DE2603599A1 - Verfahren zum immobilisieren von enzymen - Google Patents

Description

" Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen"

Priorität: 1. lebruar 1975, Japan, Nr. 13687/75

Der wichtigste Vorteil von immobilisierten Enzymen liegt in ihrer Möglichkeit zur Wiederverwendung. Ferner eignen sie sich zur kontinuierlichen Durchführung von enzymatischen Reaktionen in Säulen. Ein dritter Vorteil besteht darin, daß sich die Umsetzungen .genau kontrollieren lassen, da die Reaktionsprodukte leicht vom jeweiligen Enzym abgetrennt werden können. Schwierigkeiten, die auf Verunreinigungen der Endprodukte mit dem Enzym oder anderen Produkten zurückzuführen sind, lassen sich bei Verwendung von immobilisierten Enzymen vermeiden. Ferner wird die Stabilität der Enzyme gesteigert, was deren Einsatz erleichtert. Schließlich ermöglichen immobilisierte Enzyme die automatisierte Durchführung von enzymatischen Reaktionen, was zu einer Kostensenkung

führt.

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Es ist daher verständlich., daß bisher zahlreiche Versuche zur Herstellung immobilisierter Enzyme angestellt wurden. Die Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme lassen sich hauptsächlich in folgende drei Gruppen einteilen: Adsorptionsverfahren, Einschlußverfahren und chemisches Bindungsverfahren.

Beim Adsorptionsverfahren werden die Enzyme an der Oberfläche eines unlöslichen Feststoffs adsorbiert und immobilisiert. Die Durchführung ist einfach, jedoch ist die Adsorbierbarkeit der Enzyme so gering, daß sie durch hohe Salz- oder Substratkonzentrationen leicht desorbiert werden. Aus diesem Grund erreicht man durch das Adsorptionsverfahren in der Regel keine zufriedenstellenden Ergebnisse. .Es ist nur anwendbar, wenn Träger mit einer besonders starken Affinität für die Enzymmoleküle zur Verfugung stehen. Gegenwärtig wird hauptsächlich Diäthylaminoäthyicellulose als Träger verwendet.

Beim Einschlußverfahren werden-die Enzyme in Polymergele eingeschlossen. Gegenwärtig werden als Gele Copolymerisate von Acrylamid und ϊΓ,Ν'-Methylen-bis-acrylamid verwendet. Da aber die Enzyme selbst nicht chemisch an die das Gel bildenden Polymerisate gebunden sind, neigen die Enzyme zum Abfließen, wenn das Gelgitter zu groß ist. Bei einer Verkleinerung des Gitters verringert sich aber die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit. Deshalb ist bei derartigen Verfahren die Einstellung der Gittergröße sehr wichtig. .

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Beim chemischen Bindungsverfahren werden die Enzymmoleküle durch Ausbildung kovalenter Bindungen unter Einbeziehung von funktioneilen Gruppen der Enzyme an die Trägeroberfläche gebunden und somit immobilisiert. Durch die chemische Umsetzung wird zwar die Enzymaktivität geringfügig vermindert, jedoch ist die Stabilität der Enzyme ausgezeichnet und der Waschverlust bleibt gering. Aus diesem Grund, stellt das chemische Bindungsverfahren das wirksamste Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen dar. Jedoch gibt es auch bei diesem Verfahren noch eine Reihe ungelöster Probleme. Beispielsweise sind komplizierte Verfahrensschritte und teure Reagenzien notwendig, um die Enzymmo.leküle an die Trägeroberfläche chemisch zu binden. Häufig müssen dazu drastische Reaktionsbedingungen angewendet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Umsetzungen kann eine Einteilung in folgende vier Verfahrensarten vorgenommen werden: (A) Ausbildung von Peptidbindungen, (B) Alkylierung, (C) Diazo-Kupplung und (D) Bildung einer Schiff-Base.

Unter das Verfahren (A) fallen beispielsweise die Bildung von Azid-, Isocyanat-, Carbodiimid- oder Iminocarbonatgruppen am Träger und die anschließende Umsetzung dieser Gruppen mit Aminogruppen der Enzyme.

Bei den Verfahren gemäß (B) werden beispielsweise die Hydroxylgruppen von Cellulose unter Verwendung von Cyanurchlorid aktiviert.

