MX2008003781A - Metodo para la produccion de sacarosa-6-acetato mediante biocatalisis celular completa. - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso que emplea preparaciones de célula completa de un microorganismo, inmovilizado o sin inmovilización, incluyendo Aureobasidium pullulans, capaz de formar enzimas del grupo de fructosiltransferasas, para catalizar una reacción entre la sacarosa y la glucosa 6-O-protegida para la formación de sacarosa 6-O-protegida, un intermediario en la síntesis de triclorogalactosacarosa. La sacarosa 6-O-protegida se separa de los subproductos de alto peso molecular de la reacción. Que tienen un peso molecular de 500 daltons y mayor, mediante osmosis inversa, y se purifica aun más mediante cromatografía de columna.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE SACAROSA-6-ACETATO MEDIANTE BIOCATALISIS CELULAR COMPLETA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un nuevo proceso y una nueva estrategia para la producción de l'-6'-dicloro-1' -6' -dideoxi-p-fructofuranosil-4-cloro-4-deoxi-galactopiranósido (TGS) , que comprende el uso de biocatálisis de célula completa para producir su intermediario, la sacarosa-6-acetato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las estrategias de la técnica anterior para la producción de 4 , 1' , 6' -triclorogalactosacarosa (TGS) comprenden principalmente la cloración de sacarosa 6-0-protegida mediante el reactivo Vilsmeier-Haack derivado de la cloración de sacarosa 6-0-protegida para formar 6-acetil-4 , 1' , 6' -triclorogalactosacarosa, utilizando varios agentes de cloración como oxicloruro de fósforo, cloruro de oxalilo, pentacloruro de fósforo etc. y una amida terciaria como la dimetilformamida (DMF) . Después de la reacción de cloración, la masa de reacción se neutraliza a pH 7.0 -7.5 con hidróxidos alcalinos apropiados como el de calcio, sodio, etc. El pH de la masa neutralizada se eleva a 9.5 o más para desacilar/desacetilar la 6-acetil-4 , 1 ' , 6' triclorogalactosacarosa y formar 4,1', 6' triclorogalactosacarosa . Esta invención se relaciona con la preparación de la sacarosa-6-acetato un intermediario clave en la fabricación del sacárido clorado 4,1', 6'-triclorogalactosacarosa por biocatálisis microbiana. La sacarosa-6-acetato es un intermediario clave en el esquema de producción de TGS mencionado en lo anterior. Mufti et al. (1983) en la patente de los Estados Unidos Núm. 4380476 reportaron un proceso en el que la sacarosa-6-acetato es un producto importante de la reacción de acilación de la sacarosa en piridina con anhídrido acético a una temperatura inferior a -20 grados Celcius.

Las impurezas incluyen otros monoacilados y también algunos acilados mayores. Este proceso depende del aislamiento y obtención del monoacilado deseado en una forma pura o de la cloración de todos estos acilados y el uso de medios para separar el TGS de otros azúcares clorados. Sería deseable un proceso de producción en el que se obtuviera la sacarosa-6-acetato sin la formación de otros monoacilados o acilados mayores para que el aislamiento y la purificación del TGS fuera lo más simple posible .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención describe un proceso en el que se usa biomasa, que incluye la masa celular completa, derivada de un microorganismo capaz de producir una fructosiltransferasa, para catalizar la transferencia de una entidad fructosa de un fructosil disacárido a un receptor monosacárido o un derivado de un receptor monosacárido para producir un fructosildisacárido o un derivado de fructosil disacárido. Las modalidades preferidas de esta invención se relacionan con la preparación de un intermediario clave, la sacarosa-6-acetato, para la fabricación del sacárido clorado 4, 1', 6' -triclorogalactosacarosa por biocatálisis microbiana. Esta modalidad describe un a proceso para preparar sacarosa-6-acetato y compuestos análogos a partir de la respectiva glucosa-6-acetato o glucosa 6-O-protegida, proceso biocatalizado por células completas de Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn. La sacarosa-6-acetato asi obtenida se separa de los sacáridos de mayor peso molecular mediante filtración por membrana y se puede usar para la preparación de azúcares halogenados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Hay diferentes tipos de enzimas fructosiltransferasas producidas por una variedad de microorganismos. La acción de las diferentes fructosiltransferasas procedentes de varias fuentes se describe en Enzyme and Microbial Technology, 19, 107-117, 1996. La levansacarasa, una enzima representativa del grupo de la fructosiltransferasa cataliza la formación del levan, un derivado polifructosa, al