DE2246002A1

DE2246002A1 - Wasserunloesliches enzympraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur durchfuehrung biotechnischer reaktionen

Info

Publication number: DE2246002A1
Application number: DE2246002A
Authority: DE
Inventors: Antoon Gerardus Van Velzen
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1971-09-24
Filing date: 1972-09-20
Publication date: 1973-04-05
Also published as: CA1020894A; AU4691672A; AU466296B2; IT1004527B; CH612444A5; BE789195A; US3838007A; DE2246002C3; GB1404933A; JPS5218794B2; NL7212445A; FR2153443B1; DE2246002B2; ZA726435B; NL152562B; FR2153443A1; JPS4839687A

Description

Verwendung dieser Präparate in Säulenreaktoren und Reaktoren mit Ruheschicht werden im allgemeinen nur sehr niedrige Strömungsgeschwindigkeiten erreicht. In Enzymreaktoren mit Rührwerk wird das Enzympulver leicht durch Abriet» beschädigt. Fließbettreaktoren können ebenfalls nur mit sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten verwendet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, wasserunlösliche Enzympräparate in Teilchenform einstellbarer Größe zu schaffen, die zum Beispiel als Füllung in Säulenreaktoren, als Ruheschicht in Reaktoren oder in Reaktoren mit Rührwerk verwendet werden können, und die die vorgenannten Nachteile nicht aufweisen. Die Verwendung von Enzymen in Teilchenform mit einstellbarer Größe hat den Vorteil, daß sie als Füllmaterial besser geeignet sind, da zum Beispiel Teilchen in kugeliger Form höhere Strömungsgeschwindigkeiten gestatten als unlösliche Enzyme ip Pulverform. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Der Ausdruck nicht-proteolytisches Enzym bedeutet ein Enzym, das keine Hydrolyse des gelbildenden Proteins bewirkt. Der Ausdruck bifunktionelles oder polyfunktioneiles Vernetzungsmittel bedeutet eine Verbindung, die Proteinmoleküle, zum Beispiel die vorgenannten Enzyme und gelbildenden Proteine vernetzen kann. Der Ausdruck gelbildendes Protein bedeutet ein Protein, das in wäßriger Lösung durch eine spezielle Behandlung, sum Beispiel durch Abkühlen bei Verwendung von Gelatine oder durch Erwärmen bei Verwendung von frischem Eiklar, in einen festen oder halbfesten Zustand überführt werden kann.

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Das Enzympräparat der Erfindung kann eine beliebige Teilchenform haben, zum Beispiel eine kugelige oder nahezu kugelige !Form. Die Teilchen können jedoch auch in Form von zum Beispiel Fasern, zum Beispiel extrudierten Pasern oder Folien oder als Auskleidung von Behältern oder als imprägniertes Gewebe oder Papier vorliegen. Im allgemeinen bedeutet der Ausdruck Teilchenform eine Form des Enzympräparats von definierter eingestellter Größe. Das gelbildende Protein, das vorzugsweise Gelatine ist, bringt nicht nur das Enzym in eine wasserunlösliche Teilchenform einstellbarer Größe, sondern es stabilisiert auch das Enzym.

Wenn auch die Vernetzung von Enzymen mit bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmitteln bekannt ist und ferner der Einschluß von Enzymen in ein unlösliches Gel aus zum Beispiel Polyacrylamid bekannt ist, so ist es neu, das Enzym mit einem gelbildenden Protein in Teilchenform zu überführen und das Gemisch in Teilchenform mit einem bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmittel für Proteine zu vernetzen.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Enzympräparat ist besonders geeignet zur Füllung von Säulen und Reaktoren, zum Beispiel Reaktoren mit Ruheschicht für* enzymatische Reaktionen, insbesondere solche Reaktionen, bei denen das Endprodukt nicht das verwendete Enzym enthalten darf, wie die Umwandlung von Kohle-üiydraten, wie Zucker -., .ir, andere Produkte.

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Das Gemisch aus dem nicht-proteolytischen Enzym und dem gelbildenden Protein kann zwar auch durch Sprühtrocknung- oder Prill-Verfahren erhalten werden. Vorzugsweise wird es jedoch dadurch hergestellt, daß man das nicht-proteolytische Enzym in einer wäßrigen Lösung des gelbildenden Proteins löst oder suspendiert und dieses Gemisch mit einer organischen Flüssigkeit, die mit Wasser schlecht oder nicht mischbar ist, in solcher Weise versetzt, daß Teilchen entstehen. Danach wird die erhaltene Teilchensuspension derart behandelt, daß das gelbildende Protein geliert, zum Beispiel durch Abkühlen bei Verwendung von Gelatine. Das Zusammenbringen des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein mit der organischen Flüssigkeit kann zum Beispiel durch Vermischenunter kontrolliertem Bewegen oder durch Versprühen des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein submers in die organische Flüssigkeit erfolgen. Das letztgenannte Verfahren wird zum Beispiel in einer senkrechten Säule durchgeführt, in der die gebildeten Teilchen nach abwärts in die organische Flüssigkeit wandern, die das Vernetzungsmittel enthalten kann.

