JP2002218992A - サッカライド組成物の合成法 - Google Patents

サッカライド組成物の合成法

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JP2002218992A JP2001358211A JP2001358211A JP2002218992A JP 2002218992 A JP2002218992 A JP 2002218992A JP 2001358211 A JP2001358211 A JP 2001358211A JP 2001358211 A JP2001358211 A JP 2001358211A JP 2002218992 A JP2002218992 A JP 2002218992A
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ステイーブ・ロス
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University of Pennsylvania Penn
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】サッカライド組成の調製法の提供。 【解決手段】この方法は、反復的で、下記の３段階から
成る。 （ｉ）あらかじめ選んだサッカライド・ユニットを受容
体部分に移送することのできるグリコシルトランスフェ
ラーゼを単離するが、この単離は、この受容体部分を、
このグリコシルトランスフェラーゼを含むと予測される
混合物と、この受容体部分とこのグリコシルトランスフ
ェラーゼとの結合を実現させる条件下で、接触させて行
い、これによって、グリコシルトランスフェラーゼを単
離する。受容体部分は、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、
ないし、炭水化物である。 （ｉｉ）次に、単離されたグリコシルトランスフェラー
ゼを用いて、受容体部分と、あらかじめ選んだサッカラ
イド・ユニットとの間の結合を触媒する。 （ｉｉｉ）段階（ｉ）と（ｉｉ）を複数回繰り返し、こ
の時、この方法の第１回工程で得られた中間産物を、第
２回工程の受容体部分として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サッカライド組成
物（サッカライド化合物を含む。以下、同じ）、例え
ば、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、糖脂質、
糖蛋白に関わる。さらに具体的に言うと、本発明は、こ
れらおよびその他のサッカライド組成物を酵素法によっ
て調製する方法に関わる。
【０００２】
【従来の技術】「炭水化物」という用語は、一般式 (CH
２O)ｎを持つ様々な化合物、例えば、ジサッカライド、
オリゴサッカライド、ポリサッカライドを内包する。オ
リゴサッカライドは、別名糖と言われるサッカライド・
ユニットから成る鎖である。このサッカライド・ユニッ
トは、どのような順序にも配列することができ、また、
２個のサッカライド・ユニット間の結合は、約１０通り
の異なる結合のいずれであることもできる。この結果、
異なる可能な立体異性体オリゴサッカライド鎖の数は膨
大になる。
【０００３】あらゆる生物ポリマーの中でも、オリゴサ
ッカライドとポリサッカライドは、従来もっとも研究の
不足している分野である。これは、かなりの部分が、複
雑なことが多い糖鎖の配列を決めたり、合成するのが困
難であったためである。オリゴヌクレオチドとポリペプ
チドの合成は十分に開発されているけれども、オリゴサ
ッカライド合成に関して、一般に適用可能な方法と言う
ものは現在ない。
【０００４】炭水化物の合成に関して、古典的な方法が
多数開発されているけれども、これらの方法には選択的
な保護や脱保護を必要とするという困難が伴う。さら
に、オリゴサッカライドの有機合成は、多くのグリコシ
ド結合が不安定であること、レギオ選択的糖結合を実現
することが困難であること、一般に合成収率が低いこ
と、によって妨げられている。上記困難と、炭水化物の
単離・精製およびその構造解析に伴う困難とが相俟った
結果、この分野の化学の研究は極めて厳しいものとなっ
ている。
【０００５】従来、研究努力の多くが、炭水化物や、炭
水化物フラグメントを含む分子、例えば、糖脂質、糖蛋
白に向けられて来た。このような研究は主として、蛋白
と炭水化物間の相互作用が広範な生物認識現象に関わる
という事実に基づいている。この生物認識現象には、授
精、分子標的、細胞間認識、ウィルス性病因、細菌性病
因、真菌性病因がある。現在広く認められていることで
あるが、糖蛋白や糖脂質のオリゴサッカライド部分が、
細胞と細胞、細胞とリガンド、細胞と細胞外マトリック
ス、細胞と病原体、との間の認識を仲介する。
【０００６】上記認識現象は、細胞認識に関わる糖蛋白
ないし糖脂質の活性部分に認められるものと同じ糖配
列、立体化学を持つオリゴサッカライドによって阻害さ
れることがある。オリゴサッカライドは、受容体蛋白上
の結合部位に対して、糖蛋白や糖脂質と競合すると考え
られている。例えば、ジサッカライドであるガラクトシ
ルβ 1-4 Ｎ−アセチルグルコサミンは、肝細胞の、細
胞膜の受容体と相互作用する糖蛋白の１成分と考えられ
ている。したがって、有毒である可能性がある分子の部
分と細胞の結合部位を競合するという点において、オリ
ゴサッカライドおよびその他のサッカライド組成物は薬
学、診断学、治療法に新分野を開く可能性を持つ。
【０００７】しかし、オリゴサッカライドを、ヒトおよ
び動物の病気の治療薬としてテストすることについて
は、比較的僅かな努力しかなされていない。これは、先
にも述べた通り、オリゴサッカライドの合成法が利用で
きなかったためである。限られた種類の小さなオリゴサ
ッカライドについては、有機化学的方法によって特に合
成することもできようが、そのような化合物の製造コス
トは、通常、きわめて高い。おまけに、オリゴサッカラ
イドを立体特異的に合成することはきわめて困難であ
り、ある種の糖、例えば、シアル酸やフコースを付加す
ることは、その結合が極端に不安定であるために、従来
有効に実現することはできなかった。。薬学、治療用に
各種のオリゴサッカライドを大量に生産するために、オ
リゴサッカライドに一般的に適用できる改良法が求めら
れている
【０００８】ある種の応用においては、従来法に代わる
ものとして、有機合成における酵素の使用が有力であ
る。例えば、有機合成において、酵素は、触媒として用
いられてきている。反応速度加速や立体選択性といった
分野においては、合成酵素反応の価値は実証済みであ
る。さらに、ある種の酵素については、低コスト生産
や、その性質の変更の技術が現在既に利用できる。
【０００９】炭水化物合成の触媒として、酵素を使用す
ることは、従来から提案されてきてはいるが、今日ま
で、オリゴサッカライドやその他の複雑な炭水化物を、
相当量、一般合成するのに有効な酵素法はまだ見つかっ
ていない。一般に認められていることであるが、炭水化
物合成に酵素を触媒として使用するにあたって、主な制
限因子となるのは、炭水化物合成を実現するのに必要な
広範な酵素の入手が、現在、きわめて限られていること
である。Toone et al., Tetrahedron Reports(1990)(4
5)17:5365-5422を参照されたい。
【００１０】ほ乳類系においては、ヌクレオシド・モ
ノ、ジ燐酸糖の形で活性化される８種のモノサッカライ
ドが、殆どのオリゴサッカライドを構成する要素とな
る。すなわち、UDP-Glc, UDP-GlcUA, UDP-GlcNAc, UDP-
Gal, UDP-GalNAc, GGP-Man, GDP-Fuc,及びCMP-NeuAc で
ある。これらは、Leloir 経路の中間代謝物である。も
っと多数の糖（例えば、キシロースやアラビノース）
や、オリゴサッカライドが、微生物や植物に存在する。
【００１１】２つの群の酵素が、オリゴサッカライドの
インビボ合成に関連する。Leloir経路の酵素は最大のグ
ループである。この酵素は、糖ヌクレオシド燐酸として
活性化された糖を、成長するオリゴサッカライド鎖に転
移する。非 Leloir 経路酵素は、糖燐酸として活性化さ
れた炭水化物ユニットは転移するが、糖ヌクレオシド燐
酸として活性化されたものは転移しない。
【００１２】オリゴサッカライドのインビトロ酵素触媒
合成については、従来二つの方策が提案されている。To
one et al., 上記参照。第一の方策は、グリコシルトラ
ンスフェラーゼの使用である。第二のものは、グリコシ
ダーゼまたはグリコシル・ヒドロラーゼを使用する。
