ES2314088T3 - Una isomerasa termoestable y su uso, en particular para producir tagatosa. - Google Patents
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Abstract
Una L-arabinosa-isomerasa capaz de isomerizar D-galactosa en D-tagatosa, isomerasa que tiene al menos una identidad de secuencia del 70% con la secuencia de SEQ ID NO:2.
Description
Una isomerasa termoestable y su uso, en
particular para producir tagatosa.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de enzimas industriales, en particular, de enzimas para la
síntesis de azúcares tales como D-tagatosa.
La D-tagatosa es el cetoazúcar
que corresponde a la D-galactosa de aldoazúcar.
Tiene un valor endulzante equivalente a la sacarosa pero de
digestión pobre y se ha descubierto que es un endulzante útil,
seguro, de bajas calorías y no cariogénico, para productos
alimenticios, para los que existe una gran demanda.
La D-tagatosa puede sintetizarse
químicamente, por ejemplo, de acuerdo con lo descrito en la US
5.002.612.
Se han descrito métodos enzimáticos para la
producción de D-tagatosa. Yamanaka y Wood (1966)
enumeran un número de bacterias de ácido láctico que proporcionan
una enzima L-arabinosa-isomerasa
capaz de producir cetosas a partir de L-arabinosa,
D-galactosa o D-fucosa.
El documento US 6.057.135 divulga un
procedimiento para la fabricación de D-tagatosa,
donde se hidroliza un permeato de galactosa para obtener un
hidrolisado de lactosa que comprende D-galactosa y
glucosa. El hidrolizado es fermentado para convertir la glucosa en
etanol que es posteriormente retirada y la solución restante de
D-galactosa es sometida a isomerización enzimática
con una L-arabinosa-isomerasa para
obtener D-tagatosa. Las preparaciones de
L-arabinosa-isomerasa utilizadas son
extractos de biomasa cruda de Lactobacillus pentosus, Bacillus
amyloloquefaciens o Arthrobacter spp.
El documento WO 00/68397 describe el uso de
E. coli preparada para una expresión mejorada de
L-arabinosa-isomerasa de E.
coli para la producción de tagatosa.
El documento WO 02/50282 describe el aislamiento
de una L-arabinosa-isomerasa
termoestable capaz de isomerizar galactosa. La secuencia de
aminoácido de esta enzima se relaciona estrechamente con las
secuencias de L-arabinosa-isomerasa
previamente conocidas, especialmente Bacillus
stearothermophilus.
No obstante, hasta la fecha, los métodos
enzimáticos para la producción de tagatosa no han sido utilizados
comercialmente. Existe una gran demanda de nuevos y mejorados
endulzantes bajos en calorías y, en consecuencia, se necesitan en
la industria, métodos mejorados para la producción de tagatosa con
un rendimiento y eficacia
superiores.
superiores.
En la actualidad, se ha aislado y caracterizado
una enzima nueva activa en
L-arabinosa-isomerasa. Esta enzima
exhibe una baja similitud de secuencia al compararla con todas las
secuencias de L-arabinosa-isomerasa
conocidas en la actualidad, incluyendo aquellas divulgadas en los
documentos WO 00/68397 y en la WO 02/50282. La enzima de la actual
invención tiene una especificidad de sustrato diferente en
comparación con las
L-arabinosa-isomerasas del estado
de la técnica, y es una aldosa-isomerasa versátil
capaz de isomerizar estructuralmente aldosas relacionadas. La
enzima puede obtenerse a partir de una fuente microbiana termófila
y puede ser utilizada, así, a altas temperaturas de operación.
En un primer aspecto de la invención, se
proporciona una
L-arabinosa-isomerasa, capaz de
isomarizar D-galactosa en
D-tagalosa, cuya isomerasa tiene, al menos, un 70%
de identidad con la secuencia de SEQ IDNO:2.
Un segundo aspecto de la invención es la
provisión de ácido nucleico que codifica esta
L-arabinosa-isomerasa o su
fragmento activo de
L-arabinosa-isomerasa.
En otro aspecto, se proporciona una construcción
de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico anterior.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
una célula que se transforma con la construcción o con el ácido
nucleico anteriormente mencionados.
En otro aspecto, se proporciona un método para
convertir una aldosa en una cetosa, que comprende poner en contacto
la aldosa con la isomerasa de la invención y mantener la reacción
bajo condiciones donde al menos 1% en peso de la aldosa se
convierta en la cetosa correspondiente.
La invención proporciona, en otro aspecto, un
método para la producción de
L-arabinosa-isomerasa, que comprende
transformar una célula con el ácido nucleico de la invención y el
enlace operable del mismo a señales de expresión apropiadas que
dirigen la expresión de la isomerasa y, opcionalmente, secuencias
que dirigen la secreción de la isomerasa, propagar dicha célula
transformada y cosechar las células de progenie que contienen la
isomerasa o, si es secretada al medio, la isomerasa excretada.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición que comprende la isomerasa de la invención en otra
forma inmovilizada.
De acuerdo con lo establecido con anterioridad,
la invención aquí descrita proporciona una enzima activa de
L-arabinosa-isomerasa o su fragmento
activo de isomerasa, que deriva de una especie
Thermoanaerobacter.
La
L-arabinosa-isomerasa (EC 5.3.1.4)
también conocida como
L-arabinosa-cetol-isomerasa,
se encuentra en la clase general de oxidorreductasas
intramoleculares y más específicamente, en el grupo de
aldosa-isomerasas, que son capaces de
inter-convertir aldosas en sus cetosas
correspondientes. La
L-arabinosa-isomerasa es clasificada
y denominada según su capacidad para convertir la
aldosa-L-arabinosa en su
correspondiente cetosa, L-ribulosa.
El término "aislada", tal como se utiliza
en la presente memoria, hace referencia a que el material es
retirado de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural
donde el material se presenta naturalmente). Por ejemplo, un
polinucleótido o un polipéptido, mientras se encuentra presente en
un organismo vivo, no está aislado, pero el mismo polinucleótido o
polipéptido, que es separado de parte o de todos los materiales
coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos
polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos
polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una
composición, y aún ser aislados en el sentido que el vector o la
composición no es parte del ambiente natural.
El género Thermoanaerobacter incluye un
rango de especies como T. acetoethylicus, T. brockii, T.
cellulolyticus, T. ethanolicus, T. finnii, T. italicus, T. kivui,
T. mathranii, T. siderophilus, T. subterraneus, T. sulfurophilus,
T. thermohydrosulfuricus y T. wiegelii. En una
realización preferida, a la que ahora se hace referencia, la enzima
isomerasa o el fragmento activo de la misma se obtiene de la especie
T. mathranii, de la que puede obtenerse una cepa útil (DSMZ
11426) a partir de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSMZ).
La isomerasa de la invención tiene,
preferiblemente, al menos una de las siguientes características: (i)
una actividad óptima a una temperatura en el intervalo de 40 a
95ºC, preferentemente, en el intervalo de 60 a 80ºC, como en el
intervalo de 60 a 70ºC, incluyendo aproximadamente 65ºC; (ii) una
actividad óptima en un pH en el intervalo de 6 a 9,
preferentemente, en el intervalo de 7 a 9, como en el intervalo de
aproximadamente pH 7 a 8; y (iii) es capaz de isomerizar al menos
una aldopentosa o al menos una aldohexosa. Las aldopentosas son
aldosas de 5 carbonos que incluyen, por ejemplo, arabinosa, ribosa,
xilosa, y lixosa, mientras que las aldohexosas son azúcares de seis
carbonos, incluyendo alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa,
galactosa, y talosa. Más preferentemente, la isomerasa tiene al
menos dos de estas características y más preferiblemente, las tres
características juntas. Las temperaturas de reacción de 60ºC y
superiores, como al menos 65ºC, 70ºC, 75ºC u 80ºC, son preferidas,
al minimizarse el riesgo de contaminación a causa del desarrollo de
otros microorganismos a dichas temperaturas elevadas. Además, las
altas temperaturas permiten el uso de concentraciones superiores de
sustrato debido a una mayor solubilidad del sustrato. La isomerasa
preferida de T. mathranii tiene un excelente perfil de
temperatura en este aspecto, con una actividad máxima de
aproximadamente 65º C, y se retiene aproximadamente o más de 70% de
la actividad máxima en el intervalo de temperatura de
aproximadamente 60ºC a 75ºC.
