KR101063961B1 - 신규한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 돌연변이체 효소 및 그 효소를 이용한 엘-리보스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 효소 그리고 그 해당 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량으로 얻는 제조방법과 상기 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 엘-리보스를 고수율로 얻는 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 및 그 용도{Novel mannose 6-phosphate isomerase mutant and use of the same}

본 발명은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 돌연변이체 효소 및 그 효소를 이용한 엘-리보스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 효소 그리고 그 해당 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량으로 얻는 제조방법과 상기 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 엘-리보스를 고수율로 얻는 생산방법에 관한 것이다.

엘-리보스(L-ribose)는 많은 엘-형태(L-type)의 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서, 항바이러스제인 메틸-엘-리보플라노사이드(methyl-L-riboflanoside; "Bezimidavir"TM) 등의 합성에 사용되며, 엘-리보스 및 그 유도체의 세계시장은 2001년 약 11억불이었다.

또한, 최근에는 새로운 항포진제(Antiherpes)로 개발되고 있는 비더블유1263더블유94(BW1263W94, Glaxo Wellcome)와 B형 간염 치료제로 개발되고 있는 엘-에프엠에이유(L-FMAU, Bukwang & Triangle)등의 핵심 중간체로서 그 수요가 급증하고 있어, 산업적으로 이용가능한 제조방법을 개발하는 것은 동분야 많은 연구진들의 관심의 대상이다.

엘-리보스는 주로 엘-아라비노스, 엘-자일로스, 디-글루코스, 디-갈락토스, 디-리보스 또는 디-만노-1,4-락톤으로부터 화학 합성법으로 생산되어 왔다(Akagi, M., et al ., Chem . Pharm . Bull .( Tokyo ) 50:866, 2002; Takahashi, H., et al ., Org . Lett . 4:2401, 2002; Yun, M., et al ., Tetrahedron Lett . 46:5903, 2005). 그러나, 이러한 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다.

실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 리보스의 분리 및 정제 과정, 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.

상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 최근에는 리비톨 또는 엘-리불로오스로부터 생물학적 엘-리보스를 제조하는 방법이 연구되고 있다.

또한, 엔에이디-의존적인 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)를 포함하는 재조합 대장균을 사용하여 100g/l 리비톨로부터 발효 72시간 만에 55% 전환 수율을 얻었지만 엘-리보스의 생산성은 엘-아라비노스로부터 만드는 화학 합성법보다 약 28배가 낮았다(Woodyer R. N., et al ., Appl . Environ. Microbiol . 74:2967, 2008; Jumppanen, J., et al ., U.S. patent 6,140,498).

한편, 엘-리보스의 생물학적인 생산 연구 방법으로는 클리비지엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래 아라비노스 이성화효소, 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래 람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase), 스트렙토마이세스 루비지노시스(Streptomyces rubiginosus) 유래 자일로스 이성화효소(D-xylose isomease) 및 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis) 유래 갈락토스-6-인산 이성화효소(galactose-6-phosphate isomerase)를 이용하고 있으나, 상기 효소들을 광범위한 기질 특이성을 지니고 있어서 엘-리블로스를 엘-리보스로 전환시킬 수는 있지만 그 전환속도는 매우 느리다.

최근 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여 엘-리불로오스를 엘-리보스로 전환하여 생산성이 낮은 문제를 극복하였다(Yeom S. J., et al ., Appl . Environ . Microbiol. 75:4705, 2009). 그러나, 바실러스 서브틸리스 유래의 만노스-6-인산 이성화효소는 중온균 유래의 효소로서 열 안정성의 문제와 반응 온도가 낮기 때문에 다량의 기질 용해에 한계가 있다. 따라서, 이를 극복하기 위해 엘-리보스 생산성이 높고, 열 안정성이 높으면서 기질 용해도의 한계를 극복한 경제적인 생물학적인 방법의 개발이 시급하다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 만노스-6-인산 이성화효소의 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 만노스-6-인산 이성화효소의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고수율의 엘-리보스의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 21번, 74번, 134번 잔기의 아미노산을 각각 라이신(K), 아스파라진(N), 메티오닌(M)에서 각각 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아르지닌(R)으로 변환시킨 돌연변이체;b) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 67번, 238번 잔기의 아미노산을 각각 글루탐산(E), 트레오닌(T)에서 각각 글라이신(G), 아이소루신(I)으로 변환시킨 돌연변이체;c)서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 124번, 129번 잔기의 아미노산을 각각 라이신(K), 루신(L)에서 각각 아르지닌(R), 페닐알라닌(F)으로 변환시킨 돌연변이체; 및 d) 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 90번 잔기의 아미노산을 아스파라진(N)에서 아스파트산(D)으로 변환시킨 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 돌연변이 만노스 6-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 내지 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가지는 유전자 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 8에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 a) 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고;

b) 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;c) 상기 미생물로부터 만노스 6-인산 이성화효소를 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 이용하여 리보스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 리보스는 L-리보스(L-ribose)이고, L-리불로오스(L-ribulose)를 기질로 사용하여 생산되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소 돌연변이체를 포함하는 리보스 생산용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열의 특정 잔기가 변형된 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 한다.

