HU216881B - Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása - Google Patents
Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása Download PDFInfo
- Publication number
- HU216881B HU216881B HU9203266A HU326692A HU216881B HU 216881 B HU216881 B HU 216881B HU 9203266 A HU9203266 A HU 9203266A HU 326692 A HU326692 A HU 326692A HU 216881 B HU216881 B HU 216881B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- saccharide
- glycosyltransferase
- moiety
- acceptor
- gal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/819—Fermentation vessels in series
Abstract
A találmány tárgyát eljárásők képezik szacharidvegyületek glikőzil-transzferázzal katalizált előállítására előre kiválasztőttszacharidegységeket sőrra hőzzákapcsőlva valamilyen akceptőrcspőrthőz, amely fehérje, glikőprőtein, lipid, glikőlipid vagyszénhidrát, tővábbá eljárásők szacharidvegyület glikőzil-transzferázzal katalizált előállítására előre kiválasztőttszacharidegységeket ső ra hőzzákapcsőlva valamilyenakceptőrcsőpőrthőz, eljárás több, előre kiválasztőtt glikőzil-transzferáz előállítására. A találmány tárgyát képezik ezenkívülberendezések szacharidkészítmények, példáűl őligőszacharid,pőliszacharid, glikőlipid és glikőprőtein-készítmények előnyösenenzimatikűs eljárással való előállítására. A találmány szerintimegőldás alkalmas őligőszacharidők gazdaságős, nagy tételben történőszintetikűs előállítására. ŕ
Description
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 1 lap ábra)
HU 216 881 B
HU216 881 Β
A találmány tárgyát eljárások és berendezések képezik szacharidkészítmények, például oligoszacharid, poliszacharid, glikolipid és glikoprotein-készítmények előnyösen enzimatikus eljárással való előállítására.
A leírás szerinti speciális értelemben az oligoszacharidkészítmény oligoszacharidot tartalmazó molekulát, komplexet vagy összetett vegyületet jelöl.
A szénhidrát kifejezést a (CH2O)n általános képletű vegyületek tágan értelmezett komponenseire, mint például monoszacharidokra, diszacharidokra, oligoszacharidokra és poliszacharidokra alkalmazzuk. Az oligoszacharidok a más néven cukorként ismert szacharidegységekből felépülő láncok. Ezek a szacharidegységek bármilyen rendben elhelyezkedhetnek, és a két szacharidegység közötti kapcsolat körülbelül tízféle módon jöhet létre. Ennek eredményeként a lehetséges sztereoizomer oligoszacharid láncok száma igen nagy.
Az összes biológiai polimer családokból legkevésbé tanulmányozott családok az oligoszacharidok és a poliszacharidok. Ez legnagyobb részben annak köszönhető, hogy a gyakran komplex cukorláncaik szekvenálása és szintetizálása nehéz. Az oligonukleotidok és polipeptidek jól kifejlesztett szintézise ellenére eddig nem sikerült olyan szintetikus eljárást kidolgozni, amely az oligoszacharidok előállítására általánosan alkalmazható lenne.
A szénhidrátok előállítására számos klasszikus eljárást kifejlesztettek, azonban ezeknek az a hátránya, hogy szelektív védelmet és védelemmentesítést igényelnek [R. W. Binkley „Modem Carbohydrate Chemistry”, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel (1988)]. Az oligoszacharidok szerves szintézisének további akadálya a számos glikozidkötés instabilitása, a regiószelektív cukorkapcsolással kapcsolatos problémák, valamint az általában alacsony szintetikus hozam. Ezek, valamint a szénhidrátok izolálásával és tisztításával és szerkezetük elemzésével kapcsolatos nehézségek a figyelmet leginkább erre a területre irányítják.
Számos kutatási erőfeszítés irányult a szénhidrátok, valamint szénhidrátfragmenseket, mint például glikolipideket és glikoproteineket tartalmazó molekulákra. Az ilyen csoportokra irányuló kutatási erőfeszítés leginkább annak a felismerésnek köszönhető, hogy a fehérjék és szénhidrátok közötti kölcsönhatások nagyszámú biológiai felismerési eseményt, köztük a megtermékenyítést, célmolekula-előállítást, sejten belüli felismerést, valamint vírusos, bakteriális és gombapatogenézist foglalnak magukban. Ma már széles körben ismert, hogy a sejtek és sejtek, sejtek és ligandumok, sejtek és az extracelluláris mátrix, valamint a sejtek és a kórokozók közötti felismerést a glikoproteinek és glikolipidek oligoszacharid-részei közvetítik.
Az ilyen felismerések létrejötte valószínűleg megakadályozható olyan oligoszacharidokkal, amelyeknek cukorszekvenciája és sztereokémiája megegyezik a sejtfelismerésben szerepet játszó glikoproteinek és glikolipidek aktív részén található szekvenciával és sztereokémiával. Feltételezik, hogy az oligoszacharidok a receptorfehérjék kötőhelyeiért a glikoproteinekkel és glikolipidekkel versenyeznek. Feltételezik például, hogy a májsejtek plazmamembrán-receptoraival kölcsönhatásba lépő glikoproteinek egyik komponense a galaktozilβ-Ι-4-N-acetil-glukózamin. Ez azt jelenti, hogy a sejtkötőhelyekért a potenciálisan káros csoportokkal versenyző oligoszacharid és egyéb szacharidkészítmények legalább a versenyzés mértékéig a farmakológia, diagnózis és gyógyászat területén új utakat nyithatnak.
Azonban, mivel az oligoszacharidok szintézise a fentiekben ismertetettek szerint nem megoldott, az oligoszacharidok humán- vagy állatgyógyászati gyógyszerkészítményként való vizsgálatára eddig viszonylag kevés kísérletet tettek. Ezen túlmenően az oligoszacharidok sztereospecifikus szintézise is nagyon nehéz, és néhány cukor, mint például a szialinsav és fukóz hatásos hozzáadása - ezek rendkívül labilis kötései miatt - sem valósult még meg. A farmakológiai és gyógyászati célú oligoszacharidok nagy mennyiségű előállításához a korábbiaknál jobb, általánosan alkalmazható eljárás szükséges.
A hagyományos eljárások egyik változatában bizonyos esetekben enzimekkel megvalósított szerves szintézist alkalmaznak. így például enzimeket alkalmaznak szerves szintézisek katalizálására; az ilyen enzimes szintézisekben gyorsítóhatást és sztereoszelektivitást tapasztaltak. További előnyt jelent, hogy néhány enzim alacsony költséggel állítható elő, és tulajdonságaik is változtathatók.
Javasolták már az enzimek szénhidrátszintézisben való katalitikus alkalmazását is, azonban eddig nem találtak olyan enzimbázisú eljárást, amely oligoszacharidok és egyéb komplex szénhidrátok nagy mennyiségben történő általános szintézisére alkalmas. Ismeretes, hogy az enzimek szénhidrátszintézisek katalizátoraként való alkalmazásának egyik legfőbb korlátja, hogy a szénhidrátszintézisekhez szükséges sokféle enzim nagyon korlátozottan áll rendelkezésre (Toone és munkatársai, Tetrahedon Reports (1990) (45) 17:5365-5422.
Az emlősrendszerekben a legtöbb oligoszacharid a következő nyolc, nukleotid mono- és difoszfát cukor alakban aktivált monoszacharidból épül fel: UDP-Glc, UDI-GlcUA, UDP-GlcNAc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, GGP-Man, GDP-Fuc és CMP-NeuAc. Ezek a Leloir-út intermedierei. A mikroorganizmusok és növények sokkal több cukrot (például szilózt és arabinózt) és oligoszacharidot tartalmaznak.
Az oligoszacharidok in vivő szintézise két enzimcsoporttal kapcsolatos. A Leloir-út enzimei képezik a nagyobb csoportot. Ezek az enzimek a növekvő oligoszacharid lánchoz a cukrokat nukleozid-foszfátként aktivált cukorként továbbítják. A nem Leloir-út enzimek is cukor-foszfátként aktivált szénhidrát egységeket továbbítanak, de cukor-nukleozid-foszfátokat nem [Brunngraber: „The Neurochemistry of amino Sugars”, kiadja: Charles C. Thomas, Springfield, III, USA 357. (1979)].
Az oligoszacharidok enzimekkel katalizált in vivő szintézisében kétféle eljárást javasolnak. Lásd a fentiekben hivatkozott Toone és munkatársai eljárását. Az egyik féle eljárásban glikozil-transzferázokat alkalmaznak. A másik féle eljárásban glikozil-hidrolázokat alkalmaznak.
A glikozil-transzferázok az aktivált cukrok fehérjékhez vagy zsírokhoz, vagy a növekvő oligoszacha2
HU 216 881 Β ridok nem redukáló végéhez való, lépésenként megvalósított hozzáadását katalizálják. A szénhidrátok szintetizálásához nagyon nagy számú glikozil-transzferáz szükséges. Az NDP-cukor csoportok mindegyike a glikozil-transzferázok külön csoportját képezi, és a több, mint száz glikozil-transzferáz mindegyike valamely egyedi glicidinkötés kialakulását katalizálja. A glikozil-transzferázok tulajdonságait nem ismerjük részletesen. Nem világos például, hogy a legtöbb enzim melyik szénhidrát-szekvenciát ismeri fel.
Az oligoszacharid-szintézisben legalkalmasabb enzimek a Leloir-út enzimei. Az ilyen alkalmazás sikere két tényező függvénye: a cukor-nukleozid-foszfát gyakorlatilag elérhető árú és a glikozil-transzferáz hozzáférhető legyen. Az első feltételt a legtöbb közönséges NDP-cukor, köztük az emlősbioszintézisekben fontos NDP-cukor, kielégíti. A második feltétel kielégítése azonban továbbra is nagy gond. Mostanáig nagyon kevés glikozil-transzferáz hozzáférhető. Az ilyen típusú szénhidrátszintézisek egyetlen korlátozó tényezője az ilyen enzimek hozzáférhetősége.
Az irodalom szerint a legtöbb glikozil-transzferáz, elsősorban az emlős forrású glikozil-transzferáz izolálása nehéz [Shurés Roth, BBA 415, 473-512. (1975)]. Ez abból következik, hogy ezek a fehéijék nagyon kis koncentrációban és membránkötésben vannak jelen. Emellett annak ellenére, hogy néhány glikozil-transzferáz immobilizált, ezek az enzimek nem stabilak. Kereskedelmi forrásból eddig nagyon kevés glikozil-transzferáz beszerzése lehetséges, és ezek is drágák.
A fentiekből látható, hogy az enzim-génsebészeti (azaz klónozási) eljárások előtt nagy lehetőségek vannak. Már eddig is számos glikozil-transzferázt, köztük galakto-, fukozil- és szialil-transzferázt klónoztak. A klónozóeljárások további javításával várhatóan az egyéb glikozil-transzferázok klónozása is felgyorsul, és stabilitásuk is javul.
Ennek megfelelően az oligoszacharidok, poliszacharidok, glikoproteinek, glikolipidek és hasonló ilyen vegyületek potenciális alkalmazása és megfelelő mennyiségben való előállításának nehézségei vagy előállíthatatlansága miatt továbbra is fennáll a hatékonyan, olcsón, sztereospecifikusan és általánosan alkalmazható előállítási eljárásuk iránti igény.