Otras ventajas de la isomerización a una
temperatura alta son:
(i) que el equilibrio entre aldosa y cetosa
cambia hacia cetosa a temperaturas superiores. (Para
L-arabinosa-isomerasa fra
Lactobacillus plantarum, se ha informado que la cantidad de
cetosa a 10ºC, 25ºC o 53ºC es de 10%, 14% y 16%
respectivamente (Heath, E. C. Horecker, B. L. Smyrniotis, P. Z. y
Takagi, Y. (1958) J. Biol. Chem.
231:1031-1037);
(ii) la especificidad del sustrato hacia la
D-galactosa es superior respecto de la
L-arabinosa a temperaturas superiores. La Patente
de EE.UU. Nº 6.057.135 8 (Krafts Foods, Inc., Ejemplo 5) divulga
L-arabinosa-isomerasa fra
Lactobacillus pentosus con una especificidad relativa para
L-ara:D-gal de 300:1 a 35ºC y 85:1 a
60ºC.
En comparación con las
L-arabinosa-isomerasas conocidas,
las isomerasas de la presente invención parecen ser
aldosa-isomerasas relativamente versátiles, capaces
de isomerizar muchas aldosas estructuralmente relacionadas.
Preferentemente, las isomerasas de la invención son capaces de
isomerizar al menos todas las siguientes:
L-arabinosa, D-galactosa y
D-fucosa. Estas tres aldosas tienen la misma
configuración quiral de C-1 a C-4.
En particular, para la producción de D-tagatosa,
resultan muy convenientes las isomerasas capaces de una
isomerización eficiente de D-galactosa.
La isomerasa de la invención deriva de una
fuente termófila, que la dota de una gran actividad a temperaturas
elevadas, como los intervalos de temperaturas comprendidos entre los
mencionados con anterioridad, durante períodos prolongados, y una
buena estabilidad frente a desnaturalización térmica. Se contempla
que las L-arabinosa-isomerasas
relacionadas de otras fuentes termófilas, tendrán características
adecuadas similares.
La actividad de la enzima respecto a
L-arabinosa y D-galactosa puede
probarse de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 2 o a través de
otros métodos aplicables conocidos en el estado de la técnica. La
especificidad puede definirse aún más a través de mediciones de
actividad comparativas para otros sustratos de aldosa.
En una realización de la invención, la isomerasa
tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2 de la presente
memoria. La invención también abarca variantes y derivados de la
misma, incluyendo variantes y derivados que tienen una actividad de
isomerasa y que muestran al menos una identidad de secuencia del 70%
respecto de esta secuencia, incluyendo al menos una identidad de
secuencia de 75% o de al menos 80%, como una identidad de secuencia
de al menos 90%, y preferentemente, una identidad de secuencia de al
menos 95% o del 97%. Por ejemplo, pueden obtenerse variantes y
derivados útiles por aislamiento de especies microbianas como
aquellas mencionadas con anterioridad y/o por modificación genética
de organismos que producen naturalmente isomerasas como por
mutagénesis dirigidas a lugar, o por ejemplo, por inserción de una
secuencia que codifica un marcador de afinidad como un
marcador
His.
His.
Entre los métodos alternativos para proporcionar
variantes de la invención se incluyen métodos disponibles de
redistribución de genes, por ejemplo, de acuerdo con lo descrito en
Merz y colaboradores, Biochemistry (2000),
39:880-889; J. Minshull Curr. Op. Chem. Biol.
(1999) 3:284-290; WO 95/22625 (Affymax Technologies
N.V.); US 6.291.165 (Novo Nordisk A/S); US 6.132.970 y US 6.372.497
(Maxygen, Inc.). En resumen, las técnicas de redistribución de
genes implican la proporción de una pluralidad de genes o de
secuencias de ácido nucleico relacionados (por ejemplo, secuencias
que codifican L-arabinosa-isomerasas
diferentes de la presente invención) que son fragmentadas de forma
aleatoria y luego son vueltas a unir por una reacción en la que
fragmentos homólogos (o regiones conservadas de fragmentos
heterólogos) actúan como cebadores entre sí. Las variantes obtenidas
de esta forma pueden ser rastreadas y seleccionadas en base a
diferentes criterios. Las técnicas de redistribución son
particularmente beneficiosas en este aspecto, ya que permiten la
combinación de diferentes propiedades convenientes de diversas
proteínas relacionadas. Respecto de las isomerasas de la presente
invención, las propiedades deseadas que pueden combinarse por
técnicas de redistribución y que pueden ser rastreadas con métodos
aplicables del estado de la técnica, incluyen especificidad de
sustrato, estabilidad de temperatura, temperatura óptima,
estabilidad a largo plazo, eficacia de expresión en un organismo
huésped seleccionado, etc.
La "identidad de secuencia", de la forma
utilizada en la presente memoria, se calcula en base a una secuencia
de referencia, (que en esta instancia es la secuencia de SEQ ID
NO:2). Los algoritmos para análisis de secuencia son conocidos en
el estado de la técnica, como por ejemplo, BLAST, descrito en
Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol., (1990)
215:403-10. Por lo general, se utilizarán para
alineación, los parámetros por defecto con respecto a, por ejemplo,
una "matriz de calificación" y una "penalidad para cada
hueco".
Como se muestra en la Figura 2 y descrito en el
Ejemplo 1, la isomerasa actualmente preferida de la invención
derivada de Thermoanaerobacter mathranii, tiene una identidad
de secuencia baja (de entre 24% y 30%) con
L-arabinosa-isomerasas conocidas,
donde todas muestran una identidad significativamente superior entre
sí. Esto puede explicar diferencias en las características
cinéticas y la especificidad de las
L-arabinosa-isomerasas del estado
de la técnica anterior.
Las isomerasas preferidas de la presente
invención tienen un peso molecular comprendido en el intervalo de
aproximadamente 50-60 kDa, y más preferentemente, en
el intervalo de aproximadamente 52-55 kDa,
incluyendo aproximadamente 53 kDa. No obstante, los fragmentos
activos de isomerasa de la invención pueden tener un peso molecular
significativamente menor ya que pueden contener solamente una
pequeña porción de una secuencia de isomerasa de tipo salvaje
necesaria para un pliegue correcto del polipéptido y la retención de
actividad.
La
L-arabinosa-isomerasa altamente
preferida derivada de T. mathranii tiene un peso molecular de
longitud completa de 53 kDa calculado en base de la secuencia de la
Tabla 1.2 de la presente memoria (SEQ ID NO:2). Muchas de las
isomerasas preferidas de la invención, incluyendo la isomerasa de
longitud completa derivada de T. mathranii, tienen una
estructura cuaternaria tetramérica en estado activo, nativo de la
proteína.
La expresión "fragmento activo de
isomerasa" hace referencia, por lo general, a cualquier fragmento
de una isomerasa de la presente invención, fragmento que es
suficientemente grande como para conservar sustancialmente la
actividad de la isomerasa de la que se obtiene. Si bien el sitio
activo de arabinosa-isomerasa no ha sido
caracterizado en detalle, una comparación con la
L-fucosa-isomerasa relacionada de
E. coli (Seemann, J. E. y Schulz, G. E. (1997) J. Mol.
Biol. 273:256-268) sugiere restos de sitio
activo. Glu 337 y Asp 361 son restos catalíticamente activos en la
fucosa-isomerasa. Una alineación de
L-arabinosa-isomerasas conocidas
con la L-fucosa-isomerasa muestra
que el resto de ácido glutámico se conserva entre todas las
L-arabinosa-isomerasas conocidas
(Glu 300 en la L-arabinosa-isomerasa
T. mathranii). El ácido aspártico se conserva en todas las
secuencias de L-arabinosa-isomerasa
salvo en la secuencia de T. mathranii, que tiene una
metionina en la posición correspondiente (Met 324) (véase Figura
4). Los restos que pueden actuar como donantes de protones son Asp
318, Glu 323 y Asp 328. En consecuencia, se postula que los restos
clave del sitio activo se encuentran ubicados en la región
comprendida entre restos de aminoácido 290-340. Así,
fragmentos activos de isomerasa útiles de la presente invención
pueden incluir un fragmento de secuencia que comprende restos dentro
de la región de 150-462, o por ejemplo,
200-460, como, dentro de la región de
200-400, o 250-400, incluyendo la
región de 270-350, o la región de
290-340. Un fragmento como ese puede ser plegado en
una estructura cuaternaria tetramérica, o posiblemente conservar su
actividad, pero con una estructura cuaternaria diferente, por
ejemplo, una estructura monomérica. Además, en ciertas
realizaciones, un fragmento de isomerasa de la invención puede ser
combinado con otras secuencias de polipéptidos adecuadas que no
impiden la actividad de isomerasa sino que pueden mejorar las
características como, por ejemplo, sobre expresión, solubilidad y/o
estabilidad, para obtener una proteína quimérica que comprende una
secuencia de fragmento activo de isomerasa.
