KR20190087765A

KR20190087765A - 동시 효소 반응을 이용하여 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20190087765A
Application number: KR1020180005964A
Authority: KR
Inventors: 김태균; 김백중; 김태용; 송은범; 오덕근; 신경철; 이태의
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2019-07-25

Abstract

본 발명의 일 예는 과당 용액이 수용된 반응기에 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소를 함께 첨가하거나 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소 함유 용액이 수용된 반응기에 과당 용액을 첨가하고, 45~60℃에서 동시 효소 반응을 진행하는 단계를 포함하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 과당으로부터 희소당을 생산방법은 혼합 효소 사용시 일반적으로 예측되는 최적 반응 온도보다 훨씬 낮은 온도에서 동시 효소 반응을 진행하면서도 효소별 순차 반응을 진행하는 경우 또는 일반적으로 예측되는 최적 반응 온도에서 동시 효소 반응을 진행하는 경우보다 훨씬 높은 수율의 희소당을 얻을 수 있다.

Description

동시 효소 반응을 이용하여 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법{Method for producing rare sugar from fructose using simultaneous enzymatic reaction}

본 발명은 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 동시 효소 반응을 이용하여 과당으로부터 알룰로오스, 알로오스 등과 같은 희소당을 고수율 및 경제적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

희소당은 자연계에서 매우 적은 양으로 발생하는 당류로서, 자연 자원으로부터 분리하는 경우 상업적으로 이용하기에는 너무 양이 적기 때문에 발효나 효소 전환과 같은 생물학적 공정을 통해 제조되고 있다. 희소당은 자당(sucrose), 과당(fructose), 포도당(glucose), 젖당(lactose) 등과 같이 전통적으로 이용되는 당류에 비해 낮은 칼로리를 갖기 때문에 최근에 많은 관심을 받고 있다. 희소당의 대표적인 종류로는 알룰로오스(Allulose), 알로오스(Allose), 멜레지토스(Melezitose) 등이 있다.

D-알룰로오스(D-Allulose)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)로서 종래에 D-사이코스(D-Psicose)로 불리었다. D-알룰로오스(D-Allulose)는 설탕과 비교했을 때 70% 감미도를 갖지만(Oshima 2006) 에너지는 0.3% 밖에 없으므로 다이어트 식품의 저칼로리 감미료로 적용 가능한 기능성 단당류이다(Matsuo et al. 2002). 또한 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품, 수신용 음식품 등에 응용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부지방 축적 억제를 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다(Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011). 효소를 사용하여 과당에서 알룰로오스를 생산하는 기술과 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0744479호에는 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0832339호에는 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 지닌 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP와 이를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1106253호에는 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 아그로박테리움 투메패시엔스 C58의 사이코스 3-에피머화 효소가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균 및 이를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1339443호에는 공개특허공보 제10-2008-0071176호에는 리조븀속(genus Rhizobium)에 속하는 미생물로부터 유래하는 케토오스 3-에피머라아제(ketose 3-epimerase) 및 이를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1318422호에는 크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens)로부터 유래된 D-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법이 개시되어 있다.

알로오스 (allose)는 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psocose)로도 불리우는 알룰로오스(allulose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있다. 이러한 알로오스는 암세포의 증식의 저해하는 특성을 가지기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 또한, 알로오스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 알로오스는 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다 (Hossain, M. A., Izuishi, K., and H., Maeta. 2003, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 10: 218225.; Hossain, M. A., Izuishi, K., Tokuda, M., Izumori, K., and H. Maeta. 2004, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181189.; Hossain, M. A., Wakabayashi, H., Izuishi, K., Okano, K., Yachida, S., Tokuda, M., Izumori, K., and H., Maeta. 2006, J. Biosci. Bioeng., 101: 369371.). 효소를 이용하여 생물학적으로 알로오스를 생산하는 방법과 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0128720호에는 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens)에서 유래하고, 알룰로오스(allulose)를 알로오스(allose)로 전환시킬 수 있는 신규 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 및 이를 이용하여 알룰로오스로부터 알로오스를 제조하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0896968호에는 크로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)으로부터 유래한 재조합 라이보스 5-인산 이성화효소 및 이를 이용하여 알룰로오스로부터 알로오스를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