그 가장 대표적인 예가 상기 본 발명의 특허청구범위 제1항 및 표 1에 기재된 네 종류의 돌연변이체이다.

또, 본 발명에는 네 종류의 돌연변이체 중 하나를 코딩하는 코딩하는 만노스 6-인산 이성화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2 내지 5 중 하나로 표시되는 것을 들 수 있다.

또, 본 발명에는, 상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 만노스-6-인산 이성화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체의 제조방법이 포함된다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 분리된 것이다. 먼저, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 가진 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주의 만노스-6-인산 이성화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pTRC 99a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 만노스-6-인산 이성화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체 고수율의 엘-리보스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 무기염 종류에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 최적 무기염의 농도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 pH에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 따른 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 기질 농도 300g/ℓ 에서 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소에 의한 리보스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화 효소 (7a)의 돌연변이 효소들인 Mutant 1(7b),Mutant 2(7c),Mutant 3(7d), Mutant 4(7e)의 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 8은 발현벡터의 개열지도를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 만노스 -6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

만노스-6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 지오바실러스 써모디니트리 피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다.

구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주를 선별하고(Dae-Heoun Baek, Yujin Lee, Hong-Sig Sin, and Deok-Kun (2004) J Microbiol . Biotechnol . 14: 312-316), 이로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number CP000557)을 기초로 하여 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.

만노스-6-인산 이성화 효소

서열번호 6(정방향 프라이머): 5'-TTTGAATTCATGCATCAAGAACCGATTTTTC-3'

서열번호 7(역방향 프라이머): 5'-TTTAAGCTTTTATTTGCTTGTCCGTGG-3'

상기 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자의 프라이머는 EcoR Ⅰ과 Hind Ⅲ 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자는 각각의 제한효소를 사용하여 플라스미드 벡터 pTRC 99a(Novagen 사)에 삽입하여 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2: 만노스 -6-인산 이성화효소의 제조

만노스-6-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 만노스 6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지(IPTG)를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM 트리스-염화수소 완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 65℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 3: 만노스 -6-인산 이성화효소의 금속 특이성 조사

본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여서는, 상기 효소 활성은 10 mM EDTA를 처리하고 금속 이온(Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Ba^{2 +}, Cu^{2 +}, Co^{2 +}, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +})을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 10 mM 엘-리불로오스, 각각의 금속 이온과 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM PIPES(piperazine-N,N’-bis(2-ethane sulfonic acid) 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 10분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

효소 활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 unit은 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 엘-리보스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 엘-리보스 농도 및 엘-리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화나트륨을 통과시키도록 하였다.

그 결과, 실험한 금속염 중 지오바실러스 써모디니트리피칸스( Geobacillus thermodenitrificans) 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스 이성화에 코발트(Co^{2 +})가 가장 효과적이었다. 농도별 테스트 결과 효소에 대한 금속염 모두 최적농도는 1 mM이었다. 만노스-6-인산 이성화효소는 1 mM 망간 및 코발트 금속 이온의 영향을 받는 것으로 나타나, 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소는 금속 이온에 대해 의존성 효소인 것을 확인하였다.

금속 이온에 대한 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 활성은 각각 도 1에 나타내었고, 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 금속염 최적 농도는 각각 도 2에 나타내었다.

실시예 3: pH 및 온도가 만노스 6-인산 이성화효소 활성에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 분리한 만노스-6-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

3-1: pH 가 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM EPPS 완충용액을 사용하여 pH 6.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 구체적으로, 효소반응은 70℃에서 10분 동안 수행하고 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 7.0인 것을 알 수 있었다.

3-2: 온도가 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응은 온도 55℃에서 80℃ 범위까지 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트와 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 70℃인 것을 알 수 있었다.

또한, 도 3의 pH에 따른 만노스-6-인산 이성화 효소의 활성도에서 ●는 PIPES 완충용액을 나타내고, ○는 EPPS 완충용액을 나타낸다.