En realizaciones útiles, la isomerasa de la
invención tiene un valor K_{m} para D-galactosa en
el intervalo de aproximadamente 50 a 350 mM, incluyendo el
intervalo de 100 a 200 mM. Determinadas isomerasas preferidas de la
invención tienen un K_{m} similar también para
L-arabinosa. En Stryer, L Biochemistry, 3ra
edición, Freeman, Nueva York, 1988, puede encontrarse una
definición clásica de K_{m}. Se deduce que la afinidad de
sustrato de dichas isomerasas preferidas para
D-galactosa en comparación con
L-arabinosa, es alta respecto de las isomerasas del
estado de la técnica anterior, tal como se muestra en la Figura 2.1
de la presente memoria.
Preferiblemente, la isomerasa según la invención
tiene una actividad de D-galactosa que es de
aproximadamente 10 al 50% de su actividad de
L-arabinosa, como por ejemplo, en el intervalo de
entre 15-30%, incluyendo el intervalo de
20-25%.
Las isomerasas preferidas de la presente
invención muestran una alta eficacia de conversión para la
conversión de D-galactosa en
D-tagatosa, incluso en altas concentraciones de
sustrato. Preferentemente, las isomerasas de la invención son
capaces de convertir al menos 20% en peso de
D-galactosa que está en una concentración de
aproximadamente 30% en peso o superior en el medio de reacción, en
un período de 24 horas.
La invención proporciona, en otro aspecto, una
L-arabinosa-isomerasa capaz de
isomerizar D-galactosa en
D-tagatosa, isomerasa que tiene una identidad de
secuencia de al menos 70% respecto de la secuencia de SEQ ID NO:2 de
la presente memoria, o superior, como r una identidad de secuencia
de al menos 80% o de al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ
ID NO:2 y un fragmento activo de isomerasa de la misma.
realizaciones particulares, la isomerasa puede tener una identidad
de secuencia aún superior respecto de SEQ ID NO:2, como una
identidad de secuencia de al menos 95% o de al menos 97%.
Preferentemente, la isomerasa deriva de un
organismo termófilo, como una bacteria que está taxonómicamente
relacionada con el género Thermoanaeorobacter.
En otro aspecto, la invención proporciona un
ácido nucleico que codifica una
L-arabinosa-isomerasa o un fragmento
activo de L-arabinosa-isomerasa de
la misma, seleccionada entre el grupo que consiste en: (i) un ácido
nucleico de tipo salvaje aislado de una especie
Thermoanaerobacter y (ii) una secuencia de ácido nucleico
capaz de hibridarse con la secuencia anteriormente mencionada bajo
condiciones restrictivas.
La expresión "ácido nucleico", de la forma
utilizada en la presente memoria, incluye ADN (por ejemplo, ADN
genómico o cDNA), y ARN, con nucleótidos naturales como que
contengan una o más bases modificadas. Así, los ADN o los ARN con
estructuras principales modificadas para estabilidad o por otras
razones, son ácido nucleicos de la forma definida en la presente
memoria. Además, los ADN o los ARN que comprenden bases inusuales,
como inosina, o bases modificadas, como bases tritiladas, sólo para
nombrar dos ejemplos, son ácidos nucleicos de la forma que se
utiliza la expresión en la presente memoria.
La expresión "condiciones restrictivas" en
este contexto, hace referencia a las condiciones generales de alta
restrictividad. El término "restrictividad" es conocido en el
estado de la técnica y se utiliza en referencia a las condiciones
(temperatura, fuerza iónica y presencia de otros compuestos como
disolventes orgánicos) bajo las cuales se llevan a cabo la
hibridación del ácido nucleico. Con condiciones de "alta
restrictividad" solo se producirá un pareado de base de ácido
nucleico entre fragmentos de ácido nucleico que tienen una alta
frecuencia de complementariedad de bases, en comparación con
condiciones de restrictividad "débiles" o "bajas".
Como ejemplo, las condiciones de hibridación de
alta restrictividad incluyen (1) emplear una baja fuerza iónica y
una alta temperatura de lavado, como NaCl 0,015 M/citrato de sodio
0,0015 M, pH 7,0 (0,1 x SSC) con 0,1% de dodecilsulfato de sodio
(SDS) a 50ºC; (2) emplear, durante la hibridación, formamida 50%
(v/v) con solución de Denhardt 5x(0,1% en peso/volumen),
albúmina de suero bovino altamente purificada/0,1% (en peso/volumen)
de Ficoll/0,1% (en peso/volumen)
polivinil-pirrolidona), 50 mM de tampón de fosfato
de sodio con un pH de 6,5 y 5xSSC a 42ºC; o (3) emplear la
hibridización con formamida al 50%, 5xSSC, 50 mM de fosfato de sodio
(pH de 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5x,
ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y
10% de sulfato de dextrano a 42ºC con lavados a 42ºC en 0,2xSSC y
0,1% de SDS.
En una realización preferida, el ácido nucleico
que codifica dicha isomerasa o fragmento de la misma es el ácido
nucleico de tipo salvaje aislado de Thermoanaerobacter
mathranii, o una secuencia capaz de hibridarse con dicha
secuencia bajo condiciones restrictivas.
En una realización útil, el ácido nucleico de la
invención, codifica el aminoácido de SEQ ID NO:2 de la presente
memoria, o un fragmento de isomerasa activa de la misma. No
obstante, también se abarcan en la presente invención, los ácidos
nucleicos que codifican polipéptidos de isomerasa activa con una
alta identidad de secuencia a SEQ ID NO:2 o una parte de isomerasa
activa de la misma, como con una identidad de secuencia de acuerdo
con lo definido con anterioridad de al menos 75%, y
preferentemente, del 90% o más, como 95% o 97%.
Una realización particular de la invención
proporcionan el ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID:1,
que se muestra en la Tabla 1.1, o un fragmento de la misma que se
codifica para un fragmento activo de isomerasa.
En otro aspecto muy útil, la invención
proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el
ácido nucleico de la invención. Una "construcción de ácido
nucleico", de la forma utilizada en la presente, incluye un
plásmido, virus, retrovirus, bacteriófago, transposón, cósmido,
cromosoma artificial (bacteriano o de levadura), que es capaz de
replicarse en una célula huésped y que típicamente, tiene uno o más
sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en los que
la secuencia puede ser cortada de una forma predeterminada. La
construcción también puede contener un marcador adecuado para ser
utilizado en la identificación de células transformadas, por
ejemplo, una resistencia a la tetraciclina o una resistencia a la
ampicilina.
La invención también abarca una célula que es
transformada ya sea por el ácido nucleico o construcción
anteriormente descritos. Una "célula", de la forma utilizada
en la presente memoria, se refiere a cualquier célula procariótica
o eucariótica que es utilizada como receptora de los polinucleótidos
recombinantes y construcciones proporcionadas en la presente
memoria. En realizaciones preferidas, la célula transformada de la
invención es una célula bacteriana, una célula de levadura o una
célula de un hongo filamentoso. Una célula huésped como E.
coli, puede ser empleada en este aspecto; no obstante, células
huésped preferidas son aquellas que resultan fácilmente compatibles
con la producción de alimentos. Ejemplos de células huésped
bacterianas adecuadas son: Bacillus spp, por ejemplo
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus,
Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
alkatophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, y
Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o
Streptomyces murinus, o Lactococcus spp., o
Lactobacillus spp. y Zymomomas spp. Células huésped de
levadura útiles se incluyen células de Saccharomyces spp.