한편, 과당을 기질로 하여 효소 반응을 통해 알로오스를 제조하기 위해서는 먼저 과당을 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)와 반응시켜 알룰로오스로 전환시키고, 이후 알룰로오스를 라이보스-5-인산 이성화 효소(Ribose-5-phosphate isomerase)와 반응시켜 알로오스로 전환하는 2단계의 순차 공정을 사용하는 것이 일반적이다. 그러나 2단계의 순차 공정을 사용하여 과당으로부터 알로오스를 제조하는 경우 각 효소의 서로 다른 최적 활성 조건(예를 들어, 온도, pH 등) 때문에 공정의 제어가 복잡해지고 나아가, 알룰로오스나 알로오스로의 전환 수율이 낮아 고 함량의 희소당을 얻기 위해서는 추가적인 분리 공정이 요구되는 문제점이 있다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 과당으로부터 알룰로오스, 알로오스 등과 같은 희소당을 고수율 및 경제적으로 생산하는 방법을 제공하는데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 과당 용액이 수용된 반응기에 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소를 함께 첨가하거나 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소 함유 용액이 수용된 반응기에 과당 용액을 첨가하고, 45~60℃에서 동시 효소 반응을 진행하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 동시 효소 반응은 과당의 알룰로오스로의 전환 반응 및 알룰로오스의 알로오스로의 전환 반응으로 구성되는 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서 상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 알룰로오스로 전환하는 활성을 가지 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 과당의 알룰로오스로의 전환을 위한 최적 온도가 55~65℃인 것이 바람직하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 더 바람직하다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 분리된 와일드 타입의 효소이다. 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소의 기술적 특징과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1473918호에 개시되어 있는 내용을 참조한다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서 상기 라이보스-5-인산 이성화효소는 알룰로오스를 알로오스로 전환하는 활성을 가진 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 알룰로오스의 알로오스로의 전환을 위한 최적 온도가 65~80℃인 것이 바람직하고, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 더 바람직하다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소는 크로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum) 균주로부터 분리된 와일드 타입의 효소이고 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소는 상기 와일드 타입의 아미노산 서열 중 132번째 잔기 아미노산인 아르지닌(Arg)을 글루탐산(Glu)으로 변환된 돌연변이 효소이다. 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소의 기술적 특징과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1217670호에 개시되어 있는 내용을 참조한다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서 상기 동시 효소 반응 온도는 하기와 같은 범위로 확장되거나 일반화될 수 있다.

Tm - 18℃ ≤ 동시 효소 반응 온도 ≤ Tm - 7℃

바람직하게는, Tm - 17℃ ≤ 동시 효소 반응 온도 ≤ Tm - 8℃

상기 Tm은 사이코스 에피머화 효소의 과당을 알룰로오스로 전환하기 위한 최적 온도 및 라이보스-5-인산 이성화효소의 알룰로오스를 알로오스로 전환하기 위한 최적 온도의 산술 평균 값이다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서 상기 동시 효소 반응 온도는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 라이보스-5-인산 이성화효소를 함께 사용하는 경우 45~55℃인 것이 바람직하고, 48~52℃인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서, 상기 반응기에 존재하는 사이코스 에피머화 효소 대 라이보스-5-인산 이성화효소의 중량비는 크게 제한되지 않으나 1:9 내지 6:4인 것이 바람직하고 동시 효소 반응에서 알룰로오스의 알로오스로의 전환 단계가 율속 단계인 점을 고려할 때 2:8 내지 5:5인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서, 상기 동시 효소 반응 시간은 크게 제한되지 않으나 적정 수준의 희소당으로의 전환율을 고려할 때 24 hr 내지 72 hr 인 것이 바람직하고 48 hr 내지 72 hr 인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서, 상기 동시 효소 반응 pH는 6.7 내지 7.8인 것이 바람직하고 7.0 내지 7.5인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 일 예에 따른 방법에서, 상기 동시 효소 반응 시점의 반응기 내 과당 농도는 크게 제한되지 않으나, 작업성 또는 생산방법의 경제성을 고려할 때 5~20%(w/v)인 것이 바람직하고 8~12%(w/v)인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 일 예에 따른 방법을 사용하는 경우 과당으로부터 희소당을 고함량으로 포함하는 액상 조성물을 제조할 수 있다. 상기 희소당은 알룰로오스 및 알로오스를 포함한다. 상기 액상 조성물 내 희소당 함량은 당류 전체 중량을 기준으로 약 34 중량% 이상(예를 들어 34~45 중량%), 바람직하게는 약 35 중량% 이상(예를 들어 35~43 중량%), 더 바람직하게는 약 40 중량% 이상(예를 들어 40~42 중량%)이다. 구체적으로, 상기 액상 조성물은 당류 전체 중량을 기준으로 과당 55~66 중량%, 알룰로오스 25~30 중량% 및 알로오스 5~15 중량%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 과당 59~66 중량%, 알룰로오스 25~29 중량% 및 알로오스 5~13 중량%를 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 과당 59~65 중량%, 알룰로오스 25~28 중량% 및 알로오스 8~13 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 과당으로부터 희소당을 생산방법은 혼합 효소 사용시 일반적으로 예측되는 최적 반응 온도보다 훨씬 낮은 온도에서 동시 효소 반응을 진행하면서도 효소별 순차 반응을 진행하는 경우 또는 일반적으로 예측되는 최적 반응 온도에서 동시 효소 반응을 진행하는 경우보다 훨씬 높은 수율의 희소당을 얻을 수 있다. 본 발명의 방법은 낮은 반응 온도의 사용에 따른 에너지 절감, 고수율에 따른 생산성 향상, 고순도 분리의 부담 감소 등으로 고순도 희소당 제조 원가를 크게 낮출 수 있고, 희소당의 대량 생산 관점에서 매우 유리하다.

