
1) 다중카피 발현 벡터의 선별 유전자

본 발명을 완벽하게 기술함으로써 당해 기술 분야의 기술자는 본 발명이 본 발명 또는 이의 임의의 양태의 취지 또는 범위에 영향을 끼지치 않고 조건 및 계수등의 동등 범위 및 광범위내에서 수행될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 본원에 인용된 모든 문헌은 본원에 참조로서 전부가 인용된다.
<110> Danisco Sweeteners OY <120> Manufacture of Five-Carbon Sugars and Sugar Alcohols <130> 5-2002-004541-9 <150> US 09/488,581 <151> 2000-01-21 <160> 70 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 1 caatagcgac ggagagttag g 21 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 2 cgacgaattc cggcgtcagc ctgaatgg 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 3 cgacaagctt atcgaatcgg ctgatttgg 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 4 ccaacgtcga cgaaatcaga gacgccg 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 5 cccgaattct gtcctcctta tgtagcctg 29 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 6 ccgagaattc atgaaacagt atttgattgc cccc 34 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 7 cctctagagg atccaaaagc gacgccgcga atatcttcaa ac 42 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 8 cccggatcca agtaataaaa agaccgccg 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 9 cccaagcttt ccctctatca aaaaatgcgg 30 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 10 gttgaattcg cgtcgacgcg ttgctggcgt ttttcc 36 <210> 11 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 11 caagtgatca taaaatttat gaacgtatag caaccactga gcgtcagacc ccg 53 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 12 aattaagctt tccggatcct cgagtctaga ccgaattccc g 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 13 tcgacgggaa ttcggtctag actcgaggat ccggaaagct t 41 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 14 cgatagtact tgcttgaaac ccaggacaat 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 15 cgatggatcc gggaccccta tctagcgaac 30 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 16 gaggaattca tgaaggcatt agtattagag aaagc 35 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 17 gaggaagctt ggatccagca caattttcac atcagtcgc 39 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 18 ccacggatcc gtcaagagta cttgaaagg 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 19 caccgtcgac gttccatctt ttcatcccc 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 20 gaacaggatc cagcatgact gacttaacta 30 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 21 gtattggatc ccttggatgc caaaagtta 29 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 22 ccagtgatat cgaggatgag attagtac 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 23 ccagtgatat ctgtacttgt cagggcat 28 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 24 tcagggtcct gccagca 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 25 cgctaggaac gatctcc 17 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 26 tgagtaagct tatggcagaa ttttcagct 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 27 ttgtcaagct tttgtttact caggccctt 29 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 28 ggaagatcta taatgacaat tgaaaaacca aaaatatcg 39 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 29 ggaagatctt tataactctt tttttaaaaa ctgtttgg 38 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 30 agaagaggat ccataatgac tcagggtgaa aagatctc 38 <210> 31 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 31 agaagaggat ccttacaatt cactatctaa gaatgattca c 41 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 32 ggcacgctgc agagagcgat ttgttcacat 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 33 cgaccggtcg actaccagcc taaaaatgtc 30 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 34 gacagcctgc aattgtatgt 20 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 35 gggcccaagc tttgtactga tcgcc 25 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 36 gggcccaagc ttgacgcggt ggaatctag 29 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 37 cactagtgtc agtggaagc 19 <210> 38 <211> 483 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <220> <221> CDS <222> (1)..