(en particular, S. cerevisiae), Schizosaccharomyces
spp., y Pichia spp., y entre las células útiles de hongos
filamentosos se incluyen aquellos de Aspergillus spp, como
A. niger, A. nidulans y A. oryzae, Mucor spp., por
ejemplo, Mucor circinelloides, y Neurospora spp., por
ejemplo, Neurospora crassa.
Los métodos para transformar células como
aquellos mencionados con anterioridad con un ácido nucleico o
construcción como aquellos mencionados con anterioridad, son bien
conocidos en el estado de la técnica. La construcción o ácido
nucleico puede ser introducido en las células huésped utilizando
cualquier método adecuado (por ejemplo, electroporación,
transfección utilizando cloruro de calcio, cloruro de rubidio,
fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras
sustancias; bombardeo de microproyectiles, lipofección, infección,
transducción).
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para convertir una aldosa en una cetosa, método que comprende
poner en contacto la aldosa con la
L-arabinosa-isomerasa de la
invención y mantener la reacción bajo condiciones donde se
convierta al menos 1% en peso de la aldosa. Preferentemente, las
condiciones se seleccionan de manera tal que al menos 10% en peso
del sustrato de aldosa se convierta en su cetosa correspondiente, y
más preferentemente, que se convierta al menos aproximadamente 20%,
incluyendo aproximadamente 25%, y más preferentemente aún, al menos
aproximadamente 30% o más de la aldosa en cetosa.
La aldosa puede ser cualquiera de aquellas
mencionadas con anterioridad y se selecciona, preferiblemente,
entre el grupo que consiste en L-arabinosa,
D-galactosa y D-fucosa. Una
realización muy útil de la invención utiliza
D-galactosa como aldosa, en cuyo caso el producto de
reacción cetosa es D-tagatosa. La
D-galactosa puede obtenerse con facilidad
hidrolizando la lactosa, obtenida a escala comercial del suero de
queso y/o leche.
En una realización preferida del método, la
reacción se produce a una temperatura de la menos 60ºC, como en el
intervalo de 60-100ºC, incluyendo aproximadamente
60-801 C, y preferentemente, en un intervalo de
aproximadamente 60-70ºC.
Pueden requerirse iones de manganeso (Mn^{+2})
para sostener la actividad de al menos algunas de las isomerasas de
la invención. En consecuencia, en realizaciones útiles de la
invención, se encuentra presente un Mn^{+2} en la mezcla de la
reacción en una concentración comprendida en el intervalo de
aproximadamente 1-2 mM, incluyendo aproximadamente
entre 1-10 mM como en el intervalo de
aproximadamente 2-5 mM. No obstante, algunas de las
isomerasas preferidas aún retienen sustancialmente toda su actividad
si se encuentran presentes iones de Fe^{+2} a una concentración
como aquella que se acaba de mencionar, o superior.
Por lo general, las concentraciones de sustrato
altas son ventajosas en la producción industrial de
D-tagatosa utilizando el método de la invención,
como 5% en peso o superior, preferentemente, 10% en peso o superior
y más preferentemente, 30% en peso o superior, como en el intervalo
de 30-60% en peso. De acuerdo con lo analizado con
anterioridad, las isomerasas de la presente invención tienen una
buena eficacia de conversión de D-galactosa en
dichas concentraciones de sustrato, y altas temperaturas de
operación benefician una alta solubilidad de
sustrato.
sustrato.
La
L-arabinosa-isomerasa puede estar
proporcionada adecuadamente como una preparación de enzima aislada.
Pueden seleccionarse fácilmente, métodos de aislamiento de
isomerasa de su fuente, y el experto en la materia puede ajustarlos
para obtener la enzima aislada de la pureza deseada. Dichos métodos
pueden comprender una o más etapas de purificación cromográfica por
intercambio de iones, afinidad, y cromatografía de permeación en
gel, y/o pueden incluir etapas de sonificación, centrifugación y/o
ultra-filtración.
Preferentemente, la isomerasa es purificada
hasta un punto en el cual no hay ninguna otra proteína. En este
contexto, la expresión "esencialmente sin ninguna otra
proteína" hace referencia a un alto grado de pureza, donde otras
proteínas comprenden menos del 10% en peso de la preparación de
isomerasa purificada, preferentemente, menos del 5% en peso y más
preferentemente, menos del 3% en peso, como sustancialmente del 0%
en peso de la preparación.
La enzima de la invención puede ser utilizada,
ventajosamente, como una enzima libre, no inmovilizada, pero en
otras realizaciones útiles, la preparación de enzima de isomerasa
aislada es inmovilizada. En el presente contexto, el término
"inmovilizada" hace referencia, por lo general, al enlace
(covalente o no covalente) de la enzima con una matriz sólida como
perlas, fibras o una membrana, o la incorporación de la enzima
dentro de una matriz porosa, de manera que el contacto entre matriz
y enzima sea retenido durante condiciones normales de reacción. Los
métodos de inmovilización de una enzima resultan conocidos en el
arte, e incluyen como ejemplo, el entrecruzamiento con
glutaraldehído de la forma demostrada en el Ejemplo 3. Otros métodos
aplicables son, por ejemplo, acoplamiento de la enzima en grupos
hidroxilo de matriz que son activados, por ejemplo, por
carbodiimida, carbonil-diimidazol,
N,N=-disuccinimidil-carbonato (DSC), o bromuro de
cianógeno; y acoplamiento por epoxidación, por ejemplo, por
1,4-butanediol-diglicidil-éter.
De acuerdo con lo mostrado por el Ejemplo 3.3 de
la presente memoria, se observa que la isomerasa inmovilizada de la
invención tiene una excelente estabilidad a largo plazo durante
ciclos de reacción repetidos a temperaturas de operación
relativamente altas (65ºC), y así, es altamente adecuada para
aplicaciones industriales.
Se ha descubierto que un procedimiento de dos
etapas de (i) hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa y de (ii)
isomerizar la galactosa obtenida en tagatosa, puede llevarse a cabo
en un reactor simple; es decir, que una enzima de lactasa activa
adecuada y una L-arabinosa-isomerasa
de la presente invención pueden ser utilizadas simultáneamente en
una unidad de reacción que es alimentada con lactosa para obtener
tagatosa. Una realización de esto queda demostrada y descrita en
detalle en el Ejemplo 4. Sorprendentemente, la glucosa obtenida no
impide la actividad de la isomerasa, y la glucosa puede ser separada
de la tagatosa así como también cualquier galactosa isomerizada a
través de medios de separación adecuados, como por cromatografía. Se
establece convenientemente un procedimiento de un reactor y dos
etapas como este a través del uso de lactasa inmovilizada y
L-arabinosa-isomerasa inmovilizada,
donde ambas enzimas pueden ser inmovilizadas por ejemplo, de la
forma descrita en la presente memoria. Preferentemente, la lactasa
debe mantener su actividad a una temperatura alta, por ejemplo, en
el intervalo de 60-100ºC, incluyendo el intervalo
de 60- 80ºC y 60-70ºC, de manera tal que pueda
utilizarse el régimen de alta temperatura de la isomerasa, de
acuerdo con lo descrito en la presente memoria. Una enzima de
lactasa preferida en este aspecto es la
\beta-glicosidasa que se consigue fácilmente de
varias fuentes, por ejemplo, derivada de bacteria termófila y
expresada en un huésped adecuado como E. coli, pero más
preferentemente, en una célula huésped de producción de alimentos
mejor aprobada y más compatible, como las mencionadas en la
presente.
En base a los descubrimientos anteriormente
mencionados, la descripción proporciona, de esta forma, en otro
aspecto, un método para la producción de D-tagatosa
que comprende la hidrolización de lactosa por contacto de lactosa
con una enzima de lactasa activa (en la mayoría de los casos, una
\beta-galactosidasa) para rendir glucosa y
D-galactosa, y convertir al menos una porción de la
D-galactosa obtenida en D-tagatosa
por contacto de la galactosa con una enzima de
L-arabinosa-isomerasa activa, donde
dicha enzima de lactasa activa y dicha enzima de
L-arabinosa-isomerasa activa se
encuentran contenidas en la misma unidad de reactor bajo
esencialmente las mismas condiciones de reacción. En realizaciones
particularmente útiles, las condiciones de reacción incluyen una
temperatura en el intervalo de aproximadamente 50ºC a
aproximadamente 100ºC, preferiblemente, de aproximadamente 55ºC a
aproximadamente 100ºC, y más preferiblemente, de aproximadamente
60ºC a aproximadamente 100ºC, como en el intervalo de
aproximadamente 60ºC a 80ºC, incluyendo el intervalo de
aproximadamente 65ºC a aproximadamente 80ºC, como en el intervalo
de aproximadamente 65ºC a aproximadamente 75ºC, incluyendo
aproximadamente 65ºC, aproximadamente 70ºC y aproximadamente 75ºC.
