KR100309327B1

KR100309327B1 - 아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균주와 이를 이용한타가토스의 생산방법

Info

Publication number: KR100309327B1
Application number: KR19990016118A
Authority: KR
Inventors: 김필; 노회진; 최진환
Original assignee: 담철근; 동양제과주식회사
Priority date: 1999-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2001-09-29
Also published as: WO2000068397A1; EP1095153A1; AU1080600A; KR20000073075A

Abstract

본 발명은 pTC101 벡터를 포함하는 재조합 대장균(Escherichia coli) 및 이를 이용한 타가토스 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전공학 기술을 이용하여 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)를 자체유전자의 대사조절 없이 인위적으로 발현시킴으로서 갈락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균주와 이를 이용한 타가토스의 생산방법{Recombinant strain of Escherichia coli harboring Arabinose Isomerase and Tagatose Production Thereby}

본 발명은 아라비노스 이성화효소를 생성시키는 유전자를 분리 증폭하여 벡터에 삽입시킨 후 숙주세포인 대장균주에 도입하여 재조합된 대장균주 및 이를 이용하여 갈락토스를 타가토스로 이성화 전환시켜 타가토스를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

타가토스는 갈락토스의 이성질체이며(도 1), 감미료의 기준인 설탕과 거의 유사한 감미도와 가장 유사한 감미의 질을 갖고 있다고 알려진 물질이다. 체내 흡수시 거의 대사되지 않으므로 열량에 기여하지 않아 비칼로리성 감미료(non-caloric sweetner)의 기능을 가진다. 또한 설탕 대체 감미료로 가장 많이 이용되고 있는 당 알코올류 등이 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는 효과(laxativeeffect)가 있는데 반하여, 타가토스는 그러한 부작용이 없는 장점이 있다. 상기한 특성 때문에 설탕 대체 감미료로 관심을 받고 있으며, 식품 시장에서 시장 잠재성이 큰 물질이다[Zehener, D-Tagatose as a low-calories carbohydrate sugars and bulking agent (1988), EP 257,626 A1][Marzur, Functional sugar substitutes with reduced calories (1989), EP 341,062 A2].

종래에 타가토스를 생산하는 방법으로는 화학적 방법 또는 생물학적 방법 등이 있다. 덴마크의 유가공업체인 MD 사(MD Food Ingredient, Denmark)는 값싼 유당에서 유래한 갈락토스를 칼슘촉매의 이성화방법으로 타가토스 생산기술을 확보하여 유럽, 미국, 일본 특허를 획득하였고[Beadle et al., Process for manufacturing tagtose (1992), 미국특허 제 5,078,796호], 현재 미국 식품의약국(FDA)에 GRAS로 신청중에 있다.

덴마크의 MD 사의 화학적 생산방법은 경제성이나 수율측면에서 우수하나 고온 고압을 사용해야 하는 화학공정이므로, 같은 경제성이라면 환경친화적인 생물학적 방법에 대한 요구가 증가할 것으로 예상되며, 특히 환경비용 등을 고려할 때 폐기생물자원 등에서 얻을 수 있는 값싼 탄수화물로부터 미생물을 이용한 생물공정을 통해 보다 효율적인 방법으로 타가토스을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구가 시도되고 있다. 이러한 생물공정을 이용한 타가토스의 생산은 주로 일본의 Izomori group에서는 이루어 졌는데, 갈락티톨 탈수소효소를 이용한 생물전환방법으로 갈락티톨을 타가토스로 70∼80전환했다는 보고[Izumori and Tsuzuki, Production of the D-tagatose from D-galactitol byMycobacterium smegmatis, J. Ferment. Technol.,66, 225-227 (1988)]가 있으나, 기질로 사용된 갈락티톨이 고가이므로 대량 생산에 따른 경제적 문제점이 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균주를 유전공학적으로 제조하고, 또한 상기 재조합 대장균주를 이용하여 값싼 기질인 갈락토스로부터 타가토스를 이성화시켜 생산함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소를 포함한 대장균 및 이을 이용한 타가토스 제조방법은 종래의 화학공정과는 달리 환경친화적인 생물학적 전환법을 제공하며, 또한 갈락티톨 탈수소효소를 이용한 공정과는 달리 기질단가가 높은 갈락티톨 대신 기질단가가 낮은 갈락토스를 사용하므로 생산경비를 크게 줄일 수 있다.