A találmány szerinti megoldás egyik célja szacharid, elsősorban oligoszacharid-, poliszacharidkészítmények és oligoszacharidegységeket magukban foglaló kémiai csoportokat tartalmazó készítmények előállítása.
A találmány szerinti megoldás másik célja különféle szacharidkészítmények előállítása, beleértve a természetben nem előforduló szacharidkészítményeket is.
A találmány szerinti megoldás további célja humán vagy állatbetegségek mérséklésére alkalmas szacharidkészítmények előállítása.
A találmány szerinti megoldás további célja szacharidkészítmények előállítására alkalmas javított eljárás megvalósítása.
A találmány szerinti megoldás további célja szacharidkészítmények előállítására alkalmas enzimatikus eljárás kidolgozása.
A találmány szerinti megoldás még további célja szacharidkészítmények szintetizálására alkalmas enzimek előállítási eljárásának kidolgozása.
A találmány szerinti megoldás következő célja a találmány szerinti szacharidkészítmények szintézisében alkalmazható berendezés létrehozása.
A fenti és egyéb célkitűzések találmány szerinti megvalósítását oligoszacharidok, poliszacharidok, glikolipidek, glikoproteinek és egyéb szacharidkészítmények előállítására alkalmas enzimatikus eljárással érhetjük el. Az eljáráshoz tartozik egy előre kiválasztott szacharidegység donorcsoporttól akceptorcsoportig való enzimsegített továbbítása is. A többségében szacharidegységet tartalmazó szacharidkészítmények előnyös előállítását úgy végezzük, hogy a szacharidegységeket lépésenként olyan akceptorcsoportokhoz kapcsoljuk, amelyek maguk is a találmány szerinti eljárással előállított szacharidkészítmények.
Ennek megfelelően a szacharidkészítmények előállítása úgy történik, hogy előállítunk egy akceptorcsoportot, és ezt glikozil-transzferázzal érintkeztetjük. A glikozil-transzferázt úgy állítjuk elő, hogy az akceptorcsoportra specifikus legyen, és a szacharidegységet az akceptoregységhez továbbítsa. A találmány szerinti eljárást a lépések ismétlésével úgy folytatjuk le, hogy az első ismétlés terméke a második ismétlés akceptorcsoportja legyen, és így tovább.
A rajzok rövid ismertetése:
Az 1., 2. és 3. ábrán a találmány szerinti szacharidkészítmények glikozil-transzferáz által katalizált szintézisében alkalmazható berendezés vázlatos rajzát mutatjuk be.
A találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kivitelezését ismertetjük az alábbiakban.
A leírásban alkalmazott szacharidkészítmény kifejezés minden olyan kémiai csoportra vonatkozik, amely szerkezetében szacharidegységeket tartalmaz. Ilyen szacharidkészítmények például a cukrok, szénhidrátok, szacharidok, monoszacharidok, oligoszacharidok, poliszacharidok, glikoproteinek és glikolipidek. Az ilyen csoportokat tartalmazó elegyek és oldatok is szacharidkészítmények.
A szacharidkészítmények találmány szerinti előállítását szacharidegységek donorcsoporttól akceptorcsoportig való enzimsegített továbbításával végezzük. Az ilyen továbbítás az akceptor és donorcsoportok glikozil-transzferázzal való érintkeztetésével jön létre, és tipikusan az akceptor egység és a szacharidegység között sztereospecifikus kovalens kötést eredményez.
A találmány szerinti szacharidkészítmények várhatóan széleskörűen alkalmazható diagnosztikai, gyógyés farmakológiai szerek. Ha a kívánt cél-szacharidkészítmények cukorszekvenciáját már hagyományos eljárással meghatároztuk, a szacharidkészítmény megfelelő szintetikus vázlatának meghatározására általában egy retroszintetikus analízist végzünk. Az ilyen szintetikus vázlat előnyösen a kívánt szacharidkészítmény előállításához szükséges donorcsoportokat, akceptorcsoportokat és glikozil-transzferázokat azonosítja.
HU 216 881 Β
A találmány a szénhidrátszintézishez szükséges nagyszámú glikozil-transzferáz előállítása génsebészeti eljárástól teljesen különböző megközelítésen alapul. A találmány szerinti szacharidkészítmény szintetikus előállítási eljárásában egy előre kiválasztott szacharidegységet először enzimatikusan egy kezdeti akceptorcsoporthoz, azaz fehérje, glikoprotein, lipid, glikolipid vagy szénhidrát kiindulási anyaghoz kapcsolunk. Ezt követően előre kiválasztott szacharidegységeket a lépésenként előállított termékhez kapcsoljuk, és így a szacharidkészítményt kapjuk.
Mindegyik előre kiválasztott szacharidegység kapcsolásával intermedier terméket kapunk.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a szintézis kiindulási anyaga (azaz a fehérje, glikoprotein, lipid, glikolipid vagy szénhidrát) és a szintézis minden egyes lépcsőjében előállított intermedier termék egy olyan előnyösen alkalmazható, megfelelő glikozil-transzferáz, amely előállítására (kinyerésére) a célszacharidkészítmény-szintézis következő intermedier termékéhez való kapcsolódást specifikusan katalizálja.
Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás bármely adott lépésben szükséges glikozil-transzferázt az intermedier termékkel (az akceptorcsoporttal) izoláljuk, és a cél-szénhidrátmolekula szerkesztéséhez szükséges következő szacharidegység akceptorcsoportjához való kapcsolásra alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárásban ezt a folyamatot, amelyben minden egyes ismétlésnél a következő szacharidegység kapcsolódásához szükséges egyedi glikozil-transzferázt kapjuk, a kívánt cél-szénhidrátmolekula előállításáig ismételjük.
Kidolgoztuk a szacharidegység akceptorcsoporthoz való kovalens kötéséhez szükséges reakciókörülményeket és koreagenseket is.
Az előnyös eljárásban az akceptorcsoport lehet fehérje, glikoprotein, lipid, glikolipid vagy szénhidrát, mint például monoszacharid, diszacharid, oligoszacharid vagy poliszacharid.
Egy másik előnyös eljárásban a glikozil-transzferázt egy szilárd hordozóhoz kapcsoljuk.
A találmány szerinti eljárás a szacharidegység akceptorcsoporthoz való specifikus kapcsolására alkalmas. donorcsoportként általában előnyösen szacharidnukleotideket alkalmazunk. Előnyös donorcsoportok a szacharidegységekkel végződő ceridin, guanozin és citidin foszfátanyagok.
A találmány az egyedi akceptorcsoportokra specifikus és az előre kiválasztott szacharidegység akceptorcsoporthoz való továbbítására alkalmas glikozil-transzferáz előállítási eljárására is vonatkozik. Az eljárást úgy folytatjuk le, hogy az akceptorcsoportot többségében glikozil-transzferázt tartalmazó eleggyel érintkeztetjük olyan körülmények között, amely az akceptorcsoport és az akceptorcsoportra specifikus glikozil-transzferáz hatásos kötésére alkalmas. Ezt követően a kötött glikoziltranszferázt elválasztjuk. Előnyösen a glikozil-transzferáz szekvenált, és a glikozil-transzferázt génsebészeti eljárással, megfelelő mennyiségben is előállítjuk.
A várhatóan glikozil-transzferázt tartalmazó elegy azonosítása a következőképpen történhet. A glikoziltranszferáz legtöbb közönséges glikozidos kapcsolódásra kifejtett hatását az irodalom ismerteti. Ez elsősorban a tej-oligoszacharidok vagy a tipikus (azaz a tömegesen előforduló) glikoprotein és glikolipid szénhidrátcsoportok esetén igaz. A legkevésbé ismertetett kapcsolódások esetén a vizsgálatokat azokra a szövetekre, szervekre, élelmiszer-organizmusokra irányíthatjuk, amelyekben a kapcsolódások előfordulnak. Általában igaz, hogy ha egy kapcsolódást egy adott forráshelyen megtalálunk, ott a kapcsolódást létesítő enzim is jelen van.
Abban az esetben, ha nem rendelkezünk egy forráshellyel, és csak egy szacharidszerkezetet ismertetünk, a legérzékenyebb szűrővizsgálatokkal olyan szervezeteket tesztelhetünk például, amelyek valószínűleg tartalmaznak ilyen szacharidszerkezetet. Abban az esetben például, ha a vegyület iduronsavat, Nacetil-galaktóz-amint és N-acetil-glukóz-amint tartalmaz, gerinces kötőszövetet alkalmazunk. Ha a célvegyület abekvózt tartalmaz, a megfelelő glikozil-transzferáz-előfordulást baktérium- és növényteszt-kísérletekkel vizsgáljuk.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható glikozil-transzferáz kimutatására számos irodalomban ismertetett eljárás alkalmazható. Ilyen eljárások például a következők: Furukawa és munkatársai, Biochem. J., (1985) 227:573-582. irodalmi helyen egy borát-impregnált papír elektroforéziskísérletet és egy fluoreszcens kísérletet ismertetnek (6. ábra); Roth és munkatársai Exp1 Cell Research (1983) 743:217-225. irodalmi helyen ismertetett eljárásban glukuronil-transzferáz korábban kolorimetrikus meghatározása helyett borátot alkalmaznak; Benau és munkatársai a J. Histochem. Cytochem. (1990) 35(1):23-30. irodalmi helyen diazóniumsók NADH-val végzett redukcióján alapuló hisztokémiai kísérletet ismertetnek.
A kívánt glikozil-transzferáz forráshelyének megtalálása után a forrást homogenizáljuk. Az enzim homogenátumból való tisztítását affmitáskromatográfiás eljárással végezzük, amelyben affinitásligandumként az akceptorcsoportot alkalmazzuk. Az eljárásban a homogenátumot a glikozil-transzferáz akceptorcsoporthoz való kötésére megfelelő körülmények között egy olyan szilárd anyagon vezetjük át, amely immobilizált akceptorcsoportot tartalmaz. A kötött glikozil-transzferázt tartalmazó szilárd hordozót ezután mossuk, majd egy eluálólépésben a glikozil-transzferázt a szilárd hordozóról deszorbeáltatjuk és összegyűjtjük. Az abszorbeált glikozil-transzferáz-eluálást például úgy végezzük, hogy a szilárd hordozón egy vizes só- (például nátriumklorid) oldatot vezetünk át.
A találmány gyakorlati alkalmazásakor a homogenátumból affmitáskromatográfiás eljárással elválasztott és egy előre kiválasztott szacharidegység akceptorcsoportba való bevitelére alkalmazott enzim olyan különböző glikozil-transzferázokat tartalmazó elegy, amelyeket a homogenátumban lévő egyéb idegen anyagokból tisztítottunk, melyek a tisztított glikoziltranszferázok kívánt aktivitásával kölcsönhatásba lépő enzimeket tartalmaznak. Ennek megfelelően a találmány szerinti glikozil-transzferázok gyakran külön4
HU216 881 Β böző glikozil-transzferázok elegyei. Ez az anyag szükség esetén tovább tisztítható, és így egyetlen glikoziltranszferáz izolálható és alkalmazható a találmány szerinti eljárásban, de ez a tovább tisztítás általában nem szükséges.