Además, las condiciones de reacción incluirán, típicamente, dichas
condiciones de acuerdo con lo descrito con anterioridad, como un pH
en el intervalo de 6 a 9, preferentemente, en el intervalo de 7 a
9, como en el intervalo de aproximadamente 7 a 8.
La D-tagatosa producida por los
métodos de la presente invención, encuentra uso en una variedad de
aplicaciones farmacéuticas, alimentos y alimentos funcionales. Se
trata de un endulzante de volumen completo de bajas calorías que
puede reemplazar ventajosamente, completa o parcialmente, al azúcar
y/o endulzantes sin azúcar en productos dulces convencionales como
caramelos, chocolate, cereales, productos lácteos dulces (helados,
yogur, bebidas a base de leche), productos horneados, y gaseosas.
La D-tagatosa puede ser utilizada, además, en barras
dietéticas, goma de mascar sin azúcar, y como relleno endulzante en
productos medicinales como pastillas, tabletas y mezclas líquidas.
La D-tagatosa es no cariogénica y tiene propiedades
probióticas que promueven una digestión saludable. El compuesto es
seguro para ser utilizado por personas diabéticas.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un método para la producción de
L-arabinosa-isomerasa, que
comprende transformar una célula como aquellas descritas con
anterioridad, con un ácido nucleico de la invención, y el enlace
operable del mismo con señales de expresión adecuadas que dirigen la
expresión de la isomerasa, y opcionalmente, secuencias que dirigen
la secreción de la isomerasa, propagar la célula transformada de
esta manera y cosechar las células de progenie que contienen la
isomerasa o, si es secretada en el medio, la isomerasa extraída. El
término "transformación" hace referencia al cambio de una forma
heredable de las características de una célula huésped como
respuesta al ADN exógeno introducido, que puede estar integrado o no
(enlazado covalentemente) al ADN cromosómico que forma el genoma de
una célula. En procariotas y levadura, por ejemplo, el ADN exógeno
puede estar mantenido en un elemento episomal como un plásmido.
Respecto de células eucarióticas, una célula establemente
transformada es aquella donde el ADN exógeno ha sido integrado en un
cromosoma de manera que sea heredado por células hermanas a través
de replicación de cromosomas. Esta estabilidad queda demostrada por
la capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares
o clones formados por una población de células hermanas con
contenido de ADN exógeno.
En realizaciones útiles, el método de la
invención comprende el otro paso de purificación de
L-arabinosa-isomerasa de células de
progenie o el medio de obtener una preparación de
L-arabinosa-isomerasa, por ejemplo,
con métodos de purificación como aquellos descritos con
anterioridad.
En una forma de realización, el método comprende
la etapa adicional de secar la preparación de isomerasa a un
contenido de humedad de 10% en peso como máximo. Una preparación
como esta puede estar en forma de polvo o de gránulos, que puede
ser vuelta a disolver en un medio para utilizar la isomerasa de la
forma descrita en la presente.
Todavía en otro aspecto, la invención
proporciona una composición que comprende la
L-arabinosa-isomerasa descrita en
la presente, en una forma inmovilizada, por ejemplo, una forma
inmovilizada como la descrita en la presente memoria.
La invención además se ilustra en mayor detalle
en los siguientes ejemplos no limitativos y en los dibujos,
donde:
- la Figura 1 es un mapa genético del fragmento
de ADN de T. mathranii que fue clonado en E. coli, de
acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 1;
- la Figura 2 muestra el porcentaje de restos de
aminoácido idénticos descubiertos por alineación en forma de pares
de una cantidad de secuencias araA conocidas en comparación
con las secuencias de T. mathranii. Las secuencias conocidas
son identificadas por números de acceso de la base de datos
EMBL/Genbank;
- la Figura 3 muestra un árbol filogenético en
base a todas las secuencias de aminoácido de
L-arabinosa-isomerasa disponibles
en la actualidad en bases de datos públicas de secuencias y la
secuencia de T. mathranii;
- la Figura 4 muestra una alineación de
secuencia de aminoácido del gen araA de Thermoanaerobacter
mathranii y otras secuencias araA disponibles en la
actualidad en bases de datos públicas. Los números que se muestran
debajo de las secuencias hacen referencia a la secuencia araA
de T. mathranii. Los restos de aminoácido catalíticamente
activos en el sitio activo de la
L-fucosa-isomerasa E. coli
son Glu 337 y Asp 361, y los aminoácidos putativos correspondientes
están marcados con "#" en la alineación de las secuencias de
L-arabinosa-isomerasa. Los restos
de aminoácido conservados están marcados con "*", las
sustituciones conservadoras están marcadas con ":" y los
restos relacionados están marcados con ".". La alineación fue
realizada con el programa CLUSTAL X (1.8);
- la Figura 5 ilustra la dependencia de
temperatura de L-arabinosa-isomerasa
de T. mathranii producida en E. coli;
- la Figura 6 ilustra la dependencia de pH de
L-arabinosa-isomerasa de T.
mathranii producida en E. coli; y
- la Figura 7 ilustra la conversión de reactor
simple de lactosa en tagatosa con lactasa inmovilizada e isomerasa
inmovilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el microorganismo
Thermoanaerobacter mathranii DSMZ 11426 termofílico
anaeróbico a partir de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascherodes Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania (DSMZ). Originalmente, se describió la cepa
como "cepa A3" (Sonne-Hansen, J. Mathrani, I.
M. y Ahring, B. K. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol.
38:537-541). Posteriormente, se depositó la cepa en
DSMZ y se propuso el nombre T. mathranii (Larsen, L.,
Nielsen, P. y Ahring, B. (1997) Arch. Microbiol.
168:114-119).
Se cultivó T. mathranii (DSMZ 11426) a
65ºC bajo condiciones anaeróbicas en el medio recomendado por DSMZ.
Después del crecimiento, se centrifugó el cultivo y se almacenó el
pélet a -80ºC hasta purificación de ADN cromosómico.
Se utilizó un método de extracción de
fenol/cloroformo clásico descrito por Sambrook y colaboradores para
la purificación de ADN cromosómico total de células de T.
mathranii congeladas. Se escindió parcialmente el ADN
cromosómico purificado con enzima de restricción Sau3A (New
England Biolabs) y se purificaron fragmentos de ADN de
aproximadamente 3-4 kb a partir de geles de agarosa
utilizando el kit de Purificación de Banda en Gel GFX (Amersham
Pharmacia Biotech).
Se segmentó el plásmido de pBluescript KS (+/-)
(Strategene Cloning Systems) con enzima de restricción BamHI
(New England Biolabs), se trató con fosfatasa alcalina (CIP, New
England Biolabs) y se purificó a partir de geles de agarosa
utilizando el kit de Purificación de Banda en Gel GFX (Amersham
Pharmacia Biotech). Tras la ligación de fragmentos de ADN
purificados y el vector del plásmido purificado, se introdujo la
mezcla de ligación en células DH10B supercompetentes (Life
Technologies) por electroporación de acuerdo con lo descrito por el
fabricante. Las células transformadas se colocaron en placas sobre
medio LB que contiene ampicilina (100 \mug/ml). Se agruparon
aproximadamente 16.000 colonias de 20 placas, y se utilizó un kit
Jetstar (Genomed) para producir una preparación plasmídica a partir
de las células agrupadas.