도 1은 타가토스와 갈락토스의 화학구조를 나타낸 도면이다.

도 2는 대장균 유래의 아라비노스 이성화효소의 중합효소연쇄반응(PCR) 산물 사진이다. 이때 화살표 부분이 대장균 유래의 아라비노스 이성화효소의 PCR 산물을 나타내며(1.5kb), 첫 번째 레인은 사이즈 마커(1kb DNA Ladder, NEB, USA)를 나타낸다.

도 3은 아라비노스 이성화효소를 포함한 벡터 pTC101의 플라스미드 지도를 나타낸 도면이다.

도 4는 pTC101의EcoRI, HindⅢ 이중절단사진이다. 화살표는 pTC101을 나타내며, 첫 번째 레인은 사이즈 마커(1kb DNA Ladder, NEB, USA)를 나타낸다.

도 5는 아라비노스 이성화효소의 작용에 의한 갈락토스에서 타가토스로의 전환 개략도이다.

따라서 본 발명의 목적은 새로운 대사경로를 갖고, 갈락토스로부터 아라비노스를 생산하는 재조합 대장균주을 제공하는데 있다. 특히 본 발명에서 조립된 아라비노스 이성화효소을 포함한 재조합 대장균 (Escherichia coliJM105/pTC101)을 제공하는데 그 특징이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 대장균주를 이용하여 갈락토스를 타가토스로 이성화시켜 타가토스를 생산하는 신규한 방법을 제공하는데 있다. 이러한 제조방법은 상기 대장균 JM105/pTC101을 적합한 탄소원이 함유된 배양액에서의 세포 생장과정과 아라비노스 이성화당 발현을 유도 후 타가토스 생산과정을 포함하는 타가토스 생산방법을 그 특징으로 한다.

특히 이때 본 발명의 균주 JM105/pTC101 를 발효 배지에서 배양하여 아라비노스 이성화효소를 발현시켜 갈락토스를 타가토스로 이성화 전환시켜 타가토스를 발효 생산하는 방법을 특징으로 하며, 이때 발효 배지는 갈락토스 10∼30 g/L, 효모추출물 7∼13 g/L, 제이인산나트륨 5∼7 g/L, 제일인산칼륨 2∼4 g/L 및 소량의 염화암모늄을 포함하는 배지임을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 대장균주는 아라비노스 이성화효소 (L-arabinose isomerase; EC 5.3.1.4)의 유전자 (araA)를 대장균에서 인위적으로 발현 조절되는 프로모터에 결합시킨 벡터(pTC101)를 지니는 대장균이며, 이 대장균주는 1999년 4월 21 일 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자원센터에 기탁번호 제 KCTC-0603BP호로 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁하였다.

상기 유전자(araA)는 대장균(E.coli), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브실라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모노나스(Zymononas), 글루코노박터(Gluconobacter), 라이조비움(Rhizobium), 아세토박터(Acetobacter), 로도박터(Rhodobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium)의 미생물에서 유래한 외부 유전자임을 특징으로 하는 대장균이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 유전공학적 조작방법을 통하여 재조합된 벡터 pTC101을 포함하는 대장균 JM105/pTC101 및 이를 이용하여 타가토스를 보다 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 재조합 대장균을 이용하는 방법에 관한 것으로, 우선 본 발명과 관련된 대장균의 일반적인 특성에 대해 살펴보면 다음과 같다[Holt J. G., et. al.,Bergey's Manual of Systematic Bacteriology9th ed., 179, Williams & Wilkins(1994)]. 대장균은 영양요구성이 간단하고, 약 20분의 생장주기를 갖고 있어 생육이 빠르며, 최적온도 37℃, pH 7.0, 그람-음성의 종속영양생물로서, 어닐린 염료에 잘 염색되며, 또한 단일세포 또는 세포쌍으로 존재하는 끝이 둥근 단간균형태를 지닌다. 또한, 대장균은 호기성 성장은 물론 혐기성 성장도 가능케 하는 대사잠재력을 갖는 통기성 미생물이다[Stanier R. Y., et. al.,The Microbial World, 5th ed., 439∼452(1986)].