repetir un proceso de escisión del enlace glucosa-fructosa en la sacarosa y transferir la fructosa a un azúcar receptor. De este modo, si el azúcar receptor es la propia sacarosa, ésta incorpora una cadena de fructosa de mayor peso molecular. La investigación de Hestrin y Avigad, en Biochem.J. 69 (1958) pp. 388-398, indica que una gama de azúcares actúan con diferentes niveles de habilidad como buenos receptores de fructosa y compiten con la formación de levan y la inhiben. Se observó que la glucosa sustituida no es buen receptor. Sin embargo, cuando la relación entre el donador de fructosa (por ejemplo, la sacarosa) y el receptor es alta, por lo general, en el intervalo de 5:1 a 10:1, y la concentración es baja, se demostró que la glucosa sustituida también puede actuar como receptor. Asi, Thus Kunst et al. en Eur . J. Biochem. 42, 611-620 (1974), obtuvieron resultados satisfactorios al utilizar D-glucosa 6-fosfato como un receptor con sacarosa utilizando una enzima derivada de un una cepa mutante 168 Marburg de Bacillus subtilis . Del mismo modo, la patente núm. GB2046757B expone el uso como receptor de una variedad de materias primas tipo aldosa con sacarosa o rafinosa, en donde se usó la levansacarasa derivada de una variedad de microorganismos que incluyen Actinomyces viscosus y B. subtilis (Strain ATCC 6051, es decir, la cepa Marburg) . Sin embargo, en la solicitud de patente, la aldosa es siempre un azúcar sin derivar y la relación molar entre donador y receptor utilizada es 1:5, presuntamente para reducir la mínimo las reacciones de formación de cadenas. Rathbone et al. (1986) en la patente de los Estados Unidos Núm. 4617269 han reclamado un proceso para preparar derivados de sacarosa en posición 6- mediante la reacción de la correspondiente glucosa o galactosa 6-derivadas con una fructosil transferasa en presencia de sacarosa o rafinosa o estaquiosa, con la limitación específica de que la fructosiltransferasa usada en este proceso se aisla de una bacteria. En esta invención, se recurre satisfactoriamente a la preparación de la célula completa de un microorganismo para transferir la entidad de fructosa de la sacarosa a una glucosa-6-éster y producir una sacarosa-6-éster , el microorganismo es capaz de sintetizar una o más enzimas del grupo de la fructosiltransferasa y sus células completas son susceptibles de separarse de la mezcla de reacción mediante un simple proceso de separación que incluye filtración, centrifugación y lo similar. Se encontró que los rendimientos de conversión fueron muye buenos incluso en las preparaciones crudas, mejorando asi el aspecto económico y la conveniencia del método. En la modalidad preferida, se usa la levadura Aureobasidíum pullulans (de Bary) Arn. como biocatalizador para llevar a cabo la preparación de sacarosa-6-acetato al hacer reaccionar glucosa-6-acetato con sacarosa. Sin embargo, en un proceso de esta invención se puede utilizar cualquier otro microorganismo que manifieste la misma actividad y función como el Aureobasidíum pullulans incluidos, entre otros, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi , Aureobasidíum sp. , Aspergillus niger, Penicillium roquefortii , Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii , Sachharomyces , Bacillus subtilis , Erwinia y lo similar. Las características de las colonias de Aureobasidíum pullulans son que crecen rápidamente en agar de extracto de malta, tienen apariencia uniforme, pronto se cubren con un exudado viscoso, de color crema o rosa, que después en su mayor parte toma un color café o negro. La enzima del microorganismo Aureobasidíum pullulans actúa sobre la sacarosa en presencia de varias clases de monosacáridos, alcoholes de azúcar, alquil alcoholes, glicósidos, oligosacáridos y lo similar, como receptor para transferir el grupo fructosilo a la molécula receptora mostrando una muy amplia especificidad receptora. La enzima de Aureobasidium pullulans es activa en la descomposición de sacarosa, neokestosa, xilsacarosa, rafinosa y estaquiosa. La reacción en células completas es susceptible al efecto inhibitorio de iones de plata, mercurio, zinc, cobre y estaño. La molécula receptora puede ser cualquiera de las siguientes: D-arabinosa, L-fructosa, 6-deoxiglucosa , 6-0-metilgalactosa, glucosa-6-acetato, glucosa-6-propionato, glucosa-6-laurato, melibiosa, galactosa, xilosa glucosa-6-fosfato, glucosa-6-glutarato, lactosa, galactosa-6-acetato, mañosa, maltosa, 1-tio-glucosa, maltrotriosa , maltopentaosa, D-arabinosa, maltohexaosa, isomaltosa, L-arabinosa, ribosa, lixosa, ácido glucónico, L-rhamnosa, 6-O-metilglucosa, metil-alfa . -D-glucósido, xilitol, glicerol y lo similar. El Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn . es uno de los microorganismos, una levadura, que produce enzima fructosiltransferasa (SST) y se encuentra en forma tanto intracelular como extracelular . La enzima del cultivo de Aureobasidium es bastante regiospecifica en la reacción de transferencia de fructosilo. En la presente invención, se usa un cultivo de Aureobasidium ATCC No. 9348 productor de fructosiltransferasa para llevar a cabo la preparación 52-495 de la sacarosa-6-acetato al hacer reaccionar la sacarosa con 6-0-acetilglucosa . Los otros sacáridos de mayor peso molecular producidos se separan de la sacarosa-6-acetato por técnicas de separación molecular y cromatográficas . La fructosiltransferasa es producida por Aureobasidium pullulans mediante fermentación sumergida en un medio adecuado, durante 72 horas. En esta invención, la enzima no se aisló del organismo sino que se utilizaron las células completas para realizar la catálisis. En esta invención, las células microbianas de preferencia se separan del medio liquido por centrifugación y se lavan con agua desmineralizada. Sin embargo, es factible que las células se usen después de alcanzar una fase critica de crecimiento que produzca una biomasa suficiente para llevar a cabo la reacción transíructosilo, con el medio residual tal cual sin separación como medio para disolver el donador y también el receptor de la reacción transfructosilo y los productos de la reacción aislados y purificados después de que la reacción termina. La masa celular microbiana se suspende directamente en el medio de reacción que contiene sacarosa y glucosa-6-acetato en una solución amortiguadora. De preferencia, la relación de sacarosa y glucosa-6-acetato para la reacción es 2:0.5. La reacción se mantiene en agitación y la formación de sacarosa-6-acetato se monitorea por HPLC. Se adicionan a la reacción aditivos apropiados, que incluyen entre otros, inhibidores de invertasa también incluyen Conduritol-B-epóxido, trestatina, y los similar, para evitar reacciones secundarias que pudieran afectar la formación del producto deseado. En cuanto se obtiene la concentración apropiada de sacarosa-6-acetato, la agitación se detiene y la mezcla de reacción se filtra y se separa de las células microbianas. Luego, el filtrado que contiene sacarosa-6-acetato y otros sacáridos de mayor peso molecular, se somete a separación molecular. Aquí, el peso molecular superior a 500 daltons se separa mediante sistemas adecuados de separación por membrana. Los sacáridos de menor peso molecular se concentran. Se encontró que la pureza de la sacarosa-6-acetato obtenida fue de 60%. Se hizo otro paso más de purificación por cromatografía en sílice silanizada y agua como fase móvil. La reacción descrita en lo anterior se puede hacer en forma continua manteniendo constantes las relaciones proporcionales de sacarosa y glucosa-6-acetato para inducir la reacción en sentido positivo. También, las células microbianas separadas de la reacción se pueden reutilizar dependiendo de la actividad de la enzima. La masa de células microbianas también se puede inmovilizar por uno de los varios métodos de inmovilización de células completas conocidos en la técnica anterior. El método ilustrativo utilizado en la presente se adopta de Geri, B., Sassi, G., Specchia, V., Bosco, F. and Marzona, . , Proceso Biochem. , 1991, 21, 331-335. La sacarosa-6-acetato purificada se utiliza para cloración en la preparación de TGS. En lo siguiente, se describen ejemplos que ilustran la práctica de esta invención sin limitar su alcance en ninguna forma. Los reactivos, la proporción de los reactivos utilizados, el intervalo de las condiciones de reacción descritos son sólo de carácter ilustrativo y el alcance se extiende a sus reactivos análogos, condiciones de reacción y reacciones de análogos genéricos. En general, cualquier alternativa equivalente que sea obvia para una persona experta en la técnica de la producción de sacarosa clorada, queda cubierta dentro del alcance de esta especificación. De este modo, la mención de un acetato cubre cualquier grupo acilo equivalente que pueda realizar la misma función, y el uso de una glucosa sustituida cubrirá cualquier aldosa sustituida que de el mismo tipo de reacciones análogas en condiciones de reacción análogas. Otras varias adaptaciones de las modalidades serán fácilmente previstas por los expertos en la técnica y también quedan incluidas dentro del alcance de esta especificación. La expresión en singular cubre también su plural, a menos que el contexto no lo permita asi, por ejemplo: uso de "un solvente orgánico" para extracción cubre el uso de uno o más solventes orgánicos en forma sucesiva o en combinación como mezcla.

