DK150309B - Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose - Google Patents

Description

150309

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af isomaltulose ud fra saccharose ved en enzymatisk omdannelse.

Isomaltulose er et reducerende bisaccharid, der også kendes under navnet palatinose. Det har følgende struktur

CtyOH

Η0^Μ__ο

OH I

0-CH2 n OH

>|-f CH20H

HO

5 og betegnes med den systematiske betegnelse 6-0-(a-D-glucopyra-nosyl)-D-fructofuranose.

Historisk blev isomaltulose først nævnt i en artikel fra 1952 (J.Amer.-Chem. Soc. 74, 3202 (1952)) som biprodukt fra en fermenterende mikororganisme, Leuconostoc mesenteroides. Senere arbejder, der blev 10 offentliggjort i henholdsvis 1956 og 1960 (J.Amer.Chem.Soc. 78, 2514 (1956) og J.Org.Chem. 25, 1062 (1960)) bekræftede dannelsen af isomaltulose som biprodukt ved Leuconostoc mesenteroides' syntese af dextran ud fra saccharose.

Tysk patentskrift nr. 1049800 (offentliggjort i 1959) i navnet SUd-15 deutsche Zucker-Aktiengesellschaft beskriver, hvorledes isomaltulose kan fås ud fra saccharose ved en mikrobiologisk proces under anvendelse af Protaminobacter rubrum. Det er kendt, at andre bakterier også kan anvendes til opnåelse af omdannelsen af saccharose til iso-maitulose, og i britisk patentskrift nr. 1429334 (der svarer til tysk 20 patentskrift nr. 2217628) nævner samme firma, at Serratia plymuthica er velegnet hertil.

150308 2

Britisk patentskrift nr. 1429334 angår først og fremmest fremstillingen af isomaltitol (a-D-glucopyranosyl-1,6-sorbitol) ud fra isomaltulose ved katalytisk hydrogenering. I praksis opnås der ved hydrogeneringen en blanding, som også indeholder a-D-glucopyranosyl-1,6-mannitol; 5 denne blanding forhandles som kaloriefattigt sødemiddel under varemærket "Palatinit".

Britisk patentskrift nr. 1429334 nævner tysk patentskrift nr. 1049800 og beskriver, at omdannelsen af saccharose til isomaltulose hensigtsmæssigt opnås ved en fermentation, hvor der anvendes en saccharose-10 opløsning på 15 - 40% w/w, fortrinsvis 20 - 25% w/w, saccharose. Der anvendes kraftig omrøring og kontinuerlig luftgennemstrømning. Det britiske patentskrift angiver endvidere, at omdannelsen kan udføres chargevis eller kontinuerligt, og det angiver eksempler for begge disse teknikker. Efter fermentationen fraskilles isomaltuloseopløsningen 15 og kan krystalliseres efter filtrering og ionbytterchromatografi.

I europæisk patentansøgning nr. 0001099, offentliggjort 21. marts 1979, beskriver Bayer Aktiengesellschaft en fremgangsmåde til kontinuerlig fermentation af mikroorganismer, f.eks. Protaminobacter rubrum eller Serratia plymuthica, med samtidig omdannelse af saccha-20 rose til isomaltulose. Det anføres, at det nu er fundet, at dyrkningen af isomaltulose-dannende mikroorganismer kan udføres kontinuerligt med samtidig omdannelse af saccharose til isomaltulose, og det hævdes, at det var overraskende og uventet, at isomatulose-dannende mikroorganismer samtidig kunne omdanne saccharose til isomaltulose 25 under deres vækst i saccharose-holdige plantesafter.

Den saccharose-holdige opløsning er specificeret som en tyndsaft/ tyksaft og/eller tyndsaft/klaret produktblanding fra en sukkerfabrik og som havende et tørstofindhold på 5 - 30%, fortrinsvis 20 - 27%, hvor tørstoffet er 90 - 98% saccharose. Bortset fra Protaminobacter 30 rumbrum og Serratia plymuthica angiver den europæiske patentansøgning nr. 0001099 muligheden for at anvende Serratia marcescens,

Erwinia carotovora eller Leuconostoc mesentheroides som den isomaltulose-dannende mikroorganisme.

3 150309

Det har nu vist sig, at såfremt den isomaltulose-producerende mikroorganisme eller et enzymsystem isoleret herfra immobiliseres på en i og for sig kendt måde, jfr. nedenfor, kan der ved den enzymatiske omdannelse anvendes en overraskende høj koncentration af saccharose 5 i opløsningen, nemlig mindst 40 vægtprocent og fortrinsvis mere, fx 55 vægtprocent. Dette kunne forventes at inhibere reaktionen, men det har overraskende vist sig, at en så høj koncentration af saccharose medfører, at stabiliteten af det isomaltulose-syntetiserende enzymsystem er langt højere end ved lavere saccharosekoncentrationer, 10 hvilket også er tilfældet med enzymsystemets produktivitet, jfr. fig. 1 og 2. Dette er navnlig overraskende i betragtning af, at denne høje saccharosekoncentration ligger langt over de naturligt forekommende saccharoseniveauer, som de isomaltulose-dannende bakterier kunne forventes at have tilpasset sig, og i betragtning af, at saccharoseop-15 løsninger på 40 vægtprocent eller derover er meget viskose sirupper, der sædvanligvis er bakteriologisk stabile. Der er således mod forventning væsentlige fordele ved at anvende de høje saccha rosekoncentrationer, når der arbejdes med det immobiliserede system.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejen-20 dommelig ved, at en isomaltulose-producerende mikroorganisme eller et isomaltulose-dannende enzymsystem isoleret herfra immobiliseres, hvorefter det immobiliserede enzympræparat bringes i kontakt med en saccharoseopløsning, der indeholder mindst 40 vægt/-volumenprocent saccharose, hvorpå den opnåede isomaltuloseopløsning, hvori fortrins-25 vis 70-95 % af saccharosen er omdannet til isomaltulose, om ønsket renses, fortrinsvis ved krystallisation.

Ichiro Chibata og Tetsuyo Tosa, "Transformation of Organic Compounds by Immobilized Microbial Cells", Advances in Applied Microbiology 22, 1977, s. 1-9, og M. Kierstan og C. Bucke, "The Immobi-30 lization of Microbial Cells, Subcellular Organelles and Enzymes in Calcium Alginate Gels", Biotechnology and Bioengineering 19, 1977, s.

387-397, beskriver som generelt princip den immobiliseringsteknik, der anvendes til at immobilisere enzymsystemet. De to artikler beskriver imidlertid ikke fremstilling af isomaltulose ud fra saccharose ved 35 hjælp af et immobiliseret enzymsystem og gør det således ikke nærlig- 150309 4 gende, at der kan opnås en høj isomaltulose-produktion ved anvendelse af saccharosekoncentrationer på mindst 40 vægt/volumenprocent.