Gemäß ,(D) können beispielsweise Aminoalkylsilane an die Ober-

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flächen von porösen Glaskörnern gebunden werden. Anschließend wird unter Verwendung von Glutaraldehyd das Schiff-Salz gebildet. Da die Bildung des Schiff-Salzes jedoch eine Gleichgewichtsreaktion ist, werden die Enzyme wie beim Adsorptionsverfahren allmählich freigesetzt. ^

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß bei den herkömmlichen Verfahren komplizierte Verfahrensschritte, aufwendige Reagenzien und die genaue Einhaltung bestimmter Reaktionsbedingungen notwendig sind, um den Träger zu aktivieren.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und billiges Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen zur Verfugung zu stellen, bei dem die vorgenannten Nachteile vermieden werden und eine feste Bindung der Enzyme an den Träger gewährleistet ist.

Diese Aufgabe wird durch die Umsetzung der Enzyme mit einem einen Halogenamidrest enthaltenden Produkt gelöst.

Es ist bekannt, daß N-Halogenamide als Zwischenprodukte beim Hoffmann-Abbau von Säureamiden gebildet werden. Beim Hoffmann-Abbau wird ein Säureamid unter stark alkalischen Bedingungen mit Hypohalogenitionen (OX"") umgesetzt. Dabei wird nach folgender Reaktionsgleichung ein N-Halogenamid und dann ein Amin gebildet:

OX" ' stark alkalisch R-CONH₂ ^ R-CONHX > -R

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Bezüglich des Hoffmann-Abbaus wurden zahlreiche Untersuchungen über die Beziehung zwischen der chemischen Struktur der Amide und der Aminausbeute durchgeführt. Bisher liegen jedoch keine Versuche über die chemische Reaktivität der als Zwischenprodukte auftretenden N-Halogenamide in wäßriger Lösung vor. Bei Untersuchungen über die N-Halogenierung von verschiedenen Amiden wurde überraschenderweise festgestellt, daß N-Halogenamidreste unter schwach alkalischen Bedingungen nur langsam in die entsprechenden Amine umgewandelt werden. Die N-Halogenamidreste reagieren vielmehr mit Gruppen, die aktive Wasserstoffatome enthalten, wie NHp-, OH- und -CONHp-Gruppen, wobei beispielsweise

Ureide, Urethane oder Acylharnstoffe gebildet werden.

OX" alkalisch (Ureid)

_R_C0NH, ^ R-CONHX - ^R'-°^H - R-NHCOÖR«

^ (Urethan) R'-CONH₂ R-NHCONHCOR'

(Acylharnstoff)

Es wurde festgestellt, daß N-Halogenamidreste besonders auf Aminogruppen reagieren und auch bei milden Reaktionsbedingungen, beispielsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und einer Temperatur von 30 bis 4O⁰C, sehr reaktiv sind.

Erfindungsgemäß erhält man stabile, immobilisierte Enzyme durch Umsetzung eines Enzyms mit einem einen N-Halogenamidrest enthaltenden Produkt in einer schwach alkalischen, wäßrigen Lösung.

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Als Produkte mit M-Halogenamidresten eignen sich wasserlösliche, niedermolekulare, mehrwertige Halogenamide (im folgenden als Produkt A bezeichnet), wasserlösliche, hochmolekulare, mehrwertige Halogenamide (im folgenden als Produkt B bezeichnet) und feste Träger mit N-Halogenamidresten (im folgenden, als Produkt C bezeichnet). Die Produkte A, B und C lassen sich folgendermaßen herstellen.

Herstellung von A

Diese Verbindungen werden erhalten, indem man Verbindungen mit mehreren Amidgruppen, beispielsweise Amide von Polycarbonsäuren, wie Adipinsäureamid und Bernsteinsäureamid, carbamoylisierte, mehrwertige Alkohole und carbamoylisierte Zucker, an den Stickstoffatomen halogeniert.

Beispiele für mehrwertige Alkohole, die der Carbamoylisierung unterworfen werden können, sind Glycerin, Polyäthylenglykol und Polypropylenglykol. Beispiele für entsprechende Zucker sind Glucose, Fructose, Saccharose, Pentaerythrit, Sorbit und Mannit.

