CN117646048A - 一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，包括以下步骤：S1，斜面活化：将‑80℃甘油管保存的肠杆菌属细菌接种于活化斜面，于30℃环境下，在斜面培养基中培养12h；S2，种子扩培：S2.1，一级摇瓶培养；S2.2，二级摇瓶培养；S2.3，种子罐培养；S3，发酵：在发酵罐中加入发酵培养基，将种子罐中的种子液再转种至发酵罐，进行分批补料发酵，所述发酵过程分为两个阶段即生长代谢阶段和产物代谢阶段，得到发酵液S4，酸水解，测定岩藻糖含量。本发明采用合理的培养基组成、培养条件以及发酵控制工艺，在保证发酵单位不降低的前提下缩短了发酵时间，极大的降低了能源、人力以及加工成本，且发酵液中岩藻糖占比高且多糖产量高。
Description
技术领域
本发明涉及岩藻糖发酵技术领域，具体为一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法。
背景技术
岩藻糖(Fucose)是一种六碳糖，又称为6-脱氧-半乳糖，是一种甲基戊糖，其以两种对映异构体形式存在：L-岩藻糖(CAS：2438-80-4)和D-岩藻糖(CAS：3615-37-0)，其中L-岩藻糖在自然界中更为广泛分布，L-岩藻糖以及含岩藻糖的的分子如岩藻糖基低聚糖和岩藻多糖具有多种理化特性和生物活性，如修饰水性系统、减少过敏反应、可生物降解、肠胃调节、皮肤保湿以及抗衰老等，因此可作为化学和制药工业的重要起始材料并且也可应用于环保材料、护肤品和功能性食品领域。
L-岩藻糖可由相对廉价的底物化学合成，如L-鼠李糖、L-阿拉伯、D-甘露糖、D-半乳糖以及D-葡萄糖等，且通过L-鼠李糖的合成路线被证明是最有效的，但是通过这些底物化学合成往往涉及若干步骤且收率和产量相当不理想，除合成步骤外，保护基团的化学反应还必须用于L-岩藻糖的化学合成，进一步加大了合成难度，因此目前L-岩藻糖的大规模化学合成生产在经济效益上被证明不可行，L-岩藻糖的获取除化学合成外，还可以从自然界中提取，其作为稀有单糖在自然界中常以低聚糖和多糖的形式存在，多见于植物、藻类和微生物中。
在植物中岩藻糖存在马铃薯、猕猴桃、大豆种子、甘草、黄芩和油菜等的多糖中，作为细胞壁的组成成分；在海藻中岩藻糖也是细胞壁组成成分，是一种水溶性的硫酸化多糖，组成该多糖的种类有很多，除了岩藻糖还有半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等单糖，结构研究最多的为来自褐藻的岩藻多糖；微生物源的岩藻糖为胞外多糖(ExopolySaccharides,EPS)且多为粘液多糖，其中细菌肠杆菌属、克雷伯菌属、气杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌等和真菌念珠菌属、毛霉菌属、红酵母、掷孢酵母等皆有产岩藻多糖。
从自然界中提取盐藻多糖多从海洋中的褐藻、海带、羊栖菜、海胆以及海参等中提取，但是从自然界中提取岩藻多糖会随着采摘季节、采摘地域、褐藻等的类型以及提取手段的不同，岩藻多糖产量和品质差异显著，为了稳定的获得岩藻多糖及岩藻糖，需要一种受环境影响尽可能小的方法，而微生物发酵正好符合这一点。
近年来采用微生物发酵得到岩藻多糖的报道逐渐增多，但是普遍发酵时间较长，岩藻糖占比低，且多糖产量低，如CN102971432B中采用肠杆菌属细菌发酵得到岩藻多糖需要168h，L-岩藻糖占总糖含量26～30％，多糖产量20.1g/L；WO2021196572A1中分离出了一株Kosakonia菌株，通过96h发酵多糖产量13.5g/L；L-岩藻糖占总糖含量36％；CN114134188A用小麦麸皮作为培养基接种类芽孢杆菌发酵含岩藻糖的胞外多糖，发酵时间72h，L-岩藻糖占总糖含量38％。
发明内容