Se introdujo un banco de plásmidos preparado a
partir de células agrupadas por electroporación en células UP1089,
una cepa Escherichia coli que lleva una mutación araA
que evita que se desarrolle en un medio mínimo de
L-arabinosa. La cepa UP1089 fue provista por E.
coli Genetic Stock Center, 355 Osborn Memorial Laboratories,
Departamento de Biología, P.O. Box 208104, Universidad de Yale, New
Haven, CT 06520-8104, EE.UU. Después de la
transformación con el banco de plásmidos, las células UP1089 se
colocaron en placas sobre medio mínimo con contenido de
L-arabinosa como único azúcar, y se seleccionó así
para complementar la mutación de araA. Se obtuvieron
aproximadamente 90 colonias por selección de desarrollo sobre placas
medianas mínimas de L-arabinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron insertos plasmídicos a partir
de dos de estas colonias para secuenciar ADN (ALF Express, Amersham
Pharmacia Biotech), y se descubrió que contenían fragmentos
idénticos de ADN que comprendían un gen de
L-arabinosa-isomerasa (araA)
seguido de un gen de L-ribulokinasa (araB)
(Figura 1). La secuencia nucleótida de la parte 5' de un fragmento
de ADN clonado que comprende los genes araA y araB se
muestra en la Tabla 1.1 a continuación. El marco de lectura abierto
del gen araA se muestra en negrita (nucleótidos
463-1860).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El marco de lectura abierto del gen araA
codificó 465 restos de aminoácido, correspondientes a un peso
molecular de 52.785 Da. La secuencia de aminoácido del producto de
gen araA (SEQ ID NO:2) deducida de la secuencia de la Tabla
1.1 se muestra en la Tabla 1.2 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácido mostró una homología
con las L-arabinosa-isomerasas
previamente conocidas. El porcentaje de restos de aminoácido
idénticos era relativamente bajo, 24% y 30%, cuando la secuencia de
T. mathranii se alineaba con otros genes araA (Figura
4). En comparación, el nivel de identidad estaba por encima del 46%
dentro del grupo de referencia de
L-arabinosa-isomerasas previamente
conocidas (Figura 2). Las secuencias de aminoácido de
L-arabinosa-isomerasa disponibles en
la actualidad en bases de datos públicas de secuencias y la
secuencia de T. mathranii fueron posteriormente utilizadas
para la construcción de un árbol filogenético (Figura 3) utilizando
el programa ClustalX (Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F.,
Jeanmougin, F. y Higgins, D. G. (1997) Nucleic Acids Res.
25:4876-4882).
Se seleccionó una de las dos colonias para un
uso ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crecieron células E. coli que albergan
el gen de L-arabinosa-isomerasa,
durante la noche, a 37ºC en medio LB que contienen ampicilina (100
\mug/ml). Después de centrifugar, se volvieron a suspender las
células en 50 mM de Tris-Cl, con un pH de 7,5 y se
sometió a lisis en una celda de presión French operada a 1.100
psig. Se retiró el desecho celular por centrifugado y el extracto
celular resultante fue utilizado para caracterizar la enzima, de
acuerdo con lo descrito a continuación.
Se determinó la actividad de
L-arabinosa-isomerasa de acuerdo con
lo descrito por Yamanaka, K. y Wood, W. A. (1996) en Methods in
Enzymology 9:596-602. Se mezcló una muestra de
enzima, 10 y 50 \mul, con 950 \mul de reactivo de ensayo y se
incubó a 65ºC durante 60 minutos. Las concentraciones finales
fueron: L-arabinosa, 5 mM; MnCl_{2}, 5 mM; buffer
de maleato, con un pH de 6,9, 25 mM. Cuando se utilizó galactosa o
fucosa como sustrato, la concentración de
D-galactosa o D-fucosa fue de 0,5 M
y el tiempo de incubación, fue aproximadamente 16 horas.
Se determinaron las concentraciones obtenidas de
las cetosas L-ribulosa, D-tagatosa o
D-fuculosa, respectivamente, por el método de
cisteína-carbazol-ácido sulfúrico (Dische, Z. y
Borenfreund, E. (1951) J. Biol. Chem.
192:583-587). Se incubaron muestras a temperatura
ambiente durante 60 minutos y se midió la absorbancia a 560 nm en
un lector de microplaca. Se realizaron curvas estándar que mostraban
la respuesta de color de 0 a 5 mM de cetosa con
D-tagatosa y D-ribulosa, dado que la
L-ribulosa no se encontraba comercialmente
disponible. (No se obtuvo ninguna curva estándar para la
D-fuculosa que no se encontraba comercialmente
disponible).
Se determinaron las concentraciones de lactosa,
D-glucosa, D-galactosa,
D-tagatosa, L-ribulosa y
D-fuculosa por cromatografía líquida a alta presión
utilizando una columna Aminez HPX-87C
(Bio-Rad) y un detector de índice refractario. Se
des-ionizó la fase móvil, se desgasificó agua, la
temperatura de columna era de 85ºC y la velocidad del flujo era de
0,6 ml/min.
Los ensayos de D-galactosa que
se llevaron a cabo a temperaturas crecientes entre 45ºC y 85ºC,
mostraron la actividad más alta a 65ºC (Figura 5).
Los ensayos de D-galactosa que
se llevaron a cabo a un pH de 4, 5, 6, 7, 8 y 9, mostraron,
respectivamente, la actividad más alta a un pH de 8 (Figura 6). El
tampón utilizado para estos ensayos era una mezcla de ácido acético
25 mM, ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico
(MES) 25 mM, MnCl_{2} 5 mM, y
tris[hidroximetil]-aminometano (TRIS) 25 mM,
que fue titrado con HCl o NaOH.
Se ensayó un intervalo de sales de metal
(MnCl_{2}, NaCl, KCl, MgSO_{4}, ZnSO_{4}, CuSO_{4} y
FeSO_{4}) por su capacidad de reactivar enzimas que habían sido
previamente dializadas contra una disolución amortiguadora que
contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM. Solamente la
adición de MnCl_{2} (100%) o de FeSO_{4} (76%) restableció la
actividad de
L-arabinosa-isomerasa.
También se ha informado acerca de otras enzimas
de L-arabinosa-isomerasa de
Escherichia coli (Patrick, J. W., y Lee, N. (1968) J.
Biol. Chem. 243:4312-4318), Aerobacter
aerogenes (Yanamaka, K. y Wood, W. A. (1966) Methods in
Enzymology 9:596-602), y Lactobacillus
gayonii (Nakamatu, T. y Yamanaka, K. (1968) Biochim.
Biophys. Acta 178:156-165) requieren de
Mn^{2+}.
Se determinó un peso molecular nativo de
aproximadamente 220 kDa por filtración con gel en una columna
Superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) y por ensayo de
enzima de fracciones recolectadas.
La electroforesis en gel de
dodecilsulfatopoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) de
fracciones recolectadas mostró un peso molecular de subunidad de
aproximadamente 55 kDa, que concuerda con el tamaño de subunidad de
53 kDa previsto de la secuencia de ADN del marco de lectura abierto
de araA (465 residuos de aminoácido). La identidad de la
banda de L-arabinosa-isomerasa de 55
kDa vista en SDS-PAGE fue verificada por
transferencia electroforética del polipéptido en membrana de
difluoruro de polivinilideno (PVDF) y la secuencia de aminoácido
N-terminal en un micro-secuenciador
automatizado. La secuencia N-terminal, MQTKKK-, era
idéntica a la secuencia de aminoácido deducida de la secuencia de
ADN del gen de araA de T. mathranii, de acuerdo con lo
descrito con anterioridad en el Ejemplo 1.
El peso molecular nativo observado de
aproximadamente 220 kDa y el tamaño de subunidad de aproximadamente
55 kDa sugieren que la enzima activa es un tetrámero. La enzima
correspondiente en E. coli es un hexámero que contiene seis
subunidades idénticas de aproximadamente 60 kDa (Patrick, J. W. y
Lee, N. J. (1969) J. Biol. Chem.
244:4277-4283).
\global\parskip0.950000\baselineskip
Se ha informado previamente que determinadas
enzimas de L-arabinosa-isomerasa
pueden isomerizar no solamente L-arabinosa, sino
también D-galactosa y D-fucosa
(Yamanaka, K. y Wood, W. A. (1966) Methods in Enzymology
9:596-602). Estos azúcares tienen la misma
configuración en C_{1} a C_{4}, incluyendo una configuración
L-cis a C_{2}-C_{3}.