A találmány szerinti eljárással egy olyan akceptorcsoportot állítunk elő, amely egy előre kiválasztott szacharidegységhez való kovalens kötődésre képes. Ilyen jellemző akceptorcsoportok lehetnek fehérjék, glikoproteinek, lipidek, glikolipidek és szénhidrátok. Ezek az akceptorcsoportok nyilvánvalóan olyan mértékben előnyösek, amennyire a kívánt szacharidkészítmény szerkezeti komponenseként jelen vannak. így például N-acetil-neuramil-a-(2 - 3 )-galaktozil-3-( 1 -4)-N-acetil-glukóz-amin szacharidkészítmény előállításakor előnyös akceptorcsoport az N-acetil-glukóz-amin és galaktozil-P-l-4-N-acetil-glukóz-amin. Az is nyilvánvaló, hogy ha egy akceptorcsoport szacharidegységgel végződik, a következő szacharidegység tipikusan a zárószacharid nem redukáló végéhez kapcsolódik.
Valamely akceptorcsoporthoz továbbítandó szacharidegység továbbítása a szacharidegységet befogadó donorcsoporttal történik. A találmány szerinti donorcsoport tartalmazza a továbbítandó szacharidegységet, és a megfelelő akceptorcsoporttal és glukozil-transzferázzal érintkeztetve a szacharidegység akceptorcsoportnak való átadására képes. Előnyös donorcsoportok a szacharid-nukleotidek, mint például szacharidvégű uridin-foszfátok, szacharidvégű guanozin-foszfátok és szacharidvégű citidin-foszfátok.
Nyilvánvalóan azok a donorcsoportok előnyösek, amelyek az akceptorcsoporttal és egy glikozil-transzferázzal érintkezve szacharidegység-komponensüket az akceptomak könnyen átadják. így például az uridindifoszfát-galaktóz előnyösen galaktóz N-acetil-glukózaminhoz, a monofoszfát-N-acetil-neuraminsav pedig az N-acetil-neuraminsav, szialinsav galaktozil^-(l-4)acetil-glukóz-aminhoz való továbbítására alkalmas.
Egy szacharidkészítmény előállításához szükséges akceptorcsoportok és donorcsoportok azonosítása után mindegyik akceptor/donor párhoz elő kell állítani egy glikozil-transzferázt. A szakemberek számára ismert, hogy a glikozil-transzferázok tágabb értelemben olyan enzimek, amelyek szacharidegységek egyik kémiai csoportból (a leírásban donor) másik kémiai csoportba (a leírásban akceptor) való áthelyezésére alkalmasak, és fenomenológiai elnevezésük az általuk átadott szacharidegység szerint történik. Ennek megfelelően a galaktozil-transzferáz galaktózt, a íukozil-transzferáz pedig fukózt továbbít.
A találmány szerinti glikozil-transzferázok egy előre meghatározott szacharidegység akceptorcsoporthoz való továbbítására alkalmasak. A glikozil-transzferázok előnyösen egy akceptorcsoportra vagy legalább valamely jellemző, aktív vagy nem védett részére specifikusak. Valamely glikozil-transzferáz specifikus jellegét az akceptorcsoporttal való érintkeztetés vagy közeli szomszédság hatására létrejövő akceptorcsoport speciális szekvenált csoportjához való kötési hajlama, valamint a speciális szacharidegység akceptorcsoporthoz való továbbítására kifejtett hatása határozza meg.
A glikozil-transzferázok jelenleg csak természetes forrásokból állnak rendelkezésre, ezért számuk korlátozott. Az ismert glikozil-transzferázok köztudottan csak az olyan szacharidegységek továbbítására alkalmasak, amelyek mind a továbbított szacharidegység kémiai azonossága, mind pedig az akceptorcsoporthoz való következő kapcsolásának sztereokémiája tekintetében nagyon specifikusak. így például ismeretes, hogy egy Nacetil-neuraminil-transzferáz az N-acetil-neuraminsav olyan akceptorcsoporthoz való továbbítására alkalmas, amely csak egy galaktózcsoportot tartalmaz; és az így előállított szacharidkészítmény az N-acetil-neuraminsav-egység és galaktózegység között egy cc-(2-3)-kapcsolódást tartalmaz.
A találmány a természetben található cukorkapcsolódások szerkesztését is megengedi. így például jelenleg még nem megvalósított a természetben nem megtalálható galaktóz a-(l-2) kapcsolódása N-acetilneuramininsavhoz, azonban találmány szerinti eljárás a későbbiekben hozzáférhető glikozil-transzferázok bármely típusához alkalmazható.
Számos glikozil-transzferáznak ismerjük a tulajdonságait, azonban jelenleg legtöbbjük nem teljesen jellemzett. A találmány szerinti eljárással azonban azonosítható és előállítható mindegyik, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható glikozil-transzferáz. Kutatásaink során azt tapasztaltuk, hogy egy akceptorcsoport affinitáskromatográfiás eszközként alkalmazható olyan enzimek izolálására, melyek használhatók speciális szacharidegységek továbbítására, és így egyéb glikozidok szintetizálására.
Az előnyös eljárásban az akceptorcsoportot például egy szilárd hordozón immobilizáljuk. A leírásban alkalmazott szilárd hordozó kifejezés a félszilárd hordozókra is vonatkozik. Az immobilizált akceptorcsoportot a várhatóan glikozil-transzferázokat, mint például a természetben előforduló sejthomogenátumot tartalmazó eleggyel érintkeztetjük. Mivel az immobilizált akceptorcsoport a rá specifikus enzimet köti meg, az ilyen rendszer akceptorkötött enzim megfigyelésére alkalmazható.
Az akceptorkötött enzim megfigyelését a következőképpen végezhetjük. A sejthomogenátumot az immobilizált akceptorcsoportokra visszük. Ezt például úgy végezhetjük, hogy a sejthomogenátumot immobilizált akceptorcsoportokat tartalmazó oszlopra töltjük. Az oszlopot ezután mossuk, és mérjük az akceptorcsoportokat tartalmazó oszlopon átmenő immobilizált fehérje mennyiségét. Amikor már nem detektálunk több fehérjét, az oszlopon az enzim eluálására vizes sóoldatot engedünk át. A kapott eluátummal meghatározzuk a glikozil-transzferázok jelenlétét. A mérésre alkalmazott eljárás azonos a Furukawa és munkatársai, Roth és munkatársai és a Beneu és munkatársai által kidolgozott és a fentiekben hivatkozott eljárásokkal.
Ha az akceptorcsoportokhoz nem kapcsolódik enzim [azaz az eluátum nem tartalmaz glikozil-transzferáz(oka)t], arra következtethetünk, hogy az elegy nem tartalmaz az adott akceptorra specifikus enzimet. Az
HU216 881 Β akceptorcsoporttal azután addig érintkeztetünk például állat- és/vagy növény-sejthomogenátumokat, amíg enzimkapcsolódás nem jön létre.
Ha az akceptorcsoporthoz egy enzim kötődik, akkor az anyagot elválasztjuk és tovább tanulmányozzuk. Az előnyös eljárásban az akceptort és az adott enzimet újra érintkeztetjük, ezt az érintkeztetést egy olyan donorcsoport jelenlétében végezzük, amely az akceptorcsoporthoz továbbítandó szacharidcsoportot tartalmazza. Ha ez az érintkeztetés a szacharidegység akceptorhoz való továbbítását eredményezi, az enzim olyan glikozil-transzferáz, amely jól alkalmazható a találmány gyakorlati megvalósításában.
Nyilvánvaló, hogy az egyszer már azonosított glikozil-transzferáz a szakterületen jól ismert eljárásokkal szekvenálható és/vagy sokszorozható. A sokszorosítást például olyan rekombináns eljárással végezzük, amelyben egy, a glikozil-transzferázt kódoló genetikai anyagot izolálunk, és a glikozil-transzferáz előállítására alkalmas végtelen sejtvonalat állítunk elő. A sokszorosítás olyan eljárás, amellyel feltehetően megvalósítható a találmány szerinti szacharidkészítmény ipari méretű előállítása.
A glikozil-transzferázt azonosítása után a szacharidegység akceptorcsoporthoz való továbbítására és kötésére alkalmas körülmények között az akceptorcsoporttal és a donorcsoporttal érintkeztetjük. Az adott szacharid továbbításra alkalmas és optimális körülmények, például idő, hőmérséklet és pH meghatározása rutinkísérletekkel történik. A továbbítás elősegítésére bizonyos koreagenseket is alkalmazhatunk. Előnyös például, ha az akceptor- és donorcsoportok glikozil-transzferázzal való érintkeztetését kétértékű kationok, elsősorban mangán-kationok, mint például a mangán-diklorid kationja jelenlétében végezzük.
Az előnyös találmány szerinti eljárásban a glikoziltranszferáz immobilizálását valamilyen szilárd hordozóhoz való hozzákapcsolással végezzük, és az akceptor- és donorcsoportok érintkeztetését ehhez hozzáadva képezzük.
Amint azt a fentiekben ismertettük, a találmány szerinti glikozil-transzferáz gyakran olyan glikozil-transzferáz-elegy, amely legalább egy, kívánt aktivitású glikozil-transzferázt tartalmaz, de alkalmazhatunk egyetlen tisztított glikozil-transzferázt is. Ebben az előnyös eljárásban az immobilizálást végezhetjük akár glikoziltranszferázok elegyével, akár az egyetlen tisztított glikozil-transzferázzal. Úgy is eljárhatunk, hogy a glikozil-transzferázt, donort és akceptort külön-külön feloldjuk, és az oldatokat érintkeztetjük.
Egy glikozil-transzferázok és szükség esetén akceptorcsoportok immobilizálására alkalmazott előnyös eljárást ismertetnek Pollack és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. (1980) /02:6324-36. irodalmi helyen. Ebben az eljárásban egy semleges pufferoldatban egy vízoldható polimert, mint például poli(akril-amid-ko-Nakril-oxi-szukcinimid)-et (PAN), egy térhálósító diamint, mint például trietilén-tetramint és egy glikoziltranszferázt kopolimerizálnak. Az enzim PAN-en való immobilizálása azért előnyös, mert kis mennyiségű enzim alkalmazható, nagy enzimaktivitás érhető el, és az enzim és polimer közötti kötés stabil.
Az immobilizálás előnyösebb eljárásában a glikozil-transzferázok aminocsoportjait szilárd hordozóban lévő oxiráncsoportokhoz [például Chan és munkatársai, Enzyme Eng. (1980) 5:457-460. vagy cianogénbromiddal aktivált SEPHADEX vagy SEPHAROSE hordozóhoz [Axen és munkatársai, Natúré (1967) 2/4:1302-1304],
Az egyik előnyös eljárásban a glikozil-transzferázt az azt tartalmazó, mérsékelten tisztított készítményből immobilizálják. A nagyon tiszta enzimkészítmények (azaz, amelyek specifikus aktivitása 1 nmol továbbítás/pg fehérje/inkubációs perc) szilárd hordozókhoz kovalensen kevésbé hatékonyan immobilizálhatók, mert a %-os derivatizálás kisebb a 10-szer vagy 100szor szennyezettebb anyagokéhoz viszonyítva.