(480) <400> 38 atg act cag ggc gaa aag atc tca gta gca ttc gta tgc ctt ggt aac 48 Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 atc tgt cgt tcg cct atg gct gaa gcg gtt ttc cgc cac act gta aag 96 Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys 20 25 30 agc aaa ggt ctg gag gat agg ttc agt aag atc gat tca ttc ggt acc 144 Ser Lys Gly Leu Glu Asp Arg Phe Ser Lys Ile Asp Ser Phe Gly Thr 35 40 45 ggt agt tgg cac acc ggg gag acg cca gac cgc aga tca gtc tct acc 192 Gly Ser Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr 50 55 60 tgt cgc tcc cac ggt gtt cca atc gat cat agg gca aag cag ata agg 240 Cys Arg Ser His Gly Val Pro Ile Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Arg 65 70 75 80 cca tcg cat ttc agt gaa ttc gat tac gtc ctc tgc atg gat gac atg 288 Pro Ser His Phe Ser Glu Phe Asp Tyr Val Leu Cys Met Asp Asp Met 85 90 95 aat tta cgt aat ctg cgt cgc atg caa cca aag gag acg aaa gct agg 336 Asn Leu Arg Asn Leu Arg Arg Met Gln Pro Lys Glu Thr Lys Ala Arg 100 105 110 gtg gaa tta ttt ggc aat tgg aac aac agt aac ggt aaa ttt gac acg 384 Val Glu Leu Phe Gly Asn Trp Asn Asn Ser Asn Gly Lys Phe Asp Thr 115 120 125 att gtg gac gac cct tat tac ggc ggc gtt gat ggt ttt gaa cac aac 432 Ile Val Asp Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Val Asp Gly Phe Glu His Asn 130 135 140 ttt cgt caa atc aca cat ttc agc gag tca ttc cta gac agt gaa ttg 480 Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Ser Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu 145 150 155 160 taa 483 <210> 39 <211> 160 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 39 Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys 20 25 30 Ser Lys Gly Leu Glu Asp Arg Phe Ser Lys Ile Asp Ser Phe Gly Thr 35 40 45 Gly Ser Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr 50 55 60 Cys Arg Ser His Gly Val Pro Ile Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Arg 65 70 75 80 Pro Ser His Phe Ser Glu Phe Asp Tyr Val Leu Cys Met Asp Asp Met 85 90 95 Asn Leu Arg Asn Leu Arg Arg Met Gln Pro Lys Glu Thr Lys Ala Arg 100 105 110 Val Glu Leu Phe Gly Asn Trp Asn Asn Ser Asn Gly Lys Phe Asp Thr 115 120 125 Ile Val Asp Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Val Asp Gly Phe Glu His Asn 130 135 140 Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Ser Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu 145 150 155 160 <210> 40 <211> 483 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <221> CDS <222> (1)..(480) <220> <223> Description of Unknown Organism: PPPase2 <400> 40 atg act cag ggt gaa aag atc tca gtg gca ttc gta tgc ctt ggt aac 48 Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 att tgt cgc tca cca atg gct gaa gca gtt ttc cgc cat act gtg aag 96 Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys 20 25 30 agt aaa ggt ttg gag gat aga ttt agt aag atc gat tca ttt ggt act 144 Ser Lys Gly Leu Glu Asp Arg Phe Ser Lys Ile Asp Ser Phe Gly Thr 35 40 45 ggt ggt tgg cac act ggg gag aca cca gat cgc aga tcc gtc tct acc 192 Gly Gly Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr 50 55 60 tgt cgt tct cat gga gtc cca gtt gat cat agg gca aag caa ata aaa 240 Cys Arg Ser His Gly Val Pro