Det enzymsystem, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes efter ekstraktion fra den isomaltulose-dannende 5 mikroorganisme, men en ekstraktion er ikke nødvendig. Det er således f.eks. muligt at anvende de hele eller sprængte celler af mikroorganismen, idet cellerne virker som bærer for enzymsystemet.

Der kan ske en vis deling af hele celler efter immobiliseringen, men det foretrækkes langt, at immobiliseringsmetoden og de andre frem-10 gangsmådevarianter vælges således, at der slet ikke sker nogen deling, eller at delingen holdes på et minimum. Ved den foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden tages der ingen skridt til at opretholde cellernes levedygtighed:' det sædvanlige er, at der ikke sker nogen celledeling, når det forsøges at dyrke cellerne efter 15 langvarig anvendelse ved den foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden.

Mere generelt er det et træk ved den måde, på hvilken fremgangsmåden bedst udføres, at saccharoseopløsningen er næringsmæssigt deficient og mangler ét eller flere af de næringsmidler, der kræves til 20 den isomaltulose-dannende mikroorganismes vækst. På denne måde er det muligt at opnå den ønskede minimering af celledelingen ved anvendelse af immobiliserede hele celler til tilvejebringelse af enzymsystemet. Fravær af næringsmidler kan på sin side betyde et renere produkt og nedsætte risikoen for, at der sker vækst af nogen inficeren-25 de mikroorganisme.

Det enzymsystem, der er ansvarligt for dannelsen af isomaltulose, kan ekstraheres fra celler af mikroorganismen ved konventionelle teknikker, f.eks. ved en opløsningsmiddelekstraktion. Til lettelse af ekstraktionen kan man anvende hjælpeforanstaltninger, f.eks. spræng-30 ning af cellerne eller osmotisk chok. Fra ansøgernes forsøg med Erwinia rhapontici (den foretrukne isomaltulose-dannende mikroorganisme til den foreliggende fremgangsmåde) tyder det på, at enzymsystemet er lokaliseret i cellernes periplasmiske rum, og at enzymsyste- 5 150303 met er en saccharose-specifik glucotransferase, der kun udnytter det fra saccharose afledte fructose og ikke udnytter frit fructose eller fructose kombineret i andre molekyler. Det ekstraherede enzymsystem kan, om ønsket, renses før anvendelsen, f.eks. ved elektroforese.

5 Til immobilisering af den isomaltulose-dannende mikroorganismes enzymsystem kan der anvendes forskellige i og for sig kendte teknikker. Det er f.eks. muligt at anvende indespærring i en gel. Der kan som alternativer til indespærring anvendes andre immobiliseringsteknikker. Cellerne kan f.eks. adsorberes fysisk på en inert bærer; 10 de kan kobles kovalent til en inert bærer; eller de kan aggregeres ved anvendelse af et tværbindingsmiddel.

Blandt de immobiliseringsteknikker, der har været forsøgt, foretrækkes indespærring i en gel, specielt da denne teknik er velegnet til immobilisering af en enzymatisk aktiv ekstrakt af cellerne såvel som 15 til immobilisering af de hele eller sprængte celler. Egnede gelmaterialer er alginat, polyacrylamid, agar, xanthangummi/johannesbrødgummi, kappa-carrageenan eller kappa-carrageenan/johannesbrødgummi, collagen eller celluloseacetat.

Blandt disse gelmaterialer har en alginatgel, især en calciumalginatgel, 20 vist sig at give de bedste resultater. Der kan anvendes andre algi -natgeler, såsom alginatgeler, der dannes med andre gruppe 11-metaller, men der foretrækkes så langt calciumalginat. Det foretrækkes især at immobilisere hele celler i en calciumalginatgel. På denne måde indespærres cellerne i et inert tredimensionalt polymernetværk med 25 relativt store interstitielle rum i gelen.

For en calciumalginatgel er hastigheden for indadgående diffusion af saccharose høj, og det meste af intra-gelrummet kan nås af saccha-rosen. Endvidere er hastigheden for udadgående udslip af hele celler og protein meget lav, og når gelen udsættes for tryk, deformeres den 30 let, men den sammenpresses ikke i nogen kendelig grad. En yderligere fordel er den exceptionelle og overraskende stabilitet af de immobi-liserede hele cellers isomaltulose-dannende aktivitet; halveringtiden for de i en calciumalginat indespærrede celler nærmer sig 10.000 150309 6 timer, idet 8.500 timer er et typisk tal, medens den længste halveringstid under sammenlignelige betingelser for de andre afprøvede immobiliseringsmetoder er under 1000 timer. I modsætning til de fleste af de sædvanlige immobiliseringsmetoder fører immobilisering i alginat-5 gel typisk ikke til noget kendeligt tab af aktivitet.

Til immobilisering af enzymsystemet (i sig selv eller som hele eller sprængte celler) i alginatgel foretrækkes det først at blande enzymsystemet med en vandig opløsning af et opløseligt alginat, f.eks. natriumalginat. Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangs-10 måden vil dette omfatte opslæmning af hele celler med det opløselige alginat. Koncentrationen af cellerne i opslæmningen er ikke på nogen måde kritisk for det vellykkede resultat for fremgangsmåde ifølge opfindelsen, men ved afprøvning af forskellige koncentrationer kan man let finde et optimum for et bestemt system. Koncentrationen af 15 celler er typisk mellem 1 og 90 vådvægt/volumenprocent, men den er fortrinsvis fra 10 til 40 vådvægt/volumenp rocent helst ca. 20 vådvægt/volumenprocent. Koncentrationen af opløseligt alginat er heller ikke kritisk. En særlig velegnet koncentration til anvendelse med hele celler eller andre former for enzymsystemet er mellem 1 og 10 våd-20 vægt/volumenprocent, især ca. 5 vådvægt/volumenprocent.

Dén resulterende alginatblading sættes derpå i udmålt mængde til en opløsning af et metalsalt, med hvilket det opløselige alginat danner en gel. Som ovenfor nævnt er den foretrukne gel calciumalginat, og et eksempel på et egnet salt er da calciumchlorid. Det foretrækkes især 25 at anvende en calciumchloridopløsning, hvis molaritet er fra 0,01 til 1,0M, fortrinsvis fra 0,05 til 0,5M, mest foretrukket omkring 0,1M. Metalsaltopløsningen ligger fortrinsvis ved en temperatur på 15 -40°C, især omkring 30°C, medens blandingen tilmåles, og det er også fordelagtigt, hvis opløsningen omrøres. Det immobiliserede enzymstems 30 stabilitet forøges, hvis metalsaltopløsningen yderligere indeholder noget opløst saccharose, f.eks. 5-40 vådvægt/volumenprocent saccharose, fortrinsvis ca. 20 vådvægt/volumenprocent saccharose.