La relación molar de cetoazúcar generada por
isomerización de L-arabinosa y
D-galactosa respectivamente, fue determinada a una
concentración de sustrato de 0,5 M (con un pH de 6,9 a 65ºC). Se
calculó la relación a partir de respuestas de color de
cisteína-carbazol-ácido sulfúrico y las curvas
estándar generadas con ribulosa y tagatosa, respectivamente. Este
cálculo demostró que la actividad de D-galactosa era
el 21% de la actividad de L-arabinosa.
La respuesta de color obtenida con 0,5 M de
D-fucosa fue el 46% de la respuesta correspondiente
vista con L-arabinosa. La relación molar entre la
actividad de D-fucosa y L-arabinosa
no podía calcularse, dado que no se obtuvo ninguna curva estándar
para D-fuculosa.
No se detectó ninguna actividad enzimática
significativa con otras aldohexosas (D-glucosa,
D-manosa), con otras aldopentosas
(D-arabinosa, L-ribosa,
D-ribosa, D-xilosa), ni con otra
deoxiazúcar (L-fucosa).
La aparentes constantes de
Michaelis-Menten, K_{m}, de la enzima eran
aproximadamente 80 mM para L-arabinosa,
aproximadamente 120 mM para D-galactosa, y
aproximadamente 145 mM para D-fucosa. La Tabla 2.1
muestra valores previamente registrados para otras
L-arabinosa-isomerasas. La amplia
especificidad de sustrato mostrada con anterioridad y los valores
K_{m} similares para L-arabinosa,
D-galactosa, y D-fucosa sugieren que
la enzima de la invención, en comparación con otras
L-arabinosa-isomerasas, es una
aldosa-isomerasa versátil capaz de isomerizar un
intervalo de aldosas estructuralmente relacionadas.
Referencias citadas en la Tabla 2.1:
1: Yamanaka, K. y Wood, W. A.
(1966) Methods in Enrymology
9:596-602.
2: Ibrahim, O. O. y Spradlin, J.
E., Patente estadounidense Nº 6.057.135 (Kraft Foods, Inc.).
3: Patrick, J. W. y Lee, N.
(1968) J. Biol. Chem.
243:4312-4318.
4: Heath, E. C., Horecker, B. L.,
Smymiotis, P. Z. y Takagi, Y. (1958) J.
Biol. Chem. 231:1031-1037.
5: Nakamatu, T. y Yamanaka, K.
(1969) Biochim. Biophys. Acta
178:156-165.
6: Izumori, K., Yeda, Y. y
Yamanaka, K. (l978) J. Bacteriol
133:413-414.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se utilizó enzima libre para demostrar el
potencial de bioconversión de la enzima en concentraciones elevadas
de sustrato. Se incubaron a 65ºC mezclas de ensayo de un ml que
contienen 0,20 ml de extracto celular de E. coli con
L-arabinosa-isomerasa recombinante
de T. mathranii, 0,30 g de D-galactosa (30%,
1,67 M) o 0,60 g de D-galactosa (60%, 3,33 M), 25
mM de tampón maleato, con un pH de 6,9 y 5 mM de MnCl_{2}. Se
trataron muestras control sin enzima de forma similar.
Periódicamente, se tomaron muestras y se determinó la concentración
de D-tagatosa por el método de
cisteína-carbazol-ácido sulfúrico de acuerdo con lo
descrito con anterioridad. Los resultados aparecen en la Tabla 2.2
A (30% de D-tagatosa) y en la Tabla 2.2 B (60% de
D-galactosa).
\vskip1.000000\baselineskip
Bioconversión de
D-galactosa en D-tagatosa con enzima
libre
Concentración inicial de D-galactosa
30% (1,67
M)
\vskip1.000000\baselineskip
Bioconversión de
D-galactosa en D-tagatosa con enzima
libre
Concentración inicial de D-galactosa
60% (3,33
M)
\vskip1.000000\baselineskip
Se recolectaron células de un cultivo de 2
litros de células de E. coli que producen
L-arabinosa-isomerasa, por
centrifugación y se las homogeneizó en una celda de presión French
de acuerdo con lo descrito con anterioridad. Se inmovilizó la
enzima entrecruzando todos los componentes celulares con
glutaraldehído y polietilenimina de acuerdo con lo descrito en el
documento US 4.355.105. Se obtuvo glutaraldehído, al 25%
(peso/volumen) de Merck, Darmstadt, Alemania, y se obtuvo
polietilenimina, al 50% (peso/volumen) de Sigma Chemicals. Se
recubrió la enzima entrecruzada por centrifugación, y se liofilizó
el pélet y se almacenó a 4ºC hasta su uso posterior.
Se determinó la actividad de la enzima
inmovilizada por incubación de 20 mg de enzima liofilizada en una
mezcla de ensayo de un ml que contenía 0,30 g de
D-galactosa (30%, 1,67 M), 25 mM de tampón maleato,
pH 6,9, y 5 mM de MnCl_{2} a 65ºC. Se trató una muestra control
sin enzima de forma similar. Periódicamente, se tomaron muestras y
se determinó la concentración de D-tagatosa por
cromatografía líquida a alta presión. El rendimiento de enzima
inmovilizada generalmente, fue de 60-100 unidades
por litro de cultivo de célula de E. coli, y la recuperación
de actividad enzimática después de la inmovilización, fue
aproximadamente 50%. La actividad específica de la preparación de
enzima inmovilizada era de aproximadamente 55 unidades por gramo de
enzima liofilizada. Se definió una unidad como la cantidad de
enzima que produce un micromol de D-tagatosa por
minuto a 65ºC, pH 6,9, en una solución al 30% (peso/volumen) de
D-galactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron mezclas de ensayo de un ml que
contienen 40 mg de enzima liofilizada (2,2 unidades), 0,30 g de
D-galactosa (30%, 1,67 M), 25 mM de tampón maleato,
pH 6,9 y 5 mM de MnCl_{2} a 65ºC. Se trató una muestra control de
enzima de forma similar. Periódicamente, se tomaron muestras y se
determinó la concentración de D-tagatosa por
cromatografía líquida a alta presión. La Tabla 3.1 muestra los
resultados obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó una muestra de enzima liofilizada (40
mg, 2,2 unidades) a 65ºC en una mezcla de ensayo de un ml que
contenía 0,30 g de D-galactosa (30%, 1,67 M), 25 mM
de tampón maleato, pH 6,9 y 5 mM de MnCl_{2}. Se tomaron muestras
para determinar la concentración de D-galactosa a
las 0 h y 24 h, y se analizaron por HPLC de acuerdo con lo descrito
con anterioridad. Después de un muestreo a las 24 h, se retiró la
solución de azúcar sobre la enzima inmovilizada, y se agregó una
solución de ensayo nueva a un volumen final de 1,0 ml. La incubación
de 24 h se repitió cuatro veces utilizando la misma muestra de
enzima para todos los ciclos de conversión de galactosa en
tagatosa.
tagatosa.
La concentración final de tagatosa tras la
conversión durante 24 horas permaneció constante (promedio de 529
mM \pm 5%) durante bioconversiones repetidas con la misma muestra
de enzima (Tabla 3.2), e incluso después de la operación durante
más de 100 h a 65ºC, la enzima no mostró ningún signo de velocidad
de reacción reducida. El experimento demostró que la enzima
inmovilizada es un bio-catalizador estable que puede
ser utilizado para múltiples bioconversiones repetidas de galactosa
en tagatosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se demostró el uso combinado de una lactasa
inmovilizada termoestable y una
L-arabinosa-isomerasa inmovilizada
termoestable para conversión directa a alta temperatura de lactosa
en tagatosa en un reactor simple. La enzima seleccionada para
hidrólisis de lactosa fue la \beta-glicosidasa
extremadamente termoestable de Sulfolobus solfataricus de
arqueo termoacidófilo (Moracci, M., Ciaramella, M. y Rossi, M.
[2001] Methods in Enzymology 330:210-15).
Esta enzima de amplio espectro es una lactasa eficiente, y se ha
clonado y expresado con éxito en E. coli y otros organismos
microbianos huésped (ibid.).
