CN102971432B - 含有岩藻糖的细菌生物聚合体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在其组成中包含岩藻糖的微生物生物聚合体。此生物聚合体由包含岩藻糖的多糖组成，其占其组成的至少10％。此含有岩藻糖的多糖也含有非‑糖组分，即，酰基取代基。本发明也涉及产生生物聚合体的方法，其为使用甘油或富含甘油的混合物作为碳源获得的细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的培养物。本发明的含有岩藻糖的生物聚合体可用于几种工业应用(例如药物，化妆品和农业‑食品工业)及用于处理工业废弃物(例如油和金属回收)。

Description

含有岩藻糖的细菌生物聚合体
【技术领域】
本发明涉及在其组成中含有岩藻糖的微生物生物聚合体。此外，本发明涉及由细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)产生含有岩藻糖的生物聚合体的方法。由此，本发明是可应用于几种工业(例如药物，化妆品和农业-食品工业)及用于处理工业废弃物(例如油和金属回收)。
【背景技术】
多糖是高分子量(104～107)聚合物生物材料，通过单糖重复单元的聚合形成。它们作为重复单元的多样性，涉及的糖苷连接的类型及分支程度的结果，具有大结构多样性。许多多糖具有非-糖组分，诸如有机酰基(例如乙酸基，琥珀酸基，丙酮酸基)及无机基团(例如磷酸基，硫酸基)(Sutherland，2001)。
另一方面，多糖常常通过分子内或分子间非-共价连接形成三级结构，其给大分子赋予更大刚性，并在确定在固体状态及在溶液中聚合物的性质中起到重要作用(Kumar etal，2007)。
由于它们的物理和化学性质，即，它们的水保留能力，流变学和/或膜-形成能力，多糖用于广泛的食品和工业应用，包括织物，涂料，药物和化妆品，作为乳化，稳定化或增稠剂(Moreno et al，1998)。作为自活体获得的物质，多糖通常是非-毒性和可生物降解的，使它们成为对于可持续发展充足的生物材料。
商业多糖，天然的(例如藻酸酯，角叉菜胶，瓜尔胶，果胶，黄原胶，吉兰糖胶)和半-合成衍生物(例如甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基瓜尔胶)的主要应用基于它们修饰水性系统的物理性质(能修饰水性系统的物理性质的水胶体-化合物)的能力，主要在食品工业，之 后是油和药学工业使用。这些多糖(例如藻酸酯，果胶，支链淀粉，淀粉衍生物，纤维素衍生物)中的一些额外地具有形成，用于生产包装，容器和片材，以及用于几种农业-食品，药物和工业应用的可生物降解的膜的能力。
目前，工业中使用的大多数多糖从植物(例如瓜尔胶，阿拉伯胶)，藻(例如藻酸酯，角叉菜胶)或甲壳类动物(例如壳多糖)得到，微生物多糖(例如黄原胶，吉兰糖胶，细菌藻酸酯)仅占小部分的生物聚合体的市场(Canilha et al，2005)。虽然如此，在去年，对鉴定及分离可与传统多糖竞争的新微生物多糖的兴趣增加，由于它们的增强的物理-化学性质，即，更高乳化及絮凝活性，对有机溶剂的更高抗性，生物学活性(例如抗癌或免疫增强效应)和更佳流变学性质(例如对更低聚合物浓度的更高粘度，在更宽pH，温度和离子强度范围上的更高稳定性)(Kumar et al，2007；Sutherland，2001)。
多糖的微生物产生相比它们自植物，藻或动物的提取具有优势，由于微生物通常呈现更高生长速率和它们更依从培养条件的操作(Moreno et al，1998)。植物，藻和动物具有一或更多年的寿命周期，产生周期通常是季节性的。另一方面，微生物的生长速率是几小时或几天的量级，而植物，藻和动物具有几个月或几年的量级的生长速率。
限制微生物多糖的商业产生的主要因素是高底物成本，主要糖，尤其葡萄糖，淀粉和蔗糖。在那些生物过程中，底物成本占总生产成本的20～40％(Kumar和Mody，2009)。
因此，对于具有可比较的产率的欠昂贵的基材的搜索对于减小生产成本是必要的。甘油，几种工业过程，主要是生物柴油工业，的副产物是良好候选体。由于去年生物柴油工业巨大的增长，其在传统甘油应用中以远超其当前消费的量产生。对于以甘油作为副产物的生物柴油工业或任何其他工业，其代表负担，因为其低商业价值，且其消除是成本关联的过程。因此，有对此工业副产物的感兴趣的应用的开发的紧急需求，利用甘油是非-毒性和可生物降解的化合物( et al，2008)。
除了它们的修饰水性系统的物理性质的能力之外，含有岩藻糖的多糖增加了工业应用的潜力，由于岩藻糖是罕见糖之一，难以获得。另一方面，岩藻糖的存在减少过敏性反应的可能性，其增强这些生物聚合体在应用诸如，例如药物和化妆品中的使用。
岩藻糖可通过其自其他更常见的单糖，诸如半乳糖或葡萄糖的化学转变来合成。不过，多数化学过程是复杂的，涉及几种中间体，且具有低产率。岩藻糖的化学合成的替代是含有岩藻糖的多糖的化学或酶促水解。这些聚合物可见于植物，藻和微生物。
在植物中，岩藻糖(L-岩藻糖及甲基化的岩藻糖)存在于，例如，马铃薯及猕猴桃的细胞壁，大豆种子，长叶车前(Plantago lanceolata)的嫩叶胶浆，家独行菜(Lepidiumsativum)和甘草(Glycyrrhiza uralensis)的根，小头黄芪(Astragalus microcephalus)，胶黄芪(A.gummifer)和kurdicus黄芪(A.kurdicus)的渗出物，及白羽扇豆(Lupinusalbus)的叶中(Vanhooren和Vandamme，1999)。