Ved at tilmåle opslæmningen eller anden alginatblanding som adskilte smådråber er det simpelt at frembringe kugleformede piller af gel, der 150309 7 indeslutter enzymsystemet. Pillestørrelsen kan varieres, men til opnåelse af let manipulering og effektiv masseoverføringsegenskaber ved anvendelsen foretrækkes piller, der har en diameter på ca. 3 - 5 mm.

Størrelsen og formen er imidlertid af begrænset betydning, og det 5 kan let lade sig gøre at immobilisere enzymsystemet i en blok af gel (som derefter deles til anvendelsen) i et reb af gel (som til anvendelsen kan opvindes på en form eller skæres i stykker) eller i mikrofi-brøse partikler (ved anvendelse af betingelser med høj forskydningskraft ved tilsætningen til alginatblandingen).

10 Lignende metoder kan anvendes til immobilisering af enzymsystemet i andre gelsystemer. Fremgangsmåder til fremstilling af gelformede produkter er beskrevet i litteraturen, og det er simpelt at tilpasse dem til den foreliggende opfindelses formål. Som eksempler kan det nævnes, at følgende gelsystemer med godt resultat er blevet anvendt til 15 immobilisering af enzymsystemet som hele celler:

(i) Kappa-carrageenan eller kappa-carrageenan/johannesbrød-gummi, under anvendelse af samme procedure som for alginat med den forskel, at den mest foretrukne opløsning, til hvilken celleopslæmningen ekstruderes, er en blanding af 1M CaC^ og 1M KCI

20 ved 20°C.

(ii) Agar, ved kogning af 3 vægt/volumenprocent agar i afioniseret vand, afkøling af den resulterende gel til 50°C, tilsætning af celleopslæmningen og dråbevis ekstrusion af den resulterende suspension til iskoldt vand; 25 (i i i) xanthan/johannesbrødgummi, idet der anvendes samme metode som for agar med de undtagelser, at gummiet kun opvarmes til 80°C og at gelen afkøles til 60°C før tilsætning af cellerne; og (iv) polyacrylamid, idet der anvendes fremgangsmåden i henhold til Chibata et al (Methods in Enzymology, 44, (1976), 739). 1

Det er ikke essentielt at anvende en gel til immobilisering af de hele eller sprængte celler af den isomaltulose-producerende mikroorganis- 150309 δ me. Som eksempler kan det nævnes, at ansøgerne med godt resultat har adsorberet hele celler på DEAE-cellulose. 2 g celler blev blandet med 10 ml af en meget tyk vandig opslæmning af DEAE-cellulose indstillet til pH-værdi 7 med tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydro-5 chloridsalt, dvs. tris-HCl. Opslæmningen blev holdt ved stuetemperatur i 30 minutter og var derefter klar til anvendelse.

Celler er endvidere blevet immobiliseret ved tværbinding. Dette blev opnået ved at omsætte 2 g celler suspenderet i 10 ml afioniseret vand med tværbindingsmiddel, nemlig 10 ml 25% v/v glutaraldehyd.

10 Der er også med godt resultat blevet udført immobilisering på benkul, idet der er anvendt 2 g celler og 2 g usigtet ben kul, som blev suspenderet i 10 ml afioniseret vand i 30 minutter. Derefter blev der tilsat en opløsning af 150 mg garvesyre og 130 mg glutaraldehyd i 2,2 ml acetone. Blandingen blev holdt ved stuetemperatur til tilendebrin-15 gelse af immobiliseringen.

Det vil forstås af den ovenstående diskussion, at immobiliseringen af enzymsystemet kan udføres på sådanne måder, som ikke anvender noget gelsystem. Ved anvendelse af fysisk adsorption på en inert bærer foretrækkes det at danne et mono- eller duo-lag adsorberede 20 celler. En lignende fortrinsstilling for mono- eller duo-lag gør sig gældende ved anvendelse af kovalent kobling til en inert bærer, medens det, når der dannes aggregater med et tværbindingsmiddel, foretrækkes, at aggregationsgraden er en sådan, at aggregaterne bliver lige netop synlige. 1 2 3 4 5 6

Det gælder generelt, at når isomaltulose-dannende enzymsystemer 2 immobiliseres ved andre metoder end indespærring i calciumalginatgel, 3 er retentionen af aktivitet og aktivitetens stabilitet sædvanligvis 4 mindre. Dé andre immobiliseringsmetoder har imidlertid ofte forskellige 5 egenskaber, som kan gøre dem ønskelige. Således har f.eks. adsorp- 6 tion af cellerne på DEAE-cellulose den fordel, at den væske, der fås efter omdannelsen, typisk er krystalklar - tilsyneladende er eventuelle urenheder blevet adsorberet af DEAE-cellulosen. Mere generelt kan de alternative immoboliseringsmetoder anvendes til tilpasning til be- 150309 9 stemte omstændigheder og er nyttige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved immobilisering af sprængte celler eller opløsningsmiddelekstrakter af enzymsystemet undgås alle muligheder for, at der kan opstå celle-5 deling under brugen, og der undgås således den nedbrydning af pillerne og blokering af porerne, som undertiden sker, når immo-biliserede hele celler deler sig i calciumalginatgelpiller. Desuden er begyndelsesaktiviteten høj med immobiliserede sprængte celler eller opløsningsmiddelekstrakter, hvilket afspejler fravær af en intakt celle-10 vægmembran, der kunne virke som bærer for spredning af saccharose og isomaltulose. Sprængning kan udføres ved formaling i en kuglemølle eller ved anden behandling af hele celler.

Kilden til det enzymsystem, der fortrinsvis anvendes ved immobiliseringen, er en isomaltulose-producerende mikroorganisme af slægten 15 Erwinia. Der kan anvendes andre bakterier af arter såsom Serratia plymuthica eller Protaminobacter rubrum, men førstnævnte er muligvis sygdomsfremkaldende hos mennesker, og sidstnævnte er tilbøjelig til at producere et uønsket rødt pigment med lav molekylvægt.

Af de arter, der tilhører slægten Erwinia, foretrækkes især E. rha-20 pontici. Særlig egnede stammer af E. rhapontici omfatter de stammer, der er deponeret i Storbritannien på National Collection of Plant Pathogenic Bacteria under adgangsnumrene NCPPB 1578, NCPPB 139 og NCPPB 1739.