本发明目的是提供一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，以解决现有技术中微生物发酵普遍存在发酵时间较长，岩藻糖占比低，且多糖产量低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，包括以下步骤：
S1，斜面活化：
将-80℃甘油管保存的肠杆菌属细菌接种于活化斜面，于30℃环境下，在斜面培养基中培养12h；
S2，种子扩培：
S2.1，一级摇瓶培养：
取活化斜面，接种一环菌苔至种子培养基中，于箱式摇床中30℃、240rpm培养10h；
S2.2，二级摇瓶培养：
取一级种子瓶，以1％(v/v)接种量接种至二级种瓶，于箱式摇床中30℃、240rpm培养6h；
S2.3，种子罐培养：
将二级摇瓶培养后的扩培液转入种子罐中培养；
S3，发酵：
在发酵罐中加入发酵培养基，将种子罐中的种子液再转种至发酵罐，进行分批补料发酵，所述发酵过程分为两个阶段即生长代谢阶段和产物代谢阶段，得到发酵液；
S4，酸水解，测定岩藻糖含量：
取发酵液适当稀释，稀释倍数一般为2至4倍，后加入浓硫酸至硫酸终浓度为1.0mol/L至1.8mol/L，沸水浴30分钟至60分钟，用NaOH中和pH至3.0至8.0，高速离心取上清液，液相测定岩藻糖含量。
优选的，所述斜面培养基组成成分包括葡萄糖、酵母粉和琼脂，所述葡萄糖、酵母粉和琼脂的含量分别为40g/L、10g/L和15g/L。
优选的，所述一级摇瓶培养的种子培养基组成成分包括葡萄糖、酵母粉和CaCO3，所述葡萄糖、酵母粉和CaCO3的含量分别为30g/L、10g/L和5g/L。
优选的，所述转种指标为OD600＝13-15，pH＝5.7-5.9。
优选的，所述S3中发酵培养基由碳源、氮源和无机盐的水溶液组成；所述碳源可以是糖类、有机酸或醇类，还可以是食品或工业废弃物或者副产物；所述碳源在发酵培养基中浓度为25g/L-100g/L；所述氮源可以是无机氮源，也可以是有机氮源；所述氮源在发酵培养基中初始浓度应为5g/L-20g/L。
优选的，所述发酵培养基中碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、酵母粉、CaCO3，所述葡萄糖、酵母粉和CaCO3的含量分别为100g/L、15g/L和5g/L。
优选的，所述S3中发酵培养基初始pH应在6至8之间，发酵第一阶段即生长代谢阶段不控制pH，待此阶段结束时发酵液pH应在3.8至4.5之间，发酵第二阶段即产物代谢阶段，当溶氧和pH开始回升且生物量不再增长后用20％氢氧化钠溶液控制发酵液pH在6.0至8.0之间。
优选的，所述S3中，当溶氧和pH开始回升、发酵体系中碳源消耗殆尽，开始以流加形式补充碳源，发酵液中碳源浓度1g/L-5g/L。
优选的，所述S3中，在发酵生长代谢阶段，溶氧控制在20％-30％；在发酵产物代谢阶段，溶氧尽可能控制在5％-10％；溶氧通过通气量和搅拌转速来调控，通气量控制在1VVM-2VVM，搅拌转速控制在50rpm-1000rpm。
优选的，所述S3中发酵温度为30℃±0.2℃，发酵罐压0.05Mpa，发酵周期为24-48h。
本发明至少具备以下有益效果：
本发明提供的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，采用合理的培养基组成、培养条件以及发酵控制工艺，在保证发酵单位不降低的前提下缩短了发酵时间，极大的降低了能源、人力以及加工成本，且发酵液中岩藻糖占比高且多糖产量高。
附图说明
图1为30M3发酵罐规模发酵工艺流程图；
图2为种子液镜检图；
图3为发酵过程生物量和多糖积累曲线。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的岩藻多糖是采用肠杆菌属(Enterobacter)细菌在pH、温度和补料自控的通气搅拌式发酵罐中进行深层液体发酵24小时而得。其发酵培养基包含碳源、氮源和无机盐，发酵过程分为两个阶段即生长代谢阶段和产物代谢阶段。具体如下：
1.发酵生产步骤：