Die Halogenierung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise lassen sich N-Halogenamide durch Umsetzung eines Amids mit einem Hypohalogenit, wie Natriumhypochlorit bei einer Temperatur von -10 bis 5⁰C herstellen. Die Carbamoylisierung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise erhält man carbamoylisierte, mehrwertige Alkohole oder Zucker, indem man die mehrwertigen Alkohole oder Zucker mit Acrylnitril

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.umsetzt und anschließend das erhaltene Reaktionsgemisch mit Wasserstoffperoxid behandelt.

Herstellung von B

Die Verbindungen B werden hergestellt, indem man wasserlösliche, mehrwertige Alkohole carbamoylisiert und anschließend auf die vorgenannte Weise halogeniert.

Beispiele für entsprechende mehrwertige Alkohole sind Cellulose, Stärke, Agar, Alginsäure, Konjak (Asafoetida) und Polyvinylalkohole. Ferner eignen sich Homopolymerisate und Pfropfpolymerisate von Acrylamid oder Methacrylamid oder deren Copolymerisate mit anderen polymerisi.erbaren Yinylpolymerisaten als Carbamoylverbindungen.

Herstellung von C

Feste' Träger mit Halogenamidresten werden durch Carbamoylisierung und Halogenierung eines entsprechenden festen Materials hergestellt.

Als Ausgangsmaterial können alle natürlichen oder synthetischen Produkte verwendet werden, die sich carbamoylisieren lassen. ■Beispiele dafür sind Cellulose, Holzprodukte, wie Pulpe, Wolle, Seide, Baumwolle, Polymerisate, wie Nylon, Polyvinylalkohol, schwach basische Anionenaustauscherharze, wie Diaioh CR-20 (Handelsbezeichnung der Firma Mitsubishi Chemical Industries'Ltd.).

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Diese festen Produkte können in beliebiger Form vorliegen,
beispielsweise als Pulver, Granulat, Pasern, Gewebe, Membranpapier oder Platten. Besonders bevorzugt sind hydrophile und poröse, aber nicht steife Träger, da die enzymatischen Reaktionen im allgemeinen in wäßrigen Lösungen durchgeführt werden und somit der hydrophile Träger die Diffusion des Substrats und die Wechselwirkung zwischen Substrat und Träger nicht beeinträchtigt. Stärker hydrophile Träger führen zu einer größeren Stabilität der immobilisierten Enzyme. Durch die Verwendung von porösen
Trägern wird die Oberfläche der Träger und somit die Menge an gebundenem Enzym größer. Relativ weiche Träger wie Cellulose, werden gegenüber starren Trägern, wie Glas, bevorzugt, um eine Deformation der Enzymmoleküle zu verhindern und eine höhere
Stabilität der Enzyme zu gewährleisten.

Die Immobilisierung der Enzyme mit den N-Halogenamidreste aufweisenden Produkten wird bei Temperaturen von -10 bis 50⁰O,
vorzugsweise 15 bis 4O⁰G, bei -einem pH-Wert von 8 bis 11 in einer wäßrigen Enzymlösung durchgeführt.

Die R-HaIogenamidgruppen vernetzen dabei mit den Aminogruppen der Enzyme, wodurch die Enzyme immobilisiert werden.

Bei Verwendung von B reagiert der N-Halogenamidrest mit den beim Hoffmann-Abbau teilweise gebildeten Aminogruppen. Es ergibt sich somit nach folgender Reaktionsgleichung eine Kondensation und Gelbildung unter den N-Halogenamidgruppen selbst.

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CONHX + NH₂ > NHCONH

Gleichzeitig reagieren die N-Halogenamidgruppen mit Aminogruppen des Enzyms.

In diesem Fall wird das Enzym physikalisch und chemisch immobilisiert.

Die Stärke des Gels und die Gittergröße kann je nach der Art der polymerisieren, mehrwertigen Halogenamide, der Konzentration und der Dichte der Halogenamidreste eingestellt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können gereinigte oder rohe Enzyme, Enzymgemische oder Enzymsysteme tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs innerhalb dieser Organismen oder nach Isolation immobilisiert werden. Es können ganze Zellen, intakte intrazelluläre Teilchen oder rohe Enzymextrakte verwendet werden.