【００１３】グリコシルトランスフェラーゼは、活性化
された糖を、蛋白ないし脂質に、または、成長するオリ
ゴサッカライドの非還元性末端に、段階的に付加するよ
う触媒する。炭水化物を合成するには、多数のグリコシ
ルトランスフェラーゼが必要のようである。各 NDP- 糖
残基は、異なる別の種類のグリコシルトランスフェラー
ゼを必要とし、今日までに特定されている百種以上のグ
リコシルトランスフェラーゼのそれぞれが、ある特定の
グリコシド結合の形成を触媒するようである。現在まで
のところ、グリコシルトランスフェラーゼの特異性の正
確な詳細は不明である。例えば、炭水化物のどの配列
が、上記酵素の多くによって認識されるのかも不明であ
る。
【００１４】Leloir 経路の酵素は、オリゴサッカライ
ドの合成に応用されだしている。このような方法がうま
くいくためには、二つの要素が必要である。糖ヌクレオ
シド燐酸が、実用コストで入手できなければならず、ま
た、グリコシルトランスフェラーゼが入手できなければ
ならない。最初の問題は、ほ乳類生合成に必要なものを
含めて、多くの通常の NDP- 糖に関しては解決済みであ
る。しかしながら、本法の問題点は第二の問題にある。
これまでのところ、ごくわずかな数のグリコシルトラン
スフェラーゼしか利用できない。この種の酵素の入手可
能性が、この種の炭水化物合成法の唯一の制限因子とな
っている。
【００１５】従来から報告されていることであるが、多
くのグリコシルトランスフェラーゼは、単離が困難であ
る。特に、ほ乳類由来のものはそうである。これは、こ
の蛋白が、低濃度で、かつ、膜に結合しているからであ
る。さらに、小数のグリコシルトランスフェラーゼは固
定することができているけれども、この酵素は不安定だ
という報告がある。これまでのところ、ごく小数のグリ
コシルトランスフェラーゼしか、市販されておらず、し
かも、高価である。
【００１６】したがって、酵素の遺伝子工学（すなわ
ち、クローニング）の発展には多大の期待が寄せられて
いた。これは、特に、ガラクト、フコシル、シアリルの
各トランスフェラーゼを含む、いくつかのグリコシルト
ランスフェラーゼがクローニングされるようになって以
来、そうであった。クローニング技術の将来の進歩によ
って、他のグリコシルトランスフェラーゼのクローニン
グが促進され、その安定性が強化されることが期待され
る。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、その潜在
的な有用性、および、それらを十分な量入手することが
困難であること、または、不可能であること、から見
て、次のような一般的な合成法にたいしては、長年に渡
る要求があった。すなわち、オリゴサッカライド、ポリ
サッカライド、糖蛋白、糖脂質、などを、効率的で、コ
スト当りの有効性が高く、立体特異的で、一般的に応用
可能なやり方で、生産する方法である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】サッカライド組成物、特
にオリゴサッカライド、ポリサッカライド、および、オ
リゴサッカライド・ユニットを含む化学種を提供するの
が、本発明の目的である。
【００１９】天然に見られないものを含めて、広範なサ
ッカライド組成物を提供するのが、本発明のもう一つの
目的である。
【００２０】ヒトないし動物の病気の作用を緩和するの
に有効なサッカライド組成物を提供するのが本発明のも
う一つの目的である。
【００２１】さらに、サッカライド組成物を調製するた
めの改良法を提供するのが、本発明のもう一つの目的で
ある。
【００２２】サッカライド組成物を調製するための酵素
法を提供するのが、本発明のもう一つの目的である。
【００２３】さらに、サッカライド組成物を合成するの
に有効な酵素の入手法を提供するのが、本発明のもう一
つの目的である。
【００２４】さらに、本発明に従って、サッカライド組
成物を合成するのに有効な装置を提供するのが、本発明
のもう一つの目的である。
【００２５】上記および他の目的が本発明によって達成
される。すなわち、本発明は、オリゴサッカライド、ポ
リサッカライド、糖脂質、糖蛋白、その他のサッカライ
ド組成物の、酵素調製法を提供する。この方法では、供
与体（部分）から、あらかじめ選んだサッカライド・ユ
ニットを、受容体（部分）へ、酵素促進性の転移を行な
う。複数のサッカライド・ユニットを持つサッカライド
組成物は、できれば、そのサッカライド・ユニットを、
受容体（部分）に、段階的に付加して調製したものが望
ましい。この受容体（部分）は、それ自らが、本発明に
従って調製されたサッカライド組成物である。
【００２６】したがって、本発明によるサッカライド組
成物を調製する方法では、受容体（部分）を提供し、そ
の受容体（部分）を、グリコシルトランスフェラーゼに
接触させるという段階を含む。グリコシルトランスフェ
ラーゼは、その受容体（部分）にたいし特異的であり、
かつ、サッカライド・ユニットを受容体（部分）に転移
することができるように調製する。本発明の、この方法
は複数回実行されるが、それは、第１回反応の生成物が
第２回反応の受容体（部分）となり、これが次々に繰り
返されるというように実行される。
【００２７】
【発明の実施の形態】本明細書中、「サッカライド組成
物」とは、その構造中にサッカライド・ユニットを持
つ、いかなる化学種をも含むことを意図したものであ
る。糖類、炭水化物類、サッカライド類、モノサッカラ
イド類、オリゴサッカライド類、ポリサッカライド類、
糖蛋白類、糖脂質類は、サッカライド組成物の例であ
る。そのような化学種（部分）を含む混合物や溶液も、
サッカライド組成物である。
【００２８】サッカライド組成物は、本発明に従って、
供与体（部分）由来のサッカライド・ユニットを、受容
体（部分）に、酵素による促進の下に転移して調製され
る。このような転移は、受容体および供与体（部分）
を、グリコシルトランスフェラーゼと接触させると起こ
り、通常、受容体（部分）とサッカライド・ユニットと
が立体選択的に共有結合し、すなわち、ただ１種の立体
異性体が生成する。
【００２９】本発明に従って調製されたサッカライド組
成物は、診断、治療、薬理的応用に広い有効性を持つと
考えられる。所望の標的サッカライド組成物の糖配列
が、通常の方法で決定されたら、そのサッカライド組成
物の適当な合成法を決めるには、一般に、レトロ合成解
析を実行する。好ましくは、このような合成法で、その
所望のサッカライド組成物を生成するのに必要な、個々
の供与体部分、受容体部分、グリコシルトランスフェラ
ーゼを特定する。
【００３０】炭水化物合成に必要な多数のグリコシルト
ランスフェラーゼを得るのに遺伝子工学の将来の発達を
あてにするのでなしに、本発明では、下記のように、ま
ったく別のアプローチを採用する。本発明に従って、サ
ッカライド組成物を合成する場合には、あらかじめ選ん
だサッカライド・ユニットを、先ず、最初の受容体部
分、すなわち、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、または、
炭水化物の出発物質に酵素的に結合する。次いで、この
ようにして得られた生成物に、あらかじめ選んだサッカ
ライド・ユニットを、段階的に酵素によって結合するこ
とによって、サッカライド組成物を形成する。
【００３１】あらかじめ選んだサッカライド・ユニット
の各々を結合するごとに、中間体生成物が得られる。
【００３２】本発明は、発明者の次の発見に基づく。す
なわち、この合成の出発物質（すなわち、蛋白、糖蛋
白、脂質、糖脂質、または、炭水化物）と、この合成に
おいて形成される各中間体生成物は、この合成の相当す
る各段階で、標的サッカライド組成物の合成における次
の中間体生成物の結合を触媒するのに特異的なグリコシ
ルトランスフェラーゼを入手するのに有利に用いること
ができるという発見である。
【００３３】したがって、本発明に従えば、ある段階に
必要なグリコシルトランスフェラーゼは、その中間産物
（受容体部分）によって単離され、標的炭水化物分子を
構築するのに必要な次のサッカライド・ユニットを、そ
の受容体部分に結合するのに用いられる。本発明によれ
ば、この操作を繰り返し、繰り返し（回数）の度ごと
に、次のサッカライド・ユニットを単離すべき成長中の
分子に結合するのに必要な特定のグリコシルトランスフ
ェラーゼを生成し、標的炭水化物分子が得られるまで続
ける。
【００３４】さらに、本発明は、サッカライド・ユニッ
トを受容体部分に共有結合させるのに必要・十分である
と思われる反応条件と共存試薬も提供する。
【００３５】好ましい実施形態に従えば、受容体部分
は、蛋白、糖蛋白、脂質、糖脂質、または、モノサッカ