Stammen NCPPB 1578 er også deponeret på American Type Culture 25 Collection under adgangsnummeret ATCC 29283. Alle NCPPB-stammer omtalt i den foreliggende beskrivelse er nævnt i første udgave af "Catalogue of Cultures in the National Collection of Plant Pathogenic Bacteria", udgivet i 1977 af det britiske landbrugs- og fiskeriministerium og er offentlig tilgængelige. 1

Stammerne NCPPB 1578, 139 og 1739 er usædvanligt lovende, idet de har en højere produktspecificitet, begyndelsesaktivitet og stabilitet i sammenligning med andre stammer af Erwinia eller med stammer af 10 150309 andre slægter. Mutanter, varianter og andre artefakts af den naturligt forekommende bakterie kan om ønsket anvendes. For eksempel kan kemiske eller fysiske midler inducere mutanter.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udføres fortrinsvis 5 som en kontinuerlig proces, mest hensigtsmæssigt ved at overføre det immobiliserede enzymsystem på en søjle og føre substratsaccharosen som en opløsning gennem søjlen. Em foretriakken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er at anvende flere søjler parallelt, f.eks. på en karrusel. Man kan frit vælge den ønskede søjlestørrelse,, 10 men en størrelse på 20) ral og opefter er mest hensigtsmæssig. Der dannes normalt em vis mængde carbondioxid undler omdannelsen fra saccharose til isoima Itu låse, nir der amvendes irnmølhiriserede hele celler, og det er lettere at fjerne denne carbondioxid), hvis væsken føres opad gertnent søjlera.. Opadgående passage af væsken kan også 15 medvirke til at fluidiseire immobil!seret enzymsystem og undgå den komprimering, der kan ske· ved nedadgående passage.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen; anvendes fortrinsvis mindst 50 vægtprocent saccharose som substrat.

Stabiliteten (målt som halveringstid) fer det isomaltulbsesyntetiserende 20 enzymsystem i de immobiliserede celler stiger med stigning t saccha-rosekoncentrationen, hvilket også er tilfældet med koncentrationen af isomaltulose i den omdannede væske.

Disse virkninger er helt tydelige og vises grafisk i fig. 1 og 2, der er baseret på eksperimentelle data opnået ved anvendelse af caicium-25 alginatpilier af immoboliseret E. rhapontici NCPPB 1739.

Fig. 1 viser variationen i stabilitet for immobiliserede celler, hvad angår koncentrationen af saccharoseopløsningen, og

Fig, 2 viser virkningen af saccharosekoncentrationen på de immobiliserede cellers produktivitet. 1 Når saccha rosekoncentrationen stiger over 40%, stiger stabiliteten og produktiviteten med bemærkelsesværdigt større hastighed. Denne virk- 150309 11 ning synes i hovedsagen at være en egenskab hos det immobiliserede isomaltulose-dannende enzymsystem snarere end en egenskab ved immobiliseringsteknikken. Dog giver en immobilisationsteknik, hvor der anvendes calciumalginat, sædvanligvis den bedste stabilitet.

5 Desuden er en høj saccharosekoncentration medvirkende til at inhibere deling af immobiliserede celler og forhindre mikrobiel forurening, medens den samtidig gør det lettere at udvinde produktet og formindsker rumfanget af den væske, der skal behandles.

Der er således nu væsentlige fordele at opnå ved anvendelse af en så 10 høj saccha rosekoncentration som det er hensigtsmæssigt, og i praksis er den eneste begrænsning sædvanligvis opløsningens viskositet. Det har vist sig, at den øvre viskositetsgrænse i de fleste tilfælde ligger mellem 100 cp og 1000 cp, typisk på 500 cp.

Ved den foretrukne fremgangsmåde, der anvender celler indesluttet af 15 calciumalginatgel-piller, er saccha rosekoncentrationen i udgangsmaterialet hensigtsmæssigt ca. 55 vægtprocent.

Substratet behøver ikke at være en opløsning af ren saccharose.

F.eks. kan op til 15 vægtprocent sirup inkorporeres i stedet for saccharose, og fremgangsmåden kan anvende "affineringssirup", 20 hvilket er en uren sukkerstrøm, der forekommer i konventionelle sukkerraffinaderier.

Omdannelse af saccharose til isomaltulose ifølge den foreliggende opfindelse udføres fortrinsvis ved 15 - 40°C, især ved 20 - 35°C, og en temperatur på 30°C er særlig velegnet. 1 2 3 4 5 6

Saccharoseopløsningens pH-værdi er ikke særlig kritisk, idet den 2 fortrinsvis ligger på fra 5 til 9, især på ca. 7. Omdannelsen til 3 isomaltulose resulterer normalt i udvikling af en vis mængde syre, 4 men i praksis er det sædvanligvis unødvendigt at tage forholdsregler 5 for at holde pH-værdien inden for 5-9. Under alle omstændigheder 6 reduceres syreudviklingen sædvanligvis i takt med stigningen af substratkoncentrationen.

12 150309

Den foreliggende fremgangsmåde kan udføres på en sådan måde, at der opnås en reguleret grad af omdannelse af saccharose til isomaltu-lose. Samtidig med at opholdstiden for saccharose i kontakt med det immobiliserede enzymsystem stiger, stiger også omdannelsesgraden i 5 retning af det praktisk mulige maksimum (typisk mellem 85 og 100% omdannelse af saccharose til produkter). Den maksimale produktivitet opnås imidlertid ikke nødvendigvis ved den højeste omdannelsesgrad, fordi det større gennemløb og den højere aktivitet, der skyldes en kortere opholdstid, kan kompensere for, at der ikke opereres ved 10 maksimal omdannelse.

Det har derfor vist sig i praksis, at den maksimale produktivitet opnås ved at operere ved mindre end maksimal omdannelse, sædvanligvis på mellem 70 og 95% omdannelse til produkter. Det foretrækkes at udføre den foreliggende fremgangsmåde ved eller næsten ved den 15 omdannelsesgrad, der kræves for maksimal produktivetet. Den omdannelse, der kræves for at opnå den største produktivitet, kan let findes ved systematisk eksperimenteren. Som eksempel kan nævnes, at det har vist sig, at der for calciumalginatpiller af immobiliserede Erwinia-celler normalt er en maksimal produktivitet, når der opereres 20 på mellem 80 og 90%'s omdannelse.

Tilstedeværelsen af dette produktivitetsmaksimum er illustreret i fig.

3, der er baseret på eksperimentelle data opnået ved anvendelse af calciumalginatpiller af immobiliseret E. rhapontici NCPPB 1739.