Beispiele für entsprechende Enzyme sind proteolytische Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin und Papain, Hydrolasen, wie <*-Amylase, Invertase, ^-Galactosidase, Ribonuclease, alkalische Phosphatase, Amyloglucosidase, und Dextranase, Dehydrogenasen, wie Creatin-Phosphorkinase und Pyruvatkinase, Oxidasen,- wie Glucose-Oxidase, und Amidasen, wie Amidase und Penicillin-Amidasen.

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Die Konzentration der Enzymlösungen unterliegt keinen Beschränkungen, jedoch werden Lösungen mit einer Enzymkonzentration von 0,01 bis 10 Prozent bevorzugt.

Bei der erfindungsgemäßen Immobilisierung ist der Enzymverlust sehr gering, da die Immobilisierungsreaktion in einer wäßrigen Enzymlösung unter sehr milden Reaktionsbedingungen durchgeführt wird.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen immobilisierten Enzyme sind gegen Waschen sehr stabil. Beispielsweise zeigt immobilisierte «-Amylase, die kovalent an N-Chlorcarbamoyläthyl-Pulpe, die durch.CarbamoyläthyIierung von Pulpe und anschließende IT-Chlorierung hergestellt worden ist, eine ausgezeichnete Stabilität gegen Waschen; vgl. Tabelle I von Beispiel

In Tabelle I ist zu Vergleichszwecken auch die Stabilität von durch Adsorption an Kationen-Pulpe, die aus dem gleichen Pulpenmaterial hergestellt worden ist, immobilisierter σί-Amylase angegeben.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

140 ml einer 1,0 prozentigen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid und 5j3 g (0,1 Mol) Acrylnitril werden zu 21 g (0,1 Mol) handelsüblicher Hydroxyäthylcellulose (HAC) gegeben. Das Gemisch wird

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60 Minuten unter Rühren bei 5O⁰C umgesetzt. Anschließend werden 23 g (0,2 Mol) einer 30 prozentigen lösung von Wasserstoffperoxid in zwei oder drei Portionen zugegeben. Die lösung wird 90 Minuten bei 20⁰C umgesetzt. Die Umsetzung läßt sich durch folgende Gleichung erläutern:

Acryl- 2H₉O₉ Φ

nitril ^{d ά} \

CeIl-OH > CeIl-O-CH₂-CH₂ > CeIl-O-CH₂-CH₂ + 0_£

Alkali CN COM₂

(HÄC) (Cyanoäthyl-HÄC) (Carbamoyläthyl-HÄC)

Die erhaltene wäßrige lösung von Carbamoyläthyl-HÄC wird mit Wasser auf das zweifache Volumen verdünnt. 10 g (0,0027 Mol in bezug auf die Carbamoyigruppe) der verdünnten Carbamoyläthyl-HÄC-lösung werden mit 2,7 ml (0,0027 Mol) 1 m wäßriger Natriumhypochloritlösung versetzt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 0 bis 2 C N-chloriert und anschließend mit 1 η Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9 neutralisiert. Die erhaltene lösung wird mit 2,0 ml einer wäßrigen «-Amylaselösung mit einem Gehalt von 250 mg/100 ml versetzt. Anschließend wird das Gemisch gründlich gerührt, langsam auf 3O⁰C erwärmt und sodann 20 Minuten stehengelassen. Man erhält <tf-Amyläse, die im Gel von Carbamoyläthyl-HÄC immobilisiert ist. Dieses Enzym ist nicht nur physikalisch immobilisiert, sondern auch chemisch an die HÄC-Ketten gebunden, so daß es auch bei wiederholtem Waschen nicht ausgewaschen wird.