如图1所示，发酵菌株经斜面活化后接入种子瓶进行摇瓶阶段的扩培，然后将种子瓶扩培液转入种子罐，最后种子罐中的种子液再转种至发酵罐进行分批补料发酵，整个发酵过程可三级、四级、五级亦或六级等发酵，具体级数视发酵规模而定，但优选四级发酵，更优选三级发酵。
2.培养基
用于发酵生产岩藻多糖的基础发酵培养基由含碳源、氮源和无机盐的水溶液组成。
2.1碳源
碳源可以是单糖、低聚糖和多糖这样的糖类，常见用于发酵的糖类有葡萄糖(浆)、甘露糖、乳糖、蔗糖和淀粉等；也可以是有机酸或者醇类，如乳酸、甲醇、乙醇和甘油等；可以是油脂类，如豆油、玉米油、菜籽油和猪油等；还可以是食品或工业废弃物或者副产物，如糖蜜、乳清、橄榄油废弃物和石油工业废弃物等，本发明中碳源次优选糖蜜、优选甘油、最优选葡萄糖。
根据本发明，在用于岩藻多糖发酵过程中，碳源在发酵培养基中浓度为25g/L至100g/L之间，以满足生长代谢阶段有足够的生物量积累。在补料阶段，碳源应保持在1g/L至5g/L之间，以满足产物代谢阶段有足够的岩藻多糖合成，同时有机酸副产物尽可能的少。
2.2氮源
用于微生物发酵的氮源可以是无机氮源，如NH4Cl、NH4SO4和(NH4)2HPO4等铵盐；也可以是有机氮源，如氨基酸、尿素、酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉、玉米浆和麸皮等。
在本发明中，氮源次优选尿素、优选玉米浆、最优选酵母粉。在生长代谢阶段，氮源在发酵培养基中初始浓度应为5g/L至20g/L之间，以保证有足够的生物量积累，在产物代谢阶段氮源浓度应控制在0.5g/L以下、优选0.3g/L一下、最优选0.1g/L以下，以创造氮源限制的发酵条件。
2.3无机盐
培养基中可包含少量无机盐，如NaCl、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和CaCO3等，起到调节培养基渗透压、代谢途径中某些酶的激活剂、活性基团或者辅因子、调节发酵液pH和pH变化缓冲等作用。根据本发明无机盐优选CaCO3，以起到调节pH的作用。
3.发酵工艺
本发明的岩藻多糖是在通气搅拌式发酵罐中发酵而来，涉及转种、pH调控、搅拌转速调控、溶氧调控、温度调控和补料调控等。
3.1种子液转种指标及接种量
种子液生物量大小及菌株活性严重影响发酵过程及结果。转种时优选指数生长中期、OD600＝12至15的种子液。转种量应控制在1％至15％(v/v)之间，优选8％至12％之间。
3.2发酵条件
温度：20℃至42℃之间，优选28至32℃。
pH：发酵培养基初始pH应在6至8之间，优选6.8至7.2之间。发酵第一阶段即生长代谢阶段不控制pH，待此阶段结束时发酵液pH应在3.8至4.5之间。发酵第二阶段即产物代谢阶段，当溶氧和pH开始回升且生物量不再增长后用20％氢氧化钠溶液控制发酵液pH在6.0至8.0之间，优选7.2至7.5之间。
溶氧：在发酵生长代谢阶段，溶氧控制在20％至30％之间；在发酵产物代谢阶段，溶氧尽可能控制在5％至10％；溶氧通过通气量和搅拌转速来调控。
通气量：根据溶氧控制在1VVM至2VVM之间。
搅拌转速：根据溶氧控制在50rpm至1000rpm之间。
补料：当溶氧和pH开始回升、发酵体系中碳源消耗殆尽，开始以流加形式补充碳源，发酵液中碳源浓度1g/L至5g/L之间。
发酵周期：24小时至48小时之间，优选24小时。
3.3发酵现象
在种子液转种发酵罐后发酵进入第一阶段即生长代谢阶段。在此阶段，发酵菌株快速繁殖、生物量迅速积累、发酵液pH和溶氧持续下降；当pH和溶氧开始显著回升后开始以流加形式补入碳源。当生物量不再增长后发酵进入第二阶段即产物代谢阶段。在此阶段，pH控制在中性附近，岩藻多糖大量在胞内合成并分泌至胞外发酵液中，发酵液粘度持续升高。
4.发酵液多糖中岩藻糖含量检测
4.1酸水解
取发酵液适当稀释，稀释倍数一般为2至4倍。后加入浓硫酸至硫酸终浓度为1.0mol/L至1.8mol/L，沸水浴30分钟至60分钟，用NaOH中和pH至3.0至8.0，高速离心取上清，液相测定岩藻糖含量。
