KR19980016489A - 고정화법에 의한 이소말툴로스의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화균체를 이용하여 자당으로 부터 이소말툴로스를 제조함에 있어서, 균체분리를 하지 않은 어위니아 라폰티치 배양액 그대로를 고정화하여 얻은 고정화균체를 이용하는 것을 특징으로 하는 이소말툴로스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 제조방법에 의하면, 배양액으로부터 균체를 분리하지 않기 때문에 종래의 방법에서 균체 분리시 발생하는 제반 문제점들을 해결할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 의해 고정화균체는 기존 고정화 균체와 같이 기질용액과 생촉매의 분리가 용이하여 반복 재사용이 가능하다는 특징을 그대로 보유하고 있으므로 실 생산에서의 산업적 응용이 가능하다.

Description

고정화법에 의한 이소말툴로스의 제조방법

본 발명은 알파글루코실트랜스퍼라제를 생산하는 어위니아 라폰티치의 발효액을 균체분리하지 않고 그대로 사용하여 아르긴산 칼슘젤형의 고정화 균체를 만들어서 생촉매로 이용하여 자당으로부터 이소말툴로스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

어위니아 라폰티치가 생산하는 알파글루코실트랜스퍼라제는 균체내 효소, 특히 원형질 주변공간에 존재하는 효소로서 이 효소를 분리정제하거나 또는 이 효소가 함유된 어위니아 라폰티치 균체 그대로를 생촉매로 이용하여 자당수용액으로 부터 이소말툴로스나 트레할룰로스를 생산할 수 있다.

알파글루코실트랜스퍼라제의 주생성물인 이소말툴로스는 포도당과 과당이 결합된 이당류로서 자당의 구조이성질체이다. 이소말툴로스는 자연감미료로서 저충치유발성 및 항충치유발성이 있고 장내유용세균인 비피듀스균의 성장을 돕고 또한 인체내에서 분해흡수가 서서히 이루어지므로 당뇨병식에 이용되는 등 여러가지 기능성을 지닌 건강감미료이다. 이같은 이소말툴로스는 자당대용으로서 충치가 생기지 않아 아동을 위한 제과류, 음료류 및 당뇨병식 등의 감미료로서 이용되며 저칼로리 감미료인 이소말티톨의 중간원료가 되기도 한다.

어위니아 라폰티치의 종래의 고정화법은 영국의 테이트 앤드 라일사에서 개발한 것으로서 배양액으로 부터 원심분리하여 항습균체를 얻은 후 이를 아르긴산칼슘젤형으로 고정화하여 이소말툴로스를 제조하는 방법이다(영국특허 제2063268호). 여기서 균체를 분리하기 위한 원심분리 조건은 30℃, 15000g에서 10분간 원심분리하는 것인데, 어위니아 라폰티치는 위의 원심분리조건에서 보듯이 크기가 비교적 작고 편모를 가지고 있으며 운동성이 있고 배양조건이 불리해지면 다당류 피막을 생산하는 등 통상의 미생물들과 비교할 때 쉽게 원심분리되지 않는다. 또한 여과포에 의한 원심분리에서는 균체가 여과포를 통과하여 분리가 어렵고, 드럼필터에서도 규조토를 균체가 통과하므로 분리가 안된다. 한편 필터프레서에서는 필터공이 쉽게 균체에 의해 막혀 분리가 용이하지 않으며, 미세여과막 또는 한외여과막을 사용할 경우 전단응력 및 온도상승에 의한 활성감소현상이 일어나 적절하지 못하다. 따라서 균체분리를 위해서는 원심분리법이 가장 적당하나 15000g에서 분리해야 하는 등 분리조건이 가혹하며, 이 조건을 만족시키는 원심분리기는 고가이고 그 분리효율이 경제성 및 생산성 측면에서 타분리방법에 비하여 낮다는 단점이 있다. 특히 어위니아 라폰티치는 발효액중에서 상온 심지어는 저온(4℃)에서도 방치할 경우 알파글루코실트랜퍼라제 활성이 시간 경과에 따라 감소한다. 따라서 단시간내에 균체분리가 요구되므로 스케일업시 문제점으로 대두된다.