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Beispiel.2

10,0 g (0,007 Mol) einer 5 prozentigen wäßrigen Lösung von Polyacrylamid werden mit 2,9 ml (0,0056 Mol) einer 2 m wäßrigen Natriumhypοchloritlösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei -5 "bis O⁰C N-chloriert und anschließend mit 1 η Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9 neutralisiert. Anschließend werden 2,0 ml einer wäßrigen Oi-Amylaselösung mit einem Gehalt von 250 mg/100 ml zugegeben. Nach gründlichem Rühren wird das erhaltene Gemisch langsam auf 30⁰C erwärmt und 20 Minuten stehengelassen. Man erhält im Polyacrylamidgel immobilisierte cK-Amylase. Auch hier tritt nicht nur eine physikalische Immobilisierung, sondern auch eine chemische Bindung an die Polyacrylamidkette ein, so daß das Enzym auch bei wiederholtem Waschen nicht ausgewaschen wird.

Beispiel 3

5,0 g Acrylnitril werden in 250 ml einer 0,5 prozentigen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid gelö-st. In die erhaltene Lösung werden 16,2 g (0,1 Mol) Pulpe eingebracht. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 50 C umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch abfiltriert. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und in 200 ml einer 0,5 prozentigen wäßrigen Natriumhydroxidlösung, die 5,0 ml 30 prozentiges Wasserstoffperoxid enthält, gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 2O⁰C umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch abfiltriert. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen. Man erhält Carbamoyläthyl-Pulpe. 1,0g dieser Carbamoyläthyl-Pulpe wird in 100 ml V/asser dispergiert. Sodann werden 2,0 ml

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wäßrigen
einer 1 m/ Natriumhypochloritlösung zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0 bis 2⁰C H-chloriert. Nach beendeter Umsetzung wird die Pulpe gründlich mit Eiswasser gewaschen und anschließend -in 100 ml 0,1 m CaIciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg <X-Amylase enthält, eingebracht. Zur Immobilisierung des Enzyms wird das Gemisch 3 Stunden bei 4O⁰G umgesetzt. Die Beständigkeit des so immobilisierten Enzyms gegen Waschen wird untersucht (Versuch 1). Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Die Enzymaktivität wird in mg Amylase angegeben, d.h. dem Volumen (ml) einer 0,1 prozentigen Amylaselösung, die die blaue Jodfarbe (Blauwert) innerhalb von 30 Minuten bei 3O⁰C um 10 Prozent vermindert.

Das Waschen wird durchgeführt, indem man 100 mg immobilisiertes Enzym in 150 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer 30 Minuten bei 3O⁰C heftig rührt.

Zu Vergleichszwecken wird die Stabilität eines durch Adsorption an einer Kationen-Pulpe immobilisierten Enzyms festgestellt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I (Versuch 2) angegeben. Die Kationen-Pulpe wird hergestellt, indem man die Carbamoyläthyl-Pulpe auf die vorgenannte V/eise N-chloriert und anschließend chemisch an Polyäthylenimin (Polymerisationsgrad 100) bindet.

Die Aktivität des erfindungsgemäß immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht vermindert.

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-H-

Tabelle I

Enzymaktivität (mg)

Anzahl der Waschvorgänge	Versuch 1	Versuch 2
0	300	470 v
1	260	390
2	255	330
3	255	280
4	255	240
10	255	148

Beispiel4

1 ,44 g (10 mMb1) Adipinsäureamid werden mit 50 ml Wasser und 10 ml (20 mMol) 2 m wäßriger Natriumhypochloritlösung versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 60 Minuten H-chloriert. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit 1,2 g (20 mMol) Aceton versetzt. Anschließend wird die Lösung mit Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9,0 eingestellt.'Die erhaltene lösung wird mit 30 ml einer 1 prozentigen Enzymlösung (α-Amyläse, Papain, Trypsin oder Invertase) versetzt. Die Lösung wird 50 Minuten bei 18⁰C stehengelassen, um das immobilisierte Enzym auszufällen. Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht vermindert.

Beispi.el 5

6,8 g (0,05 Mol) Pentaerythrit, 10,& g (2 mMol) Acrylnitril und 0,4 g Natriumhydroxid werden zu 7,0 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 50⁰C stehengelassen und zum Abtrennen von

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öligen Produkten in der unteren Phase in einen Scheidetrichter gegeben. Die öligen Produkte werden 3 Stunden bei 20⁰C mit einer Lösung von 100 g (0,88 Mol) 30 prozentigem Wasserstoffperoxid " in einer 0,1 η !Tatriumhydroxidlösung hydrolisiert. Durch Zusatz von Aceton erhält man 16,8 g Tetracarbamoyläthy !pentaerythrit (80 io der Theorie).