4.2液相色谱条件
检测器：示差折光检测器
色谱柱型号：Welch，Sugar-H型色谱柱
流动相：超纯水
流速：0.5ml/min
柱温：40℃
5.岩藻多糖提取
取发酵液适当稀释降低粘度，稀释倍数一般为2至4倍。然后高速离心取上清液去除生物质。将无菌体的上清液在搅拌下缓慢添加沉淀剂(如乙醇、异丙醇和丙酮等)，沉淀剂添加量一般为上清液的1至3倍，去上清液收集多糖沉淀。多糖沉淀可进行高温通风干燥也可以进行冷冻干燥，得到干燥的岩藻多糖。
6.岩藻多糖表征
6.1组成
本发明的岩藻多糖分子量在107至108之间，其中L-岩藻糖占总糖的含量的20％至40％。多糖聚合物中除了含有岩藻糖还有葡萄糖和半乳糖(分别占总糖含量的20％至40％和10％至30％)。岩藻多糖中各组分的比例受发酵时间、培养条件以及控制工艺影响。
此外，本发明的岩藻多糖还含有少量的其它中性糖(＜3％)，如葡萄糖醛酸、甘露糖和鼠李糖等。
6.2分子量
由测定的纯化多糖的分子量在107至108之间。正常发酵工艺条件下，多糖的分子量随着发酵的进行逐渐增大，最后恒定在107至108之间。
本发明其中的一个实施例如下：
实施例
一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，包括以下步骤：
S1，斜面活化：
将-80℃甘油管保存的肠杆菌属细菌接种于活化斜面，于30℃环境下，在斜面培养基中培养12h；斜面培养基的组成如下表1所示：
表1.斜面培养基组成
| 组分 | 浓度 |
| 葡萄糖 | 40g/L |
| 酵母粉 | 10g/L |
| 琼脂 | 15g/L |
S2，种子扩培：
S2.1，一级摇瓶培养：
取活化斜面，接种一环菌苔至种子培养基中，于箱式摇床中30℃、240rpm培养10h；种子培养基的组成如下表2所示：
表2种子培养基组成
| 组分 | 浓度 |
| 葡萄糖 | 30g/L |
| 酵母粉 | 10g/L |
| CaCO3 | 5g/L |
S2.2，二级摇瓶培养：
取一级种子瓶，以1％(v/v)接种量接种至二级种瓶，于箱式摇床中30℃、240rpm培养6h；
S2.3，种子罐培养：
将二级摇瓶培养后的扩培液转入种子罐中培养；
S3，发酵：
在发酵罐中加入发酵培养基，将种子罐中的种子液再转种至发酵罐，进行分批补料发酵，所述发酵过程分为两个阶段即生长代谢阶段和产物代谢阶段，得到发酵液；
转种指标：OD600＝13-14；pH＝5.7-5.9，镜检为典型杆菌如附图2所示；
发酵罐规模：50L通气搅拌式发酵罐；
发酵培养基：见表3；
表3发酵培养基组成
| 组分 | 浓度 |
| 葡萄糖 | 100g/L |
| 酵母粉 | 15g/L |
| CaCO3 | 5g/L |
种量：10％(v/v)；
发酵温度：30℃±0.2℃；
发酵pH：培养基初始pH＝7.0±0.2，接种后pH随着微生物生长代谢降至4.0-4.5，随后pH回升；当生物量不再增长发酵进入产物代谢阶段，pH用20％(w/v)氢氧化钠自控为7.3-7.5直至发酵结束；
罐压：0.05Mpa；
溶氧：生长代谢阶段溶氧控制在20％-30％，产物代谢阶段溶氧控制在5％；
通气量：视溶氧控制在1VVM-2VVM；
搅拌转速：视溶氧控制在200rpm-800rpm；
补料：当溶氧和pH开始回升、发酵体系中葡萄糖消耗殆尽，开始以流加形式补充30％(w/v)葡萄糖溶液，发酵液中葡萄糖浓度控制在1g/L至3g/L之间；
发酵周期：24h结束发酵。
S4，酸水解，测定岩藻糖含量：
取发酵液适当稀释，稀释倍数一般为2至4倍，后加入浓硫酸至硫酸终浓度为1.0mol/L至1.8mol/L，沸水浴30分钟至60分钟，用NaOH中和pH至3.0至8.0，高速离心取上清液，液相测定岩藻糖含量；
如图3所示，发酵24h结束时岩藻多糖浓度为28.7g/L，岩藻糖浓度为8.7g/L，其浓度随发酵进行逐渐升高。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，斜面活化：