상기와 같이 종래에는 이소말툴로스 및 트래할룰로스를 생산하는 미생물인 어위니아 라폰티치를 고정화하기 위하여 균체를 배양액으로 부터 분리하여 담체에 고정화하는 것이 상식이었다. 그리고 어위니아 라폰티치의 효소활성은 보존하면서 배양액에서 균체만을 분리하기 위하여서는 통상 사용되는 저가의 제반 분리 장치로서는 어렵고 고가기기인 고속원심분리기만이 가능하였다. 그러나 본 발명에서는 이와 같은 종래의 당분야의 고정관념에서 탈피하여 배양액으로부터 균체를 분리하지 않고 배양액 그대로를 고정화 담체에 고정화하는 것을 시도하여 보았으며 그 가능성을 확인하였다. 즉, 본 발명에서는 균체를 분리하지 않은 배양액 그대로를 고정화균체 제조에 이용함으로써 균체분리시 수반도는 제반 문제점들을 쉽게 해결할 수 있었다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 대한민국 특허공고 제92-8371호에 기재된 바와 같은 통상의 배양법으로 어위니아 라폰티치를 배양한다. 그런 다음 획득된 어위니아 라폰티치 배양액 200mL을 미리 준비한 3~5%, 특히 4%의 아르긴산나트륨용액에 대하여, 바람직하게는, 1:0.5~1.5가 되게 섞어서 잘 혼합한다. 이 혼합용액을 염화칼슘 수용액에 교반하면서 적하하여 구형의 아르긴산칼슘 젤형의 고정화균체를 제조한다. 이 후 증류수에 의한 세척과정을 통하여 고정화균체중의 함입된 균체이외의 배양액 성분 및 잔류 염화칼슘을 제거한다. 이와 같이 제조된 고정화균체를 이용하여 반응온도 25~35℃ 특히 30℃, pH 5.0~6.0 특히 pH 5.5로 조절된 Bx50(613g/L)의 자당 수용액을 기질로 하여 회분식 혹은 연속식으로 이소말툴로스 및 트레할룰로스를 제조할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의해 생산된 고정화균체는 기존의 고정화균체와 같이 기질용액과 생촉매의 분리가 용이하여 반복 재생하여 가능하다는 특징을 그대로 보유하고 있으므로 실생산에서의 산업적 응용이 가능하다.

본 발명의 제조방법에 의해 싱산된 고정화균체는 기존의 고정화균체와 같이 기질용액과 생촉매의 분리가 용이하여 반복 재생하여 가능하다는 특징을 그대로 보유하고 있으므로 실생산에서의 산업적 응용이 가능하다.

다음의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1

배양배지

알파글루코실트랜스퍼라제를 생산하기 위하여 사용한 배양배지의 성분 및 함량은 자당 50g/L, 효모추출물 10g/L, 제2인산나트륨 2g/L이며, 배지조제 pH는 7.0으로 하였다.

종배양

어위니아 라폰티치(ATCC 29283)를 배지 100mL를 함유하는 250mL 용량 진탕배양용 플라스크에 1백금니씩 접종한 후, 25℃ 진탕회전배양기에서 180rpm으로 회전시키며 24시간 배양하였다.

본배양

상기의 종배양에서 얻어진 배양액 5mL를 배양배지 각각 100mL씩 함유하는 250mL 용량 진탕 배양용 플라스크에 접종한 후 25℃ 진탕회전배양기에서 180rpm으로 회전시키며 24시간 배양하였다. 배양종료액의 알파글루코실트랜스퍼라제의 효소활성은 31.5U/ml 이었다.

고정화 균체의 제조

상기 본 배양의 배양액 500mL를 미리 준비한 4% 아르긴산나트륨 수용액 500mL와 잘 혼합한 후 3L의 1% 염화칼슘 수용액에 25게이지의 주사바늘을 이용하여 교반하면서 적하하여 아르긴산칼슘젤형의 고정화 균체를 제조하였다. 미리 준비한 3L의 증류수에 고정화균체를 넣고 30분간 서서히 교반하여 함입된 균체 이외의 배양액 성분을 씻어내었다. 세척액을 폐기하고 새로운 3L의 증류수에 고정화균체를 옮겨 넣고 세척과정을 반복하였다. 이같은 세척을 5회 반복하여 생산에 사용할 고정화균체를 획득하였다.

회분식에 의한 이소말툴로스 및 트레할룰로스의 생산

5개의 500mL 용량 배플달린 삼각플라스크에 Bx50 (613g/L) 자당수용액을 각각 100mL 씩 가입하였다. 각 플라스크에 위에서 제조한 고정화 균체를 반응액에 대하여 10, 20, 30, 40, 50%(w/v)가 되게 가입하여 30℃, 180rpm의 진탕배양기에 넣고 24시간 반응하였다. 메쉬를 이용하여 고정화 균체와 반응액을 분리한 후 반응액 중의 당함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 아래 표1에 나타내었다.

표 1. 회분식에 의한 이소말툴로스 및 트레할룰로스의 생산

실시예 2

연속시에 의한 이소말툴로스 및 트레할룰로스의 생산

2개의 100mL 용량 칼럼에 상기 실시예 1에서와 같이 제조한 고정화 균체를 100mL씩 가입하였다. 정량펌프를 이용하여 Bx50(613g/L)자당수용액을 하부에서 상부로 흘려주었다. 이 때 유속은 공간속도가 각각 0.04, 0.08 hr-1가 되게 하였다. 5일 경과 후부터 3일간 칼럼출액은 Bx50이었으며 당함량을 HPLC로 분석한 결과 다음 표 2와 같았다.

표 2. 연속식에 의한 이소말툴로스 및 트레할룰로스의 생산

Claims (2)

1. 고정화균체를 이용하여 자당으로 부터 이소말툴로스를 제조함에 있어서, 균체분리를 하지 않은 어위니아 라폰티치 배양액 그대로를 고정화하여 얻은 고정화균체를 이용하는 것을 특징으로 하는 이소말툴로스의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 고정화균체는 어위니아 라폰티치 배양액과 3~5% 아르긴산나트륨 용액을 1:0.5~1.5로 섞어 염화칼슘용액에 적하하여 제조되는 것을 특징으로 하는 이소말툴로스의 제조방법.