Fig. 3 viser variationen i produktivitet af immobiliserede celler hvad 25 angår den initiale procentvise omdannelse (dvs., den procentvise omdannelse ekstrapoleret tilbage til tid nul).

Der er et tydeligt toppunkt i produktivitet ved ca. 85 - 90%’s omdannelse af saccharose til isomaltulose.

Omdannelsesgraden for saccharose til produkter har også en bemær-30 kelsesværdig indvirkning på stabiliteten af det isomaltulose-dannende enzymsystem hos de immobiliserede celler. Forsøg har vist, at stabiliteten kan stige exponentielt med omdannelsesgraden af en koncentre- 150309 13 ret saccharoseopløsning. Denne virkning ses på fig. 4, der er baseret på eksperimentelle data opnået ved anvendelse af calciumalginatpiller af immobiliseret E. rhapontici NCPPB 1739.

Fig. 4 viser variationen i halveringstid af immobiliserede celler med 5 hensyn til den initiale procentvise omdannelse.

Fig. 4's data blev fundet for omdannelse af 55% saccharoseopløsning.

Stabiliteten stiger exponentielt til en værdi af ca. 8500 timer ved 90%'s omdannelse. Dette dramatiske resultat er meget uventet og viser igen de fordele, der kan opnås ved hjælp af den foreliggende opfin-10 delse.

Generelt giver fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse en opløsning, der indeholder isomaltulose og andre saccharider sammen med uomdannet saccharose. Det har endnu ikke været muligt at isolere alle de forskellige urenheder, men det er lykkedes at bestemme 15 tilstedeværelsen af saccharose, glucose og fructose, og der er formodning om tilstedeværelsen af andre saccharider.

Efter dannelsen af isomaltulose kan det krystalliseres eller på anden måde renses, hvilket dog ikke er væsentligt for den foreliggende opfindelse.

20 Til krystallisation foretrækkes det at koncentrere opløsningen til en koncentration på 60 vægtprocent, eller fortrinsvis på ca. 65 -70 vægtprocent, hvorefter opløsningen podes og afkøles under omrøring til 20°C. Koncentreringen udføres fortrinsvis ved afdampning ved højst 65°C, hvorved farvedannelse reduceres. Podning af den kon-25 centrerede opløsning fremmer vækst af små krystaller, selv om store krystaller, om ønsket, også kan dyrkes. Det er ikke vanskelig at få en primær mængde krystaller indeholdende 90% isomaltulose, og successive krystallisationer vil øge renheden til 100%.

Der kan også opnås krystaller af isomaltulose ved tilsætning af etha-30 nol eller andre udfældningsmidler (f.eks. saccharose) til den omdannede opløsning. På denne måde produceres der hurtigt krystaller i 150303 14 godt udbytte, selv om renheden ofte er mindre end den renhed, der opnås ved koncentrerings-krystallisationsfremgangsmåden beskrevet i foregående afsnit. De krystaller, der er dannet ved tilsætning af ethanol, indeholder typisk ca. 80% isomaltulose med saccharose som 5 den væsentligste urenhed.

Når en uren saccharoseopløsning såsom affineringssirup omdannes, er de krystaller, der opnås ved koncentrerings-krystallisationsfremgangsmåden, sædvanligvis lysebrune og relativt urene.

Op mod 95% eller mere af den samlede mængde isomaltulose, der er til 10 stede i den resulterende væsken, kan let udvindes som krystaller, og det nøjagtige tal afhænger af krystallisationsteknikken og antallet af successive krystallisationer. Findeling af krystallerne giver et frit-strømmende pulver, der hovedsaglig består af isomaltulose.

Som et alternativ til rensning ved krystallisation kan den resulterende 15 væske renses ved kontakt med en basisk ionbytterharpiks såsom Amberlite® IRA-68 (til fjernelse af syrer, Amberlite® er et registreret varemærke) og med immobiliserede gærceller til fjernelse af glucose, fructose og saccharose. Desuden kan der anvendes frysetørring eller andre teknikker til fremstilling af et fast produkt.

20 Det er fastslået, at isomaltulose har nogle fysiske egenskaber, der ligner saccharoses, selv om isomaltulose har en meget reduceret sødhed C37% af saccharosens sødhed ved 7 vægtprocent i vand). Overraskende nok er det også konstateret, at isomaltulose har kvantitativt let bestemmelige egenskaber, der gør det særlig egnet til at 25 erstatte saccharose som ingrediens ved fremstillingen af produkter til human eller animalsk indtagelse.

Anvendelsen af isomaltulose i stedet for saccaharose i sådanne produkter er omtalt i dansk patentansøgning nr. 4759/80. Som beskrevet i beskrivelsen til den nævnte patentansøgning er isomaltulose særlig 30 anvendelig ved fremstilling af konserverede produkter, idet det giver volumen, struktur og konsistens samt andre ønskede effekter. Aromaen understreges ofte, når der anvendes isomaltulose i stedet for 150309 15 saccharose, og bagværk får sædvanligvis en mørkere, rigere farve. I ovennævnte danske patentansøgning nr. 4759/80 gives eksempler såsom konfekture, kiks, buddinger, kager, syltetøj og marmelade.

Til anvendelse i sådanne samt beslægtede produkter kan der anvendes 5 krystalliseret isomaltulose opnået i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse - isomaltulosen behøver ikke at være ren, og til nogle anvendelser kan bruges ukrystalliseret, urent produkt.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere i nedenstående eksempler, hvor vægt i gram svarer til vådvægt, til-10 nærmelsesvis omdannelse til tørvægt fås ved at dividere med 5, og celleaktiviteten er udtrykt pr. gram våde celler.

Eksempel 1.

Celler fra en kultur af Erwinia rhapontici (NCPPB 1578, ATCC 29283) fortyndes med 10 ml phosphatpufret saltopløsning. Der anvendes 0,10 15 ml alikvoter af den resulterende suspension til podning af 200 ml alikvoter af vækstmediet i 500 ml steriliseret, med prelplader forsynede rystekolber. Mediet fremgår af nedenstående tabel:

Tabel 1 Vækstmedium 20 - Mængde g/liter

Komponent destilleret vand

Saccharose 40 25 Pepton (fordøjet casein) 10 Kødekstrakt 4 16 150309

De podede kolber rystes ved 120 svingninger pr. minut ved 30JC i 70 timer, hvorefter de høstes. Cellerne indsamles i den stationære vækstfase i dette tilfælde, men de kan også indsamles i den logaritmiske vækstfase eller i dødsfasen. Cellerne centrifugeres ved 15.000 g i 10 5 minutter ved 30°C, hvorved fås ca. 1 gram pakkede "wct"-celler pr.