Megjegyzendő, hogy a glikozil-transzferáz aktív helyeinek immobilizálás hatására bekövetkező gyengülését el kell kerülni. Megfigyeltük, hogy a glikoziltranszferáz immobilizációs eljárás alatti speciális védelmével a szennyező enzim aktivitása megszüntethető. A glikozil-transzferáz immobilizációs eljárás alatti védelmét megvalósíthatjuk az enzim által igényelt kationnal, az enzim által felismert nukleotiddal és az enzim által felismert akceptorral. így például a galaktoziltranszferáz immobilizációs eljárás alatti védelmét, a mobilizációs eljárástól függetlenül, végezhetjük Mn2+-kationnal, N-acetil-glukózaminnal és UDP-vel. Ilyen módon a szennyező proteázok az immobilizációs eljárás alatt egyáltalán nincsenek védve.
Mivel az immobilizációs eljárás során csak a kívánt glikozil-transzferázt védjük, a kívánt szacharidkészítmény szintézisét zavaró enzimek aktivitása megszűnik. Ilyen zavaró enzimek például az egyébként a kívánt glikozil-transzferázt megtámadó proteázok, valamint az egyébként a szacharidterméket megtámadó glikozidázok.
Amint azt a fentiekben ismertettük, a találmány szerinti szacharidkészítmény, amelyet egy akceptorcsoport, egy donorcsoport és egy glikozil-transzferáz érintkeztetésével állítunk elő, akceptorcsoportként szolgálhat további enzimek izolálására, valamint a következő szacharidegységek transzferálásához. Az ilyen érintkeztetéssel előállított szacharidkészítményekhez előnyösen szénhidrogén, valamint körülbelül három szacharidegységnél hosszabb szacharidláncok szintézise esetén adunk szacharidegységet.
így például az N-acetil-neuraminil-a-(2-3)-galaktozil-P-(l-4)-N-acetil-glukózamin triszacharid előállításakor a galaktozil-P-( 1 -4)-N-acetil-glukózamin diszacharidot a találmány szerinti eljárással állítjuk elő, majd a következő egység hozzáadásakor akceptorként alkalmazzuk. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti szacharidkészítményhez hozzáadott szacharidegység lehet azonos vagy eltérő. A szacharidkészítményeket előnyösen emlősök gyógy- vagy megelőző kezelésére alkalmazzuk a 07/241012 számú, amerikai egyesült államokbeli bejelentésben ismertetettek szerint.
HU 216 881 Β
A találmány szerinti szacharidkészítmények sejtfelületreceptor-blokkoló szerként számos vírusos, bakteriális vagy gomba eredetű betegség, mint például tüdőgyulladás, cukorbaj, húgytraktusfertőzés, periodontális betegségek és hasmenés hatásos kezelésére alkalmazhatók. így például a találmány szerinti eljárással előállított oligoszacharidok különböző kórokozók, mint például a tüdőgyulladást előidéző baktérium emlősmembránmolekulákhoz való kötődését akadályozzák. Az ilyen kórokozók kromatográfiás vagy elektroforézis-eljárással elválasztott sejtglikoproteinekkel és glikolipidekkel inkubálhatók. A specifikus kötődési minta detektálása után a célvegyületet megelemezzük, és a gátló szacharidkészítményt előállítjuk. Ha valamelyik szacharidkomponens a kívánt funkcióknak megfelel, a specifikus szacharidkészítmény a kórokozó kötődését megakadályozza.
A találmány szerinti eljárással előállított szacharidkészítmények a következő területeken alkalmazhatók:
1) Táplálékkiegészítőkként
- csecsemőtápszerekben (például al-2 βΐ—4 βΐ—3 βΐ—4 fuc->gal->glcN Ac->gal->glu),
- öregkori tápszerekben,
- speciális készítményekben.
2) Baktérium elleni készítményekként:
- tüdőgyulladás ellen (például βΐ—3/4 βΐ—4 galNAc->gal-»glu),
- húgytraktusfertőzés ellen, (például al-2 βΐ—4 βΐ—3 βί-4 fuc->gal->glcNAc->gal->glu),
- fogszuvasodás ellen [például al-4 al-4 glu->(glu->)4-25Í.
- periodontális betegségek ellen (például α2-3 βΐ—3
NAN->gal->galNAc),
- hasmenés ellen (például βΐ—4 βΐ—3 βί-4 galNAc->gal->glcNAc->gal->glu),
Tal-2 fuc
- sebészeti (nozokomiális) fertőzések ellen,
- katéterrel kapcsolatos fertőzések ellen.
3) Daganat elleni készítményként
- kemény tumormetasztázis ellen (például α2-3 βΐ—3 βΐ—3
NAN->gal->galNAc->gal).
Tál-4 fuc
4) Gyulladásgátló készítményként
- neutrofil lemezkekölcsönhatás ellen,
- WBC-endotélium kölcsönhatás ellen.
5) Hajózásban ellenállás-csökkentő szerként
- hajótesteknél.
6) Fogamzásgátló szerként [például βΐ—3 βί-4 βΐ—3 βΐ—4 glcNAc->gal->(glcN Ac->gal->) H 6].
7) Vírus elleni készítményként
- herpesz,
- influenza és
- HIV-vírus ellen.
8) Gombák és penészfélék elleni készítményként
- száj- és hüvelykandidiázis ellen [például: glükomannán komplex, a-D-MAN(l-6)n, elágazó a-(l-2) L-RHAM, D-Gal, D-Glc,
O ±-P-O-cukor],
I
O
- sugárgomba ellen.
9) Élelmiszer-adalékként [például gumi tragantmézga, a-D-GalAp(l-4)n T
D-Xylp ±a-L-Fucp vagy ± β-D-Galp],
- emulgeálószerként,
- sűrítőszerként (például karragenan (család), [D-Galp a-(l-3) D-Galp β-(1-4)]η),
T T
6- vagy 2 SO4 2-SO4 vagy vagy 2,6-diSO4
3,6-anhidro
10) Állatgyógyászatban
- baktérium,
- vírus,
- gomba és
- gyulladás elleni szerként.
A fentieknek megfelelően a találmány olyan gyógyszer- és egyéb szacharidkészítményeket tartalmazó készítményekre, mint például élelmiszer-készítményekre vonatkozik, amelyeket a találmány szerinti eljárással állítunk elő. A szacharidkészítmény koncentrációja a gyógyszer- és élelmiszer-készítményekben egyaránt 10 + pg/ml-100 mg/ml. Valamely adott gyógyszer- és élelmiszer-készítmény szacharidkészítmény-tartalma az alkalmazott szacharid aktivitásának függvénye. A gyógyszerkészítmények szacharidkoncentrációja az adott vegyület in vitro aktivitásának függvénye. Az élelmiszer-készítmények találmány szerinti szacharidkészítmény koncentrációját pedig a hozzáadott vegyület ismert aktivitása szerint határozzuk meg.
Például az anyatejkészítmény annyi fentiekben ismertetett szacharidkészítményt tartalmaz, amennyi a csecsemőtápszerként és a húgytraktus fertőzései elleni szerként való alkalmazásra egyaránt alkalmas. A találmány szerinti szacharidkészítmények a kereskedelmi
HU 216 881 Β csecsemőtápszerekkel együtt, azok hatásának javítására alkalmazhatók.
A csecsemőtápszerek találmány szerinti szacharidkészítmény-tartalma 0,1 pg/ml-1000 pg/ml. Az anyatej szacharidkészítmény-tartalma körülbelül 10 pg/ml.
A gyógyszerkészítményeknek piromentesnek kell lenniük. A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket a szájon át, intravénásán, intramuszkulárisan, rektálisan, bőrön át vagy orron át (például orr-sprayként) alkalmazható gyógyszerkészítmények előállítására ismert eljárásokkal állítjuk elő. Előállíthatunk helyi kezelésre alkalmas készítményeket, például krémeket, kenőcsöket vagy szuszpenziókat is.
Megemlítettünk néhány, élelmiszer-, textil-, petróleumiparban, valamint elsődlegesen a gyógyászatban alkalmazható, a hatóanyagként szacharidot tartalmazó szacharidkészítményt, amely ipari előállítására alkalmas eljárás hiányában nem kapható jelenleg.
A találmány szerinti eljárás először teszi lehetővé az ilyen szacharidkészitmények nagy mennyiségű előállítását. Az eddig legfeljebb kis mennyiségben beszerezhető szacharidkészitmények a találmány szerinti eljárással grammnyi mennyiségektől kilogrammnyi mennyiségekig előállíthatok. A találmány szerinti szacharidkészítmények tisztasága nagyobb, mint 95 tömeg%. A nagy tisztaságú készítményeket igénylő alkalmazási területekre 98-100 tömeg%-os szacharidkészitmények is előállíthatok.
A találmány szerinti eljárással először válik lehetővé olyan gyógyszer- és egyéb készítmények előállítása, amelyek hatásos mennyiségű szacharidkészítményt tartalmaznak. A találmány szerinti készítmények találmány szerinti szacharidkészítmény-tartalma legalább 100 mg, előnyösen 500 mg, és legfeljebb a készítmény 95 tömeg%-ának megfelelő mennyiségű.
A találmány további tárgya olyan berendezés, amely a találmány szerinti szacharidkészítmény glikoziltranszferázzal katalizált előállítására alkalmas.
A berendezés vázlatos rajzát az 1., 2. és 3. ábrákon mutatjuk be.
A berendezés alapját egy olyan reakciókamra képezi, amelyben az összes glikozil-transzferázt, az összes előre kiválasztott szacharidegységet és kiindulási akceptorcsoportot társítjuk. Az elegyből a glikoziltranszferáz specifikus volta következtében megfelelő idő alatt a találmány szerinti szacharidkészítmény képződik.
Az 1., 2. és 3. ábrákon ismertetett berendezés a találmány szerinti eljárás kivitelezésére alkalmas. A berendezés alapja egy bemenettel és kimenettel ellátott reaktor. A reaktor lehetővé teszi, hogy előre kiválasztott szacharidegységek többségét egymás utáni lépcsőkben egy akceptorcsoporthoz kapcsoljuk. A reakció katalizálását minden egyes kovalens kötés esetén a rá jellemző glikozil-transzferáz végzi. Legalább három, előnyösen négy, és még előnyösebben négynél több, mint például öt, hat, hét vagy ettől is több, különböző, előnyösen immobilizált glikozil-transzferázt alkalmazunk.
A bemeneti egység lehetővé teszi, hogy az akceptorcsoportok és az előre kiválasztott szacharidegységek többsége a reaktorban szacharid készítménnyé szintetizálódjon. A bemeneti egység előnyösen a glikoziltranszferáz, előnyösen immobilizált alakban, reaktorban való betáplálására is alkalmas. A kimeneti egység a szacharidkészítmény reaktorból való leürítését teszi lehetővé.