在海藻中，岩藻糖见于是由硫酸化的L-岩藻糖组成的同聚多糖的墨角藻聚糖。岩藻糖可从海藻诸如，例如，沟鹿角菜(Pelvetia canaliculata)，墨角藻(Fucusvesiculosus)和泡叶藻(Ascophyllum nodosum)提取。在那些物种中，L-岩藻糖含量在9.0和11.2％之间变化。L-岩藻糖自海藻的总提取的产率是略低(约7.6％)(Vanhooren和Vandamme，1999)。
几种微生物，即，细菌，真菌和微藻，合成含有L-岩藻糖的细胞外多糖(EPS)。这些聚合物包括同多糖和杂多糖，后者更常见，含有可变的量的岩藻糖，以及其他糖残基(例如葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖和/或阿拉伯糖)。含有L-岩藻糖的EPS由属于几种属的细菌产生，包括气杆菌属(Aerobacter)，固氮菌属(Azotobacter)，克雷伯菌属(Klebsiella)，欧文氏菌属(Erwinia)，肠杆菌属(Enterobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)，棍状杆菌属(Clavibacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)和沙门氏菌属(Salmonella)，其中。在真菌中，岩藻糖可见于由尤其属于念珠菌属(Candida)，毛 霉菌属(Mucor)，多孔菌属(Polyporus)，红酵母属(Rhodotorula)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)的物种产生的EPS。
在最近几十年，对几种，主要自克雷伯菌属(Klebsiella)，肠杆菌属(Enterobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)和棍状杆菌属(Clavibacter)的细菌属已报道含有L-岩藻糖的多糖的产生。
几种肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)株合成聚合物链的乙酰化程度彼此不同的含有L-岩藻糖，D-半乳糖和半乳糖醛酸的几种不同EPS。由肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)I-1507(US 5876982)产生的EPS由于其精神性感觉质量，水合及自身-乳化性质而应用于化妆工业(Guetta et al，2003a)。已描述具有非常类似组成的其他EPS，即，由克雷伯菌属(Klebsiella)K-63(Joseleau和Marais，1979)及由肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 31646(US 4298691)产生的EPS。本发明的聚合物不同于那些EPS在于，除了岩藻糖和半乳糖之外，其也含有葡萄糖。另一方面，本发明的聚合物在其组成中具有显著量的酰基取代基(达约25％的EPS干重)，其未被认为是克雷伯菌属(Klebsiella)EPS的组分。
肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 12657(以前称之为产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)株A3)产生由大致等摩尔量的岩藻糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸组成的EPS(Vanhooren和Vandamme，1999)。岩藻糖占纯化的EPS重量的18.9％(Guetta et al，2003b)。此多糖不同于本发明的聚合物在于高葡萄糖醛酸含量，及存在对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 12657 EPS未描述的酰基。而且，本发明中描述的方法不使用用于微生物培养的克雷伯菌属(Klebsiella)物种。
肠杆菌属(Enterobacter)株也已报道产生含有岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和葡萄糖醛酸的EPS。例包括：产生单体以2∶2∶1∶1的比存在的EPS的肠杆菌属(Enterobacter sp.)CNCM 1-2744(FR2840920)；产生具有105和106之间的分子量的，岩藻糖占糖含量的8～10％，葡萄糖醛酸是主要成分(40～70％)的EPS的肠杆菌属(Enterobacter sp.) SSYL(KCTC0687BP)(US2002115158)；及产生2×106的分子量的EPS，其中分别岩藻糖占13～22％和甘露糖含量达8％的阪崎肠杆菌(E.sakazakii)，株ATCC 53017，ATCC 29004和ATCC 12868(US4806636)。这些多糖不同于本发明的聚合物在于它们的糖单体和酰基的不同含量。此外，本发明的聚合物趋向于具有一般106～107量级的更高分子量。
几种密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)株已被描述产生含有L-岩藻糖的EPS。那些EPS含有其他中性糖，诸如半乳糖，葡萄糖和/或甘露糖，及酰基取代基，诸如丙酮酸基，琥珀酸基和/或乙酸基。密执安棍状杆菌密执安亚种(C.michiganensissubsp.michiganensis)Cm 542(NCPPB 1064)产生由岩藻糖，半乳糖和葡萄糖(2∶1∶1)，及丙酮酸基，琥珀酸基和乙酸基(1∶0.5∶1.5)组成的高分子量EPS(106～107)(van den Bulk etal，1991)。本发明的聚合物，尽管具有的类似组成，不同于密执安棍状杆菌(C.michiganensis)EPS在于酰基的相对比例。本发明的聚合物的更高琥珀酸基含量赋予其更高阴离子特征。