Die Vernetzung des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein kann durch Abtrennung des teilchenförmigen Gemisches von der organischen Flüssigkeit und Behandlung mit dem bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmittel erfolger Man kann das teilchenförmige Gemisch auch in Suspension in der

organischen Flüssigkeit mit dem Vernetzungsmittel behandeln. Als Enzyme werden im erfinclungsgemäfien Vorfahren solche verwen-

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det, die keine proteolytische Aktivität besitzen, da andernfalls das gelbildende Protein selbst nach, der Vernetzung zersetzt wird und physikalisch instabile Produkte erhalten werden. Beispiele für geeignete nieht-proteolytische Enzyme, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Invertasen, Amyloglucosidasen, Lactasen, Maltasen, Amylasen, Ureasen, Lipasen, Esterasen, Glucoseisomerasen, Glucoseoxidasen, Dehydrogenasen und Penicillinasen, Es können auch Gemische von Enzymen verwendet werden, so daß das erfindungsgemäß erhaltene Enzympräparat zur Durchführung von zwei oder mehr enzymatisehen Reaktionen verwendet werden kann. Ferner können unlösliche Enzyme verwendet werden, zum Beispiel wenn sie in einer ungünstigen Form, zum Beispiel als Pulver, vorliegen« Es können auch Mikroorganismen und Spuren, die in derartigen nicht-proteoly-

sind,/

tische Enzyme enthalten/ im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ferner können Komplexe von Enzymen und hydratisierten Oxiden, zum Beispiel hydratisiertem Aluminiumoxid, verwendet werden.

Das Gemisch aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein kann durch Auflösen oder Suspendieren des Enzyms in einer wäßrigen Lösung des gelbildenden Proteins hergestellt werden. Die Temperatur der wäßrigen Lösung des gelbildenden Proteins soll auf einen solchen Wert eingestellt werden, "daß ein aktives Gemisch erhalten wird, das in flüssiger Form vorliegt. Vorzugsvieise beträgt die Temperatur etwa 20 bis 35⁰G. Die Maximaltemperatur hängt natürlich von der Teiaperaturempfindlichkeit des Enzyms ab. Im allgemeinen beträgt sie et v/a 60 bis G5°C, in Ausnahme-

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fällen liegt sie noch höher.

Bei Verwendung von Gelatine als gelMldendes Protein hängt die Gelatinekonzentration von der Art der Gelatine ab. Im allgemeinen beträgt die Konzentration etwa 0,1 bis etwa 25, vorzugsweise etwa 5 bis 10 Gewichtsprozent, bezogen auf das.Wasser. Die Enzymkonzentration hängt vom Verwendungszweck des Enzympräparats sowie der Aktivität des Enzyms ab. Der pH-Wert der Lösung wird vorzugsweise auf einen solchen Wert eingestellt, bei dem das Enzym seine größte Stabilität unter den herrschenden Umständen besitzt. Da auch Gelatine vorliegt, soll der pH-Wert innerhalb eines Bereiches von etwa 2 bis 12, vorzugsweise 3 "bis 10 liegen, damit die Gelatine gelieren kann. Bei Verwendung anderer gelie*- render Proteine kann der pH-Bereich verschieden sein.

Während der Herstellung des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein können auch Stabilisatoren zugesetzt werden, die zusätzlich zu dem gelbildenden Protein das Enzym stabilisieren. Beispiele für geeignete Stabilisatoren sind Sorbit und Glycerin oder Substrate für die jeweils verwendeten Enzyme, zum Beispiel Lactose für Lactase.

Die organische Flüssigkeit, die zur Herstellung der Teilchen aus der wäßrigen Lösung des Enzyms und des gelbildenden Proteins verwendet wird, ist eine mit Wasser schlecht oder nicht mischbare Flüssigkeit, die mit dem nicht-proteolytischen Enzym und dem gelbildenden Protein verträglich ist. Die Temperatur der Flüssißkeit coil unterhalb ihres Siedepunktes oder üiede-

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bereiches bei dem angewandten Druck und im allgemeinen bei einem Wert unterhalb etwa 65°C liegen. Beispiele für geeignete organische Flüssigkeiten sind aliphatische Alkohole mit mindestens 4- Kohlenstoffatomen, wie Butanol, Fettsäureester von Alkoholen, wie Äthylacetat, Butylacetat und-Äthylpropionat, unverzweigte oder verzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Paraffinöl und Petroläther, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und seine Homologen, chlorierte Kohlem^asserstoffe, wie Methylenchlorid und Irichloräthylen, sowie Gemische aus mindestens zwei dieser Lösungsmittel. .