Az 1. ábrán olyan oszlopreaktort mutatunk be, amely szilárd hordozó tölteléket tartalmaz. Az eljárásban alkalmazott különböző glikozil-transzferázok (Ei_3) a szilárd hordozóban véletlenszerű eloszlással, vagy az 1. ábrán ismertetett zónákban (Z,_3) elrendezve vannak jelen. A reaktor bemenettel (be) és kimenettel (ki) van ellátva. A reaktor működtetése során a kiindulási akceptorcsoportot (az ábrákon A jelű anyagot) és az előre kiválasztott szacharidegységet (az ábrákon a B, C és D jelű anyagokat) a bemeneti egységen (be) keresztül betápláljuk a reaktorba, és átvezetjük a szilárd hordozón, miközben a specifikus glikozil-transzferáz(ok) hatására kialakul a szacharidkészítmény. Az A-B-C-D jelű molekulával jellemzett szacharidkészítményt a kimeneti egységen (ki) keresztül nyerjük ki.
A 2. ábrán bemutatott berendezés felépítésében nagyon hasonló az első ábrán bemutatotthoz, azzal a különbséggel, hogy az egyes zónákhoz (adott esetben az első zóna kivételével) külön-külön bemeneti egység tartozik. A reaktor működtetése során a szilárd hordozó tetejére betápláljuk a kiindulási akceptorcsoportot (A) és az előre kiválasztott szacharidegységet (B), majd a reakcióelegy áramlása irányában elrendezett zónákba (Ζ,_3) betápláljuk az adott előre kiválasztott szacharidegységre specifikus glikozil-transzferázt (Ei_3; ezt a lépést az oszlopreaktor összeállításakor is elvégezhetjük). A többi, különböző, előre kiválasztott szacharidegységet (C, D) a reakcióelegy ábrán látható áramlási iránya mentén a megfelelő helyen, külön-külön tápláljuk be.
A 3. ábrán látható előnyös berendezésben a reaktor n számú, egymással sorosan kapcsolódó és így soros folyadékkapcsolatban lévő reakciózónát (Zo, Zn, Zn+I) tartalmaz, és az n értéke legfeljebb a kapcsolandó szacharidegységek számával egyező érték. Mindegyik reakciózóna legalább egy olyan glikozil-transzferázt tartalmaz (E,-E1^n+I), amely egy előre kiválasztott szacharidegység (A, Xn) előző zónában képződött intermedier termékhez való kapcsolódását specifikusan katalizálja. A berendezés adott esetben az egyes reakciózónák között elhelyezett, azokkal folyadékkapcsolatban lévő (4) tisztítóegységet is tartalmaz, amely az adott zóna leüríthetősége érdekében kimeneti egységgel van ellátva.
Ebben a folyamatban az A kiindulási akceptorcsoport és az akceptorcsoporthoz kapcsolandó B első, előre kiválasztott szacharidegység átmegy az első reakciózónán (Zo), amely az első előre kiválasztott szacharidegység kiindulási akceptorcsoporthoz való kapcsolódását specifikusan katalizáló glikozil-transzferázt (Ej) tartalmazza. Ennek hatására egy úgynevezett első intermedier termék képződik, amelyet a második reakciózónába (n=l) továbbítunk, ahol a második, előre kiválasztott szacharidegységgel (Xn), vala8
HU 216 881 Β
Kémcső sorszáma Triszacharid aktivitása (cpm) mint a második, előre kiválasztott szacharidegység első intermedier termékkel való kapcsolódását specifikusan katalizáló glikozil transzferáz (EI+n) találkozik. Ezt az eljárást a reakciózóna számának megfelelően addig ismételjük, amíg az A-B-(Xn)-Z általános képletű szacharidkészítmény kialakul. A képletben az X jelentése egymástól független szacharidegység.
Egy másik, szintén a 3. ábrán bemutatott berendezésben megvalósítható eljárásban úgy járunk el, hogy az egyes reakciózónákban képződő intermedier terméket a reaktorok között elhelyezett, azokkal folyadékkapcsolatban lévő (4) tisztítóegységben tisztítjuk. Az egységben azokat a szennyeződéseket távolítjuk el, amelyek különben a következő, előre kiválasztott szacharidegység adott intermedier termékhez való kapcsolódását akadályoznák.
A következő példákat a találmány részletesebb megismertetése érdekében mutatjuk be.
1. példa
N-Aceti-neuraminil-a-(2—3)-galaktozil-$-(l -4)-Nacetil-glukóz-amin triszacharid előállítása db kémcső mindegyikébe 10 μΐ 7,4 pH-jú káliumfoszfát-puffert, 10 μΐ 50 mmolos mangán-klorid-oldatot, 17000 CPM citidin-monofoszfát-[14C]-N-acetil-neuraminsavat, 25 μΐ galaktozil-transzferázt és 25 μΐ N-acetil-neuraminil-transzferázt adtunk. A glikozil-transzferázt marhakolosztrum (tehenészetekben, tejgazdaságokban általánosan beszerezhető néhány napon belül ellett tehenek fejésével) Sephadex G-100 gélkromatográfiás tisztításával nyertük [Ilyen jellegű eljárást ismertetnek például a következő irodalmi helyek: E. L. V. Harris, S. Angal: „Protein Purification Methods: A Practical Approach”, Practical Approach Series (1979. február), Romero-Piffiguer és Riera, J. Immunoi Methods 30(2), 153-9. (1979)].
Az 1. kémcső tartalmához 10 μΐ 40 mmolos uridindifoszfát-galaktózt és 10 μΐ 40 mmolos N-acetil-glükózamint adtunk. Az 1. kémcsövet 1 órán át jégben inkubáltuk.
A 2. kémcső tartalmához 10 μΐ 40 mmólos uridindifoszfát-galaktózt adtunk. A 2. kémcsövet 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk.
A 3. kémcső tartalmához 10 μΐ 40 mmólos N-acetillaktóz-amint adtunk. A 3. kémcsövet 1 órán át 37 °Con inkubáltuk.
A 4. és 5. kémcső tartalmához 10 μΐ 40 mmólos uiridin-difoszfát-galaktózt és 10 μΐ 40 mmólos N-acetil-glükóz-amint adtunk, és a kémcsöveket 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk.
Az inkubálás után a kémcsövek mindegyikének tartalmát nátrium-tetraboráttal átitatott papíron nagy feszültségű elektroforézisnek vetettük alá. Az izotóposán jelölt triszacharidterméket mobilitása alapján azonosítottuk úgy, hogy a mobilitást a 3. kémcsőben képződött termék (szintén triszacharid) mobilitásával hasonlítottuk össze.
A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze:
0
0
3375
670
954
Látható, hogy a 4. és 5. kémcsőben a megfelelő akceptorcsoportok, donorcsoportok és glikozil-transzferázok jelenlétében a kiindulási anyagokból a kívánt triszacharidtermék képződött. A sziálsav, az N-acetilneuraminsav szacharidvegyületekbe történő beépítése speciális problémát jelent a szintetikus szerves kémikusok számára a glikozidos kötés savas körülmények közötti labilitása miatt. A védőcsoportot ugyanis erősen savas körülmények között kell eltávolítani. Amennyiben citidin-monofoszfát-N-acetil-neuraminsav alkalmazásával enzimatikusan szintetizálunk triszacharidot, kiküszöböljük az ezzel kapcsolatos szintetikus problémákat.
Feltételezhető, hogy a reakció az alábbi lépéseken keresztül megy végbe: először egy akceptorcsoport (Nacetil-glukózamin) egy donorcsoporttal (uridin-difoszfát-galaktóz) és egy glikozil-transzferázzal (galaktozil-transzferáz) érintkezik, és így egy olyan szacharidkészítmény képződik (galaktozil-3-(l-4)-N-acetil-glukóz-amin), amely egy második donorcsoporttal (citidinmonofoszfát-N-acetil-neuraminsav) és egy második glikozil-transzferázzal (N-acetil-neuraminil-transzferáz) való érintkezéskor akceptorcsoportként viselkedik.
A 4. és 5. kémcsövekben triszacharidtermék képződött a kiindulási monoszacharidokból, amit a 3. kémcsőben képződött termékkel való összehasonlítással igazoltunk. A 3. kémcsőben ugyanis triszacharidtermék keletkezett, egy diszacharid akceptorcsoport (N-acetillaktózamin) citidin-monofoszfát-N-acetil-neuraminsawal való, N-acetil-neuraminil-transzferáz katalizálta reakciójával.
A 2. kémcsőben nem keletkezett triszacharid, ami azt mutatja, hogy a triszacharid képződéshez megfelelő akceptorcsoport jelenléte szükséges. Az 1. kémcsőben - bár itt jelen volt a megfelelő akceptorcsoport - szintén nem keletkezett triszacharid, ami azt igazolja, hogy a triszacharidszintézishez megfelelő enzimre (glikoziltranszferáz) van szükség, mivel alacsony hőmérsékleten az enzim aktivitásának hiánya miatt nem jön létre a termék.
Itt jegyezzük meg, hogy a találmány szerinti eljárás feltehetően az N-acetil-galaktózaminil-a-(l-3)-fukozilcc-(l -2)-galaktozil^-(l -4)-N-acetil-glükóz-aminil-3(l-3)-galaktóz (hasmenést okozó baktérium elleni vegyület) és N-acetil-galaktózaminil-3-(l-4)-galaktozilP*(l-4)-glükóz (tüdőgyulladást okozó baktérium elleni vegyület) előállítására is alkalmas.
2. példa
Előirat tetraszacharid bioszintézisére
Enzimek:
N-acetil-glukózaminil-transzferáz
Humán kolosztrumot (az Albert Einstein Healthcare NetWork, Philadelphia, PA, USA Újszülött Osztályától,
HU 216 881 Β a páciensek aláírt egyetértő nyilatkozatával beszerezve) centrifugálunk 1 órán át, 70 000 g-vel. A 25%-os telítettségű ammónium-szulfáttal való kicsapás során nyert felülúszót az ammónium-szulfát eltávolítása érdekében dializáljuk. A dializált mintát Sephadex G-200 oszlopra (2,5 χ 83 cm) visszük fel. A fehérjeprofilt 280 nm-en, spektrofotometriás elemzéssel határozzuk meg, a transzferázaktivitást mutató frakciókat pedig radioaktivitás mérésén alapuló vizsgálati eljárással azonosítjuk [Roth és munkatársai, J. Cell. Bioi. 51, 536-547. (1971)]. Az egyetlen enzimcsúcsot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és Amicon-szűréssel 10-szeresére töményítjük be. Az egyesített mintákból kapott enzimpreparátum aktivitását újra megmérjük, fehérjetartalmának meghatározására pedig BioRad vizsgálatot végzünk. A készítmény specifikus aktivitása 5,3 pmol/pg percenként.