도 1은 본 발명의 동시 효소 반응 최적 온도 예비 탐색 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 동시 효소 반응 최적 pH 예비 탐색 실험 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소(D- psicose 3- epimerase ) 및 라이보스 -5-인산 이성화 효소(Ribose-5-phosphate isomerase)의 최적 활성 조건

(1) D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)의 최적 활성 조건

본 발명의 실시예에서 사용하는 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)는 본 발명의 출원인이 소유하고 있는 대한민국 등록특허 제10-1473918호에 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 분리된 것으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)의 열 안정성을 고려한 최적 활성 온도는 약 65℃이고, 최적 활성 pH는 약 7.0이다(대한민국 등록특허 제10-1473918호의 도 5 및 도 6 참조). 본 발명은 D-사이코스 3-에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase)의 제조방법 및 최적 활성 조건과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1473918호에 개시된 내용을 참조한다.

(2) 라이보스-5-인산 이성화 효소(Ribose-5-phosphate isomerase)의 최적 활성 조건

본 발명의 실시예에서 사용하는 라이보스-5-인산 이성화 효소(Ribose-5-phosphate isomerase)는 본 발명의 출원인이 소유하고 있는 대한민국 등록특허 제10-1217670호에 개시되어 있는 R132E 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화 효소이다. 구체적으로, 상기 R132E 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화 효소는 크로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum) 균주로부터 분리되고 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 와일드 타입의 라이보스-5-인산 이성화 효소의 132번째 잔기 아미노산인 아르지닌(Arg)을 글루탐산(Glu)으로 변환시킨 것이다. 상기 R132E 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화 효소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 열 안정성을 고려한 최적 활성 온도는 약 65℃이고, 최적 활성 pH는 약 7.5이다(대한민국 등록특허 제10-1217670호의 도 1 내지 도 4 참조). 본 발명은 R132E 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화 효소의 제조방법 및 최적 활성 조건과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1217670호에 개시된 내용을 참조한다.

2. 순차 효소 반응을 이용한 희소당의 제조

(1) 과당의 알룰로오스로의 전환을 위한 1차 효소 반응

20g의 과당(fructose)을 50㎖의 증류수에 녹인 후 최종 부피가 100㎖가 될 때까지 증류수를 부어 과당 농도가 20%(w/v)인 기질 용액을 제조하였다. 또한, 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)에 D-사이코스 3-에피머화 효소(이하, 'DPE 효소'라 칭함)를 4㎎/㎖의 농도로 분산시켜 DPE 효소 용액을 제조하였다. 이후, 상기 기질 용액과 DPE 효소 용액을 1:1의 부피 비로 섞어서 과당 농도 10%(w/v), DPE 효소 농도 2㎎/㎖, 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)로 구성하고 약 60℃에서 24 hr 동안 1차 효소 반응을 진행시켰다.

(2) 알룰로오스의 알로오스로의 전환을 위한 2차 효소 반응

상기 1차 효소 반응이 완료된 후, 1차 효소 반응 생성액의 pH를 약 7.5로 조절하고 R132E 돌연변이 라이보스-5-인산 이성화 효소(이하, 'RPI 효소'라 칭함)를 2㎎/㎖의 농도가 되게 첨가한 후 약 65℃에서 24 hr 동안 2차 효소 반응을 진행시켰다.

(3) 1차 효소 반응 생성액 및 2차 효소 반응 생성액의 당 조성 및 함량 분석

상기 1차 효소 반응 생성액 및 2차 효소 반응 생성액의 당 조성과 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에서 보이는 바와 같이 순차 효소 반응을 이용하여 희소당을 제조하는 경우 최종 반응 생성액의 희소당(알룰로오스 및 알로오스 포함) 함량은 당류 전체 중량을 기준으로 약 31.7% 이었다.