3-3: 만노스 -6-인산 이성화효소의 온도 안정성 조사

만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 60℃에서 80℃까지의 범위에서 10 mM 엘-리불로오스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 만노스-6-인산 이성화효소 효소의 활성을 측정하였다.

도 5는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기의 그래프에서 온도 표기는 60℃(▲), 65℃(△), 70℃(▲), 75℃(□) 및 80℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 온도 60℃에서는 338시간, 65℃는 73시간, 70℃는 27시간, 75℃는 17시간, 그리고 80℃에서는 6.2시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 만노스 -6-인산 이성화효소를 이용한 리보스의 생산

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 리보스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(70 ℃)에서 300 g/ℓ 리불로오스를 가지고 리보스의 시간별 생산량을 측정하였다.

그 결과, 반응 2.2 시간 후에 300 g/ℓ의 리불로오스에서 210 g/ℓ의 리보스가 생산되어 시간당 87.5 g/ℓ의 생산성과 70% 전환수율을 나타내었다(도 6 참조).

현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 Molybdic acid를 사용한 화학합성법은 엘-아라비노스 로부터 23% 전환수율과 시간당 20 g/ℓ 생산성을 나타내었다(Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. patent 6,140,498.).

또 다른 비교로는 바실러스 서브틸리스（Bacillus subtilis) 와 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소를 사용하여 각각 시간당 71 g/ℓ, 85.2 g/ℓ를 보여 주었다 (Yoem et al., Appl. Environ. Microbiol. 2009. 75:4705-4710).

이것은 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성으로, 본 발명에서 얻은 엘-리보스 생산 효소법은 생산성, 생산농도 및 정제의 용이함 등에서 화학합성법과 기존 생물학적 방법보다 훨씬 우수하다는 것을 알려준 결과이다.

실시예 5: 만노스 -6-인산 이성화 효소 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 무작이 돌연변이 (Random mutagenesis)를 유발하기 위하여 PCR mutagenesis kit (ClonTech Laboratories, Palo Alto. CA, USA) 을 이용하여 pTrc99a/만노스-6-인산 이성화 효소 돌연변이벡터를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 6: 만노스 -6-인산 이성화효소 돌연변이체 제조

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 5에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖이 들어있는 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600㎚에서의 흡광도가 0.6 이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 만노스-6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소 돌연변이체는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM PIPES (pH 7.0)완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 70℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 7: 만노스 -6-인산 이성화효소 돌연변이체의 엘- 리불로오스에 대한 효소 활성 측정

지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화효소와 그 돌연변이체의 엘-리불로오스에 대한 효소 활성을 측정 및 비교하는 실험을 수행하였다.

상기 효소 반응은 10 mM 리불로오스, 1 mM Co^{2 +}의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 5분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 본 발명에서는 효소 활성은 엘-리불로오스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 단위(unit)는 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 리보오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 원활히 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 리보오스 농도 및 리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼 이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템 (Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이 때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화 나트륨을 통과시키도록 하였다.

그 결과, 4개의 돌연변이 효소에서 wild 효소에 비해 엘 리불로오스를 기질로 하였을 때 활성이 1.2~1.4배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이때 엘 리불로스에 대한 wild 효소의 specific activity 는 504 U/mg 임을 확인하였다 (표 1 참조). 그에 따른 돌연변이 효소의 DNA 염기 서열및 아미노산 서열을 wild 효소와 비교해본결과, 1~3개의 포인트가 돌연변이가 유발된 것을 확인할 수 있었다. 이는 현재까지 리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 지오바실러스 써모디니 트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균주 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소였지만, 그에 따른 돌연 변이 효소가 보다 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이것은 돌연변이 효소가 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성을 가진 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 능가하는 엘-리보스 생산 효소임을 나타낸다.

Enzyme	Mutation point	Relative activity (%)
Wild	None	100
Mutant 1	K21E, N74T, M134R	121
Mutant 2	E67G, T238I	132
Mutant 3	K124R, L129F	131
Mutant 4	N90D	125

표 1은 만노스-6-인산 이성화 효소와 돌연변이 효소들의 엘-리불로스에 대한 효소 활성을 나타낸 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1에 기재된 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 21번, 74번, 134번 잔기의 아미노산을 각각 라이신(K), 아스파라진(N), 메티오닌(M)에서 각각 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아르지닌(R)으로 변환시킨 돌연변이체를 제조하여 야생형 만노스 6-인산 이성화효소 (mannose 6-phosphate isomerase)의 엘-리보스 생산성을 개선하는 방법.
   
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