在文献WO2008/127134中描述了使用富含甘油的底物由细菌食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)产生富含半乳糖-的多糖的方法。不过，该方法中获得的EPS仅含有残量的岩藻糖(0～4％)。
鉴于此，本发明描述具有聚电解质特征，由微生物培养物，优选使用肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)产生的含有高分子量岩藻糖的生物聚合体，和其方法。所述方法允许使用低-成本底物及以容易的方式获得本发明的聚合物。本发明的聚合物可由于其流变学，膜-形成能力，聚电解质特征及乳化絮凝能力而用于几种工业，诸如农业-食品工业，废弃物水治疗和药学工业。
【发明概述】
本发明涉及主要成分是高分子量多糖(106～107)，其中岩藻糖占其组成的至少10％，且具有酰基取代基，包括丙酮酸基，琥珀酸基 和和乙酸基的生物聚合体的产生。生物聚合体由微生物培养物，优选细菌肠杆菌属（Enterobacter）A47（DSM 23139）使用甘油或含有甘油的底物作为优先碳源获得。
因此，本发明提供制备聚合物的方法，包括下列步骤：培养包含细菌株肠杆菌属（Enterobacter）A47（DSM 23139）的微生物培养物，及给所述培养物供给包含甘油的碳源。
【1．微生物培养物的表征】
本发明的含有岩藻糖的聚合物由假单胞菌属（Pseudomonas），克雷伯菌属（Klebsiella），甲基杆菌属（Methylobacterium），欧文氏菌属（Erwinia），产碱菌属（Alcaligenes）或肠杆菌属（Enterobacter）细菌，优选在布达佩斯条约下于2009年11月20日以保藏号No.DSM23139在DSMZ（德意志微生物和细胞培养物保藏中心，地址是：Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig）保藏的细菌肠杆菌属（Enterobacter）A47产生。此外，本发明中使用的微生物特征在于其他方面，即，生物化学特征，分别在表1和2，及图1中显示的遗传测序及种系发生聚类图。
本发明中使用的微生物可为野生型株，变体或突变体，只要其具有合成含有岩藻糖的聚合物的能力。使用几种微生物（其中至少一种能产生含有岩藻糖的聚合物，优选细菌肠杆菌属（Enterobacter）A47（DSM 23139））的纯培养物或混合的培养物是可能的。
【2．聚合物产生方法的表征】
本发明的聚合物在生物反应器中在搅拌的及通气的水性介质中产生。培养基含有碳源，氮源和无机盐。优先碳源是甘油或含有甘油的底物。不过，本发明的聚合物的产生方法预见使用其他碳源，替代甘油或与甘油混合，诸如例如，糖，醇，有机酸或烷，以及食品和工业废弃物或副产物，诸如例如自生物柴油工业的甘油副产物，糖蜜，乳清或橄榄油产生废弃物。
含有岩藻糖的聚合物的产生方法由在营养物通气的水性介质中培养微生物组成。温度控制在15和45℃之间，优选在26和37℃之间。 pH控制在5.0和9.0之间，优选6.5和7.0之间。
培养开始时，培养基中溶解的氧浓度蓄积到70％以上。然后，溶解的氧浓度逐渐减小，伴随细胞生长，控制在30％以下，或优选在20％以下，或最优选在10％以下或甚至在厌氧条件中。含有岩藻糖的聚合物是在氮限制条件下产生的，诸如在小于0.3g/L，或小于0.2g/L，或小于0.1g/L的量或甚至无氮源和碳利用，与低溶解的氧浓度同时，如上所述。碳利用通过给培养物供给含有高甘油浓度(＞100g/L)的培养基来保证。此补给分批期期间该培养基的添加流速必需调至匹配培养物的碳消费。
培养结束时在生物反应器中获得的培养肉汤可不经任何处理，或在干燥后直接使用。或者，含有岩藻糖的聚合物可通过添加沉淀剂(例如乙醇，丙酮)来自肉汤沉淀，产生天然聚合物。
本发明的聚合物的提取方法由细胞移出(例如通过肉汤的离心)，之后是通过添加沉淀剂沉淀聚合物组成。聚合物的纯化涉及使用一个或几个额外的过程(例如透析)。
依赖于在生物反应器中的培养条件，培养时间和提取/纯化聚合物使用的方法，该方法产生50g/L的天然聚合物或20g/L的纯化的聚合物。
【3.聚合物的表征】
一般而言，本发明的聚合物具有占其糖组成的至少10％的岩藻糖含量。含有岩藻糖的聚合物在其组成中具有其他中性糖，即，葡萄糖和半乳糖，且其也可含有痕量(＜5％)其他糖，诸如例如甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，果糖，葡萄糖醛酸和/或葡萄糖胺。
【4.聚合物的应用】
本发明的聚合物呈现絮凝及乳化活性，其形成具有假塑性流体行为的高度粘性水溶液，及当与其他聚合物混合时产生可生物降解的膜。因此，其可在它们的多种应用，即，在农业-食品工业，在药物和化妆品中取代其他多糖，诸如例如黄原胶，藻酸酯，角叉菜胶，瓜尔胶和阿拉伯胶。此外，在本发明的聚合物中岩藻糖的存在还增强其在医疗 和化妆品应用中的使用。而且，丙酮酸基和琥珀酸基残基的存在赋予聚合物阴离子特征。结果，其能固定毒性金属。
【附图说明】
图1-显示细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的种系发生聚类图。
图2-显示含有岩藻糖的聚合物的水溶液(0.8％w/v)的表观粘度(于室温测量)。
图3-显示本发明的聚合物的产生的培养过程期间碳源(甘油)和氮源(铵)消费，生物质和含有岩藻糖的EPS的产生的时间进程。
【发明详述】
【1.微生物的表征】
含有岩藻糖的聚合物通过培养细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)获得。微生物可为野生型株，变体或突变体，只要其具有合成含有岩藻糖的聚合物的能力。可使用纯培养物或，替代性地，可使用混合的培养物，其中至少一种微生物能产生本发明的聚合物。