ライド、ジサッカライド、オリゴサッカライドないしポ
リサッカライドのような炭水化物でもよい。他の好まし
い実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼを、固
体の支持体に結合する。
【００３６】本発明方法では、サッカライド・ユニット
と受容体部分の立体特異的な結合が可能である。一般
に、供与体部分としては、サッカライドヌクレオチドを
用いるのが望ましい。供与されるべきサッカライド・ユ
ニットを末端に持つウリジン、グアノシン、シチジン燐
酸物質が、供与体部分を構成するのが好ましい。
【００３７】したがって、本発明はまた、特定の受容体
部分にたいして特異的であり、かつ、あらかじめ選ばれ
たサッカライド・ユニットを受容体部分に転移すること
のできる、グリコシルトランスフェラーゼを調製する手
段も提供する。この方法では、受容体部分と、複数のグ
リコシルトランスフェラーゼを含むと予想される混合物
とを、受容体部分とその受容体部分にたいして特異的な
グリコシルトランスフェラーゼを結合させるのに有効な
条件下で接触させる。次に、その結果生じた結合グリコ
シルトランスフェラーゼを単離する。このグリコシルト
ランスフェラーゼの配列を決定すること、およびこのグ
リコシルトランスフェラーゼを遺伝子工学法によって多
量に製造することが望ましい。
【００３８】目的のグリコシルトランスフェラーゼを含
むと予想される混合物は、下記のようにして同定するこ
とができる。ごくありふれたグリコシド結合について
は、そのグリコシルトランスフェラーゼ活性は出版物に
記載されている。これは、ミルクのオリゴサッカライド
のような化合物、あるいは、典型的な（すなわち、広く
普及している）糖蛋白や糖脂質の炭水化物部分にたいし
ては、ほとんど当てはまる。それよりずっと記載の少な
い結合については、その結合の見られる組織、器官、食
物微生物をまず見るのがよい。一般に、結合がある特定
の供給源に見られる場合、その結合を形成した酵素もそ
の供給源の中に存在する。
【００３９】もし、サッカライド構造だけが与えられて
おり、供給源が与えられていない場合には、そのような
サッカライド構造を含むと思われる生物例を、利用可能
なものの内、もっとも感度の高いスクリーニング法でテ
ストすることができる。例えば、その化合物が、イズロ
ン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグル
コサミンを含んでいるならば、脊椎動物の結合組織をテ
ストするのがよいだろう。もし標的化合物がアベコース
を含んでいるならば、細菌や植物をテストして、相応す
るグリコシルトランスフェラーゼがあるかどうかを見る
のがよいだろう。
【００４０】本発明で用いることのできるグリコシルト
ランスフェラーゼ検出法は様々のものが発表されてい
る。下記のものは例示にすぎない。Furukawa et al, B
iochem. J., (1985) 227:573-582は、ほう酸浸透紙によ
る電気泳導法と、本発明者によって開発された蛍光法
（図６）について記載している。Roth et al, Exp'l C
ell Research (1983) 143:217-225は、ほう酸法の、グ
ルクロニルトランスフェラーゼにたいする応用例につい
て記載している。これは、以前は、比色分析によって測
定していたものである。Benau et al, J. Histochem. C
ytochem. (1990) 38(1) :23-30は、ジアゾニウム塩の N
ADH による還元反応に基づく組織化学的測定法を記載し
ている。
【００４１】目的のグリコシルトランスフェラーゼの供
給源が発見されたならば、その供給源をホモジェナイズ
する。受容体部分を親和性リガンドとして、アフィニテ
ィー・クロマトグラフィーにより、ホモジェネートか
ら、その酵素を精製する。すなわち、その上に受容体部
分を固定した固体マトリックスの上に、そのホモジェネ
ートを、グリコシルトランスフェラーゼと受容体部分が
結合するような条件下で、通過させる。次に、グリコシ
ルトランスフェラーゼが結合した、固体支持マトリック
スを洗浄する。次に来るのが溶出段階であって、ここ
で、グリコシルトランスフェラーゼを固相から脱着し、
収集する。よく知られているように、吸収されたグリコ
シルトランスフェラーゼは、例えば、塩（例えば、NaC
l）の水溶液を固相支持体の上に通過させることによっ
て、溶出することができる。
【００４２】本発明の実施において、ホモジェネートか
らアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製さ
れ、受容体部分上のあらかじめ選択されたサッカライド
・ユニットを攻撃するのに用いられる「酵素」は、各種
グリコシルトランスフェラーゼの混合体から成る。そし
て、このグリコシルトランスフェラーゼは、精製グリコ
シルトランスフェラーゼの所望の活性を邪げることので
きる酵素を含むホモジェネート中に存在する他の外来性
生物物質からあらかじめ精製したものである。したがっ
て、本発明に従って使用されるグリコシルトランスフェ
ラーゼは、各種「グリコシルトランスフェラーゼ」の混
合物であることが多い。もし望ましくば、この原料を、
さらに精製し、単一の精製グリコシルトランスフェラー
ゼを単離し、本発明の操作に用いてもよい。しかし、一
般に、それ以上の精製は不要である。
【００４３】本発明においては、あらかじめ選ばれたサ
ッカライド・ユニットに共有的に結合できる受容体部分
を用意する。代表的な受容体部分としては、蛋白類、糖
蛋白類、脂質類、糖脂質類、炭水化物類がある。受容体
部分は、それが、目的のサッカライド組成物の構造成分
として存在していれば、望ましいと言うことは了解され
るであろう。例えば、Ｎ−アセチルノイラミニル α 2
-3ガラクトシル β1-4 Ｎ−アセチルグルコサミンのよ
うなサッカライド組成物を調製する場合には、好ましい
受容体部分は、Ｎ−アセチルグルコサミンと、ガラクト
シル β1-4 Ｎ−アセチルグルコサミンであろう。同様
にして、ある受容部分の末端がサッカライド・ユニット
である場合、それに続くサッカライド・ユニットは、通
常、その末端サッカライドの非還元性末端部に共有的に
結合することも了解されるであろう。
【００４４】受容体部分に転移されるべきサッカライド
・ユニットは、そのサッカライド・ユニットにたいする
供与体部分によって与えられる。本発明によれば、供与
体部分は、転移されるべきサッカライド・ユニットを含
み、受容体部分および適当なグリコシルトランスフェラ
ーゼと接触した時に、そのサッカライド・ユニットをそ
の受容体部分に与えることができる。好ましい供与体部
分は、サッカライド末端を有するウリジン燐酸、サッカ
ライド末端を有するグアノシン燐酸、サッカライド末端
を有するシチジン燐酸のようなサッカライド・ヌクレオ
チド類である。
【００４５】供与体部分は、受容体部分およびグリコシ
ルトランスフェラーゼと接触した時に、直ちに、その成
分のサッカライド・ユニットを受容体部分に与えること
ができるのが好ましいことは了解されるであろう。例え
ば、ウリジン２燐酸ガラクトースは、ガラクトースをＮ
−アセチルグルコサミンに転移するので好ましく、シチ
ジン１燐酸Ｎ−アセチルニューラミン酸は、シアル酸の
一種であるＮ−アセチルニューラミン酸をガラクトシル
β 1-4 Ｎ−アセチルグルコサミンに転移するので、
好ましい。
【００４６】あるサッカライド組成物の調製に必要な受
容体部分と、供与体部分が特定されたら、各受容・供与
ペアにたいし１つのグリコシルトランスフェラーゼを調
製しなければならない。本技術に習熟した人ならば、グ
リコシルトランスフェラーゼとは、１サッカライド・ユ
ニットが、ある化学的部分（ここでは供与体と定義す
る）からもう一つ別のもの（ここでは、受容体と定義す
る）へと転移されるのを促進する酵素と広く定義づける
ことができ、かつ、その移送するサッカライド・ユニッ
トに応じて現象学的に命名されていることを了解してい
るであろう。それ故、ガラクトシル・トランスフェラー
ゼはガラクトースを転移するのであり、フコシル・トラ
ンスフェラーゼはフコースを転移する。
【００４７】本発明によるグリコシルトランスフェラー
ゼとは、あらかじめ定められたサッカライド・ユニット
を受容体部分へ転移することのできるものである。グリ
コシルトランスフェラーゼは、できれば、受容体部分
か、または少なくともその重要な活性もしくは露出部分
にたいして特異的であることが望ましい。あるグリコシ
ルトランスフェラーゼにおける特異性とは、ある受容体
部分と接触ないし近接させた時に、その特定配列部分と
結合を結びやすく、かつ、ある特定のサッカライド・ユ
ニットを、その受容体部分へ転移させやすい、そのよう
な性向として発揮される。
【００４８】現在、グリコシルトランスフェラーゼは、
天然供給源からのものがあるだけであって、そのため、
やや数が少ない。既知のグリコシルトランスフェラーゼ
は、きわめて特異的なサッカライド・ユニットの転移し
か実現できないことは、了解されるであろう。きわめて
特異的というのは、転移されるサッカライド・ユニット
の化学的種類から言っても、それが、その後、受容体部
分に結合するときの立体化学から言ってもそうである。
例えば、１個のＮ−アセチルニューラミニル・トランス
フェラーゼは、Ｎ−アセチルニューラミン酸を、ガラク
トース・ユニットのみを含む受容体部分に転移して、そ
のＮ−アセチルニューラミン酸ユニットと、そのガラク
トース・ユニットとの間にα 2-3結合を持つサッカライ
ド組成物を生成する。
【００４９】このようにして、本発明は、天然に見られ
る糖結合の構築を可能にする。例えば、ガラクトース
α 1-2−Ｎ−アセチルニューラミン酸の結合は、天然に
見ることはできず、現在実現できていない。しかしなが
ら、ここに開示した方法は、入手可能になるかもしれな
い、いかなる種類のグリコシルトランスフェラーゼにた
いしても応用可能である。
【００５０】いくつかのグリコシルトランスフェラーゼ
については、その振舞いは知られているとはいうもの
の、多くのグリコシルトランスフェラーゼについては、
現在のところ十分にその性質が明らかにされていない。
しかしながら、本発明は、本発明の実施にふさわしい全
てのグリコシルトランスフェラーゼを特定し、調製する
ことのできる方法を提供する。受容体部分をアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーの手段として用い、特定のサ
ッカライド・ユニットを転移することのできる、したが
って、他のグリコシドを合成することのできる、酵素を
単離できるということが初めて分かった。
【００５１】ある好ましい実施形態においては、受容体
部分を、例えば、固相の支持体に固定する。この、「固
相の支持体」とは、半固形の支持体をも含むことは了解
されるであろう。固定させたら、その受容体部分を、グ
リコシルトランスフェラーゼを含むと予想される混合
物、例えば、天然の細胞ホモジェネートに接触させる。
固定された受容体部分は、それにたいして特異的な酵素
と結合するから、次に、このシステムについて、受容体
結合酵素の有無を監視する。
【００５２】受容体結合酵素の有無の監視は、次のよう
にして実施できよう。細胞ホモジェネートを、固定化し
た受容体部分の上を通過させる。これは、例えば、細胞
ホモジェネートを、固定化した受容体部分を負荷したカ
ラム上を通過させることによって実行することができ
る。次に、カラムを洗浄し、固定化した受容体部分で負
荷したカラムを通過する蛋白量を測定する。これ以上蛋
白が検出されなくなったら、塩の水溶液である溶出液を
カラムに流し、酵素を溶出する。かくして得られた溶出
液について、グリコシルトランスフェラーゼの有無を測
定する。用いることのできる測定法については、前述し
た。すなわち、Furukawa et al, Roth et al, およ
び、Benau et al の記載する方法である。
【００５３】受容体部分にたいする酵素の結合が見られ
ない場合には（すなわち、溶出液の測定によって、グリ
コシルトランスフェラーゼの存在が認められなけれ
ば）、その混合物にはその特定の受容体にたいして特異
的な酵素は含まれていないと結論することができる。次
に、他の、例えば動物および／または植物細胞ホモジェ
ネートの混合物を、その受容体部分と接触させる。この
操作を酵素結合が見つかるまで続ける。
【００５４】受容体部分に酵素が結合している場合に
は、その種を分離し、さらに調べる。好ましい実施形態
においては、この受容体と、この酵素候補とを再び接触
させるが、今度は、受容体部分に転移すべきサッカライ
ド・ユニットを含む供与体部分の存在下に行なう。もし
この接触によって、サッカライド・ユニットが受容体に
転移されるならば、その酵素は、本発明の実施に有効な
グリコシルトランスフェラーゼである。
【００５５】一旦、このグリコシルトランスフェラーゼ
が特定されたならば、本技術に習熟した人々によく知ら
れている技術を用いて、配列決定をし、かつ／または、
複製することができるのは了解されるであろう。例え
ば、複製は、そのグルコシル・トランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子原料の単離、および、そのグリコシルト
ランスフェラーゼを生成できる無限増殖性細胞系統の調
製、を含む組換え技術によって実現することができるで
あろう。複製は、本発明によるサッカライド組成物の商
業規模の生産にとってはおそらく好ましいであろう。
【００５６】このグリコシルトランスフェラーゼが特定
されたなら、それを、受容体部分および供与体部分に、
次の条件下に接触させる。すなわち、サッカライド・ユ
ニットを受容体部分に転移し、共有結合させることがで
きるような条件である。ある特定のサッカライド・ユニ
ット転移に相応する好適な条件、例えば、時間、温度、
ｐＨは、この分野の技術者が通常の実験手法によって決
めることができるのは了解されるであろう。例えば、受
容体、供与体部分は、２価陽イオン、特に、MnCl２によ
って供給されるようなマンガン陽イオンの存在下でグリ
コシルトランスフェラーゼと接触させるのが望ましい。
【００５７】好ましい実施形態においては、このグリコ
シルトランスフェラーゼを、固相の支持体に結合させる
ことによって固定し、それにたいして接触させるべき受
容体、供与体部分を加えるのが望ましい。前述したよう
に、本発明に従って用いられるグリコシルトランスフェ
ラーゼは所期の活性を持つ少なくとも１個のグリコシル
トランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラー
ゼの混合物であることが多いが、精製した単一のグリコ
シルトランスフェラーゼもまた本発明で使用できる。こ
の好ましい実施形態においては、グリコシルトランスフ
ェラーゼ類の混合物か、または、精製した単一グリコシ
ルトランスフェラーゼのどちらを固定してよい。また別
のやり方として、そのグリコシルトランスフェラーゼ、
供与体、受容体を、それぞれ溶液として供給し、溶質と
して接触させてもよい。
【００５８】グリコシルトランスフェラーゼ、そして、
必要に応じて、受容体部分を固定するための好ましい操
作は、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−アクリルオキシ
スクシンイミド）(PAN)のような水溶性ポリマー前駆
体、トリエチレンテトラミンのような架橋結合性ジアミ
ン、および、当該グリコシルトランスフェラーゼを、中
性バッファー中で、共重合させることである。これにつ
いては、Pollack et al., J. Am. Chem. Soc.(1980) 10
2:6324-36に開示してある通りである。ＰＡＮにこの酵
素類を固定するのは、小量の酵素を使うだけで、高い酵
素活性を得ることができ、かつ、酵素とポリマー間の結
合が安定であるという理由で有効である。
【００５９】さらに、好ましい固定法は、グリコシルト
ランスフェラーゼのアミノ基を、固相支持体のオキシラ
ン基か（例えば、Chan et al, Enzyme Eng. (1980) 5:
457-460を参照）、臭化シアン活性化「セファデック
ス」または「セファローズ」（Axen et al, Nature (1
967) 214:1302-1304）上に固定することである。
【００６０】ある好ましい実施形態では、そのグリコシ
ルトランスフェラーゼを含む中等度に精製した組成物か
ら、そのグリコシルトランスフェラーゼを固定する。極
めて酵素純度の高い標本（すなわち、１分間のインキュ
ベーションにたいし、１μｇの蛋白当り転移される量が
1 nMoleの範囲の比活性）は、固相の支持体に共有的に
固定するには効率が悪い。即ち、１０倍から１００倍純
度の低い標本に比べて、誘導体化率が低いからである。
【００６１】グリコシルトランスフェラーゼの活性部位
の、固定による損傷は避けるべきである、というのは了
解されるであろう。本発明者は、次の観察をしている。
すなわち、グリコシルトランスフェラーゼを、固定操作
の間、特異的に保護すると、問題のグリコシルトランス
フェラーゼに比べて、固定操作の間の夾雑酵素活性が消
失する傾向があることである。固定操作の間、グリコシ
ルトランスフェラーゼを、その酵素の必要とする陽イオ
ン、その酵素によって認識されるヌクレオチド、およ
び、その酵素によって認識される受容体によって保護し
てもよい。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、固定の間、Ｍｎ２＋，Ｎ−アセチルグルコサミン,
UDP によって保護してもよい。これは、いずれの固定法
であっても用いてよい。夾雑蛋白分解酵素は、このよう
には、固定操作の間、全く保護されない。
【００６２】固定操作の間、所期のグリコシルトランス
フェラーゼのみが保護されるので、標的サッカライド組
成物の合成を邪げる酵素や、標的サッカライド組成物の
合成を邪げる酵素活性は消失する傾向にある。干渉性酵
素の例は、蛋白分解酵素があるが、これは、もし消失し
ていなければ、所期のグリコシルトランスフェラーゼに
作用するし、また、グリコシダーゼがあるが、これは、
もし消失していなければ、生成サッカライドに作用す
る。
【００６３】前述したように、本発明に基づいて、受容
体部分を、供与体部分とグリコシルトランスフェラーゼ
に接触させて調製したサッカライド組成物は、今度は、
自らが、さらに酵素を単離するための受容体部分とし
て、また、後続のサッカライド・ユニットが転移される
受容体部分として機能することができる。このような接
触によって、調製されたサッカライド組成物にサッカラ
イド・ユニットを付加すると、炭水化物や、約３サッカ
ライド・ユニットを越えるサッカライド鎖の合成にとっ
て望ましい。
【００６４】例えば、トリサッカライドであるＮ−アセ
チルニューラミニル α2-3 ガラクトシル β1-4 Ｎ−
アセチルグルコサミンを調製する場合には、ジサッカラ
イドのガラクトシル β 1-4Ｎ−アセチルグルコサミン
を、本発明にしたがって調製し、次に、これを、受容体
部分として用い、それに、後続のユニットを付加する。
本技術に習熟した人であれば、本発明のサッカライド組
成物に付加されるサッカライド・ユニットは、同じもの
でも、別物でもよいことが了解されるであろう。
【００６５】本発明のサッカライド組成物は、極めて広
範囲の応用分野に使用され、既知の供給源から入手され
るサッカライド組成物と同様に使用できる。このサッカ
ライド組成物は、ほ乳類の治療処置、予防処置として用
いるのが好ましい。これについては、U.S.出願 07/241,
012 に開示した通りである。
【００６６】本発明のサッカライド組成物は、細胞表面
受容体の阻止剤として、ウィルス性、細菌性、真菌性の
多数の病気治療に使用を見込まれている。その病気に
は、例えば、肺炎、カンジダ症、尿路感染、歯周囲炎、
下痢がある。例えば、本発明にしたがって調製されたオ
リゴサッカライドは、肺炎菌のような病原体が、ほ乳類
膜分子に付着するのを抑制することができる。そのよう
な病原体を、クロマトグラフィーや、電気泳動によって
分離した細胞糖蛋白や糖脂質とインキュベートしてもよ
いだろう。特定の付着パターンを検出したら、その標的
化合物を分析し、抑制性サッカライド組成物を調製する
ことができるだろう。もし、その相補的分子のいずれか
が、そのサッカライド成分を介して機能しているのであ
れば、特定のサッカライド組成物が、付着を抑制するは
ずである。
【００６７】本発明によって調製されるサッカライド組
成物は、下記の応用分野に使用することができる。
【００６８】１．栄養添加物 ＊幼児用処方
【００６９】
【化２】
【００７０】＊老人用処方 ＊特別ケア処方
【００７１】２．抗菌剤 ＊肺炎
【００７２】
【化３】
【００７３】＊尿路感染
【００７４】
【化４】
【００７５】＊虫歯
【００７６】
【化５】
【００７７】＊歯周囲疾患
【００７８】
【化６】
【００７９】＊下痢
【００８０】
【化７】
【００８１】＊外科（院内）感染 ＊カテーテル関連性感染
【００８２】３．抗腫瘍剤 ＊硬結性腫瘍転移
【００８３】
【化８】
【００８４】４．抗炎症剤 ＊好中球・血小板相互作用 ＊ＷＢＣ内皮相互作用
【００８５】５．海上牽引感緩和剤 ＊船体動揺感
【００８６】６．避妊薬
【００８７】
【化９】 ＊泡状およびゼリー状成分
【００８８】７．抗ウィルス剤 ＊ヘルペス ＊インフルエンザ ＊ＨＩＶ
【００８９】８．抗真菌剤および抗酵母剤 ＊経口および膣性カンジダ症（例えば、グルコマンナン
複合体、L-RHAM, D-Gal 含有、α-D-MAN(1-6)n分枝α-
(1-2)
【００９０】
【化１０】
【００９１】＊アクチノミセテス
【００９２】９．食品添加物
【００９３】
【化１１】
【００９４】＊乳化剤 ＊増粘剤
【００９５】
【化１２】
【００９６】１０．獣医用剤 ＊抗菌剤 ＊抗ウィルス剤 ＊抗真菌剤 ＊抗炎症剤
【００９７】上記から、本発明は、本発明に従って調製
されたサッカライド組成物を含む、医薬組成物、食品組
成物のようなその他の組成物を与える。本発明によって
与えられる医薬組成物・食品組成物のいずれにおいて
も、本発明のサッカライド組成物は、１０−３μg/mlか
ら100 mg/ml の量として存在する。
【００９８】何かある特定の医薬組成物または食品組成
物におけるサッカライド組成物の濃度は、使用するサッ
カライドの活性という点から見ると様々であろう。医薬
組成物の場合、その組成の中のサッカライドの濃度は、
何かの組成にたいして、インビトロで測定した活性に依
存するであろう。食品組成物について言えば、本発明の
サッカライド組成物の濃度は、添加する化合物の既知の
活性に従って決めることができる。
【００９９】例えば、母乳は、上記のように、幼児のた
めにも、尿路感染を防ぐ抗菌剤としても有効であるよう
なサッカライド組成物を含んでいる。これを踏まえて、
本発明は、市販の幼児用処方に改良を加えたものであ
る。すなわち、これら市販の幼児用処方に、上記のサッ
カライド組成物を添加することによってそれを実現し
た。上記の、特定のサッカライドを、市販の幼児処方
に、0.1 μg/mlから 1000 μg/mlの量加えてもよい。こ
のサッカライドは、母乳には、およそ 10 μg/mlの濃度
で存在する。
【０１００】医薬組成物には、発熱性物質があってはな
らない。本発明に一致する医薬組成物は、その分野に既
知のやり方で調製し、経口、静注、筋注、直腸、経皮、
経鼻孔（例えば、鼻噴霧）投与に適するようにしてもよ
い。それはまた、クリーム、塗り薬、懸濁液等の形で、
局所投与にふさわしいように調製してもよい。
【０１０１】二三のサッカライドは、従来、食品、繊
維、石油化学における一般化学薬品としても、主に医学
領域における特殊化学薬品としても、重要なものと注目
されてきたが、これまで、サッカライド組成物を調製す
るための効率的方法が無かったために、サッカライド組
成物を、活性成分として含む市販組成物を得ることはで
きなかった。
【０１０２】本発明は、そのようなサッカライド組成物
を、初めて、簡単に大量に入手することを可能にした。
本発明の方法を用いれば、これまでほんの小量しか入手
できなかったサッカライド組成物が、また、これまで入
手出来なかったサッカライド組成が、グラムないしキロ
グラム量で簡単に生産できる。本発明によって与えられ
るサッカライド組成物の純度は、95重量％を越える。あ
る種の、高純度を要求する応用では、本発明の方法を用
いて、98重量％からほとんど 100重量％に近い純度のサ
ッカライド組成物を得ることも可能である。
【０１０３】したがって、本発明は、今や、サッカライ
ド組成物を有効量含む医薬組成物ならびに他の組成物を
初めて供給することになる。本発明は、本発明に従って
生産されるサッカライド組成物を、少なくとも 100 mg
，できれば少なくとも 500 mg の量として、かつ、そ
れを、その組成物の95重量％まで含む組成物を供給す
る。
【０１０４】もう一つの実施例として、本発明は、本発
明に従って使用するのに適当な装置を与える。これは、
グリコシルトランスフェラーゼ触媒による、サッカライ
ド組成物の合成に用いられるものである。そのような装
置の模式形態を、図１、２、３に示す。
【０１０５】ある、きわめて基本的な実施例をあげる
と、本発明の装置は、一つの反応室を持つ。この中で、
全部のグリコシルトランスフェラーゼ、あらかじめ選ん
だサッカライド・ユニットと最初の受容体部分のすべて
を結合させる。グリコシルトランスフェラーゼの特異性
によって、この混合物は、十分な時間を与えれば、本発
明のサッカライド組成物を生産する。
【０１０６】図１、２、３は、本発明にしたがって用い
ることのできる、効率的設計の装置を図示している。図
に示した装置は、その基本要素として、入口、出口を備
えた反応器を含む。この反応器は、複数の、あらかじめ
選んだサッカライド・ユニットを、受容体部分上に、連
続的に共有結合させていき、それを、その共有結合の各
々に特異的な、複数の、相応のグリコシルトランスフェ
ラーゼの触媒の下に行なう、そのような結合反応の実施
に適している。これは、少なくとも３個の、望ましく
は、４個の、さらに望ましくは、４個を越える数の、例
えば、５、６、７個以上の、異なるグリコシルトランス
フェラーゼを含み、かつ、これら酵素は望ましくは固定
されている。
【０１０７】入口機構は、受容体部分と、複数の、あら
かじめ選んだサッカライド・ユニットとを、反応器内に
導入し、サッカライド組成物が合成されるよう、ふさわ
しく出来ているものである。できれば、入口機構は、反
応器内に、グリコシルトランスフェラーゼを導入するの
にもふさわしくできており、かつ、グリコシルトランス
フェラーゼ自体はできれば固定されていることが望まし
い。出口機構は、サッカライド組成物を、反応器から放
出させるためのものである。
【０１０８】図１は、固相支持体を負荷した、カラム型
反応器を示す。本工程に使用される、異なるグリコシル
トランスフェラーゼ（酵素１、２、３）を、その固相支
持体全体にランダムに分布させても、または、図１に示
すように数層に配置してもよい。最初の受容体部分（図
のＡ）と、あらかじめ選んだサッカライド・ユニット
（図の、Ｂ，Ｃ，Ｄ）とを、入口機構から、反応器内に
負荷し、固相の支持体を通過させる。この支持体上で、
サッカライド組成物が、特異的グリコシルトランスフェ
ラーゼの活動により生産され、出口機構から、分子 A-B
-C-Dとして回収される。
【０１０９】図２に示した実施例では、最初の受容体部
分と、その最初の受容体部分に付着させるべき、あらか
じめ選んだサッカライド・ユニットとを、固相支持体の
頂上に負荷し、選択された各サッカライド・ユニットの
添加に特異的なグリコシルトランスフェラーゼを、反応
混合物の流れの方向にそって、対応する層に配置する。
次に、あらかじめ選んだ、異なるサッカライドを、図に
示すように、反応混合物の流れに沿って、対応的に適当
する位置に、それぞれに添加する。
【０１１０】もう一つの好ましい実施例では、これは、
図３に示されているが、反応器は、直列に接続した、複
数（ｎ）の反応層から成る。この接続は、相互の、連続
的流体連絡を可能にするように行なわれており、また、
ここに、（ｎ）は、付着させるサッカライド・ユニット
の数より多くはない、そのような数にほぼ相当する。各
反応層は、あらかじめ選んだ、特定のサッカライド・ユ
ニットを、前段の反応層で形成された中間産物に結合さ
せるのに特異的触媒として働く、少なくとも１個のグリ
コシルトランスフェラーゼを含んでいる。
【０１１１】本実施例に従えば、最初の受容体部分
（Ａ）と、その受容体部分に付着させるべき、あらかじ
め選ばれた、最初のサッカライド・ユニット（Ｂ）を、
最初の反応層を通過させるが、この反応層は、あらかじ
め選ばれた、最初のサッカライド・ユニットを、最初の
受容体部分に結合させるのに特異的触媒として働くグリ
コシルトランスフェラーゼを含んでおり、これにより、
最初の中間産物が生産される。次に、この最初の中間産
物は、第２の反応層（ｎ＝１）に転送され、ここで、あ
らかじめ選ばれた第２のサッカライド・ユニット（Ｘn
）、および、あらかじめ選ばれた第２のサッカライド
・ユニットを、形成された第１の中間産物に結合させる
のに特異的触媒として働くグリコシルトランスフェラー
ゼ（Ｅ１＋ｎ）とに、結合させられる。この工程を、Ａ
−Ｂ−……（Ｘ）−ｎ……Ｚと書かれている標的サッカ
ライド組成物が得られるまで、反応層の相当する数だけ
繰り返す。ここに、各Ｘ部分は、独立に選択されるもの
とする。
【０１１２】もう一つの好ましい実施例では、これも、
図３に描かれているが、各中間産物４を精製する機構
が、各反応層間の、流体連絡路に位置している。この中
間産物は、ある任意の反応層から放出される反応混合物
から形成されるものである。この精製機構は、反応混合
物中の汚染物を除去するもので、この汚染物は、あらか
じめ選ばれた、次段のサッカライド・ユニットを、形成
された中間産物に結合させる効率を邪げるものである。
【０１１３】本発明の、これ以外の、目的、長所、新し
い特質は、下記の実施例を調べれば、この分野に熟練し
た人々にとっては明かであろう。ただし、この実施例
は、限定的な意図を持つものではない。
【０１１４】
【実施例】実施例１．トリサッカライドＮ−アセチルニ
ューラミニルα 2-3ガラクトシルβ 1-4Ｎ−アセチルグ
ルコサミンの調製 ５本の試験管の各々に、ｐＨ７．４の燐酸カルシウム・
バッファー、10μl, 50MM MnCl２, 10μl，シチジン１
燐酸-[14C]- Ｎ−アセチルニューラミン酸、17,000CPM
，ガラクトシル・トランスフェラーゼ、25μl ，Ｎ−
アセチルニューラミニル・トランスフェラーゼ，25μl
を加えた。グリコシル・トランスフェラーゼは、牛初乳
から、セファデックス G-100ゲル・クロマトグラフィー
によって精製した。
【０１１５】試験管１に、さらに、40mmのウリジン二燐
酸ガラクトース、10μl 、40mMＮ−アセチルグルコサミ
ン、10μl を加えた。試験管１を、氷中で、１時間イン
キュベートした。
【０１１６】試験管２にも、40mMのウリジン二燐酸ガラ
クトース、10μl を加えた。試験管２を３７℃で、１時
間インキュベートした。
【０１１７】試験管３にも、40mM のＮ−アセチルラク
トサミン、10μl を加えた。試験管３を、３７℃で１時
間インキュベートした。
【０１１８】試験管４と５に、40mM のウリジン二燐酸
ガラクトース、10μl と、 40mM のＮ−アセチルグルコ
サミン、10μl を加えた。試験管４と５を、３７℃で１
時間インキュベートした。
【０１１９】インキュベーション後、試験管の内容を、
各々、４ホウ酸ナトリウムで飽和させたペーパー上で、
高圧の電気泳動にかけた。同位体標識したトリサッカラ
イド産物は、その移動性によって特定した。これは、試
験管３に形成された精製物で示される通りである。
【０１２０】 試験管 トリサッカライド（cpm） 1 0 2 0 3 3375 4 670 5 954
【０１２１】これで分かるように、試験管４、５中に、
適当な受容体部分、供与体部分、グリコシルトランスフ
ェラーゼのあることが、モノサッカライド開始物質か
ら、予想通りのトリサッカライド産物を生成した。通
常、シアル酸Ｎ−アセチルニューラミン酸は、これを、
サッカライド組成物に組み込もうとする有機合成化学者
にとって、特殊な問題を形成することになる。これは、
そのグリコシド結合が、酸にたいして脆弱であることか
ら発生する。シチジン１燐酸Ｎ−アセチルニューラミン
酸からトリサッカライドを酵素的に合成すれば、強い酸
性条件下で、保護基を除去することに伴う合成上の問題
を取り除くことができる。
【０１２２】受容体部分（Ｎ−アセチルグルコサミン）
は、最初、供与体部分（ウリジン二燐酸ガラクトー
ス）、グリコシル・トランスフェラーゼ（ガラクトシル
・トランスフェラーゼ）と接触し、サッカライド組成物
（ガラクトシルβ 1-4 Ｎ−アセチルグルコサミン）を
形成し、これが、次に、第二の供与体部分（シチジン１
燐酸Ｎ−アセチルニューラミン酸）と第二のグリコシル
・トランスフェラーゼ（Ｎ−アセチルニューラミニル・
トランスフェラーゼ）との接触時には、受容体部分とし
て働くと、考えられている。
【０１２３】試験管４・５においては、モノサッカライ
ド開始物質から、トリサッカライド産物を合成したので
あるが、このことは、試験管３の産物との比較から確か
められた。すなわち、試験管３においては、トリサッカ
ライドは、ジサッカライド受容体部分（Ｎ−アセチルラ
クトサミン）を、シチヂン１燐酸Ｎ−アセチルニューラ
ミニン酸、および、Ｎ−アセチルニューラミニル・トラ
ンスフェラーゼに接触させて形成した。
【０１２４】試験管２にはトリサッカライドが存在しな
かったが、これは、トリサッカライド形成には、適当な
受容体部分が必要であることを示している。試験管１に
はトリサッカライドが存在しなかったが、これは、トリ
サッカライドの合成は、実際に、何らかの酵素（グリコ
シル・トランスフェラーゼ）の活性に依存していること
を示している。すなわち、この酵素が低温で不活性であ
ったわけである。
【０１２５】オリゴサッカライド、Ｎ−アセチルガラク
トサミニル α 1-3（フコシル α1-2）、ガラクトシ
ル β 1-4Ｎ−アセチルグルコサミニル β 1-3ガラク
トース（下痢誘発性細菌にたいする標的）、および、Ｎ
−アセチルガラクトサミニルβ 1-4ガラクトシル β 1
-4グルコース（肺炎誘発性細菌にたいする標的）も、本
発明の工程を用いて、同様に調製できると期待されてい
る。
【０１２６】実施例２．テトラサッカライド生合成プロ
トコル 酵素−−Ｎ−アセチルグルコサミニル・トランスフェラ
ーゼ ヒト初乳を、70,000×G で、１時間遠心する。２５％飽
和硫酸アンモニウム分画で上清を生じ、これを透析し
て、硫酸アンモニウムを除去する。残留物を、セファデ
ックス G-200カラムに注ぐ。蛋白スペクトラムは、280
nm で、分光学的に測定し、放射能測定を行い、トラン
スフェラーゼ活性を持つ分画の位置を特定する。単一酵
素ピークを含む分画をプールし、Amiconろ過により１０
倍に濃縮する。プールした酵素標本を再び測定する。蛋
白の濃度は、BioRad法を用いて定量する。この標本の比
活性は、１μg 蛋白、１分当り 5.3 pMoleである。
【０１２７】ガラクトシル・トランスフェラーゼ ヒト初乳を、8,700xG で、１５分遠心する。上清を、チ
ーズ布で濾し、10mlをセファデックス G-100カラム(2.5
×90cm) に注ぐ。蛋白スペクトラムは、280nmで、分光
学的に測定し、放射能測定を行い、酵素活性を持つ分画
の位置を特定する。最高の活性を持つ分画をプールし、
Amicon ろ過により１０倍に濃縮する。プールされた酵
素標本は、再び、測定し、その蛋白濃度を、上記のよう
に定量する。標本の比活性は、１μg 蛋白、１分当り 1
5.4 pMole である。
【０１２８】酵素固定−Ｎ−アセチルグルコサミニル・
トランスフェラーゼ 300mg の Eupergit ビーズ（1.2ml ）を、脱イオン水
で、三回洗浄し、次に、消毒 Hepesバッファー水で、３
回、洗浄する。酵素標本の１ｍｌを、UDP, ラクトー
ス、MnCl２（最終濃度はそれぞれ、10, 25, 10mM）、一
滴のクロロフォルムとと共に、Hepes バッファー溶液中
で、ビーズと結合させる。ビーズを、４℃で、２1/2 日
静かに撹拌する。分液を採取し、定期的に測定する。誘
導化を防ぐために、ビーズを、無菌のバッファーで３回
洗浄し、 UDP, ラクトース、MnCl２、クロロフォルムを
含むバッファー中に、冷却保存する。
【０１２９】ガラクトシル・トランスフェラーゼ 3.75g のビーズを、脱イオン水で、３回洗浄し、次に、
無菌の、Hepes 緩衝水で、３回洗浄する。このビーズ
を、各 3mlの酵素標本液に（いずれの場合も、至適誘導
条件は、200 mg のビーズにたいして蛋白約 1mgの時に
起こる）、 UDP, GlcNAc, MnCl２（最終濃度はすべて 1
0mM ）や、１滴のクロロフォルムと一緒に、Hepes 緩衝
液中で与えた。誘導化と保存は、上記の通りである。た
だし、GlcNacは、ラクトースでなく、ガラクトシル・ト
ランスフェラーゼと共に用いる。これは、Ｎ−アセチル
グルコサミニル・トランスフェラーゼにたいする受容体
である。
【０１３０】テトラサッカライド生産 誘導化されたＮ−アセチルグルコサミニル・トランスフ
ェラーゼ（0.5ml ビーズ）を、ラクトース（25mM）、 U
DPGlcNAc（80μM）、MnCl２（10mM）と共に、２１時
間、絶えず撹拌しながら、インキュベートする。このイ
ンキュベーションを２重に行なう。片方のインキュベー
ションによる上清は、トリサッカライド（14μg）の生
成量を測定するのに用いられ、もう一方のインキュベー
ションによる上清は、ガラクトシル・トランスフェラー
ゼによって誘導された 0.5mlビーズに加えられる。した
がって、このガラクトシル・トランスフェラーゼ・イン
キュベーション物は、14μg のトリサッカライド、25μ
g の UDPgal, 10mM のMnCl２を含む。室温で２４時間置
くと、第二の酵素標本は、約 1.6μg のテトラサッカラ
イドを生成した。３１時間後では、2.2 μg のテトラサ
ッカライドが生産された。
【０１３１】実施例３ 下記の処方は、３種の、比較的複雑なオリゴサッカライ
ドを合成するのに用いることができよう。すなわち、
Ａ、Ｂ型ミルク・オリゴサッカライド（Ｉ，ＩＩ）とト
ラガカント・ゴムであって、後者は、食品添加物とし
て、大量に使用される植物性オリゴサッカライドであ
る。
【０１３２】
【化１３】
【０１３３】最初に、CNBr活性化支持体、例えば、セフ
ァローズに付着させるグルコースの、ヘキサノールアミ
ン・グリコシド(glc-O-(CH２)６−NH２)を、ヘキサノー
ルアミンのアミノ基を介して合成する。次に、グルコー
ス認識性のガラクトシル・トランスフェラーゼを、この
アフィニティー・リガンドを用いて、ヒトのミルクない
し初乳から精製する。この酵素は、一部でも精製すれ
ば、グルコースをガラクトース化するのに使用すること
ができ、ラクトースを生成する。
【０１３４】別のやり方としては、ラクトースのヘキサ
ノールアミン・グリコシドを合成する。これは、安価
で、簡単に手にはいるジサッカライドである。このよう
にして生成されたラクトースを、セファローズに付着さ
せ、アフィニティー・リガンドとして用いる。次に、こ
れを用いて、ヒト初乳、ないし、ヒト血漿由来の、Ｎ−
アセチルグルコサミニル・トランスフェラーゼを一部精
製する。
【０１３５】次に、この第２のトランスフェラーゼを用
いて、Ｎ−アセチルグルコサミンをラクトースに加え、
トリサッカライドを生成し、これを、再び、セファロー
ズに付着させる。この、結合したトリサッカライドを用
いて、β 1,3 ガラクトシル・トランスフェラーゼ（ブ
タ顎下腺由来）を得、これが、次に、次段の酵素−−α
1,4 フコシル・トランスフェラーゼ（ブタ肝臓由来）を
生成する基質を生産する。α1,2 フコシル・トランスフ
ェラーゼ（ブタ顎下腺由来）、および、最後に、Ａ型ミ
ルク・オリゴサッカライドの合成を停止させる、α1,3
Ｎ−アセチルガラクトサミニル・トランスフェラーゼ
（ブタ顎下腺由来）を、この段階法により、アフィニテ
ィー・クロマトによって精製する。このようにして得ら
れた各トランスフェラーゼは、いくつかの手段の内のい
ずれかを用いて、固相基質に固定し、この基質を、カラ
ム型に注ぐ。
【０１３６】酵素含有カラムを順々に、誘導される基質
の合成が次第に小量になっていく順序に使用し、各溶解
性オリゴサッカライドを大量に合成する。これよりさら
に単調な別法として、各酵素を順番に用いて、その産物
の小量を合成し、次に、これを、ヘキサノールアミン・
リンカーを用いて、セファローズに固定するやり方があ
る。この別法では、ヘキサノールアミン・リンカーを、
６種の化合物に付着させ、誘導化を、６種のヘキサノー
ルアミン含有グリコシドによって行なうことが必要とな
ろう。この方法では、ただ、ヘキサノールアミン１段階
と、グルコース・ヘキサノールアミンからセファローズ
への１誘導化しか必要でなく、しかも、後者は、比較的
込み入ったところのない過程である。
【０１３７】糖付着の順番は重要である。近位フコース
（α1,4 を glcNAc に付着させる）は、第２のフコース
（α1,2 をガラクトースに付着させる）の添加の前に、
反応を完了した、中核テトラサッカライドに付着させな
ければならない。最後に、末端galNAc（α1,3 ）を加え
て、７糖オリゴサッカライドを完了する。この順番は、
グリコシル・トランスフェラーゼの特異性から要求され
るものである。
【０１３８】
【化１４】
【０１３９】Ｉを合成したならば、ＩＩも厳密に同様に
して合成する。ただし、ヘキササッカライドを用いる。
これは、第一に、Ｎ−アセチルガラクトシル・トランス
フェラーゼではなく、ガラクトシル・トランスフェラー
ゼにたいする保護基を持って誘導されるα1,3 ガラクト
シル・トランスフェラーゼを精製するのに用いられる。
つぎに、この酵素を用いて、Ｂ型オリゴサッカライドを
合成する。
【０１４０】
【化１５】
【０１４１】トラガカント・ゴムのα1,4 ガラクツロン
酸幹鎖、これは、最近では、わずかに、中東に土着する
ある樹種の皮から入手することができるものであるが、
これを合成する酵素を単離するには、ヘキサガラクツロ
ナンを、柑橘類果皮の一般的な成分であるペクチンから
調製し、これを、アフィニティー・クロマトのリガンド
として用いる。
【０１４２】同じアフィニティー・リガンドを、樹種に
用いて、次には、近位β1,3 キシロシドを合成するキシ
ロシル・トランスフェラーゼを単離することができる。
キシロシル化したガラクツロナンは、一旦誘導される
と、フコシル・トランスフェラーゼ、ガラクトシル・ト
ランスフェラーゼの単離に用いることができる。後者は
それぞれ、キシロシル化したガラクツロナンを、フコシ
ル化、ガラクトシル化する。このオリゴサッカライドの
場合、キシロシル化、フコシル化、ガラクトシル化の度
合は、経験的に、これら化合物が、対応する酵素含有カ
ラムを通過するその回数でコントロールされる。生成さ
れる繰り返しユニットの数は、最初に用いられるガラク
ツロン酸の数に依存し、この数は、長さにして、４から