Val Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Lys 65 70 75 80 cca gca cat ttc aat gaa ttt gat tat atc ctc tgt atg gat gac atg 288 Pro Ala His Phe Asn Glu Phe Asp Tyr Ile Leu Cys Met Asp Asp Met 85 90 95 aat tta cgc aat cta cgt cgt atg cag cca aag gaa tca aaa gct aga 336 Asn Leu Arg Asn Leu Arg Arg Met Gln Pro Lys Glu Ser Lys Ala Arg 100 105 110 gta gaa ttg ttt ggt aat tgg aat aaa agt aat ggt aaa ttt gaa act 384 Val Glu Leu Phe Gly Asn Trp Asn Lys Ser Asn Gly Lys Phe Glu Thr 115 120 125 att gtt gat gat cct tat tac ggt ggt gtt gat gga ttt gaa cat aat 432 Ile Val Asp Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Val Asp Gly Phe Glu His Asn 130 135 140 ttc cgt caa atc aca cat ttt tgt gaa tca ttc tta gat agt gaa ttg 480 Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Cys Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu 145 150 155 160 taa 483 <210> 41 <211> 160 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: PPPase2 <400> 41 Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys 20 25 30 Ser Lys Gly Leu Glu Asp Arg Phe Ser Lys Ile Asp Ser Phe Gly Thr 35 40 45 Gly Gly Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr 50 55 60 Cys Arg Ser His Gly Val Pro Val Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Lys 65 70 75 80 Pro Ala His Phe Asn Glu Phe Asp Tyr Ile Leu Cys Met Asp Asp Met 85 90 95 Asn Leu Arg Asn Leu Arg Arg Met Gln Pro Lys Glu Ser Lys Ala Arg 100 105 110 Val Glu Leu Phe Gly Asn Trp Asn Lys Ser Asn Gly Lys Phe Glu Thr 115 120 125 Ile Val Asp Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Val Asp Gly Phe Glu His Asn 130 135 140 Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Cys Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu 145 150 155 160 <210> 42 <211> 25 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 42 Met Lys Ala Ser Met Leu Glu Asp Leu Asn Lys Phe Ser Val Lys Glu 1 5 10 15 Ile Asp Ile Pro Ser Pro Lys Lys Asp 20 25 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 43 Glu Trp Thr Asn Ser Ile Gln Leu Val Arg 1 5 10 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 44 Phe Gly Gly Phe Glu Gln Tyr Val Ser Val Pro Ala Arg 1 5 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 45 Gly Leu Asp Glu Gly Cys Thr His Val Ile Asn Ser Ala Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oLRXPD 53 primer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n represents an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n represents an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n represents an inosine residue <400> 46 atgaargcnt cnatgttnga rgattt 26 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oLRXPD 31 primer <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is an inosine residue <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is any nucleotide of a, g, t or c <400> 47 gcrttnacna rytgnatnga rttngtccay tc 32 <210> 48 <211> 2123 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 48 gatctgttgc ctttattgtt acgcagagtt ggtggttcag catcttatca gcgattatct 60 atatgatctt ctgcttagtc atcgctgact ggacagcaaa ggatgtacaa gaattttacg 120 gattagaagg aattagtttt ccaacaggtt caagtgacgc gtttggcctt ttgggaattc 180 caatttcagc agctattgca aggattcctg gaattaagaa cctgcatgct gattctgaaa 240 caattcaaaa gcgttttggt atctttggtg aaccaatggt aatggggatt attattggcg 300 ccgctattgg tgcgcttggc ggatacgata ttgctggtat tttaaaactt ggtatcaaca 360 tgggagctgt tatgatgctg atgcccgaga atggtcaagt tgctgatgga aggcttaatg 420 ccaatttctg agtctgcacg aggggttctt caaaagcgtt atggtaagga tcgtgagatt 480 tatcttggta tggatgcggc cttatcaaca ggagcaccag