상기와 같은 유용한 대사능력과 함께, 대장균은 생리학적 및 유전학적 연구가 가장 많이 되어 있는 생물체이고, 이에 따른 대사조절이 용이하고 대사공학의 결과를 쉽게 예측할 수 있으며, 또한 유전공학적 조작에 따른 재조합 균주의 생산 및 대사공학 기술을 아주 쉽게 적용할 수 있는 장점이 있다.

1. 타가토스 생산균주의 재조합

대장균내에서 갈락토스를 기질로 타가토스로의 직접적인 이성화반응을 촉매하는 효소는 아직 알려진 바 없다. 그러나 본 발명자는 아라비노스 기질로 유도된 미생물를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 생산했다고 보고하였다 [Kim et al., D-Tagatose Production from Galactose byEnterobacter agglomeransTY-25,Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.,25, 490-494 (1997)]. 이것은 아라비노스에 의해 유도되는 효소들중 갈락토스를 타가토스로 전환할 수 있는 효소가 존재함을 암시한다. Cheetham등은 이러한 갈락토스로부터 타가토스 전환효소가 아라비노스 이성화효소라고 제안한 바 있었다[Cheetham et al., Bioconversion of D-galactose into D-tagatose,Enzyme Microb. Technol.,15, 105-108 (1993)]. 이를 기초로 아라비노스 이성화효소를 대장균으로부터 PCR 클론하였고, 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)에 의해 쉽게 발현 유도되는 벡터 pKK223-3에 삽입하여 아라비노스 이성화효소를 포함하는 재조합 벡터 pTC101을 제조하였다. 계속하여 pTC101을 대장균 JM105에 도입하여 타가토스 생산균주 JM105/pTC101을 제조하였다.

2. 재조합 대장균에서의 타가토스의 생산

아라비노스 이성화효소는 5탄당인 아라비노스를 리뷸로스로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소로, 아라비노스에 의해 유도되며 포도당에 의해 저해되는 효소이다. 갈락토스에서 타가토스 전환을 위한 배지에는 유일 탄소원으로 갈락토스가 포함되어 있으므로 정상적인 대장균에서는 아라비노스 이성화 효소가 발현되지 않는다. 타가토스 생산균주인 JM105/pTC101는 IPTG에 의해 인위적인 아라비노스 이성화효소의 유도가 가능하며, 배지중의 갈락토스를 타가토스로 전환시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) 아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균의 제조

재조합 대장균의 제조는 Sambrook등이 제시한 방법을 따랐다 [Sambrook etal., Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].

제 1 단계 : 아라비노스 이성화효소 유전자 (araA)의 PCR 및 발현벡터로의 삽입

중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 아라비노스 이성화효소 유전자의 주형은 야생형 대장균E. coliW3110 [Genetic stock center collection number(CGSC) 4474]의 염색체 (chromosomal) DNA를 사용하였다. PCR에 사용된 프라이머의 서열에는 아라비노스 이성화효소 유전자의 양쪽 말단의 일부서열과 각각EcoRI과 HindⅢ의 제한효소 반응서열을 포함하였다.

센스 프라이머(FORWARD) 5'-GAC-GAA-TTC-ATG-ACG-ATT-3' (서열번호 1)

안티센스 프라이머(BACKWARD) 5'-TGC-AAG-CTT-TTA-GCG-ACG-3' (서열번호 2)

이 결과로부터 1.5 kb의 PCR 산물(서열번호 3)을 얻을 수 있었다(도 2).

잘 알려진 발현벡터인 pKK223-3(4.5kb; 미국 Pharmacia사 제조)와 araA의 PCR 산물을 각각EcoRI과 HindⅢ로 이중 절단한 후 혼합하여 접합 후 대장균 JM105에 형질전환시켰다(도 3).

제 2 단계 : 균주 선별

1단계에서 형질전환된 대장균은 암피실린이 포함된 평판배지에서 도말하여 암피실린에 대한 내성이 있는 균주를 1차로 선별하였다. 1차 선별된 균주들을 각기 액체배양한 후 벡터를 정제하여EcoRI과 HindⅢ로 이중절단했을 때 1.5kb와 4.5kb의 DNA 단편이 확인된 균주를 최종 선별하였고(도 4), 이때 재조합된 벡터를 pTC101로 명명하였다.

