KR101246852B1 - 신규한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 돌연변이체 효소 및 그 효소를 이용한 엘-리보스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 효소 그리고 그 해당 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량으로 얻는 제조방법과 상기 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 엘-리보스를 고수율로 얻는 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 및 그 용도{Novel mannose 6-phosphate isomerase mutant and use of the same}

본 발명은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 돌연변이체 효소 및 그 효소를 이용한 엘-리보스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 효소 그리고 그 해당 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량으로 얻는 제조방법과 상기 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 엘-리보스를 고수율로 얻는 생산방법에 관한 것이다.

엘-리보스(L-ribose)는 많은 엘-형태(L-type)의 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서, 항바이러스제인 메틸-엘-리보플라노사이드(methyl-L-riboflanoside; "Bezimidavir"TM) 등의 합성에 사용되며, 엘-리보스 및 그 유도체의 세계시장은 2001년 약 11억불이었다.

또한, 최근에는 새로운 항포진제(Antiherpes)로 개발되고 있는 비더블유1263더블유94(BW1263W94, Glaxo Wellcome)와 B형 간염 치료제로 개발되고 있는 엘-에프엠에이유(L-FMAU, Bukwang & Triangle)등의 핵심 중간체로서 그 수요가 급증하고 있어, 산업적으로 이용가능한 제조방법을 개발하는 것은 동분야 많은 연구진들의 관심의 대상이다.

엘-리보스는 주로 엘-아라비노스, 엘-자일로스, 디-글루코스, 디-갈락토스, 디-리보스 또는 디-만노-1,4-락톤으로부터 화학 합성법으로 생산되어 왔다(Akagi, M., et al ., Chem . Pharm . Bull .( Tokyo ) 50:866, 2002; Takahashi, H., et al ., Org. Lett . 4:2401, 2002; Yun, M., et al ., Tetrahedron Lett . 46:5903, 2005). 그러나, 이러한 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다.

실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 리보스의 분리 및 정제 과정, 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.

상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 최근에는 리비톨 또는 엘-리불로오스로부터 생물학적 엘-리보스를 제조하는 방법이 연구되고 있다.

또한, 엔에이디-의존적인 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)를 포함하는 재조합 대장균을 사용하여 100g/l 리비톨로부터 발효 72시간 만에 55% 전환 수율을 얻었지만 엘-리보스의 생산성은 엘-아라비노스로부터 만드는 화학 합성법보다 약 28배가 낮았다(Woodyer R. N., et al ., Appl . Environ . Microbiol. 74:2967, 2008; Jumppanen, J., et al ., U.S. patent 6,140,498).

한편, 엘-리보스의 생물학적인 생산 연구 방법으로는 클리비지엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래 아라비노스 이성화효소, 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래 람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase), 스트렙토마이세스 루비지노시스(Streptomyces rubiginosus) 유래 자일로스 이성화효소(D-xylose isomease) 및 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis) 유래 갈락토스-6-인산 이성화효소(galactose-6-phosphate isomerase)를 이용하고 있으나, 상기 효소들을 광범위한 기질 특이성을 지니고 있어서 엘-리블로스를 엘-리보스로 전환시킬 수는 있지만 그 전환속도는 매우 느리다.