ccacattagc gacaggcttg 540 ttgttggttc ctattacttt gtttatagca gtgattctgc ctggaaatag ggtgctgcct 600 tttggagatt tagcaacaat tccattttat gtatccctta tcgttgctag gaggcgtggc 660 aatattatcc attcagtctt agcaggagcc gttgtcatca cattggcatt gtttatggct 720 actgacttta gtcctgtgca tacggagatg ctacgcggag ttgtgaaatt ccctgctggt 780 tcagcacaag tttcttccct cgatatgggc ggtaatttct taaactggat tctccttaaa 840 ttctcagagc tggtaaaagg attcatttaa tgaaagaggt aaatttcatt gaaagcatca 900 atgttggaag atctaaataa attctcggta aaagaaattg atatccctag tccaaaaaag 960 gacgaagttg ttgttaaagt catggctgct ggtacatgtg gatccgatag ccataagatg 1020 attagcggat ggaagtatgg ctatccggcc gttatgggcc acgagttctc aggtattgtt 1080 acgcaattag gggagaatgt ttcaaatgtt tcagtaggtc aacatgtagc tgtagcgcct 1140 tttataccat gtttcaagtg tcactattgt cagattggcc ttttccagat gtgtgaaaat 1200 tactcaatgc tggggcaaca aaagttcggt ggttttgaac aatatgttag tgttcctgcc 1260 agaaacgttc ttgatatcgg aaagatgagt tttgaagagg gagcgttaat tgaaccaatg 1320 gctgtagcgg ctcacgccgt aatgggaatt aagccagaat tgggcgatac cgttgctgtc 1380 tttggattgg gtacggttgg cgatttagtg gtccgcttat taatttcttc aggggcaact 1440 aatgtgattg gaattgatat cgatgatcaa aagttagaaa agggcctaga tgaaggttgc 1500 acccacgtca ttaattctgc aaaagaatct ttagaagaaa agattatgga atatactgac 1560 ggtcttggcg ttgatatatc aatggagtgc gctgggtcaa agattacgga agagcaaaca 1620 ttgcttgtta caaaaagacg cggcaaggtt gggtttgttg gaattgccta ctcagatgtt 1680 ttgttacatc aaaaggcttt tgaaaacatc ttccgacatg aattaactgt aacaggtttt 1740 tggaactcgt attctgctcc gttccctggt agggaatgga ctaattcaat tcaattggtg 1800 aatagaggtc gaataaaaat caaagatctc ataactcacc gatttgagtt agaagatatg 1860 caaaaggctt ttaacatgat tacgactcgt tcggaatcct ttaataaagt gatgtttttt 1920 ccgaatggca taaattgatt ttgtttatat tttggtgaaa ttggaggcat tttataatgg 1980 atgcagtgaa aactaagaca atgaaagcag tcgtcaaatc agaacctgga tacgatcaca 2040 tgagtttgaa gaatgtaccg attccggaag ttacgggcaa tcatgtttta atgaaagtcg 2100 catatacagg aatttgtggt acc 2123 <210> 49 <211> 349 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 49 Met Lys Ala Ser Met Leu Glu Asp Leu Asn Lys Phe Ser Val Lys Glu 1 5 10 15 Ile Asp Ile Pro Ser Pro Lys Lys Asp Glu Val Val Val Lys Val Met 20 25 30 Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ser Asp Ser His Lys Met Ile Ser Gly Trp 35 40 45 Lys Tyr Gly Tyr Pro Ala Val Met Gly His Glu Phe Ser Gly Ile Val 50 55 60 Thr Gln Leu Gly Glu Asn Val Ser Asn Val Ser Val Gly Gln His Val 65 70 75 80 Ala Val Ala Pro Phe Ile Pro Cys Phe Lys Cys His Tyr Cys Gln Ile 85 90 95 Gly Leu Phe Gln Met Cys Glu Asn Tyr Ser Met Leu Gly Gln Gln Lys 100 105 110 Phe Gly Gly Phe Glu Gln Tyr Val Ser Val Pro Ala Arg Asn Val Leu 115 120 125 Asp Ile Gly Lys Met Ser Phe Glu Glu Gly Ala Leu Ile Glu Pro Met 130 135 140 Ala Val Ala Ala His Ala Val Met Gly Ile Lys Pro Glu Leu Gly Asp 145 150 155 160 Thr Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Gly Asp Leu Val Val Arg 165 170 175 Leu Leu Ile Ser Ser Gly Ala Thr Asn Val Ile Gly Ile Asp Ile Asp 180 185 190 Asp Gln Lys Leu Glu Lys Gly Leu Asp Glu Gly Cys Thr His Val Ile 195 200 205 Asn Ser Ala Lys Glu Ser Leu Glu Glu Lys Ile Met Glu Tyr Thr Asp 210 215 220 Gly Leu Gly Val Asp Ile Ser Met Glu Cys Ala Gly Ser Lys Ile Thr 225 230 235 240 Glu Glu Gln Thr Leu Leu Val Thr Lys Arg Arg Gly Lys Val Gly Phe 245 250 255 Val Gly Ile Ala Tyr Ser Asp Val Leu Leu His Gln Lys Ala Phe Glu 260 265 270 Asn Ile Phe Arg His Glu Leu Thr Val Thr Gly Phe Trp Asn Ser Tyr 275 280 285 Ser Ala Pro Phe Pro Gly Arg Glu Trp Thr Asn Ser Ile Gln Leu Val 290 295 300 Asn Arg Gly Arg Ile Lys Ile Lys Asp Leu Ile Thr His Arg Phe Glu 305 310 315 320 Leu Glu Asp Met