이에, 상기 제 2 단계에서 최종적으로 선별된 균주를 JM105/pCT101로 명명하여 이를 대한민국 기탁기관이며, 부다페스트조약에 의한 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자원센터에 1999년 4월 21일자로 기탁하고, 기탁번호 제KCTC-0603BP호를 부여받았다.

(실시예 2) 갈락토스 배지에서의 타가토스 생산방법

실시예 1에서 제조된 아라비노스 이성화효소를 함유하는 재조합 대장균 JM105/pCT101을 LB배지에서 종배양시킨 후 다음 표 1의 배지성분 및 함량을 이용하여 본배양을 실시하였다.

성분	갈락토스	제일인산 칼륨	제이인산 나트륨	염화암모늄	효모추출물
농도(g/ℓ)	20	3	6	1	10

실시예 1의 평판배지에서 생장시킨 균주를 3 ㎖ LB배지에 접종하여 37℃에서 호기적 조건으로 하룻밤 동안 종배양한 후, 250 ㎖ 플라스크에 든 50 ㎖ LB-IPTG배지에 재접종하여 600 ㎚에서 흡광도 1.0까지 균주를 1차 스케일-업하였다. 그런 다음, 1차 스케일-업한 균주를 증류수로 세척한 후 본 배양 액체배지에 접종하였다.

3㎖ 본 배양액은 진탕배양기를 이용하여 배양온도 37℃, 250 rpm으로 호기적 조건을 유지하며 대략 96시간 동안 배양하였다. 그 결과, 아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균에서 0.86 g/ℓ의 타가토스를 생산하였다 (표 2).

균주	타가토스 생산량 (g/ℓ)	갈락토스 잔여량
JM105	0	10.0
JM105/pTC101	0.86	12.2

이때, 타가토스와 잔여 갈락토스의 분리 및 측정은 분광분석기를 이용한 HPLC를 이용하여 측정하였다.

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 아라비노스 이성화효소를 포함하고 있는 재조합 대장균 KCTC-0603BP호의 경우에는 갈락토스를 타가토스로 전환할 수 있었다. 이로서 아라비노스 이성화효소를 인위적으로 발현시켜 고가의 타가토스를 생산할 수 있는 시스템을 확립하였다.

본 발명의 효과는 갈락토스에서 타가토스의 전환을 목적으로 아라비노스 이성화효소를 인위적으로 발현시킬 수 있는 대장균 JM105/pTC101(KCTC-0603BP호)을 제공함으로써, 상기 대장균 변이주를 이용한 타가토스의 고수율 생산방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 아라비노스 이성화효소를 포함한 대장균 및 이을 이용한 타가토스 제조방법은 종래의 화학공정과는 달리 환경친화적인 생물학적 전환법을 제공하며, 또한 갈락티톨 탈수소효소를 이용한 공정과는 달리 기질단가가 높은 갈락티톨 대신 기질단가가 낮은 갈락토스를 사용하므로 생산경비를 크게 줄일 수 있다.

Claims

타가토스 생산을 목적으로 한 아라비노스 이성화효소 (L-arabinose isomerase; EC 5.3.1.4)의 유전자 (araA)를 대장균에서 인위적으로 발현 조절되는 프로모터에 결합시킨 벡터(pTC101)를 지니는 대장균 JM105/pTC101 (KCTC-0603BP호)
제 1항에 있어서, 상기 유전자(araA)는 대장균(E.coli), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브실라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모노나스(Zymononas), 글루코노박터(Gluconobacter), 라이조비움(Rhizobium), 아세토박터(Acetobacter), 로도박터(Rhodobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium)의 미생물에서 유래한 외부 유전자임을 특징으로 하는 대장균
제 1항의 균주 JM105/pTC101 (KCTC-0603BP호)를 발효 배지에서 배양하여 아라비노스 이성화효소를 발현시켜 갈락토스를 타가토스로 이성화 전환시켜 타가토스를 발효 생산하는 방법
제 3항에 있어서, 발효 배지는 갈락토스 10∼30 g/L, 효모추출물 7∼13 g/L, 제이인산나트륨 5∼7 g/L, 제일인산칼륨 2∼4 g/L 및 소량의 염화암모늄을 포함하는 배지임을 특징으로 하는 타가토스의 생산방법