Galaktozil-transzferáz
Humán kolosztrumot centrifugálunk 15 percig, 8700 g-vel. A felülúszót szűrővásznon átszűrjük, majd Sephadex G-100 oszlopra (2,5x90 cm) visszük fel. A fehérjeprofilt 280 nm-en, spektrofotometriás elemzéssel határozzuk meg, a enzimaktivitást mutató frakciókat pedig radioaktivitás mérésén alapuló vizsgálati eljárással azonosítjuk [Roth és munkatársai, J. Cell Bioi. 57, 536-547. (1971)]. A legnagyobb aktivitású frakciókat egyesítjük, és Amicon-szűréssel 10-szeresére töményítjük be. Az egyesített mintákból kapott enzimpreparátum aktivitását újra megmérjük, fehérjetartalmának meghatározását a fentivel azonos módon végezzük. A készítmény specifikus aktivitása 15,4 pmol/pg percenként.
Az enzimek immobilizálása
N-acetil-glukózaminil-transzferáz
300 mg (1,2 ml) Eupergit-gyöngyöt háromszor ionmentes vízzel és háromszor aszeptikus Hepes-sel pufferolt vízzel mosunk. 1 ml enzimpreparátumhoz aszeptikusán gyöngyöt, UDP-t, laktózt, mangán-kloridot (végső koncentrációk rendre: 10, 25 és 10 mM), továbbá Hepes-pufferolt oldatban egy csepp kloroformot adunk hozzá. A gyöngyöket enyhén keveijük 4 °C-on, 2,5 napon át. Eközben egyenletes időközönként alikvot mintákat veszünk, és azokat megvizsgáljuk. A származékképződés leállítása érdekében a gyöngyöket háromszor mossuk aszeptikus pufferrel, és a pufferben, UDP, laktóz, mangán-klorid és kloroform jelenlétében hideg helyen tároljuk.
Galaktozil-transzferáz
3,75 g gyöngyöt háromszor ionmentes vízzel, majd háromszor Hepes-sel puffereit vízzel mosunk. A gyöngyöt Hepes-sel pufferolt oldatban, UDP-vel, GlcNAc-cal, mangán-kloriddal (a végső koncentráció minden esetben 10 mM) és egy csepp kloroformmal együtt 3 ml enzimpreparátumhoz adjuk (az optimális származékképződés mindkét esetben körülbelül 1 mg fehérje/200 mg gyöngy). A származékképzést és a tárolást a fent ismertetett eljárással végezzük, azzal a különbséggel, hogy a galaktozil-transzferáz esetében GlcNac-t alkalmazunk laktóz helyett, amely utóbbi az N-acetil-glukózaminil-transzferázhoz kötődő akceptorcsoport.
Tetraszacharid előállítása
N-acetil-glükózaminil-transzferáz-származékot (0,5 ml gyöngyöt) állandó keverés közben laktózzal (25 mM), UDPGlcNAc-al (80 μΜ) és mangán-kloriddal (10 mM) inkubálunk 21 órán át. Az inkubálást két párhuzamos eleggyel végezzük el. Az egyik elegyből származó felülúszót a kapott triszacharid (14 pg) meghatározására alkalmazzuk, a másik elegyből származó felülúszót pedig 0,5 ml, galaktozil-transzferázzal származékok gyöngyhöz adjuk. Ennek megfelelően tehát a galaktozil-transzferáz-származékot 14 pg triszacharid, 25 pM UDPgal és 10 mM mangán-klorid jelenlétében inkubáljuk. 24 óra múlva, szobahőmérsékleten, a második enzim katalizálta reakcióban körülbelül 1,6 pg tetraszacharid képződött. 31 óra elteltével 2,2 pg tetraszacharid keletkezett.
3. példa
Ebben a példában olyan reakciósémákat ismertetünk, amelyek a következő három, viszonylag komplex szerkezetű oligoszacharid előállítására alkalmasak: Aés B-tipusú tej-oligoszacharid (I. és II. oligoszacharid), valamint tragantmézga (III. oligoszacharid), amely élelmiszer-adalékként alkalmazott növényi oligoszacharid.
(I) galNACa 1 »(fuca 1,2—> )gal β 1,3—»(fuca 1,4—>) GlcNAcP 1,3—>gaipi ,4—>glc
Először glükóz-hexanolamin-glikozidot (glc-O(CH2)6-NH2) állítunk elő, amelyet a hexanolamin aminocsoportján keresztül egy CNBr-aktivált hordozón, például Sepharose hordozón rögzítünk. Ezután ennek mint affinitási ligandumnak az alkalmazásával humán tejből vagy kolosztrumból galaktozil-transzferázt tisztítunk, amely felismeri a glükózt, és hozzáköt ahhoz. A részben tisztított enzimmel galaktozilált glükózt, azaz laktózt állítunk elő.
Alternatív lehetőségként az olcsó és könnyen beszerezhető laktóz hexanolamin-glikozidját is megszintetizálhatjuk. Ebben az esetben az így kapott laktózszármazékot rögzítjük Sepharose-on, majd affinitási ligandumként N-acetil-glükózaminil-transzferáz humán kolosztrumból vagy humán plazmából való részleges tisztítására alkalmazzuk.
Ezt a második transzferázt használjuk fel azután Nacetil-glükózamin laktózhoz való hozzákapcsolására, amivel már triszacharidot állítunk elő. Az így kapott triszacharidot ismét Sepharose-on rögzítjük. A rögzített triszacharidot (sertés állkapocs alatti mirigyéből származó) [3l,3-galaktozil-transzferáz előállítására használjuk fel. Az így kapott enzimmel szintetizáljuk meg azután a következő lépéshez szükséges enzim, az (sertésmájból származó) al,4-fukozil-transzferáz tisztításához szükséges szubsztrátot.
Az al,2-fukozil-transzferázt (sertés állkapocs alatti mirigyéből) és végül az A-típusú tej-oligoszacharid szintézisét lezáró al,3-N-acetil-galaktózaminil-transzferázt (szintén sertés állkapocs alatti mirigyéből) ugyanilyen, lépésről lépésre végrehajtott módon, affinitási eljárással tisztítjuk. Az így kapott transzferázok mindegyikét - bármilyen, önmagában ismert módszer10
HU 216 881 Β rel - szilárd hordozón rögzítjük, majd a kapott mátrixokat oszlopokba töltjük.
Az enzimtartalmú oszlopokat abban a sorrendben, ahogyan a fent ismertetett módon a kisebb mennyiségű származékolt szubsztrátokat előállítottuk, az oldható formájú oligoszacharidok nagy mennyiségben történő, egyenként megvalósított előállítására használjuk fel. Egy alternatív, munkaigényesebb eljárásban az egyes enzimekkel sorra kis mennyiségű terméket állítunk elő, majd ezeket egy hexanol-amin-kapcsolócsoporton keresztül Sepharose-on immobilizáljuk. Ez az alternatív eljárás a hexanol-amin hat vegyülethez való kapcsolását és a származékképzés hat hexanol-amin-tartalmú glikoziddal való kivitelezésével igénylik. Az eljárás csak egyetlen hexanol-aminos lépést és egyetlen glükóz-hexanol-amin alkalmazásán alapuló, Sepharose-zal történő származékképzést igényel, ami viszonylag egyszerűen kivitelezhető eljárás.
A cukorcsoportok kapcsolási rendje kritikus. A lánc elejéhez közelebb eső fukózt (amelyik a 1,4-kötéssel a glcNAc-hoz kapcsolódik) a kész tetraszacharid maghoz kell kapcsolni a második fukóz (amely a al,2-kötéssel a galaktózhoz kapcsolódik) hozzáadása előtt. Végül a lánczáró (al,3-kötésű) galNAc hozzáadásával állítjuk elő a hét cukorból álló oligoszacharidot. Ezt a sorrendet a glikozil-transzferázok specifitásai határozzák meg.
(Π) gála 1,3—>(fuca 1,2—>)gal β 1,3—>(fuca 1,4—>)
GlcNAc β 1,3—>ga$ 1,4—>glc
Ha már az (I) képletű oligoszacharidot megszintetizáltuk, II szintézisét pontosan ugyanúgy végezzük, azzal a különbséggel, hogy először a - két vegyület azonos részét képező - hexaszacharidot alkalmazzuk al,3-galaktozil-transzferáz tisztítására, amelyet egy, galaktoziltranszferáznak - és nem N-acetil-galaktozil-transzferáznak - megfelelő védőcsoporttal származékolunk. Ezzel az enzimmel ezután megszintetizáljuk a B-típusú oligoszacharidot.
(III)
[. ..(fuca 1,2—>xy 1β 1,3—>)gal Aa 1,4—»(gal^ 1,4—> xy^l,3->)galA...]
A jelenleg csak egy Közel-Keleten honos fa kérgéből előállítható tragantmézga al,4-galakturonsavból álló vázszerkezetének szintetizálására alkalmas enzim izolálásához pektinből - amely citrusfélék héjkomponensének közönséges alkotóeleme - hexagalakturonánokat állítunk elő. Ezeket alkalmazzuk az enzim izolálása során affinitási ligandumként.
A következő lépésben ugyanezt az affinitási ligandumot alkalmazhatjuk xilozil-transzferáz izolálására faszövetekből. Ez az enzim a proximális al,3-xilozidok előállítására alkalmas. A xilozilált galakturonánokat a származékképzés után a fukozil- és galaktoziltranszferázok izolálására egyaránt felhasználjuk. Ezek az enzimek fukozilálják, illetve galaktozilálják xilozilált galakturonánt. Ennél az oligoszacharidnál a xilozilálás, fukozilálás és galaktozilálás mértékét a vegyületeknek a megfelelő, enzimet tartalmazó oszlopon történő átjuttatásának számával szabályozzuk, kísérleti úton. A képződött ismétlődő egységek száma a kiindulási galakturonsav-csoportok számának függvénye; ez a szám 4-20 monoszacharidegység lehet.
A fenti kitanítás fényében nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás számos módosítása és változata lehetséges. A csatolt igénypontsorozat által meghatározott oltalmi körön belül tehát a találmány a leírásban feltárt specifikus megvalósítási módoktól eltérően is megvalósítható.
Claims (39)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás szacharidvegyületek glikozil-transzferázzal katalizált előállítására előre kiválasztott szacharidegységeknek valamely akceptorcsoporthoz - amely fehérje, glikoprotein, lipid, glikolipid vagy szénhidrát történő sorozatos hozzákapcsolásával, azzal jellemezve, hogy:(i) egy előre kiválasztott szacharidegységnek az akceptorcsoportra való átvitelére alkalmas glikozil-transzferázt állítunk elő úgy, hogy az akceptorcsoportot glikozil-transzferázt tartalmazó eleggyel érintkeztetjük az akceptorcsoport és a glikozil-transzferáz kötődésére alkalmas körülmények között, és az akceptorcsoporthoz kötött glikozil-transzferázt - kívánt esetben egy, az előre kiválasztott szacharidegységet tartalmazó donorcsoporttal érintkeztetve - izoláljuk;(ii) az előre kiválasztott szacharidegység akceptorcsoporthoz való - a glikozil-transzferáz által katalizált - kapcsolódására alkalmas körülmények között és koreagensek hozzáadásával egy, szacharidegységgel megnövelt szacharidot állítunk elő; és (iii) az (i) és (ii) lépéseket legalább egyszer megismételjük úgy, hogy az adott ismétlés (ii) lépésében kapott terméket a következő ismétlés (i) lépcsőjében akceptorcsoportként alkalmazzuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) és az (ii) lépéseket egynél többször ismételjük meg az (iii) lépésben.