Der organischen Flüssigkeit können eine oder mehrere grenzflächenaktive Verbindungen einverleibt werden, da hierdurch eine bessere Steuerung des Dispersionszustandes der herzustellenden Suspension aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein in der organischen Flüssigkeit möglich wird. Als grenzflächenaktive Verbindungen kommen solche Verbindungen infrage, die für ähnliche Zwecke verwendet werden. Es können anionaktive, nichtionische , kationaktive oder zwitterionische grenzflächenaktive Verbindungen sein.

Beim Zusammenbringen des wäßrigen Gemisches aus dem Enzym und . dem gelbildenden Protein mit der organischen Flüssigkeit kann die Art des Bewegens bzw. Rührens und der Abkühlvorgang (bei Verwendung von Gelatine) der erhaltenen Suspension von solcher Art sein, daß eine Zerteilung das wäßrigen Gemisches aus dem Enzym und dem gel ildenden Protein zu Teilchen gewünschter Größe erreicht wird. Die Größe der Teilchen hängt von der Inten-

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sität der Bewegung, dem Unterschied des spezifischen Gewichts der Flüssigkeiten, der Oberflächenspannung und der Viskosität der Flüssigkeiten und in einigen Fällen von der Geschwindigkeit der Abkühlung, der Temperatur und der Konzentration der eingesetzten wäßrigen Lösung oder Suspension des Enzyms und gelbildenden Proteins ab. Im allgemeinen genügt Rühren. Es können jedoch auch andere Maßnahmen zur Ausbildung der Suspension verwendet werden, zum Beispiel das Einsprühen des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein in die organische Flüssigkeit. Das Abkühlen des Gemisches aus dem Enzym und der Gelatine in der organischen Flüssigkeit zum Beispiel auf Temperaturen von etwa 1O⁰C oder darunter oder sogar auf Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes dieses Gemisches kann gleichzeitig mit der Bildung der Suspension des Gemisches in der organischen Flüssigkeit oder danach erfolgen. Das Abkühlen kann rasch oder langsam durchgeführt werden.

Die Vernetzungsreaktion kann mit einer der vorgenannten bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmittel für Proteine durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine wäßrige Lösung von Glutardialdehyd verwendet. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Teilchen aus dem Enzym und dem gelbildenclen Protein in einer gesonderten Stufe entwässert. Beispiele für geeignete Entv/ässerungsmittel sind Fliir¹^- keiten mit hoher Löslichkeit in Wasser oder wasserrischbare Flüssigkeiten. Sie müssen mit dem Enzym verträglich sein, spezielle Beispiele für derartige Flüssigkeiten sind Alkohole mit, bis zu 3 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol oder Isopro-

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panol, oder Aceton oder ein Gemisch, aus diesen Lösungsmitteln.

Das Vernetzungsmittel kann entweder dieser Flüssigkeit zugesetzt oder den Teilchen nach der Entwässerungsstufe einverleibt werden. Die Entwässerungsstufe kann vor oder nach der Abtrennung der Teilchen von der organischen Suspendierflüssigkeit· durchgeführt werden. Durch die Entwässerung wird die Größe der Teilchen aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein vermindert, und gleichzeitig wird eine verbesserte Vernetzung erhalten, wenn diese geschrumpften Teilchen in eine wäßrige Lösung des Vernetzungsmittels eingetragen werden, da die entwässerten Teilchen quellen können.

Dem im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Gemisch aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein, können noch unlösliche Füllstoffe einverleibt werden. Diese verbessern die physikalischen Eigenschaften des fertigen Enzympräparats. Beispiele für geeignete unlösliche Füllstoffe sind feinzerteilte Silikate oder Kieselsäuren, wie Ketjensil , Hy-flo , Dicalite , Diatomeenerde und Perlit.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Enzympräparat wird vorzugsweise noch gewaschen. Beispiele für geeignete ■tffaschflüssigkeiten sind V/asser oder Pufferlösungen, deren pH-Wert von der Art des verwendeten Enzyms abhängt. Im allgemeinen ist eine Trocknung des erhaltenen Enzympräparats nicht erforderlich, jedoch kann in besonderen Fällen eine Trockenstufe vorgesehen sein. Für spezielle Anwendungszwecke kann die Vernetzungsreak-