최근 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여 엘-리불로오스를 엘-리보스로 전환하여 생산성이 낮은 문제를 극복하였다(Yeom S. J., et al ., Appl . Environ . Microbiol . 75:4705, 2009). 그러나, 바실러스 서브틸리스 유래의 만노스-6-인산 이성화효소는 중온균 유래의 효소로서 열 안정성의 문제와 반응 온도가 낮기 때문에 다량의 기질 용해에 한계가 있다. 따라서, 이를 극복하기 위해 엘-리보스 생산성이 높고, 열 안정성이 높으면서 기질 용해도의 한계를 극복한 경제적인 생물학적인 방법의 개발이 시급하다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소의 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 만노스-6-인산 이성화효소의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고수율의 엘-리보스의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 21번, 74번, 134번 잔기의 아미노산을 각각 라이신(K), 아스파라진(N), 메티오닌(M)에서 각각 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아르지닌(R)으로 변환시킨 돌연변이체;b) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 67번, 238번 잔기의 아미노산을 각각 글루탐산(E), 트레오닌(T)에서 각각 글라이신(G), 아이소루신(I)으로 변환시킨 돌연변이체;c)서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 124번, 129번 잔기의 아미노산을 각각 라이신(K), 루신(L)에서 각각 아르지닌(R), 페닐알라닌(F)으로 변환시킨 돌연변이체; 및 d) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 90번 잔기의 아미노산을 아스파라진(N)에서 아스파트산(D)으로 변환시킨 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 돌연변이 만노스 6-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 내지 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 유전자 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 8에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 a) 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고;

b) 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;c) 상기 미생물로부터 만노스 6-인산 이성화효소를 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 리보스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 리보스는 L-리보스(L-ribose)이고, L-리불로오스(L-ribulose)를 기질로 사용하여 생산되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 포함하는 리보스 생산용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열의 특정 잔기가 변형된 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 한다.

그 가장 대표적인 예가 상기 본 발명의 특허청구범위 제1항 및 표 1에 기재된 네 종류의 돌연변이체이다.

또, 본 발명에는 네 종류의 돌연변이체 중 하나를 코딩하는 코딩하는 만노스 6-인산 이성화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2 내지 5 중 하나로 표시되는 것을 들 수 있다.

또, 본 발명에는, 상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 만노스-6-인산 이성화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체의 제조방법이 포함된다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 분리된 것이다. 먼저, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 가진 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주의 만노스-6-인산 이성화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pTRC 99a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 만노스-6-인산 이성화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 고수율의 엘-리보스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 무기염 종류에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 최적 무기염의 농도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 pH에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 따른 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 기질 농도 300g/ℓ 에서 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소에 의한 리보스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화 효소 (7a)의 돌연변이 효소들인 Mutant 1(7b),Mutant 2(7c),Mutant 3(7d), Mutant 4(7e)의 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 8은 발현벡터의 개열지도를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 만노스 -6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

만노스-6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다.

구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주를 선별하고(Dae-Heoun Baek, Yujin Lee, Hong-Sig Sin, and Deok-Kun (2004) J Microbiol . Biotechnol . 14: 312-316), 이로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number CP000557)을 기초로 하여 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.

만노스-6-인산 이성화 효소

*서열번호 6(정방향 프라이머): 5'-TTTGAATTCATGCATCAAGAACCGATTTTTC-3'

서열번호 7(역방향 프라이머): 5'-TTTAAGCTTTTATTTGCTTGTCCGTGG-3'

상기 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자의 프라이머는 EcoR Ⅰ과 Hind Ⅲ 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자는 각각의 제한효소를 사용하여 플라스미드 벡터 pTRC 99a(Novagen 사)에 삽입하여 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2: 만노스 -6-인산 이성화효소의 제조

만노스-6-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 만노스 6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지(IPTG)를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM 트리스-염화수소 완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 65℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 3: 만노스 -6-인산 이성화효소의 금속 특이성 조사

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여서는, 상기 효소 활성은 10 mM EDTA를 처리하고 금속 이온(Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Ba^{2 +}, Cu²⁺, Co^{2 +}, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +})을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 10 mM 엘-리불로오스, 각각의 금속 이온과 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM PIPES(piperazine-N,N’-bis(2-ethane sulfonic acid) 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 10분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

효소 활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 unit은 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 엘-리보스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 엘-리보스 농도 및 엘-리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화나트륨을 통과시키도록 하였다.