获得本发明的聚合物的优选的微生物是细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM23139)，其具有如下描述的特征。由DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH))进行微生物的生物化学和遗传表征。
【1.1.细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的形态学表征】
细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)是具有下列尺寸的杆菌：0.7～0.8μm×1.2～2.5μm。其是革兰氏阴性能动性细菌。
【1.2.细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的生物化学特征】
细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)具有下列生物 化学特征，其是肠杆菌属(Enterobacter)的典型(表1)：
表1：细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的生物化学特征(“+”和“-“代表分别对进行的测试的阳性或阴性反应)
【1.3.细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的16SrDNA基因序列】
细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的16S rRNA 基因序列(表2)通过PCR-扩增的16S rDNA的直接测序来测定。如描述于Rainey等人(1996)进行基因组DNA提取，16S rDNA的PCR(聚合酶链反应)介导的扩增和PCR产物的纯化。使用CEQTMDTCS-快速Start试剂盒(Beckman Coulter)根据生产商的流程测序纯化的PCR产物。使用CEQTM8000遗传分析系统电泳序列反应。得到的序列数据投入比对编辑器ae2(Maidak et al，1999)，手动比对及与生物属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的代表性的16S rRNA基因序列比较(Maidaket al，1999)。为比较，从EMBL，RDP或DSMZ数据库得到16S序列。
表2：细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的16S rDNA基因序列-SEQ IDNO：1
【1.4.细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的种系发生聚类图】
使用ARB包装构建细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的种系发生聚类图(Pruesse et al，2007)。基于进化距离值，由邻接法(Jukes和Cantor，1969)，使用Saitou和Nei修正(1987)构建系统树。树根通过在分析中包括肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的16S rRNA基因序列来测定。聚类图以下的比例尺指示1个核苷酸取代/100个核苷酸。
细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的16S rDNA基因序列与细菌梨形肠杆菌(Enterobacter pyrinus)(98.3％)，霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)(99.0％)和阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)(98.9％)显示最高相似性。鉴定知道的物种之中的给定微生物的标准定义为与对该物种的株类型具有至少＞90％或，理想地，＞99.5％的相似性(Janda和Abbott，2007)。
鉴于此，待用于本发明的聚合物的产生方法的微生物培养物可为与通过遗传操作，突变，变异或直接从自然获得的肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)的SEQ IDNO：1(根据表2)共享至少99.0±0.5％的相似性的任何微生物。
【2.产生聚合物的方法的表征】
本发明的聚合物在具有pH和温度控制的搅拌的通气的生物反应器中产生。产生聚合物的方法通过在含有碳源，氮源和无机盐的营养水性介质中接种微生物来起始。该方法包括初始分批期，之后是补给分批期，这期间矿物质培养基被导入生物反应器。
【2.1.培养基】
用于产生含有岩藻糖的聚合物的培养基由含有碳源，氮源和无机盐的营养水性介质组成。
【2.1.1.碳源】
优选的碳源是甘油和含有甘油的混合物。或者，碳源可为单体，二聚或寡聚体糖，醇，有机酸，烷或含有2种或更多所指的化合物的 混合物。
碳源也可为食品或工业废弃物或副产物，其含有一种或几种以上所指的化合物，诸如例如，自生物柴油工业的甘油副产物，糖蜜，乳清或橄榄油废弃物。自生物柴油工业的甘油副产物主要由不纯的甘油组成，且除了来自工业过程的几种其他混杂物(例如NaOH，脂肪油，一些酯，硫，蛋白和矿物质)之外，含有可变的量的甲醇(5～50％)。糖蜜是糖精炼副产物，富含糖(蔗糖，葡萄糖和果糖)(＞50％)。乳清是干酪工业的副产物，主要由乳糖组成。橄榄油废弃物的有机级分包括糖，单宁，多酚，多元醇，果胶和脂质。可将在它们的组成中具有化合物诸如糖，醇，有机酸和/或脂质的其他食品或工业废弃物和副产物用作微生物培养物的底物和用于产生含有岩藻糖的聚合物。