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tion wiederholt werden, um Enzympräparate mit optimalen physikalischen Eigenschaften zu erhalten.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete gelMldende Protein, zum Beispiel Gelatine, ist ein Polyelektrolyt, der möglicherweise das pH-Optimum des Enzyms beeinflußt, d.h. den pH-Wert bzw. -Bereich, bei dem das Enzym seine höchste Aktivität entfaltet. Das Enzympräparat der Erfindung kann noch andere Verbindungen enthalten, die das pH-Optimum des Enzyms beeinflussen, zum Beispiel andere Polyelektrolyte, vorzugsweise Protaminsulfat oder Polyacrylsäure, wodurch das pH-Optimum des Enzympräparats auf seinen Verwendungszweck eingestellt wird. Das Enzympräparat der Erfindung kann zur Durchführung biotechnischer Reaktionen, zum Beispiel in Säulen, Kolonnen oder Reaktoren, verwendet werden. Es läßt sich leicht aus dem Reaktionsgemisch abtrennen und kann wiederholt verwendet werden. Das Enzympräparat der Erfindung kann im allgemeinen in allen Verfahren eingesetzt werden, bei denen lösliche" Enzyme benutzt werden. Beispielsweise kann ein Invertase enthaltendes Enzympräparat der Erfindung zur Inversion von Rohrzucker, ein Amyloglucosidase enthaltendes Enzympräparat zur Hydrolyse von Stärke und Dextri-r nen, zum Beispiel zur Bierherstellung, verwendet werden. Ferner können die wasserunlöslichen Enzympräparate der Erfindung in solchen Fällen eingesetzt werden, bei denen lösliche Enzyme nicht verwendet werden können. Während ihrer Verwendung können die Enzympräparate der Erfindung durch Mikroorganismen unterminiert werden. Durch Behandlung der Enzympräparate mit den vorgenannten Vernetzungsmitteln können sie jedoch wieder sterili-

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-V-

siert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

2 g Invertase werden bei einer Temperatur von etwa 45°C in 100 ml einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 7»5 g Gelatine enthält. Der pH-Wert wird auf 7 eingestellt. Die erhaltene Suspension wird unter Rühren und bei einer Temperatur von 50⁰C in 400 ml n-Butanol gegeben. Die erhaltene Suspension wird rasch auf 10⁰C abgekühlt, wobei sich Teilchen bilden. Das Butanol wird dekantiert und die enzymhaltigen Gelatineteilchen werden durch Zusatz von 400 ml 96prozentigem Äthanol entwässert. Anschließend wird die Flüssigkeit abgetrennt. Die erhaltenen Teilchen werden mit einer Lösung von 3,75 g Glutardialdehyd in 200 ml Wasser versetzt und vernetzt. Nach dem Abtrennen der Flüssigkeit werden die Teilchen mit Wasser butanolfrei gewaschen. Die erhaltenen Teilchen haben eine gute mechanische Festigkeit und sind in Wasser unlöslich.

Die hergestellten Teilchen werden zur Inversion von Rohrzucker verwendet. Ein Plug-flow-Säulenreaktor mit einer Hohe von 22 cm und einem Durchmesser von 4 cm wird mit den Teilchen gefüllt. Dann wird eine lOgewichtsprozentige wäßrige Rohrzuckerlösung vom pH-Verb 4,5 durch den Reaktor mit verschiedener Strömungsgeschwindigkeit; hlndurchgeleitet. Die Menge des invertierten Rohrzuckers wird aus dom Glucocegehalb dor abströmenden Flüssigkeit berechnet und wird aungodrückt in Prozent umgewandolten

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Rohrzuckers. Die prozentuale Umwandlung nimmt mit zunehmender Strömungsgeschwindigkeit ab. Der Reaktor wurde 12 Wochen bei Raumtemperatur kontinuierlich betrieben. Während der neunten Woche fiel der Umwandlungsgrad ab. Dies beruhte auf dem Befall von Mikroorganismen, die auf den Enzymteilchen wuchsen. Es wurden keine Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um die Enzymteilchen während dieser 9 Wochen steril zu halten. Durch gründliches Waschen der Enzymteilchen in dem Säulenreaktor mit einer 2gewichtsprozentigen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd werden diese wieder sterilisiert, und der ursprüngliche Umwandlungsgrad wird wieder hergestellt. In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengestellt.

Strömungsgeschwindigkeit Rohrzuckerumwandlung,Prozent ml/Stunde anfänglich nach 12 Wochen

200 100 100

300 - 80

400 80 -

500 70 68

700 - 50

800 50

1500 30 30

Die Ergebnisse zeigen die hohe Stabilität des Invertase enthal tendon Enzympräparat^ der Erfindung.

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Beispiel 2

Ein Fließbett-Säulenreaktor (fluid bed column reactor) mit einer Höhe von 75 cm und einem Durchmesser von 2,5 cm wird mit 150 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Enzympräparats "beschickt. Eine wäßrige, 80gewichtsprozentige Rohrzuckerlösung vom pH-Wert 4,5 wird durch den Eeaktor in einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Stunde hindurchgeleitet. Bei dieser Strömungsgeschwindigkeit beträgt die Rohrzuckerumwandlung 100 Prozent. Der Reaktor wird 7,5 Monate kontinuierlich bei Raumtemperatur betrieben. Nach dieser Zeit wird der Reaktor weitere 2 Monate unter identischen Bedingungen in Betrieb gehalten, wobei jedoch der pH-Wert der Substrat lösung auf pH 7 eingestellt wird. Es wird der gleiche Umwandlungsgrad erhalten. Somit kann der Reaktor mindestens 9»5 Monate ohne Verlust an enzymatiseher Aktivität betrieben werden. ■