그 결과, 실험한 금속염 중 지오바실러스 써모디니트리피칸스( Geobacillus thermodenitrificans) 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스 이성화에 코발트(Co^{2 +})가 가장 효과적이었다. 농도별 테스트 결과 효소에 대한 금속염 모두 최적농도는 1 mM이었다. 만노스-6-인산 이성화효소는 1 mM 망간 및 코발트 금속 이온의 영향을 받는 것으로 나타나, 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소는 금속 이온에 대해 의존성 효소인 것을 확인하였다.

금속 이온에 대한 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 활성은 각각 도 1에 나타내었고, 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 금속염 최적 농도는 각각 도 2에 나타내었다.

실시예 3: pH 및 온도가 만노스 6-인산 이성화효소 활성에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 분리한 만노스-6-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

3-1: pH 가 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM EPPS 완충용액을 사용하여 pH 6.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 구체적으로, 효소반응은 70℃에서 10분 동안 수행하고 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 7.0인 것을 알 수 있었다.

3-2: 온도가 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응은 온도 55℃에서 80℃ 범위까지 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트와 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 70℃인 것을 알 수 있었다.

또한, 도 3의 pH에 따른 만노스-6-인산 이성화 효소의 활성도에서 ●는 PIPES 완충용액을 나타내고, ○는 EPPS 완충용액을 나타낸다.

3-3: 만노스 -6-인산 이성화효소의 온도 안정성 조사

만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 60℃에서 80℃까지의 범위에서 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 만노스-6-인산 이성화효소 효소의 활성을 측정하였다.

도 5는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기의 그래프에서 온도 표기는 60℃(▲), 65℃(△), 70℃(▲), 75℃(□) 및 80℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 온도 60℃에서는 338시간, 65℃는 73시간, 70℃는 27시간, 75℃는 17시간, 그리고 80℃에서는 6.2시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 만노스 -6-인산 이성화효소를 이용한 리보스의 생산

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 리보스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(70 ℃)에서 300 g/ℓ 리불로오스를 가지고 리보스의 시간별 생산량을 측정하였다.

그 결과, 반응 2.2 시간 후에 300 g/ℓ의 리불로오스에서 210 g/ℓ의 리보스가 생산되어 시간당 87.5 g/ℓ의 생산성과 70% 전환수율을 나타내었다(도 6 참조).

현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 Molybdic acid를 사용한 화학합성법은 엘-아라비노스 로부터 23% 전환수율과 시간당 20 g/ℓ 생산성을 나타내었다(Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. patent 6,140,498.).

또 다른 비교로는 바실러스 서브틸리스（Bacillus subtilis) 와 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소를 사용하여 각각 시간당 71 g/ℓ, 85.2 g/ℓ를 보여 주었다 (Yoem et al ., Appl . Environ . Microbiol. 2009. 75:4705-4710).

이것은 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성으로, 본 발명에서 얻은 엘-리보스 생산 효소법은 생산성, 생산농도 및 정제의 용이함 등에서 화학합성법과 기존 생물학적 방법보다 훨씬 우수하다는 것을 알려준 결과이다.

실시예 5: 만노스 -6-인산 이성화 효소 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 무작이 돌연변이 (Random mutagenesis)를 유발하기 위하여 PCR mutagenesis kit (ClonTech Laboratories, Palo Alto. CA, USA) 을 이용하여 pTrc99a/만노스-6-인산 이성화 효소 돌연변이벡터를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 6: 만노스 -6-인산 이성화효소 돌연변이체 제조

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 5에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖이 들어있는 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600㎚에서의 흡광도가 0.6 이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 만노스-6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM PIPES (pH 7.0)완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 70℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 7: 만노스 -6-인산 이성화효소 돌연변이체의 엘- 리불로오스에 대한 효소 활성 측정

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소와 그 돌연변이체의 엘-리불로오스에 대한 효소 활성을 측정 및 비교하는 실험을 수행하였다.