100 ml medium. (Når der skal behandles større mængder inkuberet medium, anvendes en kontinuerligt virkende centrifugerotor, hvor mediet pumpes igennem med 100 ml/minut.)

De indsamlede pakkede celler suspenderes umiddelbart efter i en 10 opløsning af 5 vægt/volumenprocent (tør) natriumalginat i afioniseret vand til dannelse af en cellesuspension på 20 vægt/volumenp rocent (våd). Cellesuspensionen ekstruderes derefter dråbevis fra en højde på 10 cm ud i en omrørt 0,1M calciumchloridopløsning, der holdes ved 30°C og også indeholder 15 vægt/volumenprocent saccharose, der 15 tjener til at stabilisere isomaltulosesyntetiseringsaktiviteten i cellerne.

De resulterende piller omrøres i 1 time og pakkes derefter ind i en 30 cm høj og 5 cm bred kolonne forsynet med en kappe.

En opløsning af 55 vægt/volumenprocent saccharose i afioniseret vand fremstilles og indstilles til pH-værdi 7,0 med 1,0M NaOH. Saccha-20 roseopløsningen pumpes op i søjlen, der holdes ved 30°C. Med en saccharosegennemstrømningshastighed på ca. 0,01 tomt kolonnevolu-men/time (ecv/h) nærmer omdannelsen af saccharose til isomaltulose og andre produkter sig ligevægt.

Der opnås en stabil tilstand efter 24 timer. På dette tidspunkt er de 25 immobiliserede cellers aktivtet ca. 0,2 g produkt/g våde celler pr. time. Cellernes stabilitet er ca. 1 år udtrykt i halveringstid. Når saccharosegennemstrømningshastigheden øges, for at reducere omdannelsen til 80%, er aktiviteten ca. 0,325 g produkt/g våde celler pr. time. 1 Søjleeluatet indsamles, inddampes til ca. 70 vægt/volumenprocent ved 60°C og afkøles eller tvangsafkøles derefter under omrystning, hvorved der fås små hvide krystaller. I praksis kan krystaller udvindes hurtigere ved podning af den afkølede opløsning med en lille mængde 150309 17 tørt isomaltulose. Krystallerne indsamles ved filtrering eller centrifugering og tørres ved 40°C og 700 mm Hg i en vakuumovn. Produktet analyseres. Krystallerne er 94,5% isomaltulose med ét molekyle krystalvand pr. molkyle isomaltulose, og remanensen er andre sukkerar-5 ter. Omkrystallisation tre gange giver ren isomaltulose.

Hvis substratet omdannes 80% til isomaltulose og tilknyttede produkter, fås typisk 88 g krystallinsk produkt pr. 100 g saccharosesub-strat, og søjlens produktivitet er 0,30 tons tørt krystallinsk pro-dukt/søjlevolumen/år.

10 Ved anvendelse i praksis falder antallet af levedygtige celler hurtigt: antallet af levedygtige celler er nul efter ca. 500 timers brug. Herefter er der ikke flere levedygtige celler tilbage, og der iagttages ikke nogen involutionsform af cellerne. På trods af det forholdsvis hurtige tab af levedygtighed, reduceres isomaltulosesyntetiseringsaktiviteten 15 hos de immobiliserede celler uafhængigt og meget langsommere, med en halveringstid på 354 dage.

Dette viser, at der ikke kræves levedygtige celler til dannelse af isomaltulose, og at der sandsynligvis er ét enkelt stabilt enzym, der omdanner saccharosen til isomaltulose, og som ikke kræver recykling 20 co-faktorer eller fortsat gendannelse af energikilder. Denne antagelse bekræftes, når 0,1 g/liter chloramphenicol, der inhiberer proteinsyntese, tilføres de 55 vægt/volumenprocent saccharose, der anvendes som substrat. Isomaltulosesyntetiseringsaktiviteten forbliver upåvirket, men ingen celledeling finder sted, selv ikke når der tilsættes 25 næringsstoffer.

Vækst de novo af Erwinia-celler in situ kan fremkaldes ved at tilføre næringsstoffer i form af et frisk sterilt medium, selv efter at cellerne er brugt uafbrudt i søjlen over et langt tidsrum, således at isomaltu-losesyntetiseringsaktiviteten er faldet til en brøkdel af dens oprinde-30 lige værdi. I disse forsøg pumpes medium op gennem søjlen ved 0,01 ecv/time. De immobiliserede cellepiller afgiver betydelige mænger CC^, pH-værdien af det brugte medium, der elueres fra søjlen, falder til pH-værdi 4,4, antallet af levedygtige celler stiger både i pillerne og i 150309 18 det brugte medium, og nitrogenanalyse af både det brugte medium og cellepillerne viser, at cellevækst har fundet sted. Efter at være gået tilbage til at anvende 55% saccharose som substrat skal det under-streges, at pillernes isomaltulose-dannende aktivitet stiger, i nogle 5 tilfælde til et højere niveau end oprindeligt. Der er ikke noget bevis for induktion af enzym i den oprindelige celle, men det har vist sig, at gendannelsen udelukkende skyldes cellevækst. Graden af genaktivering af pilleaktivitetén er proportional med antallet af de levedygtige celler, der er tilbage umiddelbart før tilsætning af næringsstoffer, 10 og der opnås ingen genaktivering med de piller, der har været anvendt i så lange perioder, at alle de indesluttede celler er blevet ikke-levedygtige (500 timer).

Efter anvendelse i praksis af de gendannede celler i en yderligere periode kan aktiviteten af søjlen genaktiveres på lignende måde mindst 15 3 gange. Muligheden for at regenerere immobiliserede cellesøjler gør, at søjlens stabilitet teoretisk er uendelig, og åbner mulighed for, at de immobiliserede cellers alder er uafhængig af den gennemløbne substratmængde.

I stedet for at der med mellemrum tilsættes næringsstoffer efter at 20 pillerne har været brugt i nogen tid, kan vækstmediet tilsættes umiddelbart efter immobiliseringen, i disse forsøg fremkommer en langsom vækst af Erwinia in situ. Når et 1 vægt/vol umen procents cellepillein-okulum immobiliseres, opnås en 30-foldig stigning i antallet af levedygtige celler, og cellerne vokser med en fordoblingstid på 64 timer, 25 før forsøges må afsluttes på grund af en kraftig svækkelse af alginat-gelstrukturen. Når celler anvendes på denne måde med hyppig gen-dannelse af aktivitet ved hjælp af cellevækst, er enzymsystemets indre stabilitet mindre end i de tilfælde, hvor ingen cellevækst finder sted.