Beispiel3

160 g- Invertase werden in 16 1 einer wäßrigen Lösung von 12öü g Gelatine bei 40⁰C gelöst. Der pH-Wert beträgt 5,6. Sodann werden 400 g synthetische Kieselsäure (Ketjensil 125) eingetragen. Nach dem Homogenisieren wird das Gemisch langsam und unter gesteuertem Rühren bei 45°C in 35 1 Butylacetat eingegossen, das 350 g Span-80, das heißt eine grenzflächenaktive Verbindung auf der Basis eines Fettsaurepartialesters von Sorbitanhydrid oder Sorbitan, enthält. Die erhaltene Suspension wird auf 12°G abgekühlt. Zur Vernetzung werden hierauf 1350 ml einer 25prozentigen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd zugegeben, Und das Ge-

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misch wird 20 Minuten gerührt. Danach werden 40 1 Äthanol zugegeben. Die Teilchen werden vom Lösungsmittel abgetrennt, zweimal mit 4-0 1 Äthanol und viermal mit 40 1 Wasser gewaschen. Es werden etwa 17 1 teilchenförmiges Enzympräparat erhalten. Dies entspricht einer Menge von 3i5 kg» bezogen auf das Trockengewicht.

Beispiel 4 Kontinuierliche Herstellung eines Enzympräparats.

Zur kontinuierlichen Herstellung des Enzympräparate in Teilchenform wird das Verfahren folgendermaßen modifiziert: Die enzymhaltige Gelatinelösung wird durch eine Anzahl von engen Röhren in eine Säule gepumpt, die Butylacetat enthält. Die Röhren_f die mit ihren unteren Enden unterhalb des Flüssigkeitsspiegel» des Butylacetats angeordnet sind, speisen einen konstanten Strom der enzymhaltigen Gelatinelösung in das Butylacetat ein. Dieser Strom zerfällt in kleine Tropfchen, sobald er mit dem Butylacetat in Berührung kommt. Die Größe dieser Tröpfchen hängt von der Pumpgeschwindigkeit ab. Das Butylacetat enthält Glutardialdehyd. Die Länge der Säule beträgt 5 m» so daß die Tröpfchen, die in der Säule durch die Schwerkraft absinken, genügend Zeit zur Gelierung haben und mit dem Glutardialdehyd reagieren können. Der untere Teil der Säule wird zu diesem Zweck auf 5°C

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abgekühlt. Die erhaltenen Teilchen werden kontinuierlich vom Boden der Säule abgenommen, vom Butylacetat abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Das Butylacetat wird nach Erßäiieung des verbrauchten Glutardialdehydswieder in die Säule eingespeist.

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Eine Säule mit einem Innendurchmesser von etwa 4 cm liefert innerhalb 1 Stunde 3 1 wasserunlösliches Enzympräparat in Teilchenform.

Beispiel 5

In einer Reihe von Versuchen werden Invertase enthaltende GeIatineteilchen gemäß Beispiel 1 hergestellt, anstelle von n-Butanol werden jedoch folgende organische Flüssigkeiten verwendet: Cyclohexan, Petroläther (hochsiedende Fraktion), Chloroform, Benzol, Toluol, Methylenchlorid und ein Gemisch aus Chloroform und Toluol. In sämtlichen Versuchen werden mechanisch stabile Enzympräparate in Teilchenform erhalten. Die Teilchengröße hängt von der Art des verwendeten Lösungsmittels ab. Beispielsweise werden bei Verwendung von Chloroform feine Teilchen erhalten, während bei Verwendung von Toluol wesentlich gröbere Teilchen erhalten werden. Bei einem Versuch mit den Gemischen aus Chloroform und Toluol scheint die Teilchengröße vom Mengenverhältnis von Chloroform zu Toluol abzuhängen. Bei einem Versuch mit Methylenchlorid wird eine Maximaltemperatur von 35°C anstelle von 5O°C angewandt.

Beispiel 6

Invertase enthaltende Gelatineteilchen werden gemäß Beispiel 1 hergestellt, jedoch wird anstelle von Glutardialdehyd Acrolein als Vernetzungcmittel verwendet. Die.erhaltenen Teilchen sind in Wasser unlöslich und enzymatisch aktiv.

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Beispiel?

200 mg Invertase werden mit einer Lösung von 7 ml frischem Eiklar in 14 ml Wasser vermischt. Das Gemisch wird unter Rühren in 80 ml Butylacetat gegeben und die erhaltene Suspension auf 65°C erwärmt. Die Teilchen verfestigen sich innerhalb 15 Minuten. Nach dem Vernetzen mit Glutardialdehyd werden enzymatisch aktive, wasserunlösliche Teilchen erhalten.

Beispiele

6 g Invertase werden mit 400 ml einer wäßrigen Lösung von 32 g Gelatine bei 40°C und einem pH-Wert von 7 vermischt. In das Gemisch wird ein Stück Baumwollfiltertuch gegeben,und anschließend wird das Tuch in kaltem Butylacetat gekühlt. Nach dem Vernetzen mit Glutardialdehyd wird das Filtertuch gründlich mit V/asser gewaschen und auf einen Büchner-Trichter gegeben. Beim Filtrieren einer lOprozentigen wäßrigen Rohrzuckerlösung durch das Filtertuch wird der Rohrzucker invertiert.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 1 werden unlösliche, enzymatisch aktive Invertase enthaltende Gelatineteilchen hergestellt, jedoch werden anstelle eines gereinigten Invertasepräparats getrocknete Zellen eines Invertase liefernden Hefestammes verwendet.