Si bien la mayoría de las lactasas previamente
caracterizadas son fuertemente inhibidas por galactosa, se ha
informado que esta enzima en particular no es inhibida por
galactosa, y es inhibida solamente de forma moderada por glucosa
(Pisani, F. M., Rella, R., Raia, C. A., Rozzo, C., Nucci, R.,
Gambacorta, A., De Rosa, M. y Rossi, M. [1990] Eur. J.
Biochem. 187:321-328).
Pisani y colaboradores 1990). Se esperaba que
estas propiedades favorables respecto de la inhibición de un
producto final resultaran altamente ventajosas para la hidrólisis de
lactosa a una concentración de sustrato alta como el 30%
(peso/volumen). Además, la enzima de S. solfataricus no
requiere de ningún cofactor, a diferencia, por ejemplo, de la
\beta-galactosidasa de E. coli que es
dependiente de Mg^{2+}. Por lo tanto, solamente el cofactor
requerido por los iones de manganeso de isomerasa de T.
mathranii, tiene que ser incluido en el medio de la reacción,
así, excluyendo así cualquier influencia de un cofactor requerido
por la lactasa.
Se clonó y se expresó en E. coli el gen
que codifica la \beta-glicosidasa de Sulfolobus
sulfataricus. El gen se aisló por reacción de cadena de
polimerasa (PCR) utilizando ADN cromosómico purificado de cepa P2
de Sulfolobus solfataricus. Se diseñaron cebadores que
contenían sitios de restricción adicionales para Ndel y
BamHI para dar lugar a la totalidad de la secuencia de
codificación en un fragmento que fue posteriormente clonado, en el
plásmido de expresión estándar pET3a (Novagen).
Las células de E. coli que producen la
enzima se cultivaron, recolectaron por centrifugación, se sometieron
a lisis en una celda de presión French y se entrecruzaron con
glutaraldehído y polietilenimina de acuerdo con lo descrito en el
documento US 4.354.105. Se recuperó la enzima inmovilizada por
centrifugación y liofilización del pélet. La actividad de la
lactasa inmovilizada fue de 1.500 unidades/g en peso seco. Se
definió una unidad como la cantidad de enzima que libera un
micromol de glucosa por minuto a 65ºC, pH 6,5, en un 30%
(peso/volumen) de solución de lactosa.
Se produjo
L-arabinosa-isomerasa de
Thermoanaerobacter mathranii en E. coli y se
inmovilizó según lo descrito en el Ejemplo 3.1.
Se incubaron mezclas de ensayo de un ml con
contenido de 20 mg (30 unidades) de lactasa inmovilizada, 80 mg
(4,4 unidades) de isomerasa inmovilizada, 0,30 g de lactosa (30%,
875 mM), 25 mM de tampón de K-maleato, pH 6,9 y 5
mM de MnCl_{2} a 65ºC. Se trató una muestra control sin enzimas de
forma similar. Periódicamente, se tomaron muestras y se
determinaron las concentraciones de glucosa, galactosa y tagatosa
por cromatografía líquida de alta presión. De acuerdo con la Figura
7, la concentración de glucosa aumentó a aproximadamente 800 mM
durante 24 horas, lo que indica que se hidrolizó casi toda la
lactosa en galactosa y glucosa. La concentración de tagatosa
aumentó de forma lineal a aproximadamente 300 mM durante 24 horas,
lo que indica una bioconversión de aproximadamente 38% (300 mM/800
mM).
La hidrólisis exitosa de lactosa y la posterior
isomerización de galactosa en tagatosa demostraron que las dos
enzimas implicadas eran capaces de operar bajo las mismas
condiciones de reacción con respecto al pH, la temperatura, los
componentes tampón y la concentración de iones de metal (5 mM de
MnCl_{2}). Además, quedó demostrado que la enzima isomerasa no es
afectada por la alta concentración de glucosa presente como
resultado de la hidrólisis de lactosa.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Bioteknologisk Institut
\hskip1cm Jørgensen, Flemming
\hskip1cm Hansen, Ole C.
\hskip1cm Stougaard, Peter
\hskip1cm Berthelsen, Hans
\hskip1cm Eriknauer, Kristian
\hskip1cm Bøttcher, Karen
\hskip1cm Christensen, Hans Jørgen Singel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Una nueva isomerasa termoestable y
uso de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 30077US02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/305,155
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/905, 108
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3719
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoanaerobacter
matrahnii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (463)...(1860)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marco de lectura abierto del gen
araA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermoanaerobacter matrahnii,
secuencia araA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Y. pestis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B. stearotherm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B. halodurans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B. subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. aceto7646
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. aceto7645
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> T. maritima
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> T. neapol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> M. smegmatis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> T. mathranii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
Claims (23)
1. Una
L-arabinosa-isomerasa capaz de
isomerizar D-galactosa en
D-tagatosa, isomerasa que tiene al menos una
identidad de secuencia del 70% con la secuencia de SEQ ID NO:2.
2. La isomerasa de la reivindicación 1,
isomerasa que tiene al menos una identidad de secuencia del 90% con
la secuencia de SEQ ID NO:2.
3. La isomerasa de la reivindicación 2, que
tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
4. Un fragmento activo de isomerasa de la
L-arabinosa-isomerasa de cualquiera
de las reivindicaciones 1-3.
5. Un ácido nucleico que codifica la
L-arabinosa-isomerasa de cualquiera
de las reivindicaciones 1- 3 o el fragmento activo de isomerasa de
la reivindicación 4.
6. Un ácido nucleico según la reivindicación 5,
seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico de
tipo salvaje aislado de una especie Thermoanaerobacter y (ii)
una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la
secuencia de (i) bajo condiciones restrictivas comprendiendo dichas
condiciones lavar con 0,1 x SSC con 0,1% SDS a 50ºC.
7. El ácido nucleico de la reivindicación 6, en
el que el ácido nucleico de tipo salvaje se aísla de
Thermoanaerobacter mathranii.
8. El ácido nucleico de la reivindicación 6,
que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, o un
fragmento del mismo que codifica un fragmento activo de
isomerasa.
9. Una construcción de ácido nucleico que
comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6.
10. La construcción de la reivindicación 9, que
es una construcción seleccionada del grupo que consiste en un
plásmido, un cromosoma, un bacteriófago, un transposón y un
cósmido.
11. Una célula que es transformada con el ácido
nucleico de la reivindicación 5 ó 6, o con la construcción de la
reivindicación 9.
12. Un método para convertir
D-galactosa en D-tagatosa, que
comprende poner en contacto la D-galactosa con la
isomerasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4
y mantener la reacción bajo condiciones en las que se convierta al
menos 1% en peso de la D-galactosa.
13. El método de la reivindicación 12, en el
que la reacción se lleva a cabo a una temperatura de al menos
60ºC.
14. El método de la reivindicación 12, en el
que al menos el 10% en peso del sustrato D-galactosa
se convierte en D-tagatosa.
15. El método de la reivindicación 14, en el
que al menos el 25% en peso del sustrato D-galactosa
se convierte en D-tagatosa.
16. El método de la reivindicación 12, en el que
se proporciona la isomerasa como una preparación de enzima
aislada.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
la preparación de enzima aislada está inmovilizada.
18. Un método para producir
L-arabinosa-isomerasa, que comprende
transformar una célula con el ácido nucleico de la reivindicación 5
ó 6 y unir operativamente al mismo, señales de expresión apropiadas
que dirigen la expresión de la isomerasa, y opcionalmente,
secuencias que dirigen la secreción de la isomerasa, propagar dicha
célula transformada y recolectar las células de progenie que
contienen la isomerasa o, si es secretada al medio, la
isomerasa
excretada.
excretada.
19. El método de la reivindicación 18, en el
que la célula que se transforma es una célula seleccionada del
grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura
y una célula de un hongo filamentoso.
20. El método de la reivindicación 18, que
comprende la etapa adicional de purificar la
L-arabinosa-isomerasa de las
células de progenie o del medio para obtener una preparación de
L-arabinosa-isomerasa.
21. El método de la reivindicación 20, donde la
isomerasa es purificada hasta un punto en el que se encuentra
esencialmente sin ninguna otra proteína.
\newpage
22. El método de la reivindicación 21, que
comprende la etapa adicional de secar la preparación hasta un
contenido de humedad de 10% en peso, como máximo.
23. Una composición que comprende la isomerasa
de la reivindicación 1 en forma inmovilizada.
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