구분	당 조성 및 함량(피크 면적 기준, %)
구분	과당	알룰로오스	알로오스
1차 효소 반응 생성액	68.4	31.6
2차 효소 반응 생성액	68.3	22.9	8.8

3. 동시 효소 반응을 이용한 희소당의 제조

(1) 동시 효소 반응 최적 온도 예비 탐색

20g의 과당(fructose)을 50㎖의 증류수에 녹인 후 최종 부피가 100㎖가 될 때까지 증류수를 부어 과당 농도가 20%(w/v)인 기질 용액을 제조하였다. 또한, 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)에 DPE 효소 및 RPI 효소를 각각 4㎎/㎖의 농도로 분산시켜 혼합 효소 용액을 제조하였다. 이후, 상기 기질 용액과 혼합 용액을 1:1의 부피 비로 섞어서 과당 농도 10%(w/v), DPE 효소 농도 2㎎/㎖, RPI 효소 농도 농도 2㎎/㎖, 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)로 구성하고 다양한 온도(45~70℃)에서 1 hr 동안 동시 효소 반응을 진행시켰다. 이후, 동시 효소 반응 생성액에 함유된 희소당(알룰로오스 및 알로오스) 함량을 HPLC를 이용하여 분석하고, 그 결과로부터 동시 효소 반응 최적 온도를 탐색하였다. 도 1은 본 발명의 동시 효소 반응 최적 온도 예비 탐색 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 1에서 Y 축 값은 HPLC 피크 면적을 기준으로 한 희소당(알룰로오스 및 알로오스 포함) 함량을 나타내고, X축 값은 반응 온도(단위 : ℃)를 나타낸다. 도 1에서 보이는 바와 같은 동시 효소 반응 최적 온도는 약 50℃이었다.

(2) 동시 효소 반응 최적 pH 예비 탐색

20g의 과당(fructose)을 50㎖의 증류수에 녹인 후 최종 부피가 100㎖가 될 때까지 증류수를 부어 과당 농도가 20%(w/v)인 기질 용액을 제조하였다. 또한, 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)에 DPE 효소 및 RPI 효소를 각각 4㎎/㎖의 농도로 분산시켜 혼합 효소 용액을 제조하였다. 이후, 상기 기질 용액과 혼합 용액을 1:1의 부피 비로 섞어서 과당 농도 10%(w/v), DPE 효소 농도 2㎎/㎖, RPI 효소 농도 농도 2㎎/㎖, 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)로 구성하고 반응물 용액의 pH를 다양한 값(약 6~8)으로 조정한 후, 50℃에서 1 hr 동안 동시 효소 반응을 진행시켰다. 이후, 동시 효소 반응 생성액에 함유된 희소당(알룰로오스 및 알로오스) 함량을 HPLC를 이용하여 분석하고, 그 결과로부터 동시 효소 반응 최적 pH를 탐색하였다. 도 2는 본 발명의 동시 효소 반응 최적 pH 예비 탐색 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 2에서 Y 축 값은 HPLC 피크 면적을 기준으로 한 희소당(알룰로오스 및 알로오스 포함) 함량을 나타내고, X축 값은 반응물 용액 pH를 나타낸다. 도 2에서 보이는 바와 같은 동시 효소 반응 최적 pH는 약 7이었다.

(3) 동시 효소 반응을 이용한 희소당의 제조시 반응 온도가 미치는 영향

20g의 과당(fructose)을 50㎖의 증류수에 녹인 후 최종 부피가 100㎖가 될 때까지 증류수를 부어 과당 농도가 20%(w/v)인 기질 용액을 제조하였다. 또한, 100mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)에 DPE 효소 및 RPI 효소를 각각 4㎎/㎖의 농도로 분산시켜 혼합 효소 용액을 제조하였다. 이후, 상기 기질 용액과 혼합 용액을 1:1의 부피 비로 섞어서 과당 농도 10%(w/v), DPE 효소 농도 2㎎/㎖, RPI 효소 농도 농도 2㎎/㎖, 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)로 구성하고 다양한 온도(45~65℃)에서 48 hr 동안 동시 효소 반응을 진행시켰다. 이후, 동시 효소 반응 생성액에 함유된 당 조성 및 함량을 HPLC를 이용하여 분석하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

동시 효소 반응 온도(℃)	당 조성 및 함량(피크 면적 기준, %)
동시 효소 반응 온도(℃)	과당	알룰로오스	알로오스	희소당(알룰로오스+알로오스)
45	63.5	25.8	10.7	36.5
50	59.7	27.5	12.8	40.3
55	64.1	27.3	8.6	35.9
60	65.6	28.6	5.8	34.4
62.5	70.4	26	3.6	29.6
65	76.3	22.2	1.5	23.7