상기 효소 반응은 10 mM 리불로오스, 1 mM Co^{2 +}의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 5분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 본 발명에서는 효소 활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 단위(unit)는 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 리보오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 원활히 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 리보오스 농도 및 리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼 이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템 (Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이 때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화 나트륨을 통과시키도록 하였다.

그 결과, 4개의 돌연변이 효소에서 wild 효소에 비해 엘 리불로오스를 기질로 하였을 때 활성이 1.2~1.4배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이때 엘 리불로스에 대한 wild 효소의 specific activity 는 504 U/mg 임을 확인하였다 (표 1 참조). 그에 따른 돌연변이 효소의 DNA 염기 서열및 아미노산 서열을 wild 효소와 비교해본결과, 1~3개의 포인트가 돌연변이가 유발된 것을 확인할 수 있었다. 이는 현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소였지만, 그에 따른 돌연 변이 효소가 보다 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이것은 돌연변이 효소가 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성을 가진 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 능가하는 엘-리보스 생산 효소임을 나타낸다.

Enzyme	Mutation point	Relative activity (%)
Wild	None	100
Mutant 1	K21E, N74T, M134R	121
Mutant 2	E67G, T238I	132
Mutant 3	K124R, L129F	131
Mutant 4	N90D	125

표 1은 만노스-6-인산 이성화 효소와 돌연변이 효소들의 엘-리불로스에 대한 효소 활성을 나타낸 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Novel mannose 6-phosphate isomerase mutant and use of the same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> Geobacillus thermodenitrificans <400> 1 Met Asp Leu Glu Pro Ile Phe Leu Thr Pro Val Phe Gln Glu Arg Ile 1 5 10 15 Trp Gly Gly Thr Lys Leu Ala Glu Arg Phe Gly Tyr Asp Ile Pro Ser 20 25 30 Ser Gln Thr Gly Glu Cys Trp Ala Val Ser Ala His Pro His Gly Gln 35 40 45 Thr Val Val Ala Arg Gly Pro Phe Gln Gly Met Thr Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Trp Glu Glu Arg Arg Asp Leu Phe Gly Asn Phe Pro Ser Asp Arg Phe 65 70 75 80 Pro Leu Leu Thr Lys Ile Leu Asp Ala Asn Ala Asp Leu Ser Val Gln 85 90 95 Val His Pro Asp Asp Asp Tyr Ala Lys Thr Asn Glu Gly Gly Glu Leu 100 105 110 Gly Lys Thr Glu Cys Trp Tyr Ile Ile Asp Cys Lys Pro Gly Ala Gln 115 120 125 Leu Ile Tyr Gly His Tyr Ala Gln Thr Lys Glu Glu Leu Arg Ala Met 130 135 140 Met Glu Ala Gly Glu Trp Asp Arg Leu Leu Arg Lys Val Pro Ile His 145 150 155 160 Pro Gly Asp Phe Phe Tyr Val Pro Ser Gly Thr Ile His Ala Leu Cys 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Val Leu Glu Thr Gln Gln Ser Ser Asp Thr Thr Tyr 180 185 190 Arg Val Tyr Asp Tyr Asp Arg Val Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Glu 195 200 205 Leu His Leu Glu Lys Ala Ile Asp Val Thr Thr Val Pro His Arg Asp 210 215 220 Thr Asp Val Gln Pro His Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Thr