- 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozil-transzferázt tartalmazó elegyként sejthomogenizátumot alkalmazunk.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szénhidrátként monoszacharidot, diszacharidot, oligoszacharidot vagy poliszacharidot alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott glikozil-transzferázt szilárd hordozón immobilizáljuk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozóhoz kapcsolt glikozil-transzferáz előállítása során a glikozil-transzferáz aktív helyét az immobilizációs eljárás alatt védelemmel látjuk el.
- 7. Az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az akceptorcsoporthoz kötött szacharidok legalább egyikeként szacharid-nukleotidot alkalmazunk.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleotidként uridin-, guanidin- vagy citidin-foszfátot alkalmazunk.HU 216 881 Β
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első ismétlésben akceptorcsoportként fehérjét, glikoproteint, lipidet vagy glikolipidet alkalmazunk.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljá- 5 rás, azzal jellemezve, hogy az első ismétlésben akceptorcsoportként monoszacharidot, diszacharidot, oligoszacharidot vagy poliszacharidot alkalmazunk.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első ismétlésben akcep- 10 torcsoportként N-acetil-glükózamint alkalmazunk.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első ismétlésben glikozil-transzferázként galaktozil-transzferázt, a második ismétlésben glikoziltranszferázként N-acetil-neuraminil-transzferázt alkal- 15 mázunk.
- 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második ismétlésben β1-3 β1-4 (iv) glcNAc->galakceptorcsoportként 3-(l-4)-N-acetil-glükózamint alkalmazunk.
- 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott donorcsoportok legalább egyikeként citidin-monofoszfát-N-acetilneuraminsavat alkalmazunk.
- 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szacharidkészítményként az alábbi képletű vegyületek bármelyikét állítjuk elő:«1-2 β1-4 β1-3 β1-4 (i) fuc->gal->glcNAc->gal->glu;al-4 al-4 (ii) glu->(glu->)4 25;«2-3 β1-3 β1-3 (iii) NAN->gal->glcNAc->gal;|al - 4 fuc βΐ—3 βΐ—4XglcNAc->gal->), _6.
- 16. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szacharidkészítményként az alábbi képletű vegyületet állítjuk elő:βΙ-3,4 β1-4 (ii) galNAc->gal->glu.
- 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szacharidvegyület intermedier vegyületeként alábbi képletű vegyületet állítunk elő:«1-2 β1-4 β1-3 (i) fuc->gal->glcNAc->gal;al-4 al-4 (ii) glu->(glu—-»)3;«2-3 βΐ—3 (iii) NAN->gal->glcNAc.|al-4 fuc
- 18. Eljárás több, előre kiválasztott glikozil-transzferáz előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy, szilárd vagy félig szilárd hordozón immobilizált akceptorcsoportot glikozil-transzferázokat tartalmazó keverékkel érintkeztetünk az akceptorcsoport és a glikozil-transzferáz kötődésére alkalmas körülmények között, és így immobilizált, akceptorcsoportból és glikozil-transzferázból álló komplexeket hozunk létre;(b) az immobilizált komplexeket egy előre kiválasztott szacharidegységet tartalmazó donorcsoporttal érintkeztetjük az előre kiválasztott szacharidegységnek a donorcsoportról az akceptorcsoportra történő átvitelének és az előre kiválasztott glikozil-transzferáz felszabadításának megvalósítására alkalmas körülmények között, ezáltal az előre kiválasztott glikozil-transzferázok egyikét eluáljuk az immobilizált komplexekből, amivel immobilizált reakcióterméket hozunk létre, (c) a felszabadított, előre kiválasztott glikozil-transzferázt begyűjtjük; és (d) az (a), (b) és (c) lépéseket legalább egyszer megismételjük, és a lépések minden egyes ismétlése után a (b) lépésben kapott immobilizált terméket a következő ismétlés (a) lépésében akceptorcsoportként alkalmazzuk.25
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozil-transzferázok mindegyikét egyenként gyűjtjük össze.
- 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptorcsoportként fehérjét, glikoproteint,30 lipidet, glikolipidet, szénhidrátot, monoszacharidot, diszacharidot, oligoszacharidot vagy poliszacharidot alkalmazunk.
- 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) és a (b) lépések között egy mosási lépést35 alkalmazunk.
- 22. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donorcsoportként szacharid-nukleotidot, előnyösen szacharid-uridin-foszfátot, szacharid-guanozinvagy szacharid-citidin-foszfátot alkalmazunk.40
- 23. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a komplexet az előre kiválasztott szacharidegységnek a donorcsoportról az akceptorcsoportra történő, glikozil-transzferáz-katalizált átvitelét elősegíteni képes koreagensek jelenlétében érintkeztetjük a donor45 csoporttal.
- 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szacharid-uridin-foszfátként uridin-difoszfátgalaktózt alkalmazunk.
- 25. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezed ve, hogy szacharid-citidin-foszfátként citidin-monofoszfát-N-acetil-neuraminsavat alkalmazunk.
- 26. Eljárás szacharidvegyület glikozil-transzferázzal katalizált előállítására előre kiválasztott szacharidegységeket sorra hozzákapcsolva valamilyen akceptor55 csoporthoz, azzal jellemezve, hogy:(a) akceptorcsoportot előre kiválasztott, csupán az akceptorcsoportra és a szacharid donorcsoportra specifikus, és csupán egy kötés kialakulását katalizálni képes homogén glikozil-transzferázzal érintkeztetünk60 az előre kiválasztott glikozil-transzferáznak az akcep12HU 216 881 Β torcsoporthoz való kötődését kiváltó körülmények között, (b) egy, szacharidegységgel megnövelt termék előállításához az akceptorcsoportot a donorcsoporttal érintkeztetjük az előre kiválasztott szacharidegységnek a donorcsoportról az akceptorcsoportra történő, glikoziltranszferáz által katalizált átvitelét kiváltó körülmények között, ezáltal állítjuk elő, (c) az (a) és (b) lépéseket legalább egyszer megismételjük, és minden egyes ismétlés során a (b) lépésben előállított terméket alkalmazzuk akceptorcsoportként a következő ismétlés (a) lépésében, és az utolsó ismétlés (b) lépésében a kívánt szacharidvegyülethez jutunk el.
- 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szacharidvegyületet a 18. igénypont szerint előállított glikozil-transzferáz(ok) alkalmazásával állítjuk elő.
- 28. A 26. vagy a 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptorcsoportként fehérjét, glikoproteint, lipidet, glikolipidet, szénhidrátot, monoszacharidot, diszacharidot, oligoszacharidot vagy poliszacharidot alkalmazunk.
- 29. A 26. vagy a 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott glikozil-transzferázt szilárd vagy félszilárd hordozón immobilizáljuk.
- 30. A 26. vagy a 27. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szacharid donorcsoportként szacharid-nukleotidot alkalmazunk.
- 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szacharid-nukleotidként uridin-, guanidin- vagy citidin-foszfátot alkalmazunk.
- 32. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az akceptorcsoportot, a szacharid donorcsoportot és a glikozil-transzferázt koreagensek jelenlétében érintkeztetjük.
- 33. Berendezés az 1-16. igénypontok bármelyike szerint előállított fehérje, glikoprotein, lipid, glikolipid, vagy szénhidrát akceptorcsoportból és szacharidegységekből álló szacharidvegyület glikozil-transzferáz-katalizált előállítására, azzal jellemezve, hogy a berendezés:- egy, legalább három különböző, az adott szacharidkészítmény szintézisére specifikus glikoziltranszferázt (E,_3, vagy E[-E1+n+1) tartalmazó reaktorból;- legalább egy, az akceptorcsoport és többféle, szükséges szacharidegységet (A, B, C, D) tartalmazó elegy reaktorba való bevezetésére alkalmas bemeneti egységből (be); valamint- egy, az adott szacharidvegyület (A-B-C-D) reaktorból való eltávolítására alkalmas kimeneti egységből (ki) áll.
- 34. A 33. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a reaktor legalább négy, a szacharidkészítmény szintézisére specifikus glikozil-transzferázt (E1+n+|) tartalmaz.
- 35. Berendezés gal-glcNAc-gal-P-( 1 -4)—>glc képletű tetraszacharid-vegyület glikozil-transzferáz-katalizált előállítására, azzal jellemezve, hogy a berendezés:- egy reaktorból;- a reaktorban elhelyezkedő, N-acetil-glukóz-aminil-transzferázzal (E,) és galaktozil-transzferázzal (E2) származékon szilárd hordozóból;- laktóz, UDPGlcNAc, és UGPgal reaktorba való bevezetésére lehetővé tevő bemeneti egység(ek)ből (be); és- a tetraszacharid-készítménynek a reaktorból való eltávolítására alkalmas kimeneti egységből (ki) áll.
- 36. A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy több olyan, egymáshoz sorba kapcsolt reakciózónát (Zj 3 vagy Zo, Zn és Zn+1) tartalmaz, amelyek egymással soros folyadékkapcsolatban vannak; és a reakciózónák egy előre kiválasztott szacharidegységnek az előző reakciózónában képződött intermedier termékhez való kapcsolódását specifikusan katalizáló glikozil-transzferázt (E,_3, vagy E|-E1+n+1) tartalmaznak.
- 37. A 33-36. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy mindegyik reakciózóna között, ezekkel folyadékkapcsolatban a reakciózónákban képződött intermedier terméknek a reakcióelegyből való tisztítására alkalmas egység (4) helyezkedik el.
- 38. A 33-37. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a glikozil-transzferázokat szilárd hordozón immobilizálva tartalmazza.