２０モノサッカライド・ユニットの間に渡る。
【０１４３】上記の開示事項に照らして、本発明につい
ては、多数の修飾、変更が可能であることは明かであ
る。従って、付属の請求項の範囲内においても、本発明
は、ここに特に記載したものとは別のやり方で実行する
こともできるということは了解される筈である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従って、グリコシルトランスフェラー
ゼを触媒としてサッカライド組成物を合成する際に使用
するのに適した装置である。
【図２】本発明に従って、グリコシルトランスフェラー
ゼを触媒としてサッカライド組成物を合成する際に使用
するのに適した装置である。
【図３】本発明に従って、グリコシルトランスフェラー
ゼを触媒としてサッカライド組成物を合成する際に使用
するのに適した装置である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０７Ｈ 3/06 13/08 13/08 19/10 19/10 19/20 19/20 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｐ 19/44 // Ａ６１Ｋ 31/7008 Ａ６１Ｋ 31/7008 31/702 31/702 31/7068 31/7068 31/7072 31/7072 Ｆターム(参考） 4B064 AF04 AF41 4C057 BB02 BB04 DD01 LL10 LL17 LL21 LL40 LL44 4C086 AA03 EA01 EA17 EA18 NA14 ZB33 ZB35

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数のグリコシルトランスフェラーゼを
    順番に触媒として用いて、あらかじめ選んだサッカライ
    ド・ユニットを含むサッカライド組成物を合成する方法
    であって、（ａ）受容体部分を、その受容体部分及びあ
    らかじめ選んだサッカライド供与体部分の両方に特異的
    なあらかじめ選んだ均質のグリコシルトランスフェラー
    ゼと接触させて、前記のあらかじめ選んだグリコシルト
    ランスフェラーゼを前記受容体部分に結合させて受容体
    部分とあらかじめ選んだグリコシルトランスフェラーゼ
    との複合体を形成し、（ｂ）前記の受容体部分とあらか
    じめ選んだグリコシルトランスフェラーゼとの複合体を
    前記供与体部分と接触させて、前記供与体部分のあらか
    じめ選んだサッカライド・ユニットを前記受容体部分に
    転移させ、これにより中間体サッカライド組成物を形成
    し、（ｃ）各時点で工程（ｂ）で得られた生成物が工程
    （ａ）の受容体部分として作用し、前記工程（ａ）と
    （ｂ）を繰り返す最後の回の後の工程（ｂ）の生成物が
    目的のサッカライド組成物となるように、前記工程
    （ａ）及び（ｂ）を少なくとも１回繰り返すことを含ん
    でおり、目的とするサッカライド組成物が次の連続合成
    経路の１つの中間体を含む前記方法。 【化１】
  2. 【請求項２】 前記のあらかじめ選んだ均質のグリコシ
    ルトランスフェラーゼが、（ａ）固体又は半固体支持体
    に固定された受容体部分を、目的のグリコシルトランス
    フェラーゼを含むと推定される混合物と接触させて、前
    記グリコシルトランスフェラーゼを前記受容体部分に結
    合させ、これにより固定化受容体部分とグリコシルトラ
    ンスフェラーゼとの複合体を形成させ、（ｂ）前記の固
    定化された複合体をあらかじめ選んだサッカライド・ユ
    ニットを含む供与体部分と接触させて、グリコシルトラ
    ンスフェラーゼ触媒により前記供与体部分から前記受容
    体部分に前記のあらかじめ選んだサッカライド・ユニッ
    トを転移させることにより、前記固定化複合体から前記
    あらかじめ選んだ均質のグリコシルトランスフェラーゼ
    を生成して得、及び（ｃ）前記あらかじめ選んだ均質の
    グリコシルトランスフェラーゼを回収することを含む方
    法によって得られることを特徴とする請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 前記のあらかじめ選んだ均質のグリコシ
    ルトランスフェラーゼが、（ａ）固体又は半固体支持体
    に固定された受容体部分を、目的のグリコシルトランス
    フェラーゼを含むと推定される混合物と接触させて、前
    記グリコシルトランスフェラーゼを前記受容体部分に結
    合させ、これにより固定化受容体部分とグリコシルトラ
    ンスフェラーゼとの複合体を形成させ、（ｂ）前記の固
    定化された複合体をあらかじめ選んだサッカライド・ユ
    ニットを含む供与体部分と接触させて、グリコシルトラ
    ンスフェラーゼ触媒により前記供与体部分から前記固定
    化受容体部分に前記のあらかじめ選んだサッカライド・
    ユニットを転移させて固定化された生成物を形成するこ
    とにより、前記固定化複合体から前記あらかじめ選んだ
    グリコシルトランスフェラーゼの１つを得、及び（ｃ）
    前記あらかじめ選んだグリコシルトランスフェラーゼを
    回収し、及び（ｄ）各時点で前記工程（ａ）、（ｂ）及
    び（ｃ）を繰り返し、工程（ｂ）で得られた固定化生成
    物が工程（ａ）の受容体部分として作用するように、前
    記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回繰り
    返すことを含む方法によって得られることを特徴とする
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記受容体部分が、蛋白質、糖蛋白質、
    脂質、糖脂質、炭水化物、モノサッカライド、ジサッカ
    ライド、オリゴサッカライド又はポリサッカライドであ
    ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記あらかじめ選んだ均質のグリコシル
    トランスフェラーゼが、固体又は半固体支持体に固定化
    されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記あらかじめ選んだ均質のグリコシル
    トランスフェラーゼが、そのグリコシルトランスフェラ
    ーゼの複製によって得られることを特徴とする請求項１
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記あらかじめ選んだ均質のグリコシル
    トランスフェラーゼが、そのグリコシルトランスフェラ
    ーゼを配列分析することによって得られることを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記複製が、前記グリコシルトランスフ
    ェラーゼをコードする遺伝物質の単離と、前記グリコシ
    ルトランスフェラーゼを産生可能な無限増殖性細胞系の
    作製を含む組換法によって実現されることを特徴とする
    請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記サッカライド供与体部分がサッカラ
    イドヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記サッカライドヌクレオチドが、末
    端にサッカライドが結合した、ウリジンリン酸、グアノ
    シンリン酸又はシチジンリン酸であることを特徴とする
    請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記工程（ａ）と（ｂ）との間に洗浄
    工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記工程（ｂ）と（ｃ）との間に洗浄
    工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 前記受容体部分、前記サッカライド供
    与体部分及び前記グリコシルトランスフェラーゼを互い
    に、マンガンカチオンのような共存試薬の存在下に接触
    させることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項
    に記載の方法。
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