将-80℃甘油管保存的肠杆菌属细菌接种于活化斜面，于30℃环境下，在斜面培养基中培养12h；
S2，种子扩培：
S2.1，一级摇瓶培养：
取活化斜面，接种一环菌苔至种子培养基中，于箱式摇床中30℃、240rpm培养10h；
S2.2，二级摇瓶培养：
取一级种子瓶，以1％(v/v)接种量接种至二级种瓶，于箱式摇床中30℃、240rpm培养6h；
S2.3，种子罐培养：
将二级摇瓶培养后的扩培液转入种子罐中培养；
S3，发酵：
在发酵罐中加入发酵培养基，将种子罐中的种子液再转种至发酵罐，进行分批补料发酵，所述发酵过程分为两个阶段即生长代谢阶段和产物代谢阶段，得到发酵液；
S4，酸水解，测定岩藻糖含量：
取发酵液适当稀释，稀释倍数一般为2至4倍，后加入浓硫酸至硫酸终浓度为1.0mol/L至1.8mol/L，沸水浴30分钟至60分钟，用NaOH中和pH至3.0至8.0，高速离心取上清液，液相测定岩藻糖含量。
2.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述斜面培养基组成成分包括葡萄糖、酵母粉和琼脂，所述葡萄糖、酵母粉和琼脂的含量分别为40g/L、10g/L和15g/L。
3.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述一级摇瓶培养的种子培养基组成成分包括葡萄糖、酵母粉和CaCO3，所述葡萄糖、酵母粉和CaCO3的含量分别为30g/L、10g/L和5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述转种指标为OD600＝13-15，pH＝5.7-5.9。
5.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述S3中发酵培养基由碳源、氮源和无机盐的水溶液组成；所述碳源可以是糖类、有机酸或醇类，还可以是食品或工业废弃物或者副产物；所述碳源在发酵培养基中浓度为25g/L-100g/L；所述氮源可以是无机氮源，也可以是有机氮源；所述氮源在发酵培养基中初始浓度应为5g/L-20g/L。
6.根据权利要求5所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基中碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、酵母粉、CaCO3，所述葡萄糖、酵母粉和CaCO3的含量分别为100g/L、15g/L和5g/L。
7.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述S3中发酵培养基初始pH应在6至8之间，发酵第一阶段即生长代谢阶段不控制pH，待此阶段结束时发酵液pH应在3.8至4.5之间，发酵第二阶段即产物代谢阶段，当溶氧和pH开始回升且生物量不再增长后用20％氢氧化钠溶液控制发酵液pH在6.0至8.0之间。
8.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述S3中，当溶氧和pH开始回升、发酵体系中碳源消耗殆尽，开始以流加形式补充碳源，发酵液中碳源浓度1g/L-5g/L。
9.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述S3中，在发酵生长代谢阶段，溶氧控制在20％-30％；在发酵产物代谢阶段，溶氧尽可能控制在5％-10％；溶氧通过通气量和搅拌转速来调控，通气量控制在1VVM-2VVM，搅拌转速控制在50rpm-1000rpm。
10.根据权利要求1所述的一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法，其特征在于，所述S3中发酵温度为30℃±0.2℃，发酵罐压0.05Mpa，发酵周期为24-48h。
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