根据本发明，在用于产生含有岩藻糖的聚合物的方法中，碳源必需在分批期期间占水性营养培养基的2和10％(w/v)之间，以便充分供给细胞生长。补给分批期之后期间，碳源应保持在0.1％(p/v)以上，优选0.5(p/v)以上，以便保证用于聚合物合成的碳利用度。
【2.1.2.氮源】
用于微生物培养的氮源可为无机盐(例如(NH4)2HPO4，NH4OH，(NH4)2SO4，NH4Cl)或有机氮化合物(例如脲，氨基酸)，其混合物或含有氮化合物的食品或工业废弃物或副产物(例如大豆粉，酵母提取物，小麦糠)。
在用于产生含有岩藻糖的聚合物的方法中，氮源必需在分批期期间具有0.6和3.0g/L之间的初始浓度，以便保证细胞生长。补给分批期之后期间，氮源必需保持在0.3g/L以下，优选0.1g/L以下，由此创建氮限制。因此，在补给分批期间，细胞生长由氮限制限制或局限，其伴随碳利用，诱导含有岩藻糖的聚合物的合成。
【2.1.3.无机盐】
培养基也包括，痕量的金属阳离子，即，钠，钾，镁，铁，锰，钴，铜和锌。各这些阳离子必需以0.001和100mM之间的浓度存在于培养基中，除了钠之外，其可以更高量存在，尤其用于pH控制。
【2.2.培养条件】
生物反应器培养通过在用压缩的空气通气的上述水性营养培养基中接种微生物来起始。接种物体积应在培养开始时占总反应培养基的10和30％之间。
在整个培养过程中，将温度控制在15和45℃之间，可优选在26和37℃之间，及将pH控制在5.0和9.0之间，优选6.5和7.0之间。
在培养开始时溶解的氧浓度高(＞70％)，在分批期期间伴随细胞生长逐渐降低。在补给分批期期间，将溶解的氧浓度控制在30％以下，优选在10％以下或甚至在厌氧条件下。空气流速可保持恒定在0.1和2.0vvm之间，通过将搅拌速度在0和2000rpm之间，优选400和800rpm之间自动变化来控制溶解的氧浓度。或者，空气流速可贯穿培养在0和2.0vvm之间改变，而保持恒定搅拌速度。补给分批期期间溶解的氧浓度也可通过底物添加控制。在此情况中，搅拌速度和空气流速可分别保持恒定在0和2000rpm之间，及0和2.0vvm之间的值。
在分批期期间起始聚合物合成，但其主要在补给分批期期间发生，当由于施加到生物反应器的氮限制而细胞生长减缓或停止时。在补给分批期期间，营养培养基被导入生物反应器，其创建了碳利用和氮限制的条件。此期的氮浓度保持在0.3g N/L以下，优选0.1gN/L以下。在这些条件下，只要有可利用的碳以匹配其由培养的消费，则局限细胞生长及产生聚合物。
在生物反应器中的聚合物合成可保持4～7天或直到当肉汤变得太粘的时刻，其不再可能维持氧，温度和营养的均质分布。当肉汤的表观粘度达到约2.0Pa.s时，此情况发生(于30℃，以5s-1的剪切率测量)。
或者，本发明的聚合物的产生可保持在连续过程中或在重复的补给分批过程中。在连续过程中，将营养培养基连续导入生物反应器中，也连续移出含有聚合物的肉汤。在重复的补给分批过程中，循环重复上述生物反应器操作模式(初始分批期，之后是补给分批期)。在生 物反应器中留下约10～30％的肉汤体积，及用作随后循环的接种物。这2替代性的生物反应器操作模式允许过程的优化，由于消除了非生产时期，即，新接种物和生物反应器制备。
【2.2.培养产物的提取和纯化】
可不经任何处理直接使用培养结束时获得的培养肉汤。或者，可通过在达80℃的温度干燥肉汤或由冷冻干燥获得生聚合物。
或者，可在培养结束时自肉汤优选通过沉淀回收天然形式的聚合物，这可通过添加聚合物不溶性的水混溶性溶剂来达到，所述水混溶性溶剂诸如例如醇(例如乙醇，异丙醇)或酮(例如丙酮)。含有岩藻糖的聚合物通过对每升肉汤添加1～3体积的沉淀剂来沉淀。聚合物与细胞，蛋白，盐和不溶于沉淀剂的其他肉汤组分共沉淀。沉淀的聚合物可在达80℃的温度干燥或冷冻干燥。此天然聚合物，以及上述肉汤和生聚合物，可用在应用中，诸如例如废水处理或动物饲料。
在替代性的提取方法中，本发明的聚合物可在方法中部分纯化，其包括通过离心(10000～20000rpm，30～60分钟)移出细胞，之后是添加沉淀剂(每升肉汤1～3l的沉淀剂)。沉淀剂可为以上所指的任何溶剂(例如乙醇，异丙醇，丙酮)。
在培养结束时培养肉汤是高度粘的，由此通过在离心之前稀释其(每升肉汤添加1～4l的去离子水)来辅助细胞分离。沉淀的聚合物可在达80℃的温度干燥或冷冻干燥。此半-纯化的聚合物可用于几种应用尤其诸如，例如，农业-食品，化妆品，纸，涂料或油工业。
纯聚合物可通过额外地使用一种或更多下列方法获得：
(1)自稀释的半-纯化的聚合物水溶液(0.1～5.0g/L)的聚合物的再沉淀，随着进行再沉淀数纯度增加；
(2)用不同沉淀剂，即，乙醇，丙酮和/或异丙醇，或其混合物连续沉淀，由此促进在各溶剂中可溶性的不同混杂物的消除；
(3)用聚合物不是溶性，但溶解一种或更多混杂物的溶剂(例如己烷)洗涤半-纯化的聚合物；
(4)通过在60和80℃之间的温度加热来使用蛋白水解酶(例如 胰蛋白酶)，添加蛋白沉淀剂(例如三氯乙酸)或变性蛋白性物质；
(5)用减少的浓度(0.1～5.0g/L)透析，超滤或渗滤水性半-纯化的聚合物溶液，其由于高分子量聚合物从全部低分子量混杂物分离，从而导致高纯度。
用这些过程之任何获得的纯聚合物可在达80℃的温度干燥或冷冻干燥。高纯度的此聚合物允许其尤其用于食品，药物和化妆工业。
根据其所旨在的纯度和特定应用，可将所指的方法的几种不同组合用于提取/纯化含有岩藻糖的聚合物。
【3.聚合物表征】
【3.1.组成】
本发明的聚合物主要由高分子量多糖(106～107)构成，具有总糖含量的至少10％的岩藻糖含量。所述聚合物也由葡萄糖和半乳糖(总糖含量的分别20～70％和10～40％)组成。在聚合物中所指的糖(岩藻糖，半乳糖和葡萄糖)的相对组成依赖于培养时间及生物反应器操作条件。