상기 표 2에서 보이는 바와 같이 동시 효소 반응을 이용한 희소당의 제조시 반응 온도가 약 50℃인 경우 과당의 희소당(알룰로오스 및 알로오스)으로의 전환율이 가장 높게 나타났다. 일반적으로 혼합 효소 반응시 기질 전환 활성 최적 온도로 각 효소의 최적 온도 평균값을 선택한다. 그러나 과당을 기질로 하고 DPE 효소 및 RPI 효소로 동시 반응을 진행하는 경우 각 효소 최적 온도 평균값인 62.5℃를 반응 온도로 사용하면 과당의 희소당으로의 전환율이 순차 효소 반응과 유사하거나 오히려 떨어지고 각 효소 최적 온도 평균값보다 훨씬 낮은 반응 온도에서 과당의 희소당으로의 전환율이 매우 우수하였다.

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Method for producing rare sugar from fructose using simultaneous enzymatic reaction <130> DP-17-705 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-psicose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii <400> 1 Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp 1 5 10 15 Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe 20 25 30 Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile 50 55 60 Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu 85 90 95 Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala 100 105 110 Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg 115 120 125 Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val 130 135 140 Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe 145 150 155 160 Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys 165 170 175 Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met 180 185 190 Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro 195 200 205 Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly 210 215 220 Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly 245 250 255 Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly 260 265 270 Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe 275 280 285 Leu Lys Glu Leu Thr Ala 290 <210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type of Ribose 5-phosphate isomerase derived from Clostridum thermocellum <400> 2 Met Lys Ile Gly Ile Gly Ser Asp His Gly Gly Tyr Asn Leu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Ile Ala Asp Phe Leu Lys Lys Arg Gly Tyr Glu Val Ile Asp Phe 20 25 30 Gly Thr His Gly Asn Glu Ser Val Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Leu Lys 35 40 45 Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Glu Cys Asp Arg Gly Ile Val Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Val Pro Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Ala Val Cys Thr Asn Ser Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg 85 90 95 Glu His Asn Asp Ala Asn Ile Leu Ala Leu Gly Glu Arg Val Val Gly 100 105 110 Leu Asp Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Thr Trp Leu Lys Ala Glu Phe 115 120 125 Gln Gly Gly Arg His Ala Thr Arg Val Gly Lys Ile Gly Glu Ile Glu 130 135 140 Lys Lys Tyr Ser Lys 145 <210> 3 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R132E mutant of Ribose 5-phosphate isomerase derived from Clostridum thermocellum <400> 3 Met Lys Ile Gly Ile Gly Ser Asp His Gly Gly Tyr Asn Leu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Ile Ala Asp Phe Leu Lys Lys Arg Gly Tyr Glu Val Ile Asp Phe 20 25 30 Gly Thr His Gly Asn Glu Ser Val Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Leu Lys 35 40 45 Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Glu Cys Asp Arg Gly Ile Val Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Val Pro Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Ala Val Cys Thr Asn Ser Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg 85 90 95 Glu His Asn Asp Ala Asn Ile Leu Ala Leu Gly Glu Arg Val Val Gly 100 105 110 Leu Asp Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Thr Trp Leu Lys Ala Glu Phe 115 120 125 Gln Gly Gly Glu His Ala Thr Arg Val Gly Lys Ile Gly Glu Ile Glu 130 135 140 Lys Lys Tyr Ser Lys 145

Claims

과당 용액이 수용된 반응기에 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소를 함께 첨가하거나 사이코스 에피머화 효소 및 라이보스-5-인산 이성화효소 함유 용액이 수용된 반응기에 과당 용액을 첨가하고, 45~60℃에서 동시 효소 반응을 진행하는 단계를 포함하는 방법으로서,
상기 동시 효소 반응은 과당의 알룰로오스로의 전환 반응 및 알룰로오스의 알로오스로의 전환 반응으로 구성되는 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소의 과당의 알룰로오스로의 전환을 위한 최적 온도는 55~65℃인 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 라이보스-5-인산 이성화효소의 알룰로오스의 알로오스로의 전환을 위한 최적 온도는 65~80℃인 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 라이보스-5-인산 이성화효소는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동시 효소 반응 온도는 45~55℃인 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응기에 존재하는 사이코스 에피머화 효소 대 라이보스-5-인산 이성화효소의 중량비는 1:9 내지 6:4인 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동시 효소 반응 시간은 24 hr 내지 72 hr 이고, 동시 효소 반응 pH는 6.7 내지 7.8인 것을 특징으로 하는 과당으로부터 희소당을 생산하는 방법.