Gln Lys Ala Phe Asn Met Ile Thr Thr Arg Ser Glu 325 330 335 Ser Phe Asn Lys Val Met Phe Phe Pro Asn Gly Ile Asn 340 345 <210> 50 <211> 354 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 50 Met Lys Ala Leu Asn Leu Tyr Gly Ile Gln Asp Leu Arg Phe Glu Glu 1 5 10 15 Thr Pro Ala Pro Ser Ile Glu His Asp Asp Asp Ile Ile Ile Lys Val 20 25 30 Lys Ala Val Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu Ser Arg Tyr Lys Lys Leu 35 40 45 Gly Pro Tyr Val Pro Gly Met Thr Phe Gly His Glu Phe Ala Gly Glu 50 55 60 Val Val Lys Ile Gly Arg Ser Val Thr Gly Phe Ser Ile Gly Asp Arg 65 70 75 80 Val Ala Ala Cys Pro Thr Tyr Thr Cys Gly Gln Cys Arg Tyr Cys Gln 85 90 95 Leu Gly Glu Pro Thr Arg Cys Glu Arg Leu Ser Val Ile Gly Ala Arg 100 105 110 His Pro Gly Ala Tyr Ala Glu Tyr Val Lys Leu Pro Ala Lys His Val 115 120 125 Ile Pro Leu Pro Asn Val Val Asn Tyr Asp Glu Ala Ala Leu Ile Glu 130 135 140 Pro Ala Ser Val Val Ala His Gly Phe Tyr Arg Thr Asn Ile Lys Pro 145 150 155 160 Gly Ala Ser Val Ala Ile Met Gly Val Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ala 165 170 175 Val Gln Trp Ala Lys Ile Phe Gly Ala Thr Thr Val Phe Ala Ile Asp 180 185 190 Ile Asp Glu Gln Lys Leu Asn Val Ala Asn Gln Leu Gly Ala Asp Val 195 200 205 Leu Ile Ser Ser Leu Gln Arg Pro Ala His Lys Gln Ile Leu Glu Tyr 210 215 220 Thr Asn Gly Ile Gly Val Asp Val Ala Val Glu Ser Ala Gly Thr Pro 225 230 235 240 Ser Thr Ser Ala Gln Val Phe Ala Leu Pro Lys Lys Gly Gly Glu Val 245 250 255 Val Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Asp Val Gln Ile Glu Arg Phe Tyr 260 265 270 Phe Glu Lys Ile Val Arg Asn Glu Leu His Val Tyr Gly Ser Trp Asn 275 280 285 Ala Leu Ser Ser Pro Phe Pro Gly Lys Glu Trp Ala Thr Thr Ile His 290 295 300 Tyr Met Ser Ser Gly Gln Leu Asn Val Ala Pro Met Ile Ser Tyr Arg 305 310 315 320 Leu Pro Leu Ala Lys Gly Pro Glu Thr Phe Gln Gln Ile Ala Lys Gly 325 330 335 Glu Leu Lys Pro Thr Lys Val Leu Phe Tyr Pro Glu Lys Leu Ser Glu 340 345 350 Arg Lys <210> 51 <211> 350 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 51 Met Lys Ala Ala Val Leu His Gly Thr Asn Asp Met Arg Phe Glu Asp 1 5 10 15 Ile Glu Ile Lys Pro Cys Glu Ser Asp Glu Val Lys Ile Lys Val Met 20 25 30 Ala Ala Gly Ile Cys Gly Ser Asp Pro Pro Arg Val Leu Lys His Trp 35 40 45 Lys Tyr Pro Val Pro Ala Ile Pro Gly His Glu Phe Ser Gly Val Ile 50 55 60 Ala Glu Val Gly Lys Asp Val Lys Asn Val Lys Val Gly Asp Arg Val 65 70 75 80 Val Ala Ile Pro Phe Ile Pro Cys Asn Glu Cys Glu Tyr Cys Lys Arg 85 90 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Ala Tyr His Gly Ile Ser 145 150 155 160 Lys Ser Asn Ile Arg Val Gly Asp Ser Val Val Val Leu Gly Cys Gly 165 170 175 Pro Ile Gly Gln Phe Val Ile Gln Trp Ala Lys Val Phe Gly Ala Ser 180 185 190 Lys Ile Ile Ala Val Asp Ile Phe Asp Glu Lys Leu Glu Leu Ser Lys 195 200 205 Leu Leu Gly Ala Asn Tyr Ile Leu Asn Ser Lys Glu Val Asn Val Ile 210 215 220 Lys Glu Ile Lys Lys Ile Thr Asn Gly Gly Ala Asp Val Val Ile Glu 225 230 235 240 Thr Ala Gly Ser Arg Phe Thr Gln Glu Gln Ser Leu Phe Val Ala Lys 245 250 255 Lys Arg Gly Asn Ile Val Phe Val Gly Ile Ser His Thr Glu Leu Pro 260 265 270 Leu Ser Ala Asp Ala Thr Glu Cys Ile Leu Arg Gly Glu Leu Thr Leu 275 280 285 Lys Gly Ser Trp Asn Ser Tyr Thr Ser Pro Tyr Pro Gly Arg Ala Trp 290 295 300 Thr Ala Thr Leu Asp Phe Met Glu Lys Gly Asp Ile Ile Phe Lys Pro 305 310 315 320 Met Ile Ser Asp Lys Ile Gly Leu Asn Glu Val Gly Asp Phe Leu Ser 325 330 335 Lys Met Ser Lys Arg Glu Ile Asn Phe Asn Lys Ile Leu Val Glu Ile 340 345 350 <210> 53 <211> 350 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 53 Met Lys Ser Val Arg Phe Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Arg Val Glu Asp 1 5 10 15 Val Asp Val Pro Lys Ile Leu Glu Lys Asp Asp Val Ile Ile Lys Val 20 25 30 Lys Val Ala Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile Ser Lys Tyr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Pro His Met Val Gly Glu Ile Leu Gly His Glu Phe Ser Gly Glu 50 55 60 Val Ala Gln Val Gly Lys Glu Val Arg Ser Phe Lys Ile Gly Asp Arg 65 70 75 80 Val Ala Val Cys Pro Ala Met Pro Cys Phe Glu Cys Asp Glu Cys Lys 85 90 95 Lys Gly Leu Tyr Ser Arg Cys Asn Asn Val Ala Ile Ile Gly Asn Lys 100 105 110 Glu Leu Gly Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Thr Lys Val Lys Glu Arg Asn 115 120 125 Leu Ile Lys Ile Pro Asp Glu Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Ala Ala Leu 130 135 140 Glu Pro Val Cys Ile Ala Gly His Gly Leu Phe Arg Ser Glu Ala Lys 145 150 155 160 Val Gly Asp Thr Val Val Val Leu Gly Thr Gly Pro Ile Gly Leu Phe 165 170 175 Ser Ile Gln Trp Ala Lys Ile Phe Gly Ser Thr Lys Ile Ile Ala Val 180 185 190 Asp Val Phe Asp Glu Lys Leu Asp Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ala Asp 195 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atacaggcgg aaatttctta aaatggatct tcttgaaatt ctcagaatta gttgccacag 180 tgatgtagga ggtttttgta aatgagtaaa acaatgaagg gtgtttccaa gcaggcaccc 240 ggttatgacc aaatggcatt tatcgattta tctgttccag aagcaacaga tgacaaggtc 300 ttgattaaag tcgcttatac aggtatttgc ggatcagata tccatacgtt taaaggtgaa 360 tacaaaaatc ccactactcc cgtcgtccta ggacatgaat tttctgggca ggtagttgaa 420 gtcggagcca atgtaacaaa ggtcaaggtt ggtgatcggg taaccagtga gacgaccttt 480 tatgtctgcg gcgaatgcga ttattgcaag gaaaagcagt ataatttgtg tccccatcga 540 aaaggaatcg gcacgcagca aaatggctcc atggcgaact atgtgttggc tcgagaagaa 600 agcattcatt tactgccgga tcatttaagc tatgaaggtg cggcgatgag cgaaccatta 660 gcgtgctgtg tccacgcgat gtatcaaaag agtcacttgg aattaaaaga cacgatcatt 720 atcatgggcc ctggaccaat cggactgtat cttttgcaga ttgccaagga aattggagcc 780 ttcgtcatta tgacggggat cacaaaagat gctcatcgct tagcattagc aaaaaaacta 840 ggcgcggatg tgatcgttga tacgatgaag gaagatctag cgaaagtcgt caatgagatc 900 acggatggct acggtgtcga taaagtgtat gatgcctcag gagcagttcc tgctgttaat 960 gctagtctgc cattgattcg caagcagggg caatttattc aagtaggctt gttcgctaat 1020 aaaatggtgg atttagacac tgaatcgatc attcaacgag agatcgaata catcggcagt 1080 cgttcacaga acccttatga ctggccgatt gcgatccact tattagcgaa aggtgcgatc 1140 aatatcgatg agatgattac gaaaaaatac ccgttgactg aatggcggga agcctttgat 1200 aaagtgatgg aaggcaatga aatcaaggta atgatcgaat ccaatccaga agaattttaa 1260 tttgaatcaa ggaagctgta ccagaatttt tggtgcagct ttttgtgagt ttgttttata 1320 ggaggatttt tttgatacta ttttcatgag aacagtgtaa taaataatca ttagcaagaa 1380 attgtaaaag aatattgtat 1400 <210> 69 <211> 352 <212> PRT <213> Enterococcus avium <400> 69 Met Ser Lys Thr Met Lys Gly Val Ser Lys Gln Ala Pro Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Gln Met Ala Phe Ile Asp Leu Ser Val Pro Glu Ala Thr Asp Asp Lys 20 25 30 Val Leu Ile Lys Val Ala Tyr Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His 35 40 45 Thr Phe Lys Gly Glu Tyr Lys Asn Pro Thr Thr Pro Val Val Leu Gly 50 55 60 His Glu Phe Ser Gly Gln Val Val Glu Val Gly Ala Asn Val Thr Lys 65 70 75 80 Val Lys Val Gly Asp Arg Val Thr Ser Glu Thr Thr Phe Tyr Val Cys 85 90 95 Gly Glu Cys Asp Tyr Cys Lys Glu Lys Gln Tyr Asn Leu Cys Pro His 100 105 110 Arg Lys Gly Ile Gly Thr Gln Gln Asn Gly Ser Met Ala Asn Tyr Val 115 120 125 Leu Ala Arg Glu Glu Ser Ile His Leu Leu Pro Asp His Leu Ser Tyr 130 135 140 Glu Gly Ala Ala Met Ser Glu Pro Leu Ala Cys Cys Val His