此外，本发明的聚合物也可具有少量(＜5％)其他中性糖，诸如甘露糖，鼠李糖，木糖，核糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸和/或葡萄糖胺。
所指的聚合物也具有非糖组分，即酰基，其占聚合物的干重的至多25％。检测的主要酰基是琥珀酸基，丙酮酸基和乙酸基。
一般而言，乙酸基和丙酮酸基占聚合物的干重的0.5和5％之间，而琥珀酸基以更高量存在，正常在1和20％之间。各酰基的本发明的聚合物的组成依赖于反应器操作条件及培养时间。丙酮酸基和琥珀酸基残基的存在给聚合物赋予阴离子特征。结果，其能固定毒性金属，使其应用于毒性金属(重金属和放射性核素)自混杂的土壤和水去除成为可能。
依赖于提取/纯化方法，获得的聚合物可，除了含有岩藻糖的聚合物之外，含有存在于培养肉汤的其他组分，即蛋白和无机化合物。在天然聚合物中检测这些组分的最大含量(15～30％的蛋白和25～40％的无机化合物)，而在通过透析获得的纯化的聚合物中检测最小量 (＜1％)。
【3.2.聚合物平均分子量】
由凝胶渗透层析测定的纯化的聚合物的平均分子量在106～107范围。正常情况下，当在微生物生长期期间起始聚合物产生时，其平均分子量是约105，培养期间经时增加达106～107范围的相对恒定值。
【3.3.聚合物性质】
【3.3.1.溶解度】
本发明的聚合物在环境温度不可溶于广范围的有机溶剂，包括尤其是丙酮，异丙醇，DMSO，己烷，二乙基醚，二甲苯和四氯乙烯。聚合物的此特征使其在待用于分离过程的溶剂抗性膜的制备中应用成为可能。但是，观察到聚合物可溶于一些有机溶剂，即四氯乙烷。
本发明的聚合物在与测试的有机溶剂接触中稳定，在暴露于那些溶剂之后维持其糖成分和酰基组成。此外，也不影响平均分子量。
【3.3.2.聚合物水溶液的粘度】
用本发明的聚合物制备的水溶液不是牛顿流体，呈现假塑性流体行为(图2)。于25℃测量的0.8％(w/v)聚合物溶液的表观粘度，对于5s-1剪切率，是0.21Pa.s；对于500s-1剪切率，降低到0.02Pa.s。由于当剪切率降低时，粘度立即恢复，未观察到滞后现象。聚合物溶液的假塑性流体行为赋予此物质修饰水性系统的物理性质的能力，及作为增稠剂和质地增强剂应用的潜力，主要在食品，药物和化妆工业。
聚合物水溶液的表观粘度随着温度增加而减小，但假塑性流体行为维持。0.8％(w/v)聚合物溶液的表观粘度，在5s-1剪切率于15℃测量的是0.32Pa.s，于65℃降低到0.05Pa.s。
进行连续加热及冷却步骤的循环而研究了连续加热及冷却阶段对纯化的EPS溶液的动态和稳定-剪切性质的效应。于25℃记录机械谱和稳定-状态数据之后，将相同的样品加热到40，55，70和80℃。观察到，在各循环结束时于25℃记载的表观粘度和动态模量(G’和G”)实际上一致。自此，我们可总结，聚合物样品在温度波动下相当地稳定，于25℃维持其连续振荡性质和稳定-状态测试，在暴露于增加到 80℃的温度之后。这些特征使我们想到，聚合物可用于在处理期间经历温度波动的水性制剂(例如食品)。
关于粘弹性性质，含有岩藻糖的聚合物水溶液呈现粘液体行为(在研究的整个频度范围G”＞G’)。在测试的条件下未检测到凝胶形成。
【3.3.3.乳化活性】
本发明的聚合物具有乳化活性，这表示，其能稳定化在疏水化合物，诸如油(例如橄榄油，石蜡)和烃(例如己烷，甲苯)中水滴的乳剂。由此，可将该聚合物用作生物乳化剂或稳定化剂，且具有在广范围的应用中取代合成乳化剂的潜力，诸如在石油，去污剂，织物，纸，涂料，化妆品，药物和食品工业。
乳化活性不限于纯化的聚合物。其他形式，即生，天然和半-纯化的，揭示了在疏水化合物中稳定化水的乳剂的能力。使用当与几种烃(例如十六烷，己烷，甲苯和二甲苯)和油(橄榄油和石蜡)混合时具有0.05和1.5％之间的浓度的本发明的聚合物的溶液确证此能力。形成的乳剂相当地稳定几周。此外，它们显示对温度非常稳定，抵抗自环境温度加热达，40，50，60和100℃。
【3.3.4.絮凝活性】
本发明的聚合物也呈现显著的絮凝活性，且可用作天然的生物絮凝剂。絮凝剂在促进细胞和胶体聚集中有用，广泛用于工业应用，诸如废水和饮用水处理和食品。本发明的聚合物的生物降解性和安全性呈现优于合成絮凝剂的优势，所述合成絮凝剂对人健康危险，且其在环境中难以降解。
在环境温度和中性pH，本发明的聚合物的絮凝活性随着聚合物浓度自0.1％增加到0.8％(w/v)而自70％减小到60％。将此絮凝活性与商业多糖，即，黄原胶，藻酸酯，瓜尔胶和羧甲基纤维素比较。本发明的聚合物揭示是良好絮凝剂，对相同的聚合物浓度与商业产品具有类似性能。
【3.3.5.可生物降解的膜的制备】
含有岩藻糖的聚合物可通过将其与其他生物聚合体，诸如淀粉， 果胶，藻酸酯，角叉菜胶，谷蛋白，吉兰糖胶和壳聚糖混合而用于产生可生物降解的复合膜。这些膜可在有机溶剂加工及包装材料中作为膜应用。
已在药物受控释放用微球的制备中测试多糖，诸如壳聚糖，淀粉和瓜尔胶。本发明的聚合物也可单独或与其他生物聚合体混合而用于其他目的。
【4.本发明的聚合物的应用】
本发明的聚合物呈现乳化及絮凝活性，及形成具有假塑性流体行为的高粘度水溶液。结果，其可在广范围的应用中取代其他多糖，如黄原胶，藻酸酯，瓜尔胶和阿拉伯胶，即作为增稠剂，质地增强剂或结合剂，在食品，药物和化妆工业中应用。
含有岩藻糖的聚合物可通过将其与其他生物聚合体，诸如淀粉，果胶，藻酸酯，角叉菜胶，谷蛋白，吉兰糖胶和壳聚糖混合来用于产生可生物降解的复合膜。这些膜可作为膜在有机溶剂加工(例如由渗透蒸发的溶剂脱水)，及在包装材料，如食品包装(鉴于它们对于气体(氧和二氧化碳)的低通透性)中应用。