Val Thr 225 230 235 240 Thr Phe Val Glu Gly Asp Tyr Phe Gly Val Gln Lys Trp His Val His 245 250 255 Gly Glu Ala Glu Trp Glu Gln Thr Lys Pro Phe Leu Ile Val Ser Ile 260 265 270 Leu Gln Gly Glu Gly Glu Leu Val His Gly Glu Arg Thr Tyr Pro Ile 275 280 285 Arg Gln Gly Asp His Phe Ile Leu Pro His Gln Phe Gly Arg Phe Ala 290 295 300 Ile Arg Gly Thr Leu Glu Ala Ile Ala Ser Trp Pro Arg Lys Gly Lys 305 310 315 320 Glx <210> 2 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 2 atggaccttg aaccgatttt tctcactcct gtcttccaag agcgcatttg gggcggcacg 60 gagctcgccg aacggttcgg ctacgatatc ccgtcatcgc aaacagggga atgttgggcg 120 gtatcggccc atccgcacgg acagacggtt gtcgcccgcg ggccgtttca agggatgacg 180 cttggacagc tatgggagga gcgccgcgac ttgttcggca cttttccatc cgatcgcttt 240 ccgttgctga cgaaaatttt agacgccaac gccgatttgt ccgtccaagt ccatccggat 300 gacgactatg caaaaacaaa cgaaggtggg gagctcggta agacagaatg ttggtacatt 360 atcgactgca agccgggcgc ccagttaatt tacggccatt atgcccaaac gaaagaagag 420 ctgcgcgcca tgatggaggc gggagaatgg gatcgtttgc tgcggaaagt accgatccat 480 cccggtgact tcttctatgt cccgagcggc acgattcacg ccctctgtga ggggacgctt 540 gttctcgaga cgcagcaaag ctctgacacg acttatcgcg tctacgatta cgaccgcgtc 600 gacagccaag ggcggaagcg tgagctccac ttagagaaag ccattgacgt caccactgtc 660 ccgcatcgcg acaccgatgt ccagccccat gtcgccaaca ggcctggcgc aaccgtgacg 720 acctttgtgg agggtgacta ctttggcgtc caaaaatggc atgtccatgg agaagccgag 780 tgggagcaga cgaagccatt tctcatcgtc agcatccttc aaggagaggg cgagcttgtt 840 cacggcgagc gtacataccc gatccgccaa ggtgaccatt ttattttgcc gcaccaattc 900 ggccggtttg cgattcgtgg cacacttgaa gccattgcct cttggccacg gaaaggcaaa 960 taa 963 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 3 atggaccttg aaccgatttt tctcactcct gtcttccaag agcgcatttg gggcggcacg 60 aagctcgccg aacggttcgg ctacgatatc ccgtcatcgc aaacagggga atgttgggcg 120 gtatcggccc atccgcacgg acagacggtt gtcgcccgcg ggccgtttca agggatgacg 180 cttggacagc tatgggaggg gcgccgcgac ttgttcggca attttccatc cgatcgcttt 240 ccgttgctga cgaaaatttt agacgccaac gccgatttgt ccgtccaagt ccatccggat 300 gacgactatg caaaaacaaa cgaaggtggg gagctcggta agacagaatg ttggtacatt 360 atcgactgca agccgggcgc ccagttaatt tacggccatt atgcccaaac gtaagaagag 420 ctgcgcgcca tgatggaggc gggagaatgg gatcgtttgc tgcggaaagt accgatccat 480 cccggtgact tcttctatgt cccgagcggc acgattcacg ccctctgtga ggggacgctt 540 gttctcgaga cgcagcaaag ctctgacacg acttatcgcg tctacgatta cgaccgcgtc 600 gacagccaag ggcggaagcg tgagctccac ttagagaaag ccatcgacgt caccactgtc 660 ccgcatcgcg acaccgatgt ccagccccat gtcgccaaca tgcctggcgc aatcgtgacg 720 acctttgtgg agggtgacta ctttggcgtc caaaaatggc atgtccatgg agaagccgag 780 tgggagcaga cgaagccatt tctcatcgtc agcatccttc aaggagaggg cgagcttgtt 840 cacggcgagc gtacataccc gatccgccaa ggtgaccatt ttattttgcc gcaccaattc 900 ggccggtttg cgattcgtgg cacacttgaa gccattgcct cttggccacg gaaaggcaaa 960 taa 963 <210> 4 