Ala Met 145 150 155 160 Tyr Gln Lys Ser His Leu Glu Leu Lys Asp Thr Ile Ile Ile Met Gly 165 170 175 Pro Gly Pro Ile Gly Leu Tyr Leu Leu Gln Ile Ala Lys Glu Ile Gly 180 185 190 Ala Phe Val Ile Met Thr Gly Ile Thr Lys Asp Ala His Arg Leu Ala 195 200 205 Leu Ala Lys Lys Leu Gly Ala Asp Val Ile Val Asp Thr Met Lys Glu 210 215 220 Asp Leu Ala Lys Val Val Asn Glu Ile Thr Asp Gly Tyr Gly Val Asp 225 230 235 240 Lys Val Tyr Asp Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala Val Asn Ala Ser Leu 245 250 255 Pro Leu Ile Arg Lys Gln Gly Gln Phe Ile Gln Val Gly Leu Phe Ala 260 265 270 Asn Lys Met Val Asp Leu Asp Thr Glu Ser Ile Ile Gln Arg Glu Ile 275 280 285 Glu Tyr Ile Gly Ser Arg Ser Gln Asn Pro Tyr Asp Trp Pro Ile Ala 290 295 300 Ile His Leu Leu Ala Lys Gly Ala Ile Asn Ile Asp Glu Met Ile Thr 305 310 315 320 Lys Lys Tyr Pro Leu Thr Glu Trp Arg Glu Ala Phe Asp Lys Val Met 325 330 335 Glu Gly Asn Glu Ile Lys Val Met Ile Glu Ser Asn Pro Glu Glu Phe 340 345 350 <210> 70 <211> 343 <212> PRT <213> Bacillus halodurans (deduced sequence) <400> 70 Met Lys Ala Leu Val Lys Thr Gln His Gly Thr Gly His Phe Ala Val 1 5 10 15 Gln Glu Lys Pro Glu Pro Thr Pro Gly Lys His Gln Val Lys Ile Lys 20 25 30 Val Lys Tyr Thr Gly Val Cys Gly Ser Asp Ile His Thr Tyr Glu Gly 35 40 45 His Tyr Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Gly His Glu Phe Ser Gly 50 55 60 Glu Ile Val Glu Leu Gly Glu Gly Val Thr Gly Phe Asn Val Gly Asp 65 70 75 80 Arg Val Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Ser Ile Cys Gly Lys Cys Ser Tyr 85 90 95 Cys Thr Ser Gly Asp Tyr Asn Leu Cys Ser His Arg Lys Gly Leu Gly 100 105 110 Asn Gln Gln Asp Gly Ser Phe Ala Lys Tyr Val Ile Ala Arg Gln Glu 115 120 125 Ser Leu His His Leu Pro Ala Gly Val Asp Asp Arg Ser Ala Ala Met 130 135 140 Thr Glu Pro Leu Ala Cys Thr His His Ala Ile Ala Lys Thr Ser Ile 145 150 155 160 Asn Lys Gly Asp Leu Val Val Val Thr Gly Pro Gly Pro Ile Gly Leu 165 170 175 Leu Ala Ala Gln Val Ala Lys Ser His Gly Gly Thr Val Ile Ile Thr 180 185 190 Gly Leu Ser Asn Asp Gln Val Arg Leu Lys Lys Ala Lys Glu Val Gly 195 200 205 Ile Asp Tyr Ala Ile Asp Thr Gln Glu Val Asp Ile Lys Glu Leu Val 210 215 220 Ser Glu Leu Thr Asp Gly Tyr Gly Ala Asp Val Val Leu Glu Cys Ser 225 230 235 240 Gly Ala Val Pro Ala Ala Lys Gln Gly Ile Asp Leu Leu Arg Lys Lys 245 250 255 Gly Gln Tyr Ala Gln Val Gly Leu Phe Ala Gln Pro Glu Ile Gln Phe 260 265 270 Asn Phe Glu Lys Ile Ile Gln Lys Glu Ile Ser Val Val Gly Ser Arg 275 280 285 Ser Gln Lys Pro Ala Asp Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Leu Asn Glu 290 295 300 Lys Lys Val Asn Ala Lys Thr Leu Val Thr His Glu Tyr Thr Ile Ser 305 310 315 320 Glu Trp Asp Lys Ala Tyr His Ala Ile Lys Ser Gly Glu Ala Ile Lys 325 330 335 Val Leu Leu Thr Pro Ile Asp 340

Claims (180)

  1. (A) 글루코스, 프럭토스, 만노스, 슈크로스, 락토스, 말토스, 라피노스, 이눌린, 전분, 및 이들을 함유하는 중합체 및 올리고머 중에서 선택된 탄소원상에서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 유전학적으로 변형된, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택되는 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주를 배양하는 단계;
    (B) 당해 숙주를 사용하여 숙주내 하나 이상의 펜토스 포스페이트 경로 중간체를 크실리톨로 전환시켜 (A) 단계의 배양동안에 크실리톨을 생산하는 단계; 및
    (C) (B) 단계에서 생산되는 크실리톨을 회수하는 단계를 포함하는, 크실리톨의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 49의 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 48의 핵산 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 50의 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 51, 52 및 53으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 당해 숙주가 글루코키나제 및 헥소키나제를 암호화하는 유전자를 추가로 도입함으로써 유전학적으로 변형되는 방법.