- 39. A 38. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozón immobilizált glikoziltranszferáz aktív helyeit az immobilizációs eljárás alatt védelemmel látjuk el.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US50956090A | 1990-04-16 | 1990-04-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9203266D0 HU9203266D0 (en) | 1993-03-29 |
HUT63202A HUT63202A (en) | 1993-07-28 |
HU216881B true HU216881B (hu) | 1999-09-28 |
Family
ID=24027151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9203266A HU216881B (hu) | 1990-04-16 | 1991-04-11 | Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6569649B2 (hu) |
JP (2) | JPH05500905A (hu) |
KR (1) | KR920702721A (hu) |
AT (1) | ATE225402T1 (hu) |
AU (1) | AU642253B2 (hu) |
BG (1) | BG61170B1 (hu) |
BR (1) | BR9106345A (hu) |
CA (1) | CA2062715A1 (hu) |
DE (1) | DE69133122D1 (hu) |
HU (1) | HU216881B (hu) |
OA (1) | OA09678A (hu) |
ZA (1) | ZA912840B (hu) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1405905B1 (en) | 2001-07-02 | 2007-02-07 | Hitachi, Ltd. | Sugar chain synthesizer |
JP4006385B2 (ja) | 2002-11-20 | 2007-11-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 糖鎖合成装置 |
US7700701B2 (en) | 2003-05-08 | 2010-04-20 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Water-soluble polymer compound having sugar chains |
JP4252922B2 (ja) | 2004-03-31 | 2009-04-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 糖鎖合成装置 |
KR101137021B1 (ko) | 2006-11-30 | 2012-04-19 | 한국생명공학연구원 | 퓨조박테리움 뉴클레텀 유래의 신규 글리코실트랜스퍼라제및 이를 이용한 올리고당 제조방법 |
KR100888513B1 (ko) * | 2006-12-15 | 2009-03-12 | 주식회사 진켐 | 신규 n―아세틸글루코사민―2―에피머라아제 및 이를이용한 cmp―n―아세틸뉴라민산의 제조방법 |
EP2769726B1 (en) | 2013-02-21 | 2018-10-31 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Synthetic or recombinant fucosylated Oligosaccarides for use in the treatment of infections |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4184917A (en) | 1974-04-01 | 1980-01-22 | Sandoz Ltd. | Process for producing a structurally modified interferon |
US4150116A (en) | 1978-02-21 | 1979-04-17 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Immunization against dental caries with glucosyltransferase antigens |
US4219571A (en) | 1978-06-15 | 1980-08-26 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing a sweetener |
JPS5539304A (en) * | 1978-09-13 | 1980-03-19 | Shoei Netsukougiyou Kk | Drying furnace for printed matter |
US4261976A (en) | 1978-10-03 | 1981-04-14 | The Massachusetts General Hospital | Method and glycoprotein composition for inhibition of growth of transformed cells and tumors |
DE3066516D1 (en) | 1979-11-07 | 1984-03-15 | Tate & Lyle Plc | Production of isomaltulose |
JPS5836959B2 (ja) | 1980-08-21 | 1983-08-12 | 三井製糖株式会社 | 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法 |
FR2535324A1 (fr) | 1982-10-27 | 1984-05-04 | Choay Sa | Station perfectionnee pour l'epuration d'eaux usees |
US4818816A (en) | 1981-04-28 | 1989-04-04 | Choay, S.A. | Process for the organic synthesis of oligosaccharides and derivatives thereof |
JPS58870A (ja) | 1981-06-20 | 1983-01-06 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 飲食物及びその製造方法 |
FR2509313A1 (fr) * | 1981-07-08 | 1983-01-14 | Choay Sa | Derives de 3-fucosyl-n-acetyl lactosamine, leur preparation et leurs applications biologiques |
JPS58149697A (ja) | 1982-02-27 | 1983-09-06 | Dainippon Ink & Chem Inc | β−1,3グリコシルステビオシドの製造方法 |
JPS58170493A (ja) | 1982-04-01 | 1983-10-07 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 3′−デオキシグアノシンの製造法 |
US4569909A (en) | 1982-06-03 | 1986-02-11 | Seitetsu Kagaku Co., Ltd. | Process for preparing uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine |
CA1236090A (en) * | 1982-07-30 | 1988-05-03 | Harry G. Rittenhouse | Determination of carbohydrate acceptors |
US4770994A (en) * | 1982-07-30 | 1988-09-13 | Abbott Laboratories | Determination of carbohydrate acceptors |
JPS59118053A (ja) | 1982-12-24 | 1984-07-07 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 飲食物とその製造方法 |
US4678747A (en) | 1983-02-18 | 1987-07-07 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies for detection of an H (O) blood group antigen |
US4557927A (en) | 1983-03-10 | 1985-12-10 | Kabushiki Kaisha Hoyashibara | Food products and process for producing same |
JPS59187792A (ja) | 1983-04-11 | 1984-10-24 | Meito Sangyo Kk | 酵素法リン脂質糖類誘導体の製法 |
JPS59187787A (ja) | 1983-04-11 | 1984-10-24 | Meito Sangyo Kk | 酵素法スフインゴリン脂質誘導体の製法 |
US4683297A (en) | 1983-06-07 | 1987-07-28 | Daicel Chemical Industries Ltd. | Process for the preparation of glycosides |
GB8316790D0 (en) | 1983-06-21 | 1983-07-27 | Tate & Lyle Plc | Chemical process |
US4757012A (en) | 1983-06-28 | 1988-07-12 | Genentech, Inc. | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
SE8304006D0 (sv) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | Karlsson Karl Anders | Forening och komposition for terapeutisk eller diagnostisk anvendning samt forfarande for terapeutisk behandling |
JPS60114193A (ja) | 1983-11-22 | 1985-06-20 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規なマルトースデヒドロゲナーゼおよびその製法それを用いる分析法 |
HU194939B (en) | 1983-12-22 | 1988-03-28 | Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet | Process for producing alpha- beta- and gamma cyclodextrine of high yield capacity |
DE3446380C1 (de) | 1984-12-19 | 1986-05-22 | Pfeifer & Langen, 5000 Köln | Suessungsmittel,Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben |
US4868104A (en) | 1985-09-06 | 1989-09-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous assay for specific polynucleotides |
SE451849B (sv) | 1985-12-11 | 1987-11-02 | Svenska Sockerfabriks Ab | Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter |
US4912093A (en) | 1986-10-01 | 1990-03-27 | Marion Laboratories, Inc. | Use of synthetic sulfated saccharides to enhance wound healing |
US4876195A (en) | 1985-12-26 | 1989-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for producing 2-keto-D-glucaric acid |
US4851517A (en) | 1986-02-26 | 1989-07-25 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells |
US4925796A (en) | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
DE3626213A1 (de) | 1986-08-02 | 1988-02-04 | Hoechst Ag | Enzymatische synthese von cyclodextrinen mit (alpha)-glucosylfluorid als substrat fuer cyclodextrin-(alpha)(1->4)glucosyltransferase |
US4865976A (en) | 1986-09-10 | 1989-09-12 | Uop | Method of cyclodextrin manufacture using an immobilized cyclodextrin glycosyltransferase |
JPS63185352A (ja) * | 1986-09-30 | 1988-07-30 | Taiho Akira | 腫瘍の予防効果を有する食品 |
US4835264A (en) | 1986-12-12 | 1989-05-30 | National Jewish Center | Synthesis of 3,6-Di-O-methyl-D-glucose and compounds formed thereby |
DE3644401A1 (de) | 1986-12-24 | 1988-07-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue hydrolase-substrate |
NL8701616A (nl) | 1987-07-09 | 1989-02-01 | Stamicarbon | Fructosyltransferase en bereiding van fructose-oligomeren daarmee. |
US4855128A (en) | 1988-01-14 | 1989-08-08 | Warner-Lambert Company | Saccharide inhibition of dental plaque |
SE466403B (sv) * | 1988-03-24 | 1992-02-10 | Kurt G I Nilsson | Saett att syntetisera oligosackarider |
JPH0698012B2 (ja) | 1988-05-13 | 1994-12-07 | 農林水産省食品総合研究所長 | 複分岐グルコシルーサイクロデキストリンの製法 |
EP0356048A3 (en) * | 1988-08-05 | 1990-11-14 | Uop | Novel cylodextrin glycosyltransferases |
US5874261A (en) * | 1988-09-02 | 1999-02-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for the purification of glycosyltransferases |
DK626488D0 (da) | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Torben Falck Oerntoft | Fremgangsmaade til udtagning af en sekretproeve via en legemsaabning og til praeparation af proeven med henblik paa kvantitativ bestemmelse af molekylaere strukturer og enzymaktivitet i proeven samt proeveudtagningsindretning til brug derved |
US5032519A (en) * | 1989-10-24 | 1991-07-16 | The Regents Of The Univ. Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes |
-
1991
- 1991-04-11 KR KR1019910701867A patent/KR920702721A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-04-11 AU AU76852/91A patent/AU642253B2/en not_active Ceased
- 1991-04-11 JP JP3507770A patent/JPH05500905A/ja active Pending
- 1991-04-11 BR BR919106345A patent/BR9106345A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-11 DE DE69133122T patent/DE69133122D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 AT AT91907908T patent/ATE225402T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-11 HU HU9203266A patent/HU216881B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-04-11 CA CA002062715A patent/CA2062715A1/en not_active Abandoned
- 1991-04-16 ZA ZA912840A patent/ZA912840B/xx unknown
-
1992
- 1992-10-15 BG BG96982A patent/BG61170B1/bg unknown
- 1992-10-15 OA OA60288A patent/OA09678A/en unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/484,885 patent/US6569649B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-11-22 JP JP2001358211A patent/JP2002218992A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9106345A (pt) | 1993-04-20 |
BG61170B1 (bg) | 1997-01-31 |
US20020045222A1 (en) | 2002-04-18 |
JPH05500905A (ja) | 1993-02-25 |
US6569649B2 (en) | 2003-05-27 |
CA2062715A1 (en) | 1991-10-17 |
HUT63202A (en) | 1993-07-28 |
OA09678A (en) | 1993-05-15 |
AU7685291A (en) | 1991-11-11 |
HU9203266D0 (en) | 1993-03-29 |
ZA912840B (en) | 1992-01-29 |
ATE225402T1 (de) | 2002-10-15 |
JP2002218992A (ja) | 2002-08-06 |
AU642253B2 (en) | 1993-10-14 |
KR920702721A (ko) | 1992-10-06 |
DE69133122D1 (de) | 2002-11-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0481038B1 (en) | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis | |
EP0619837B1 (en) | A method for obtaining glycosyltransferases | |
Nilsson | Enzymatic synthesis of oligosaccharides | |
US5583042A (en) | Apparatus for the synthesis of saccharide compositions | |
Lowe et al. | Molecular cloning of a human fucosyltransferase gene that determines expression of the Lewis x and VIM-2 epitopes but not ELAM-1-dependent cell adhesion. | |
Sabesan et al. | Combined chemical and enzymatic synthesis of sialyloligosaccharides and characterization by 500-MHz and proton and carbon-13 NMR spectroscopy | |
EP0710674B1 (en) | Method for producing a glucan having cyclic structure | |
Arlt et al. | Rapid chemical synthesis of sugar nucleotides in a form suitable for enzymic oligosaccharide synthesis | |
CN101415834A (zh) | 生产涎化低聚糖的方法 | |
JPH09503905A (ja) | 糖組成物の合成方法 | |
Rosevear et al. | Synthesis and solution conformation of the type 2 blood group oligosaccharide. alpha. LFuc (1. fwdarw. 2). beta. DGal (1. fwdarw. 4). beta. DGlcNAc | |
Johnson et al. | Reassessment of the acceptor specificity and general properties of the Lewis blood-group gene associated α-3/4-fucosyltransferase purified from human milk | |
Anwar et al. | Sugar nucleotide regeneration system for the synthesis of Bi-and triantennary N-glycans and exploring their activities against siglecs | |
HU216881B (hu) | Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása | |
US6518051B1 (en) | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis | |
Shibaev | Biosynthesis of Salmonella O-antigenic polysaccharides: specificity of glycosyl transferases | |
Bårström et al. | New derivatives of reducing oligosaccharides and their use in enzymatic reactions: efficient synthesis of sialyl Lewis a and sialyl dimeric Lewis x glycoconjugates | |
Zehavi | Polymers as supports for enzymic oligo-and polysaccharide synthesis | |
Veyrieres | The Synthesis of Blood Group I and i Active Oligosaccharides | |
POLYSACCHARIDES | Vladimir N. Shibaev |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |