JPS5944037B2 - 固定化グルコ−ス・イソメラ−ゼの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコース・イソメラーゼを菌体中に含有した
状態のまま固定化する方法による固定化グルコースイソ
メラーゼ剤の製造法に関する。

従来グルコースイソメラーゼを工業的に用いる場合、菌
体のまメ酵素剤として使用するのが普通であった。

しかしながら菌体そのものでは反応溶液中への酵素の溶
出は非常に早く、せいぜい２〜３回の使用が経済的に使
用できる限界であった。

このような回分式反応では、酵素費を節減するために少
量の酵素剤を使用して長時間反応させることが必要とな
るため、反応装置が大きくなるほか反応液が著るしく着
色し、反応後の精製費が高くつくなど不利な点が多い。

もしグルコースイソメラーゼを水に不溶な酵素として固
定化しその固定化酵素を塔に層状に充填して連続的に通
液すれば反応時間が著しく短縮されるので、着色物質や
その他不純物の生成が大幅に減少し、更には反応装置や
運転操作も簡略化されるので工業的に非常に有利となる
。

最近グルコース・イソメラーゼを固定化して連続反応を
行なおうとする試みがなされて、種々の方法が提案され
ている。

これら酵素の固定化法としては菌体よりグルコース・イ
ソメラーゼを抽出して、イオン交換樹脂（特開昭５Ｏ−
５３５８２）や、活性アルミナ（特開昭４９−１１０８
８７）などの担体に吸着させる方法、抽出した酵素を合
成繊維中に包括させる方法、グルコース・イソメラーゼ
を含有する菌体をグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用
いて菌体の細胞壁或は細胞膜を強固にし、更に菌体間の
架橋を形成させる固定化方法（特開昭４９−９２２７８
）、或はグルコース・イソメラーゼを含有する菌体を特
殊樹脂に吸着させる方法（特開昭５Ｏ−６７７４）、ま
たグルコースイソメラーゼを含有する菌体をアクリルア
トゲルなどの重合体やコラーゲンなとで包括する方法な
どがある。

このうち、菌体よりグルコース・イソメラーゼを抽出し
て各種担体に吸着固定化する方法はグルコース・イソメ
ラーゼが菌体内酵素であるため、酵素を抽出する操作が
必要であり、高活性に吸着させるためには抽出酵素の精
製が必須である場合が多く、これら処理操作中での酵素
の損失はまぬがれ得ないところである。

グルコース・イソメラーゼを含有する菌体をグルタルア
ルデヒドで固定化する方法はすでに公知であり、特開昭
４９−９２２７８、特公昭５０−３７２７４等に示され
ている。

上記の特公昭５０−３７２７４に於ては酸性領域に於て
酵素活性を示すリゾープス属の産出する酸性プロテアー
ゼの難溶性化について示されている。

しかしながら元素酵素は処理反応ｐｎが酵素活性を示す
適正ｐＨと異なる場合には反応中に著しい酵素活性の低
下を招き使用不可能となる。

そのため、前記の公知の方法を、中性乃至アルカリ性領
域に於て酵素活性を示す放線菌の産出するグルコースイ
ソメラーゼの固定化にそのまま適用することは全く不可
能であり、たとえそのｐＨをグルコースイソメラーゼの
酵素活性の安定範囲内に設定したとしても効果的なグル
コースイソメラーゼの固定化は達成できえない。

本発明は、高活性を有し、しかも長期にわたって活性を
保持し、物理的強度の強い安定した固定化グルコース・
イソメラーゼの製法を提供するためになされた。

グルコース・イソメラーゼのような菌体内酵素を固定化
する場合は酵素を抽出せず、酵素を含有する菌体そのも
のを固定化する手段が有利であり、この方法によれば酵
素を抽出したり、精製したりする操作を必要としないの
で、固定化処理における酵素の損失を最少限にとどめる
ことができる。

本発明は菌体内に生産される酵素グルコース・イソメラ
ーゼを、架橋剤としてグルタルアルデヒド、補強剤とし
てゼラチンまたはカゼインナトリウムを用いて菌体内に
固定化する方法に関するものであり、対象となるグルコ
ース・イソメラーゼ生産菌の例には次のようなストレプ
トマイセス属に属するものがあるが他の層の放線菌に属
する生産菌にも適用できる。

１ ストレプトマイセス・フエオクロモゲヌス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕ
ｓ）微工研菌寄第２２１号 ２ ストレプトマイセス・フラジアエ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）微工
研菌寄第２２０号 ３ ストレフトマイセス・アルプス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＡＴＣＣ２
１１３２ ４ストレプトマイセス・アクロモゲ゛ナス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ
１２７６７ ５ストレプトマイセス・エクイナタス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ）Ａ
ＴＣＣ２１９３３ ６ストレプトマイセス・ウエドモレンシス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｗｅｄｍｏｒｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ２
１２３０ ７ストレプトマイセス・フラボビレンス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｖｏｖｉｒｅｎｓ
）ＡＴＣＣ３３２０ ８ストレプトマイセス・オリボクロモグネス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
）ＡＴＣＣ２１１１４ いずれもグルコース・イソメラーゼは菌体内に生産され
る。

本発明の方法について更に詳細に説明する。

本発明においては、まず最初にグルコースイソメラーゼ
活性を有する放線菌の菌体をｐＨ６〜９に調節した培養
液中で７０〜８０℃の温度に加熱し１〜２０分保持し、
急冷したのち、濾過または遠心分離で菌体を回収するこ
とからなる。

これは菌体中に存在するプロテアーゼを失活させ、自己
消化を防ぐと同時に補強剤として用いる蛋白質であるゼ
ラチンまたはカゼインナトリラムを有効に作用せしめる
ためである。

培養液のｐＨは以後の操作においてイソメラーゼの活性
を安定に保持させるため、６〜９の範囲に調節されてい
なければならない。

また培養液をもし７０°−８０°Ｃの温度に加熱して１
〜２０分間保持しなければ補強剤としてのゼラチンまた
はカゼインナ） ＩＪウムが放線菌体の含有すプロテア
ーゼのために分解して補強効果が著しく低下するため好
ましくない。

この場合８０℃・ 以上の温度だとプロテアーゼととも
にイソメラーゼの失活がおこり、７０℃以下だとプロテ
アーゼが十分に失格しないので好ましくない。

このように加熱した妨線菌体を含有する培養液は、イソ
メラーゼの失活を防止するため急速に冷ン 却する必要
がある。

急冷後、菌体を沢過または遠心分離によって分離回収す
る。

上記のような凍結、解凍する前の前処理により補強剤の
量が固形分当り２〜１０係と云う少い量で、硬度の大き
なイソメラーゼ活性の強い固定化酵素が得られる。

つぎに菌体を凍結後、解凍して細胞膜を部分的に破壊し
、固定化反応における架橋剤および補強剤の浸透を助け
る第２の前処理を行う。

ついで、グルタルアルデヒドによる架橋重合反応におい
て補強剤としてゼラチンまたはカゼインナトリウムを菌
体固形分当り、２〜１０％添加することにより固定化酵
素の活性の安定性を増し、物理的強度とカサ比重を高め
る。

さらに適量のグルタルアルデヒドを用いたアセトン溶液
中で架橋重合反応を行わせ、反応液を除去後、ゲル状菌
体粒子は水洗せず、加熱乾燥して残留するグルタルアル
デヒドによる重合反応を進め、酵素活性の損失を防止す
ると同時に固定化の効果を最大限に発揮せしめることが
できる。

以上説明した一連の方法の結合によってすぐれた固定化
イソメラーゼを得ることができる。

なお凍結した菌体を解凍する場合は常温または必要に応
じて加熱して解凍することができる。

つぎに解凍菌体にゼラチンまたはカゼインナトリウムを
加えペーストとする場合は粉末または溶液の形で加える
ことができる。

ゼラチンまたはカゼインナトリウムの添加量は菌体固形
分当り２〜１０％である。

ゼラチン又はカゼインナトリウム量が２係以下の場合に
はでき上った製品の硬度が著しく低くなり好ましくない
。

又、１０係以上であると製品の硬度は２〜１０％のもの
と大差ないにもかかわらず製品の単位重量当りの酵素の
活性低下が著しくなるので好ましくない。

ゼラチン溶液は予め６０〜７０℃に加熱して溶解してお
くことが好ましく、解凍菌体との混和は常温で行なわれ
る。

またゼラチンを粉末で加える場合は解凍菌体は予め６０
〜７０℃に加熱し、混和することが好ましい。

カゼインナトリウムは冷水で溶解してもよく、また粉末
で加える場合でも解凍菌体を加熱せず常温で混和しても
よい。

このようにして良く練り合わされたペーストはグルタル
アルデヒド０．２〜１．０１％を含有するアセトン中に
細いノズルより押出すか、或はその他の方法で少なくと
もグルタルアルデヒドが内部に十分に浸透し、架橋反応
が十分性なわれる程度の大きさににして投入し、５分間
静置してゲル化させ、更に反応を十分に進めるため５〜
１０分間ゆるやかに攪拌する。

この際ゲルの破砕を極力防止するため溶液のみをポンプ
で循環することが好ましい。

反応終了後、沢過または遠心分離により、反応液中から
ゲル化した菌体を回収する。

菌体ゲルは４５°〜５０℃で加熱乾燥して製品とする。

この際更に残留するクルクルアルデヒドにより後重合反
応が進み、物理強度及びカサ比重の高い、しかも安定し
た活性を有する固定化酵素が得られる。

必要に応じて適当な太きさまで破砕し、微細粉を篩別す
るなど整粒して製品とする。

しかしながらゼラチンまたはカゼインナトリウムを混合
した菌体ペーストを、グルタルアルデヒドを含有するア
セトン中に投入する際、適度の大きさに成形された粒子
として供給し、反応させれば、乾燥固定化酵素について
粉砕処理を行う必要はない。

架橋剤として使用されるグルタルアルデヒドは、０．２
〜１．０係濃度とすることが必須であり、これより少な
い場合は、固定化が十分性なわれず活性の安定性も、粒
子の物理的強度も劣るものとなり、またそれ以上では粒
子の強度は増すが活性が減少し、製品の保存中の活性の
低下が犬となる。

この濃度範囲内でゲル化した場合、ゲルを水洗して、未
反応のグルタルアルデヒドを除く必要がなく、しかも残
留する未反応のグルタルアルデヒドが後の加熱乾燥で、
後重合反応を起し、活性を減少させることなく酵素製品
の活性安定性、カサ比重及び物理的強度を増加させる効
果がある。

本発明の方法を用いれば酵素を強固に菌体内にとじ込め
ると同時に菌体と菌体を強固に結合させ、安定した活性
を持ち、かつ物理的強度の強い粒子を容易に得ることが
できる。

本発明によればグルコースイソメラーゼ含有菌体の前処
理法と、ゼラチンまたはカゼインナトリウムを補強剤と
して用いる方法を好適に組み合せた固定化条件を用いる
ことによって、高活性を有し、しかも長期にわたって活
性を保持し、物理的強度の強い、安定した固定化酵素を
得ることができる。

本発明の方法により製造された粒状の固定化グルコース
・イソメラーゼは塔に層状に充填して連続的に基質溶液
を通すとき層の単位体積当たりの活性が高いので反応が
速い流速の下で行なわれ、基質溶液と酵素との接触時間
が短かい。

したがって本発明の方法によれば公知の方法よりも着色
物質やその他の分解物の生成が少なく後の精製工程の負
担が小さくなり経費も少なくてすむ。

また酵素活性の安定性も高く、粒子の硬度も高いので、
使用可能期間も長く、工業的に非常に有利となる。

これらの利点は今までの公知の方法では到底達成できる
ものでなく、本発明の方法を用いることによって初めて
得られるものである。

本発明の方法によれば以上述べたような優れた固定化グ
ルコース・イソメラーゼ剤を製造することができるが、
それを更に図面により説明する。

図面において１は実施例１による酵素剤、２は実施例２
による酵素剤、３は補強剤を添加しない比較例による酵
素別のグルコースの異性化処理能力を示したものである
。

処理能力は固定化酵素製品を乾燥固形分として１０９、
カラムに充填し、４０ｗ／ｗ％グルコース溶液（ＭｇＳ
Ｏ４０，４ｍ ｍｏｌＡ、Ｎａ２ＳＯ３４ｍｍｏ １−
Ａ−Ｎａ ２ Ｃ０３でｐＨ８，２に調整）を６５°Ｃ
で通したとき、異性化率４５％が得られる流速をもって
表しである。

この数字が大きい程、酵素の活性が高い。

上記の試験結果が示すように、ゼラチンを添加した実施
例１及びカゼインナトリウムを添加した実施例２による
製品はゼラチンまたはカゼインナトリウムを添加しない
比較例に比べて、その酵素活性の安定性は極めて犬であ
る。

その酵素活性は初めの１０日間は変らず、その後約６０
日間で半減するが、この通算７０日間に、４５係の異性
化率で処理し得たグルコース量は酵素乾物１０ｇ当たり
ゼラチンの場合で４２ｋｇ、カゼインナトリウム添加の
場合で４０ｋｇとなり、無添加の場合の活性半減までの
期間４０日間に処理し得たグルコース量２７ｋｇに比べ
て約１．５倍の量に達する。

なお比較例はゼラチンを無添加とする以外は実施例１と
同様にして製造した。

本発明のゼラチン及びカゼインナトリウムの代りに卵ア
ルブミン及びグルテニンを用いて、実施例１と同様の方
法で固定化酵素剤を製造したが、表１に示すように粒子
硬度、特に湿潤状態の粒子硬度において本発明の方法に
較べ大幅に劣っている。

またカサ比重は本発明のゼラチンまたはカゼインナトリ
ウム添加において大幅に増加している。

これらの結果より如何に蛋白質の選択が重要な因子であ
るかがわかるものであり本発明の新規性が明白なる所以
である。

カサ比重が増加することは反応カラムを調整する場合、
酵素の沈降性がよく充填し易いし、更に重要なことは単
位容積当りの活性が高くなるので基質溶液の接触時間が
それだけ短かくてすむ、云いかえれば早い速度で通液で
きると云うことであり、したがって反応塔を小さくする
ことができ工業的に有利となる。

またゼラチン若しくはカゼインナトリウムの添加量と酵
素粒子の硬度及びカサ比重の関係は表２に示す通りであ
り、ペースト中の乾物重量に対して２〜１０係添加が適
当であり、好ましくは５〜１０係である。

なお表２における固定化酵素製品の内ゼラチン２％添加
は実施例１と全く同様にして製造したものであり、その
他は各々所定の添加量とした以外は実施例１と同様にし
て製造したものである。

＊１ カラム内で基質溶液を通している状態において測
定 ＊２ 粒子の硬度はＴｅｘｔｕｒｏｍｅｔｅｒ ＧＴＸ
２型（全型ＫＫ）を用イテ２０〜４０ｍｅＳｈの粒子、
１粒を破砕するに要する荷重（ｋΦを測定し硬度とした
。

測定条件は次の通り プランジャー； アルミ合金１３ｍ／ｍ径プラットフォ
ーム；フラットプレート クリアランス ：０．３５ｍ／ｍ 電 圧 ；乾燥製品１．５■、湿潤状態３．０■ ストレインゲージアーム；バードアーム 湿潤状態は乾燥製品を４０ ｗ／ｗ％グルコース溶液 （ＭｇＳＯ４０，４ｍｍｏｌ ／ ＣＮａ２ＳＯ２４ｍ
ｍｏ１／ＩＩ １Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ８，２に調整）に
６５°Ｃで一昼夜浸漬したもの。

実施例 １ ストレプトマイセス・フエオクロモゲヌス（微工研菌寄
第２２１号）をＤキシロースを含む液体培地中で好気的
に培養して得られた培養液約１０１をｐＨ７，５に調節
した後、加熱して７５℃としこの温度に５分間保持して
後急速に冷却して２０℃とし、遠心分離して菌体を集め
た。

この菌体をケイソウ十をプレコートしたグツフナ−漏斗
上に移し吸引濾過しながら純水で洗滌し、最後に充分に
水を切ってケイソウ士の上からはがしてポリ袋に入れ、
−２０℃の冷凍庫に１夜放置して凍結させた。

この凍結菌体の重量は１３５ｇで固形分は２８係、グル
コースイソメラーゼ活性性）は８２０Ｕｎｉｔ／９であ
った。

凍結菌体を３００ＴＬｌ容ビーカーに入れ室温に放置し
て解凍し予め加温した純水３０ｍ１に溶解しておいたゼ
ラチン３．２ｇを加えて薬さしでよく捏和して均一なペ
ースト状にし、内径０．８關のノズルを有する注射筒に
充填した。

１１のビーカーにアセトン（９９係）４００ｍｌと２５
％グルタルアルデヒド水溶液８ｍｌを入れて゛ 攪拌混
合し、ｌＮＮａＯＨを微量添加してｐＨを７．５に調節
した。

この溶液中に前述の注射筒のノズルより菌体のペースト
を全量を約５分間で押出し、その後約５分間静置すると
押出されたペーストが紐状のままゲル化したのでその後
ガラス棒で攪拌しながら更に１０分置き、プツフナー漏
斗に濾紙をセットして吸引沖過した。

漏斗上の残渣を軽く圧搾してアセトン液を搾り出した後
、得られた紐状のものを平皿上に拡げて約１時間放置し
てアセトンを揮発させ、次に４７℃の恒温乾燥器中で３
時間乾燥した。

乾燥物を空瓶を用いて押しつぶして短稈状のペレットト
し、４０メツシユの篩を用いて微粉末を除去し、固定化
グルコースイソメラーゼの製品４０．９得た。

製品の水分は１２．５％であった。異性化反応用の基質
溶液としてグルコース４０ｗ／ｗ係、Ｍｇ８０４０．４
ｍ ｍｏ ｌ ｅ ｓ／Ａ 、Ｎ’ａ２ＳＯ３４ｍ ｍ
ｏ ｌ ｅ ｓ／ｌとなるよう純水に溶解しＮ ａ ２
ＣＯｓによりｐＨを８，２に調節したものを準備した
。