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  12. 제9항에 있어서, 당해 숙주가 glcUgdh 오페론의 과발현을 암호화하는 유전자를 도입함으로써 유전학적으로 변형되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, glcUgdh 오페론이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) glcUgdh 오페론인 방법.
  14. 삭제
  15. 제10항에 있어서, 당해 숙주가 포스포글루코이소머라제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 당해 숙주가 포스포프럭토키나제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 당해 숙주가 프럭토스디포스페이트 알돌라제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 트랜스하이드로게나제, NAD(P)H-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 및 NAD(P)H 의존성 크실로스 리덕타제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 효소를 발현할 수 있는 하나 이상의 유전자를 도입함에 의해 당해 숙주가 유전학적으로 추가로 변형되는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 글루코키나제 또는 헥소키나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 형질전환되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 리보스-5-P 이소머라제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 트랜스케톨라제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 트랜스알돌라제 활성을 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 DOG1, LPT1, PPPase1, PPPase2 및 저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 탈인산화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
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  27. 제25항에 있어서, 언급된 탈인산화 효소가 서열 38 및 서열 40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 당해 숙주가, 펜토스 당 키나제, 펜툴로스 당 키나제 또는 이 둘다를 암호화하는 유전자(들)를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
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  35. 제1항에 있어서, 유전학적으로 변형된 숙주가 바실러스인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 바실러스가 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 제1항에 있어서, 펜토스 포스페이트 경로가 중간체로서 리불로스-5-P를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 펜토스 포스페이트 경로가 중간체로서 리불로스-5-P, 크실룰로스-5-P 및 크실리톨-5-P를 포함하는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 리불로스-5-P 3-에피머라제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  42. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 크실룰로스 키나제를 암호화하는 유전자를 파괴시킴으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  43. 제1항에 있어서, 당해 숙주가 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형되는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 크실리톨 데하이드로게나제가 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 크실리톨 데하이드로게나제인 방법.
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  56. 서열 49의 아미노산 서열을 갖는 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드.
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  64. 제56항에 있어서, 서열 49의 아미노산 서열이 서열 48의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리뉴클레오타이드.
  65. 삭제
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  67. 글루코스, 프럭토스, 만노스, 슈크로스, 락토스, 말토스, 라피노스, 이눌린, 전분, 및 이들을 함유하는 중합체 및 올리고머 중에서 선택된 탄소원 상에서 배양하는 경우, 하나 이상의 펜토스 포스페이트 경로 중간체를 크실리톨로 전환시켜 크실리톨을 생산할 수 있고, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 유전학적으로 변형된, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
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  69. 제67항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  70. 제69항에 있어서, 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 49의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  71. 제70항에 있어서, 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 48의 핵산 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는 것인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  72. 제67항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  73. 제72항에 있어서, 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 50의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  74. 제67항에 있어서, 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  75. 제74항에 있어서, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 크실리톨 포스페이트 데하이드로게나제가 서열 51, 52 및 53으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
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  90. 제67항에 있어서, 트랜스하이드로게나제, NADH- 및 NADPH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 및 NADH- 및 NADPH-의존성 크실로스 리덕타제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나의 효소를 발현할 수 있는 하나 이상의 유전자가 도입됨에 의해 추가로 유전학적으로 변형되는, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
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  95. 제67항에 있어서, DOG1, LPT1, PPPase1, PPPase2 및 저분자량의 단백질-타이로신 포스파타제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 탈인산화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형되는, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
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  97. 제95항에 있어서, 탈인산화 효소가 서열 38 및 서열 40으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되는, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  98. 제67항에 있어서, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형된, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  99. 제98항에 있어서, 크실리톨 데하이드로게나제가 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 크실리톨 데하이드로게나제인, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
  100. 제67항에 있어서, 타가토스 에피머라제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 추가로 유전학적으로 변형된, 세균, 효모 또는 진균류로부터 선택된 크실룰로스-5-포스페이트 생산 숙주.
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