Beispiel 10

4 g Amyloglucosidase werden in 400 ml einer Lösuno suspendiert, die 8 g Gelatine pro 100 ml Wasser enthält. Godann werden 10 β

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synthetische Kieselsäure (Ketjensil 125) eingetragen. Die !Temperatur des Gemisches beträgt etwa 45°C und der pH-Wert wird auf 7 eingestellt. Die erhaltene Suspension wird unter Rühren in 850 ml Butylacetat "bei 5O°G eingegossen. Das Gemisch wird auf 10⁰G abgekühlt. Die gebildeten Teilchen werden mit 25 ml einer 25gewichtsprοzentigen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd versetzt und zur Vernetzung 20 Minuten gerührt. Sodann werden die vernetzten Teilchen mit 1,6 1 Äthanol entwässert. Die Flüssigkeit wird dekantiert und die Teilchen werden in 1,5 1 Wasser quellen gelassen, das 10 ml der 25gewichtsprozentigen wäßrigen Glutardialdehydlösung enthält. Nach dem Abtrennen der wäßrigen Lösung werden die enzymhaltigen Teilchen mit Wasser gewaschen, bis der Butylaeetatgeruch nicht mehr wahrnehmbar ist·

Die erhaltenen Teilchen werden in einen ?lug-flow-Seaktor in Form eines Festbettes eingefüllt. Es wird eine 40gewichtsprοζentige wäßrige Losung eines Stärkehydrolysate von 19 Dextroseäquivalenten (D,E.) als Substrat verwendet. Die Eeaktionstemperatur beträgt 55°C. Während eines 3,5wöchigen kontinuierlichen Betriebs des Reaktors wird keine Abnahme der enzymatisehen Aktivität der Teilchen beobachtet. Der Umwandlungsfaktor bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 25 ml pro Stunde beträgt 97 D.E.

B e i s ρ i e 1 11

Gemäß Beispiel 10 werden unlösliche Amyloglueösidase-Gelatine-Teilchen hergestellt, jedoch wird der pH-VJert auf 9 eingestellt. Es werden gleich gute Ergebnisse erhalten.

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Beispiel 12 Verzuckerung von Stärke.

(a) Kontinuierliches Verfahren.

Die kontinuierliche Umwandlung von Stärke in Dextrose mittels des Amyloglucosidase enthaltenden Enzympräparats gemäß Beispiel 10 wird in einem einfachen Reaktionsbehälter durchgeführt. Das Substrat wird durch Vorbehandlung der Stärke mit X-Amyläse löslich gemacht. Der Umsatz wird durch Vergleich des Verhältnisses von Dextrose (bestimmt mit Glucoseoxidase) und der Menge der reduzierenden Zucker, ausgedrückt in g Dextrose, bestimmt nach der Methode von Hoffmann, nach der Hydrolyse der restlichen Polysaccharide durch Kochen mit konzentrierter Salzsäure bestimmt. Das Reaktionsgefäß wird mit dem Substrat und mit dem Amyloglucosidase enthaltenden Enzympräparat beschickt. Das Gemisch wird 20 Stunden bei 55°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt hat das Verhältnis einen Wert von 92 Prozent (Anfangswert 6,5 Prozent) erreicht. Nun wird mit der Beschickung begonnen (50 ml pro Stunde). Das aus dem Reaktionsgefäß abströmende Produkt wird zweimal täglich analysiert, um das vorstehend erwähnte Verhältnis zu bestimmen. Dieses Verhältnis ist an 10 aufeinanderfolgenden Tagen konstant (92 Prozent). Es werden 12 1 Substrat verbraucht. Das unlösliche Enzympräparat hat seine gesamte Aktivität beibehalten.

(b) Diskontinuierliches Verfahren.

Gemäß (a) vorbehandelt« Stärke wird mittels des Ainyloglucoruaase enthaltenden Enzympräparats bei einer !temperatur von 5.^r>°G

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in einem Reaktionsgefäß in Dextrose umgewandelt,, Nach beendeter Umwandlung wird das Enzympräparat aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und in frisches Substrat gegeben. Innerhalb eines Zeitraums von 60 Tagen wird ein täglicher Anteil des Substrats mit einem D.E.-Wert von 20 auf einen D.E.-Wert von 94 umgewandelt. Dies erläutert die hohe chemische und physikalische Stabilität des Enzympräparats während seiner Verwendung.