含有岩藻糖的聚合物也可用作寡糖来源，通过应用物理处理(例如微波，热，辐射和超声处理)，化学过程(例如酸性水解)，酶促处理(例如用水解酶及裂合酶)或生物学过程(使用能降解聚合物的微生物剂和使用全部糖(除了岩藻糖)作为碳源)自原聚合物获得。分离的或混合的一起的获得的岩藻糖和岩藻糖-寡糖，以及原聚合物作为抗-致癌和抗-炎性剂在医疗应用中，在治疗类风湿性关节炎中具有大潜力(Vanhooren和Vandamme，1999；Péterszegi et al，2003b)。此外，由于在其组成中岩藻糖的存在，本发明的聚合物也作为水合及抗衰老添加剂在用于化妆品中具有大潜力(Péterszegi et al，2003a)。
【实施例】
【实施例1：使用自生物柴油工业的甘油副产物通过培养细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)产生含有岩藻糖的聚合物】
肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)培养物接种于8L的具有表3显示的组成的培养基中。在下列条件下操作生物反应器(BioStat B-plus，Sartorius)：于30℃控制的温度；在6.80±0.05控制的pH，自动添加NaOH 1M和1.6L/min的恒定通气速度(0.2vvm)。随着微生物生长发生，溶解的氧浓度在1天之后自培养运行开始的80％饱和度降低到约20％。
然后立即，连续供料(约20mL/h)导入反应器。其组成显示于表3，但具有不同甘油浓度(200g/L)。这些操作条件限制了发酵肉汤中的氮浓度(0.1g N/L以下)及同时允许碳源的良好利用度。
表3：培养基的组成
溶解的氧浓度逐渐降低到10％饱和度，在2天的培养之后达到的值。自该时刻，通过自动改变搅拌速度在400和800rpm之间将其控制在10％以下。在这些条件下1天之后，发酵肉汤的粘度快速增加，这与聚合物产生相关。
在4天的培养结束时，聚合物浓度是几乎13.3g/L，这表明以其半-纯化的形式提取及定量的聚合物(图3)。即使聚合物产生已停止，发酵肉汤粘度在第4天和第7天之间显著增加。产率达到3.6g/L/天的值，且自甘油的产率是0.47g/g，考虑到聚合物产生发生的时间间隔(第1天～第4天)。
培养运行在第7天，当在5s-1的剪切率和T＝30℃发酵肉汤的粘度达到3.0Pa.s时停止。
【实施例2：由肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)自甘油副产物产生的含有岩藻糖的聚合物的提取和纯化】
在实施例1中描述的培养运行结束时，以具有不同的纯度级：天然，半-纯化的及纯化的聚合物的3种不同产物的形式自发酵肉汤回收含有岩藻糖的聚合物。
通过直接添加丙酮到发酵肉汤(3∶1)来获得天然聚合物。天然聚合物的浓度是20.6g/L。
为了获得半-纯化的聚合物，首先稀释发酵肉汤以减少粘度(2L的去离子水到1L的发酵肉汤)，然后由离心分离(20000rpm，30min)生物质。然后将无细胞的上清液在弱搅拌下缓慢添加到丙酮(1∶3)，促进聚合物沉淀。将沉淀物溶于去离子水，并冷冻干燥。半-纯化的聚合物的浓度是11.6g/L。
为了获得纯化的聚合物，通过与去离子水接触透析24h期间，使用3500MWCO膜(SnakeSkinTM折叠透析管道68035-Thermo Scientific)处理半-纯化的聚合物的水溶液。添加叠氮化钠(6ppm)，以防止聚合物的微生物降解。那之后，通过添加丙酮沉淀聚合物，再溶解于水，并冷冻干燥。纯化的聚合物的浓度是5.5g/L。
作为替代，聚合物可通过下列方法提取/纯化：发酵肉汤的稀释和通过离心的生物质分离；于60℃加热1h，以灭活存在于上清液中的可负责部分聚合物降解的酶；与去离子水接触的上清液的透析和最终冷冻干燥。用此方法回收了5.0g/L的纯化的聚合物。
【实施例3：由肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)产生的含有岩藻糖的聚合物的化学分析】
使用Freitas等人(2009)描述的方法表征如在实施例1描述中产生，及如在实施例2中描述提取的聚合物的化学组成，即关于其糖组成，酰基的含量和非-糖残基(蛋白和灰)的量。在培养运行期间经时分析全部聚合物纯度级(天然，通过透析半-纯化的及纯化的)的化学组成。
在1天的培养之后，聚合物主要由葡萄糖(77％)和半乳糖(15％)，以及更低量的岩藻糖(6％)组成。随着培养进行，这些糖单体的相对 比例显著变化：葡萄糖含量在第4天逐渐降低到40％，而半乳糖和岩藻糖的相对量分别增加到26％和28％。
糖组成在最后3天的操作中实际上恒定(葡萄糖，40～44％；岩藻糖，26～30％；半乳糖，28～29％)。
也观察到酰基的相对比例的经时变化：其自在第1天的2.4％琥珀酸基，0.2％丙酮酸基和0.3％乙酸基变成在第4天的20％琥珀酸基，2.4％丙酮酸基和2.0％乙酸基。然后，在第7天观察到琥珀酸基含量减小到3.9％，伴随丙酮酸基(4.9％)和乙酸基(3.6％)的增加。
糖和酰基成分的组成对于不同纯度级聚合物类似。对于蛋白和灰的情况则不同。这些组分的含量自天然聚合物到半-纯化的聚合物减小，及自半-纯化的聚合物到纯化的聚合物减小。
【实施例4：使用自生物柴油工业的甘油副产物，在不同温度和pH下，通过培养细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)产生含有岩藻糖的聚合物】
于2L生物反应器中，如在实施例1中描述，除了将温度和pH控制在根据表4的不同值下，培育肠杆菌属(Enterobacter)A47(DSM 23139)培养物。在各运行结束时，如在实施例2中所述回收聚合物。
表4：测试的温度和pH的值
运行 Temp(℃) pH
1 30.0 7.0 0.30 7.14 8.37 5.00 0.17
2 30.0 7.0 0.32 7.58 10.13 4.94 0.21