内径２０ｍｍの内筒を有する２重管に予め基質溶液中に
１時間漬浸しておいた固定化酵素製品１１．４２．９（
乾物１０．０ｇに相当する）を充填し、外とう管に６５
℃の温水を循環させながら基質溶液を初速６２ｍ１／Ｈ
ｒで通過させ、異性化液についてはクルコースオキシダ
ーゼ法によりぶどう糖を、またシスティンカルバゾール
法によって果糖を定量して、グルコースの異性化率を求
めた。

異性化率が４５係になるように流速を制御したから７０
日間反応試験を行った結果は次の通りであった。

日数 流速 １ ６２”／’Ｈｒ ７０ 日数 流速 １０ ６８ｍｌ／Ｈｒ ５６３ ０６１ ５５９ ０５５ ５５３ ０５０ ５４７ ５０ ４５ ５５ ４２ ６０ ３８ ５３６ ０３４ 上記のデーターによれば酵素活性は初めの１０日間は変
らず、その後約６０日間で半減し、通算７０日間に４５
係の異性化率で処理し得たグルコースの量は４２ｋｇで
あった。

カラム内での酵素床の体積は反応初期４０ＴＬｌ、７０
日後４４ｍ１であったので、７０日後でも基質溶液の接
触時間は２時間未満であった。

カラムから酵素を取り出し粒子の硬さを試したが未だ充
分に硬く、更に長期間使用に耐えるものと思われた。

注）グルコースイソメラーゼの活性 ブドウ糖０．１モル／１１． Ｍｇ８０４０．００５モ
ル／Ｌ リン酸バッファー０．０５モルの存在するｐ
Ｈ７，０の反応液中で７０℃で１時間に１〜の果糖を生
成する酵素活性をＩＵｎｉｔとする。

実施例 ２ ゼラチンに代えて、カゼインナトリウム３．２ｇ用いる
以外は実施例１と同様にして製造した。

得られた製品は約４０ｇであり、水分は１２．３％であ
った。

又異性化反応も実施例１と同様にして行ったが、結果は
次の通りであった。

日数 流速ｌ／Ｈｒ １ ５７ ５ ６５ 日 数 流 速ｍｌ／Ｈｒ １０ ６３ １５ ５８ ２０ ５７ ２５ ５５ ３０ ５３ ３５ ５１ ４０ ４８ ４５ ４６ ５０ ４４ ５５ ４１ ６０ ３８ ６５ ３５ ７０ ３３ 上記のデータによれば酵素活性は初めの１０日間は変ら
ず、その後約６０日間で半減し、通算７０日間に４５係
の異性化率で処理し得たグルコースの量は４０ｋｇであ
った。

カラム内での酵素床の体積は反応初期４２ｍ１７０日後
４６ｍ１であったので７０日後でも、基質溶液の接触時
間は２時間未満であった。

カラムから酵素を取り出し粒子の硬さを試したが未だ充
分に硬く、２更に長期間使用に耐えるものと思われた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例１，２による酵素剤および比較例
による酵素剤のライフを基質溶液（グルコース４０ｗ／
ｗ％、Ｍｇ５Ｏ，０，４ｍ ｍｏｌ／ｌ。 Ｎａ２ＳＯ３４ｍ ｍｏｌ、／ｌ、ｐＨ８，２）の通液
時間の経過と基質溶液の流速（酵素活性に比例する）の
関係で示した図表である。 １・・・・・・ゼラチンを補強剤として添加した実施例
１による酵素剤のライフを示す曲線、２・・・・・・カ
ゼインナトリウムを補強剤として添加した実施例２によ
る酵素剤のライフを示す曲線、３・・・・・・補強剤を
添加しない比較例による酵素剤のライフを示す曲線。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコースイソメラーゼ活性を有する放線菌の菌体
   をｐＨ６〜９に調節した培養液中で７０°Ｃ〜８０℃の
   温度に加熱して１〜２０分保持した急冷し、濾過または
   遠心分離して回収し、一旦凍結後解凍し、ゼラチンまた
   はカゼインナトリウムを乾燥菌体固形分当り２〜１０チ
   加え、練ってペーストとした後グルタルアルデヒド０．
   ２〜１．ｏ％を含有するアセトン中に浸漬して、ゲル化
   させ、モル化後溶液を沢過して除き、水洗を行わずにそ
   のまま乾燥することを特徴とする固定化グルコースイソ
   メラーゼの製造法。