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 4 atggaccttg aaccgatttt tctcactcct gtcttccaag agcgcatttg gggcggcacg 60 aagctcgccg aacggttcgg ctacgatatc ccgtcatcgc aaacagggga atgttgggcg 120 gtatcggccc atccgcacgg acagacggtt gtcgcccgcg ggccgtttca agggatgacg 180 cttggacagc tatgggagga gcgccgcgac ttgttcggca attttccatc cgatcgcttt 240 ccgttgctga cgaaaatttt agacgccaac gccgatttgt ccgtccaagt ccatccggat 300 gacgactatg caaaaacaaa cgaaggtggg gagctcggta agacagaatg ttggtacatt 360 atcgactgaa ggccgggcgc ccagtttatt tacggccatt atgcccaaac gaaagaagag 420 ctgcgcgcca tgatggaggc gggagaatgg gatcgtttgc tgcggaaagt accgatccat 480 cccggtgact tcttctatgt cccgagcggc acgattcacg ccctctgtga ggggacgctt 540 gttctcgaga cgcagcaaag ctctgacacg acttatcgcg tctacgatta cgaccgcgtc 600 gacagccaag ggcggaagcg tgagctccac ttagagaaag ccattgacgt caccactgtc 660 ccgcatcgcg acaccgatgt ccagccccat gtcgccaaca tgcctggcgc aaccgtgacg 720 acctttgtgg agggtgacta ctttggcgtc caaaaatggc atgtccatgg agaagccgag 780 tgggagcaga cgaagccatt tctcatcgtc agcatccttc aaggagaggg cgagcttgtt 840 cacggcgagc gtacataccc gatccgccaa ggtgaccatt ttattttgcc gcaccaattc 900 ggccggtttg cgattcgtgg cacacttgaa gccattgcct cttggccacg gaaaggcaaa 960 taa 963 <210> 5 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 5 atggaccttg aaccgatttt tctcactcct gtcttccaag agcgcatttg gggcggcacg 60 aagctcgccg aacggttcgg ctacgatatc ccgtcatcgc aaacagggga atgttgggcg 120 gtatcggccc atccgcacgg acagacggtt gtcgcccgcg ggccgtttca agggatgacg 180 cttggacagc tatgggagga gcgccgcgac ttgttcggca attttccatc cgatcgcttt 240 ccgttgctga cgaaaatttt agacgccgac gccgatttgt ccgtccaagt ccatccggat 300 gacgactatg caaaaacaaa cgaaggtggg gagctcggta agacagaatg ttggtacatt 360 atcgactgca agccgggcgc ccagttaatt tacggccatt atgcccaaac gaaagaagag 420 ctgcgcgcca tgatggaggc gggagaatgg gatcgtttgc tgcggaaagt accgatccat 480 cccggtgact tcttctatgt cccgagcggc acgattcacg ccctctgtga ggggacgctt 540 gttctcgaga cgcagcaaag ctctgacacg acttatcgcg tctacgatta cgaccgcgtc 600 gacagccaag ggcggaagcg tgagctccac ttagagaaag ccattgacgt caccactgtc 660 ccgcatcgcg acaccgatgt ccagccccat gtcgccaaca tgcctggcgc aaccgtgacg 720 acctttgtgg agggtgacta ctttggcgtc caaaaatggc atgtccatgg agaagccgag 780 tgggagcaga cgaagccatt tctcatcgtc agcatccttc aaggagaggg cgagcttgtt 840 cacggcgagc gtacataccc gatccgccaa ggtgaccatt ttattttgcc gcaccaattc 900 ggccggtttg cgattcgtgg cacacttgaa gccattgcct cttggccacg gaaaggcaaa 960 taa 963 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 6 tttgaattca tgcatcaaga accgattttt c 31 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tttaagcttt tatttgcttg tccgtgg 27

Claims (8)

1. 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 90번 잔기의 아미노산을 아스파라진(N)에서 아스파트산(D)으로 변환시킨 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 제조하여 야생형 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 엘-리보스 생산성을 개선하는 방법
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