3 20.0 6.0 0.14 7.41 0.82 0.19 0.01
4 40.0 6.0 0.34 9.20 2.59 0.81 0.03
5 20.0 8.0 0.13 8.39 4.40 2.54 0.10
6 40.0 8.0 0.22 5.63 1.62 1.34 0.04
7 15.9 7.0 0.08 8.17 1.12 0.33 0.02
8 44.1 7.0 0.21 0.23 0.06 0.02
9 30.0 5.6 0.10 10.62 7.50 2.05 0.09
10 30.0 8.4 0.07 3.01 2.67 2.38 0.09
发现最大化细胞生长，聚合物产生和产率的条件是25和34℃之间的温度，及控制在6.5和7.5之间的pH(表5)。此外，在这些温 度和pH范围之内，聚合物中岩藻糖的含量最大。在这些范围之外，培养合成了具有不同组成的聚合物，诸如，例如：岩藻糖含量的减小(＜14％)，伴随葡萄糖含量的增加(＞50％)和添加新单体(例如鼠李糖和葡萄糖胺)作为主要成分(分别达20％和达10％)。也检测到这些聚合物中的葡萄糖醛酸含量达15％。在培养期间，酰基含量也受到温度和pH的影响，减少到聚合物干质量的10％以下的水平。
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Claims (20)

1.制备包含含有岩藻糖的多糖的聚合物的方法，
其中通过使用甘油或含有甘油的混合物作为碳源培养保藏号为No.DSM 23139的细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47来获得所述聚合物，
所述方法包括下列培养步骤：
(a)分批期，其包括在搅拌的及通气的生物反应器中在培养基中培养保藏号为No.DSM23139的细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47，其中所述培养基包含碳源、氮源和无机盐，所述碳源包含甘油，其中
碳源占培养基的2和10w/v％之间；
氮源具有0.6和3.0g/L之间的初始浓度；
在培养基中初始溶解的氧浓度在70％以上；和
(b)补给分批期，其包括在碳利用和氮限制的条件下培养所述保藏号为No.DSM 23139的细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47，其中
碳源保持在0.1w/v％以上；
氮源保持在0.3g/L以下；
当培养基中溶解的氧浓度达到30％，则所述溶解的氧浓度控制到在30％以下的水平，
其中在所述分批期和补给分批期期间，
所述培养基的温度在15℃和45℃之间，且
所述培养基的pH在5.0和9.0之间，
所述培养基还包含金属阳离子，其中除了钠之外的金属阳离子以0.001和100mM之间的浓度存在于培养基中，
其中在培养开始时向培养基接种占总反应培养基的10和30体积％之间的保藏号为No.DSM 23139的细菌肠杆菌属(Enterobacter)A47。
2.权利要求1的方法，
其中在补给分批期氮源限于小于0.1g/L的量；且
其中供给碳源以匹配其微生物消费速度。
3.权利要求1或2的方法，其中在补给分批期中含矿物质的培养基被导入生物反应器。
4.权利要求1或2的方法，其中培养步骤的
温度在25℃和34℃之间，且
pH在6.5和7.5之间。
5.权利要求1或2的方法，其中将培养步骤结束时的培养基在不超过80℃的温度干燥或冷冻干燥。
6.权利要求1或2的方法，其中将细胞从培养基中移出而得到无细胞的上清液，且通过对每体积的培养基添加1～3体积的沉淀剂来从所述无细胞的上清液中沉淀所述聚合物。
7.权利要求1或2的方法，其中聚合物通过透析，超滤或渗滤技术进一步纯化。
8.权利要求1或2的方法，其中碳源是食品或工业废弃物或副产物。
9.权利要求1或2的方法，其中碳源在补给分批期在0.5w/v％以上。
10.由权利要求1～9之任一项所述的方法制备的聚合物，
其中所述聚合物具有106～107的平均分子量，
其中所述聚合物包含：
总碳水化合物含量的至少10摩尔％的量的岩藻糖，
总碳水化合物含量的20摩尔％～70摩尔％之间的量的葡萄糖，及
总碳水化合物含量的10摩尔％～40摩尔％之间的量的半乳糖，且
其中酰基占聚合物干重的至多25摩尔％，其中酰基是琥珀酸基和/或丙酮酸基和/或乙酸基或其任意组合，且其中
琥珀酸基构成所述聚合物干重的不超过20％的量，
丙酮酸基构成所述聚合物干重的不超过5％的量，和
乙酸基构成所述聚合物干重的不超过5％的量。
11.权利要求10的聚合物，其中所述聚合物在水性介质中具有假塑性流体行为，在不超过80℃的温度，3～10之间的pH和不超过20％NaCl的离子强度下具有稳定的粘度。
12.权利要求10的聚合物，其中所述聚合物不溶于有机溶剂。
13.权利要求10的聚合物，其中所述聚合物具有针对疏水化合物的乳剂形成及稳定化能力，所述乳剂对于加热至达100℃的温度稳定。
14.权利要求13的聚合物，其中所述疏水化合物为植物油、矿物油和烃。
15.权利要求10～14之任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有絮凝活性。
16.膜，包衣和包装，其包含权利要求10～15之任一项所述的聚合物。
17.可生物降解的复合膜，其包含权利要求10～15之任一项所述的聚合物。
18.药物受控释放用微球，其包含权利要求10～15之任一项所述的聚合物。
19.药物和/或化妆制剂，其包含权利要求10～15之任一项所述的聚合物。
20.权利要求10～15之任一项所述的聚合物在农业食品工业，药物和化妆工业和/或废弃物处理中的用途。
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