Beispiel 13

Gemäß Beispiel 1 wird ein Alkoholdehydrogenase enthaltendes Enzympräparat hergestellt. Anstelle von Invertase wird Alkoholdehydrogenase aus Hefe verwendet. Bei Zusatz dieses Enzympräparats zu einer Lösung von 1 Prozent NAD in Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 9> der 20 Prozent Äthanol enthält, katalysierte das Enzympräparat die Reduktion von NAD zu NADH.

Beispiel 14

Ein Lipase enthaltendes Enzympräparat wird gemäß Beispiel 1 hergestellt, anstelle der Invertase wird dabei Lipase (Lipase "My" der Sankyo Comp.) verwendet. Das Enzympräparat ist enzymatisch aktiv, was sich durch potentiometrische Titration mit einer wäßrigen Lösung von Triacetin als Substrat ergibt.

Beispiel 15

Gemäß Beispiel 1 wird ein Urease enthaltenden Enzympräparat hergestellt;, wobei die Invertane durch Ureane (B.D₀II.) ersetzt wird. Dan Enzympräparat ist ^orjonübor Harnstoff aktiv. Die Be-

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Stimmung erfolgt nach der in J.Clin.Path.,Bd. 13 (1960), S.156 beschriebenen Methode.

Beispiel 16

Gemäß Beispiel 1 wird ein Lactase enthaltendes Enzympräparat hergestellt. In diesem Fall wird die Invertase durch Lactaseß-galactosidase ersetzt. Zur Stabilisierung des Enzyms werden dem Gemisch aus Lactase und Gelatine noch MnSO^ und Lactose zugesetzt. Die erhaltenen Teilchen sind aktiv gegenüber o-Nitrophenylgalactosid, einem synthetischen Substrat zur Bestimmung der Lactaseaktivität. Nach 6monatiger Lagerung im Kühlschrank haben die Teilchen ihre Aktivität beibehalten.

Beispiel 17

Gemäß Beispiel 1 wird ein Invertase und Glucoseoxidase enthaltendes Enzympräparat hergestellt. In diesem Fall wird die Invertase durch das vorgenannte Enzymgemisch ersetzt. Die erhaltenen Teilchen werden an Rohrzucker als Substrat geprüft. Der Rohrzucker wird durch die Invertase in Fruktose und Glucose gespalten, und die Glucose wird durch die Glucoseoxidase ihrerseits in Gluconsäure umgewandelt. Die letztgenannte Reaktion wird durch die Bildung von Peroxid im Heaktionsgemisch beobachtet. Die Gegenwart; dieser Verbindung, die ein Nebenprodukt der durch Glucooeoxidane katalysierten Umwandlung der Glucose in Gluconnäure ist, wird durch seine Reaktion mit farblosem Cliromogen bestätigt. Der Versuch zeigt, daß mLt diesem Enzympräparat zwei, enzymatische Reaktionen durchgeführt werden können.

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Claims

DIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSJUS

PATENTANWALT

3 MÜNCHFN 86, SIEBirtTSTRAoSE 4 PHO.JE: 47-JO 75

CABLE ADDRESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29453 VOPAT D

u.Z. ι Κ 071 (Vo/H) Case DUI-1189

GIST-BROCÄDES F. V. DeIft, Wiederlande

20. September 1972

"Wasserunlösliches Enzympräparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Durchführung biotechnischer Reaktionen"

Priorität: 24. September. 1971, Großbritannien, Hr. 4Λ 73O/7I

Patentansprüche

1. Wasserunlösliches Enzympräparat in Teilchenform, enthaltend mindestens ein nicht-proteolytisches Enzym-, ein gelbildendes Protein und ein bifunktionelles oder polyfunktionelles Vernetzungsmittel, das an das Enzym oder das gelbildende Protein und bzw. oder das Enzym und das gelbildende Protein gebunden ist.

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß da?: gelbildende Protein Gelabine lsi;.

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3. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gelbildende Protein Eiklar ist.

4. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-proteolytische Enzym eine Invertase, Amyloglucosidase, Lactase, Maltase, Amylase, Urease, Lipase, Esterase, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, Dehydrogenase oder Penicillinase oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Enzyme ist.

5. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel Glutardialdehyd, Acrolein, Crotonaldehyd, ein Chlorameisensäureester, ein Säurehalogenid, ein Epoxid, ein Derivat der Dimethyladipinsäure, ein Carbodiimid, Phenol-2,4-disulfonylchlorid, Bromcyan, ein mit Bromcyan aktiviertes Säurehalogenid oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Verbindungen ist.

6. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel Glutardialdehyd ist.

7. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich noch einen unlöslichen Füllstoff enthält.

8. Enzympräparat nach Anspruch 7, dadurch gekonnzeichnet, daß der Füllstoff ein feinverteiltes Silikat oder Siliciumdioxid, Diatomenerde oder Perlit ist.

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9· Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-proteolytische Enzym ein unlösliches Enzym oder ein Komplex des Enzyms mit einem hydratisieren Oxid oder vollständige Zellen oder Spuren von Mikroorganismen ist.