4,2 g (10 mMol) dieses Produkts werden mit 50 ml Wasser und 10 ml einer 2 m wäßrigen Lösung von Natriumhypochlorit versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 60 Minuten N-chloriert. Anschließend werden 1,2 g (20 mMol) Aceton zugegeben. Sodann wird das Gemisch mit Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 9,0 gebracht und mit 100 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg «X-Amylase enthält, versetzt. Das Gemisch wird 50 Minuten bei 25°C umgesetzt. Man erhält die immobilisierte <*-Amylase als weißen Niederschlag. Die Aktivität dieser immobilisierten <*-Amylase wird auch'durch wiederholtes Waschen nicht vermindert.

Beispiel 6

2 g Cellulose-Pulpe werden mit 70 ml Wasser, 187 mg Cernitrat, 0,7 ml 1 η Salpetersäure und 0,5 g Acrylamid versetzt. Sodann wird das Gemisch eingefroren und entlüftet. Nach zweimaliger • S.tickstoffverdrängung wird das Gemisch 10 Minuten bei 35°C der Pfropfpolymerisation unterworfen. Die Homopolymerisate von Acrylamid werden durch Waschen mit Wasser entfernt. Die Cellulose-Pulpe weist ein Acrylamid-Propfverhältnis von 7,9 Prozent auf.

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1 g dieses Pfropfpolymerisats wird mit 100 ml einer 0,5m wäßrigen Hatriumhypoehloritlösung versetzt. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 30 Minuten ΪΊ-chloriert und anschließend viermal mit einer 10 prozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung von O⁰C gewaschen. Das erhaltene Polymerisat wird in 100 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer vom pH-Wert 8,10, der 100 mg &-Amyläse enthält, eingebracht. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 2O⁰C umgesetzt. Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht vermindert.

Beispiel 7

6j46 g (20 mMol) Diaion CR-20 (schwach basisches Anionenaustauscherharz) werden mit 14,0 g (200 mMol) Acrylamid und 20 ml 0,1 η Natriumhydroxid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 40⁰C der Carbamoyläthylierung der Aminogruppen des Harzes unterworfen. Das nicht umgesetzte Acrylamid wird durch Waschen mit Wasser entfernt. Man erhält 8,40 g carbamoyläthyliertes Anionenaustauscherharz (100 fo der Theorie).

1,0g dieses carbamoyläthylierten Anionenaustauscherharzes werden mit 10 ml einer 0,5m wäßrigen Lösung von Katriumhypochlorit versetzt. Das Gemisch wird 60 Minuten unter Eiskühlung N-chloriert. Fach beendeter Umsetzung wird das Harz gründlich mit Eiswasser gewaschen und anschließend in 100 ml 0,1 m Calciumacetatpuffer vom pH-V/ert 8,10, der ,100 mg W-Amylase enthält, eingebracht. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Man erhält ein an das Harzgranulat gebundenes, immobilisiertes Enzym.

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Die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms wird auch durch wiederholtes Waschen nicht vermindert.

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Claims (11)

1. Patentansprüche

   Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym mit einem einen Halogenamidrest enthaltenden Produkt umsetzt. \
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man o(-Amylasej Papain, Trypsin oder Invertase umsetzt. ■
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung mit Chloramidgruppen · verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in Wasser lösliche, mehrwertige Halogenamidverbindung verwendet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein festes Material mit Halogenamidresten verwendet.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch geken η zeichnet, daß man eine Verbindung verwendet, die durch Umsetzung eines wasserlöslichen,, mehrwertigen Amids mit ITatriumhypochlorit erhalten worden ist.

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7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit Adipinsäureamid, Tetracarbamoyläthylpentaerythrit, Carbamoyläthyl-hydroxyäthylcellulose oder Polyacrylamid vorgenommen worden ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein schwach basisches Anionenaustauscherharz mit Halogenamidresten verwendet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, d adurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7 bis 11 durchführt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennze ichnet, daß man die Umsetzung bei Temperaturen von -10 bis 50⁰C durchführt.
11. 11. Immobilisiertes Enzym, herstellbar gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1.

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