Det ser således ud til, at enzymet er meget mere stabilt, når cellen 30 befinder sig i en pseudohvile- eller overlevelsestilstand, end når cellen får lov til at dele sig.

Eksempel 2.

19 150309

Der anvendes den grundlæggende fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1, og de indsamlede celler af Erwinla rhapontici sprænges ved formaling i en kuglemølle i 90 minutter ved 8°C før immobili-5 sering. Pillernes initialaktivitet minder om aktiviteten, når der anvendes hele celler som beskrevet i eksempel 1, men halveringstiden er ca. 170 dage.

Eksempel 3.

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1, men der anvendes andre 10 stammer af isomaltuloseproducerende mikroorganismer, nemlig Erwinia rhapontici (NCPPB 1578, 139 og 1739 og ATCC 29284), Erwinia cara-tovora var atroseptica BCPPB 139, Erwinia dissolvens (NCPPB 1862 og 2209), Protaminobacter rubrum (CBS 574, 77), Serratia marscescens (NCIB 8285) og Serratia plymuthica (ATCC 15928). De immobiliserede 15 stammers specificitet, aktivitet og stabilitet måles. Når mikroorganismers patogenicitet og tendens til at producere polymerer eller pigmenter tages i betragtning, vurderes teststammerne (herunder den fra eksempel 1) med hensyn til velegnethed i fremgangsmåden ifølge eksempel 1. Vurderingen vises i nedenstående tabel 2.

20 Tabel 2

Stammevelegnethed

Stamme Velegnethed 25 E. rhapontici NCPPB 1578 +++++ E. rhapontici NCPPB 139 +++++ E. rhapontici NCPPB 1739 +++++ E. rhapontici ATCC 29284 ++++ E. carotovora var atroseptica NCPPB 139 +++ 30 E. dissolvens NCPPB 1862 ++ E. dissolvens NCPPB 2209 ++ 150309 20

Tabel 2 fortsat

Serratia plymuthica ATCC 15928 +

Serratia marcescens NCIB 8285 +

Protaminobacter rubrum CBS 574.77 + 5 ____

Eksempel 4.

Der gås frem som beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse af forskellige saccharose-koncentrationer på 12,5 - 60 vægt/volumenprocent. Aktiviteten og halveringstiden måles for en procentvis initialomdannel-10 se til produkter på 40%, og resultaterne vises i tabel 3.

Tabel 3

Saccharose-koncentration

Aktivitet 15 Saccha rose-koncentration gram produkt/ Halveringstid (vægt/volumenprocent) vådeel ler/time (timer) 12,5 0,4 47 25 0,7 200 20 35 1,18 415 45 1,17 650 55 0,82 4000 60 0,31 1935 1

Variationen i substratets saccharose-koncentration har en række vigtige indvirkninger på de immobiliserede søjlers ydeevne. For det første indvirker saccharose-koncentrationen på de immobiliserede cellers aktivitet, idet koncentrationer på over ca. 40 vægt/volumen- 150302 21 procent viser sig at være inhiberende. For det andet har det overraskende vist sig, at de immobiliserede cellers stabilitet (dvs. halveringstid) øges mærkbart, når saccharose-koncentrationen stiger over de koncentrationer, der hidtil er anvendt. Stigningen i de immobilise-5 rede cellers stabilitet i takt med stigningen i saccharose-koncentrationen mere end kompenserer for eventuelt fald i aktivitet, og således stiger søjlens produktivitet, når saccharose-koncentrationen stiger.

Forholdet mellem ligevægtsprodukterne og saccharose varierer også mærkbart, alt efter hvilken saccharose-koncentration, der anvendes 10 som substrat, idet de højeste ligevægtsværdier opnås, når 55 vægt/-volumenprocent anvendes. Dvs., med 55% saccharose er ligevægtsforholdet mellem produkter og saccharose ca. 13,2, svarende til 93%'s omdannelse til produkt.

Eksempel 5.

15 Der gås frem som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af celler af Erwinia rhapontici NCPPB 1578 immobiliseret ved andre immobiliseringsteknikker, der er nærmere specificeret tidligere i denne beskrivelse. Aktiviteten og halveringstiden fremgår af nedenstående tabel 4.

Tabel 4 20 Immobiliseringsteknik

Aktivitet (gram produkt/ Halveringstid

Immobiliseringsteknik gram våde celler/timer) (timer) 1 2 3 4 5

Calciumalginat 0,325 8500 2 DEAE cellulose 0,583 400 3

Polyacry lamid 0,13 570 4

Glutaraldehyd-aggre- 0,153 40 5 gerede celler 22

15030S

Tabel 4 fortsat K-carrageenan-johannes- 0,263 37,5 brødgummi

Ben kul 0,01 25 5 Agar 0,34 27

Xanthan-johannesbrød- 0,10 8 gummi

Eksempel 6.

10 Der gås frem som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af alginat-gel indeholdende indesluttet NCPPB 1578-celler, som er geleret enten i en blok og skåret i småstykker eller geleret i en kontinuerlig streng, hvorefter gelen anvendes enten vundet op på en stav eller skåret i stykker. Ved anvendelse i kolonner viser disse immobiiiserede celler 15 ingen mærkbar forskel i aktivitet eller stabilitet sammenlignet med celler immobiliseret i kugleformede piller.

Eksempel 7.

Eksempel 3 indicerer, at stammerne af E. rhapontici er særlig egnede.

En yderligere sammenligning udføres under standardiserede betingel-20 ser og under anvendelse af hver af de tre E. rhapontici-stammer immobiliseret i calciumalginat. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel 5.

Tabel 5 25 Aktivitet Produktivitet

Stammer (gram pro- (kg produkt/ E. rhapon- Initial om- dukt/gram Halverings- litersøjle-vol.

tici dannelse % celler/timer) tid (timer) 1000 timer) 1 NCPPB 1578 52,4 0,441 1507 59,52 NCPPB 139 54,4 0,389 T877 52,53 NCPPB 1739 56,6 0,354 1840 47,77

Eksempel 8.

23 150309

Det enzymsystem, der er ansvarlig for omdannelse af saccharose til isomaltulose opløsningsmiddelekstraheres fra celler af Erwinia rhapon-tici NCPPB 1578 ved anvendelse af fire forskellige teknikker, nemlig 5 Mickle-rystning, osmotisk chok, lydpåvirkning og detergentbehandling.

Ved Mickle-rystning rystes 2 g alikvoter frisk indsamlede celler med 2 g tørt sand og 2 ml destilleret vand i 20 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af et Mickle-rysterapparatur indstillet til maksimale 10 gyrorotationssvingninger.