10. Verfahren zur Herstellung des Enzympräparats gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus einem nichtproteolytischen Enzym und einer Lösung eines gelbildenden Proteins in Teilchenform bringt und diese Teilchen mit einem "bifunktionellen oder polyfunktioneilen Vernetzungsmittel für Proteine umsetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als gerbildendes Protein eine Lösung von Gelatine oder frischem Eiklar verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym in einer wäßrigen Lösung des gerbildenden Proteins löst oder suspendiert, dieses Gemisch mit einer organischen Flüssigkeit, die mit Wasser schlecht oder nicht mischbar ist, in solcher Weise versetzt, daß Teilchen entstehen, die erhaltene Teilchensuspension derart behandelt, daß das gelMldende Protein geliert und hierauf vernetzt.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein mit der organischen Flüssigkeit unter kontrolliertem B&wegen zusammenbringt.

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14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man

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das Gemisch aus dem nicht-proteolytischen Enzym und dem gelbildenden Protein submers in die organische Flüssigkeit einsprüht .

15. Verfahren nach Anspruch 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine Invertase, Amyloglucosidase, Lactase, Maltase, Amylase, Urease, Lipase, Esterase, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, Dehydrogenase oder Penicillinase oder ein Gemisch aus mindestens zwei der Enzyme verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein unlösliches Enzym oder einen Komplex des Enzyms mit einem hydratisierten Oxid, hydratisiertem Aluminiumoxid, oder vollständige Zellen oder Spuren von Mikroorganismen verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung des gelbildenden Proteins bei einer Temperatur unterhalb etwa 60 bis 65⁰C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 35⁰C verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine etwa 0,1 bis 25, vorzugsweise etwa 5 bis lOgewichtnprozentige wäßrige Gelatinelösung verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 11 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Gelatinelösung mit einem pH-Wert von etwa 2 bit; 12, vorzugsweise etwa 3 bis 10 verwendet.

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20. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich einen weiteren Polyelektrolyt, wie Protaminsulfat oder Polyacrylsäure,- zusetzt.

21. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die organische Flüssigkeit bei einer Temperatur unterhalb ihres Siedepunktes bei dem angewandten Druck verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Flüssigkeit einen aliphatischen Alkohol mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, einen'Fettsäureester eines Alkohols, einen unverzweigten oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoff, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen chlorierten Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Flüssigkeiten verwendet,

25. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man der organischen Flüssigkeit noch eine grenzflächenaktive Verbindung einverleibt.

24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelierung durch Abkühlen oder Erwärmen gleichzeitig mit· der Bildung der Suspension des Gemisches aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein in der organischen Flüssigkeit oder danach bewirkt*

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man

die Abkühlung auf Temperaturen von etwa 10⁰G oder darunter durchführt.

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26. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutardialdehyd, Acrolein, Crotonaldehyd, Chlorameisensäureester, Säurehalogenide, Epoxide, Derivate von Dimethy!adipinsäure, Carbodiimide, Phenol-2,4-disulfonylchlorid, Bromcyan, mit Bromcyan aktivierte Säurehalogenide oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Verbindungen verwendet.

27. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutardialdehyd verwendet.

28. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Teilchen aus dem Enzym und dem gelbildenden Protein mittels eines mit Wasser mischbaren und dem Enzym verträglichen Lösungsmittels entwässert.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man als wassermischbares Lösungsmittel aliphatisclie Alkohole mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Aceton oder ein Gemisch aus diesen Lösungsmitteln verwendet.

30. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Gemisch aus dem Enzym und dem gelbildend©»: Protein einen unlöslichen Füllstoff einverleibt.

31. Verfahren nach Anspruch 30» dadurch gekennzeichnet, daß man als Füllstoff fein zerteilte Silikate oder Siliciumdioxid,

Diatomoenerde oder Perlit verwendet.

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32. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das teilchenförmige Präparat aus dem Enzym und dem gerbildenden Protein mit einer Flüssigkeit wäscht.

33· Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man als Waschflüssigkeit Wasser oder eine Pufferlösung verwendet.

34-. Verwendung des Enzympräparats gemäß Anspruch 1 zur Durchführung "biotechnischer Reaktionen.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Wasserlösliche Enzyme, die mit Proteinen oder Proteinhydrolysaten mittels bifunktioneller Vernetzungsmittel vernetzt sind, sind bekannt. Beispielsweise sind Enzyme bekannt, die mit einem Proteinhydrolysat mittels eines Vernetzungsmittels, wie GIutardialdehyd, vernetzt sind. Diese Produkte können für die verschiedensten Zwecke verwendet.werden, zum Beispiel im Falle proteolytischer Enzyme als Zusätze für Waschmittel.

Es sind ferner unlösliche Enzympräparate bekannt, die durch Vernetzen von Enzymen mit bifunktionellen Vernetzungsmitteln hergestellt \rorden sind. Diese Präparate liegen in Pulverform vor, und sie haben den Nachteil, daß das Pulver nur mit Schwierigkeiten aus dem Reaktionsgejuisch abgetrennt werden kann. Bei

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