Ved osmotisk chok-teknik suspenderes 1,5 g alikvoter af cellerne i 10 ml afioniseret vand i 30 minutter ved 1°C.

Ved iydpåvirkninger suspenderes 2 g alikvoter af cellerne i 15 ml afioniseret vand og lydpåvirkes i 30 minutter under anvendelse af en 15 lydtransducer med en endediameter på 2,5 cm.

Ved detergentbehandling suspenderes 0,5 g v/v vandig Triton X-100-opiøsning i 3 timer.

Efter hver behandling centrifugeres den resulterende suspension ved 17000 g i 30 minutter ved 30°C. Cellerne eller celleresterne og super-20 natanten immobiliseres derefter separat i piller af calciumalginat under anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne generelle fremgangsmåde.

Pillerne afprøves derefter mod 55 vægt/vol umen procent saccharose for isomaltulose-synteriseaktivitet, og resultaterne fremgår af nedenstående tabel 6, hvor "IM" betegner isomaltulose.

Tabel 6 24 150309

Aktivitet af celle-Aktivitet af oprindelige rester (g IM/gww 5 celler (g IM/gww/timer) opr. celler/timer)

Mickle-ryster 0,63 0,567

Osmotisk chock 0,70 0,465

Lydpåvirkning 0,63 0,514 10 Triton-X 100 1,16

Aktivitet hos supernatant

Specifik ak-Protein-kegle tivitet 15 (g IM/gww) (g IM/ml af ekstrakt (g/IM/mg opr. celler/h) ekstrakt/h) (mg/ml) protein/h)

Mickle-ryster 0,094 0,094 32,6 0,0029

Osmotisk chok 0,038 0,253 3,0 0,0844 20 Lydpåvirkning 0,042 0,042 14,9 0,0028

Triton-X 100 0,046 0,92

Af resultaterne i tabel 6 fremgår det, at Mickle-rystning frigør ca. 5% af celleaktiviteten til supernatanten, medens den resterende aktivitet 25 er forbundet med celleresten. Den opløselige enzymekstrakt, dvs.

supernatanten, har en aktivitet på 0,094 g produkt/ml/time, en specifik aktivitet på 0,0029 g produkt/mg protein/time og indeholder tolv forskellige proteinbånd, hvilket fremgår af analyse ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese.

30 Enzymsystemet ekstraheres mere effektivt ved at give cellerne osmotisk chok. Ved denne metode ekstraheres ca. 9% af celleaktiviteten, idet ekstrakten har en aktivitet på 0,253 g produkt/ml/time og en specifik aktivitet på 0,0844 g produkt/mg protein/g. Desuden viser polyacrylamidgelelektroforese kun ti proteinbånd. Dette enzyms for-35 holdsmæssigt høje renhed skyldes sandsynligvis, at cellerne ikke sprænges ved osmotisk chok.

Det fremgår af ovenstående resultater, at enzymsystemet er bundet til membranen og/eller findes i sektioner i cellen, idet den mest sandsynlige lokalisering er det periplasmiske rum, især da osmotisk chok er 40 den bedste metode til ekstraktion, og da det endvidere har vist sig, 150309 25 at enzymmarkørerne i det periplasmiske rum, såsom syrephosphater, co-ekstraheres ved behandling med osmotisk chok.

Ser man i tabel 6 på initialaktiviteten af de chokbehandlede, de Mick-le-rystede og de ubehandlede celler, udviser de sprængte celler den 5 største aktivitet. Det skyldes muligvis fjernelsen af diffusionsrestriktionen ved substratoverførsel forårsaget af en intakt cellevæg og membran. Der er imidlertid ikke nogen signifikant forskel i aktivitet hos de osmotisk choksbehandlede ikke-levedygtige celler og friske levedygtige celler, hvilket viser, at der ikke findes noget fungerende 10 aktiv transportsystem til optagelse af saccharose i cellen, da et sådant optagelsessystem er afhængig af hele cellens integrerede metabolisme og således må forventes at være gået tabt, når cellerne udsættes for osmotisk chok.

Yderligere behandling af den celle-frie enzymekstrakt ved osmotisk 15 chok viser, at den har en optimal pH-værdi på 7,0, en optimal temperatur på 30°C og er maksimalt aktiv i en 35 vægt/volumenprocents saccharoseopløsning. Det er ikke overraskende, at substratoptimumet for det opløselige enzymsystem ligger lavere end de (55%) for de frie eller immobiliserede celler, og det afspejler antagelig en modifikation 20 af de indre egenskaber hos enzymsystemet på grund af dets periplasmiske lokalisering. Når det Mickle-rystede ekstraherede enzymsystem anvendes på 55 vægt/volumenprocent saccharose, har det immobiliserede enzym en initialaktivitet på 0,0067 g produkt/ gram piller/time og en halveringstid på 620 timer og en initialomdannelsesgrad af på 25 81,5%.

Ved anvendelse af almindeligt og specifikt mærket saccharose, fructose og glucose som substrat for det ekstraherede enzymsystem har det vist sig at systemet indeholder en saccharosespecifik glucotransferase.

Enzymet er også specifikt for acceptordelen, idet kun fructose afledt 30 af saccharose, og ikke exogent tilsat fructose, glucose eller glucose og fructose er tilgængelig for inkorporering i isomaltulose. Glucose og fructose afledt af saccharose "aktiveres" sandsynligvis på én eller anden måde; f.eks. kan det eksistere i et sterisk mere gunstigt miljø. Enzymsystemet giver ikke et renere produkt, end når der anvendes 35 hele celler.

Claims (7)

150309

7. Fremgangsmåde til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose, kendetegnet ved, at en isomaltulose-producerende mikroor-5 ganisme eller et isomaltulose-dannende enzymsystem isoleret herfra immobiliseres, hvorefter det immobiliserede enzympræparat bringes i kontakt med en saccharoseopløsning, der indeholder mindst 40 vægt/-vofumenprocent saccharose, hvorpå den opnåede isomaltuloseopløsning, hvori fortrinsvis 70-95% af saccharosen er omdannet til isomaltulose, 10 om ønsket renses, fortrinsvis ved krystallisation.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den isomaltulose-producerende mikroorganisme immobiliseres som hele cellér.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at det isomaltulose-dannende enzymsystem, som immobiliseres, er en opløsningsekstrakt af hele eller sprængte celler af den isomaltulose-producerende mikroorganisme.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at immobiliseringen foregår ved indeslut-20 ning i en gel.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at gelen er en alginatgel.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at den isomaltulose-producerende mikro- 25 organisme er af slægten Erwinia.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at mikroorganismen er af arten E. rhapon-tlci.