EJEMPLO 1 Cultivo de células de Aureobasidium para biocatálisis En un experimento, un cultivo puro de Aureobasidium obtenido de ATCC No. 9348 se desarrolló en matraces de agitación de 200 mi inoculando un asa llena de cultivo del agar inclinado (slant) . El medio de cultivo que tenia un nivel óptimo de carbono y nitrógeno se preparó utilizando "Maida" (harina de trigo refinada fabricada en India) , harina de soya, extracto de levadura, fosfatos y cloruros. El cultivo se desarrolló durante un periodo de 48 horas en un agitador rotatorio a 200 RPM. Las células bien desarrolladas se transfirieron a un cultivo para una segunda etapa de crecimiento que se mantuvo durante 120 horas. El caldo obtenido después de 120 h se centrifugó a 8000 RPM y las células se separaron. Las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora para eliminar todos los componentes del medio que se pegaron a las células. Las células se congelaron y liofilizaron y se conservaron asi hasta que se utilizaron. 52-495 EJEMPLO 2 Conversión de glucosa-6-acetato a sacarosa-6-acetato por medio de células Aureobasidium Se utilizaron lOOg de glucosa-6-acetato y 380 g de para la reacción. Los reactivos se disolvieron en 1.2 L de amortiguador de acetato se sodio a pH 6.5 - 7.0. La solución se mantuvo en agitación. 250g de células de Aureobasidium liofilizadas se suspendieron en la solución y la temperatura se elevó ligeramente hasta 35°C. Se adicionaron 0.25g de trestatina a la masa de reacción para inhibir la actividad de la invertasa. La formación de sacarosa-6-acetato se monitoreó por HPLC. Después de un tiempo de reacción de 90 horas, se registró la formación de 45 g de sacarosa-6-acetato en la mezcla de reacción. La reacción continuó hasta 120 horas y se logró una conversión de hasta 45% de la glucosa-e-acetato adicionada para este fin. Los contenidos de la reacción se filtraron para eliminar las células suspendidas y luego se utilizaron para aislar la sacarosa-6-acetato por separación con osmosis inversa. La membrana RO separó todos los compuestos de bajo peso molecular como glucosa y fructosa y se retuvieron los compuestos de mayor peso molecular. Luego, los compuestos retenidos se volvieron a diluir con un volumen de agua equivalente a 1:5 veces y se sometieron a nanofiltración 52-495 hasta un limite de peso molecular de 500 daltons y se recolectó el permeato que consistía principalmente de sacarosa-6-acetato y otros compuestos en el intervalo de peso molecular de 350 -400 daltons. Estos compuestos se sometieron otra vez a filtración en RO para concentrarlos a una concentración mayor de 20%. Aquí, la pureza de la sacarosa-6-acetato era aproximadamente de 85% y entonces se pasó por una columna de gel de sílice silanizada. La fase móvil utilizada fue amortiguador de acetato a pH 9.0 -9.5 y se separaron las fracciones puras de sacarosa-6-acetato y se sometieron a concentración adicional y a eliminación del agua. Al término de la etapa de eliminación del agua, la sacarosa-6-acetato se disolvió en DMF y se utilizó para cloración. La sacarosa-6-acetato aislada con 90% de pureza se utilizó para la preparación de TGS.

EJEMPLO 3 Conversión de glucosa-6-acetato a sacarosa-6-acetato mediante células Aureobasidium inmovilizadas en Eudragit RL 100 (copolimero de resina acrilica) Las células de Aureobasidium se inmovilizaron en Eudragit RL100 según el método descrito a continuación. 350 g de células Aureobasidium separadas después de centrifugación se incorporaron en 350 g de alginato de 52-495 sodio mezclándolas y extruyendo la mezcla en forma de miniesferas. Estas miniesferas se recubrieron con Eudragit RL 100 un copolimero de resina poliacrílica. Se utilizaron 100 g de glucosa-6-acetato y 380 g de sacarosa para la reacción. Los reactivos se disolvieron en 1.2 L de amortiguador de acetato de sodio a pH 6.5 -7.0. La solución se mantuvo en agitación. Se adicionaron a la solución 175 g de células Aureobasidium inmovilizadas en Eudragit RL100 y la temperatura se elevó ligeramente a 45°C. La formación de la sacarosa-6-acetato se monitoreó por HPLC. Después de un tiempo de reacción de 75 horas, se registró la formación de 52 g de sacarosa-6-acetato en la mezcla de reacción. La reacción continuó hasta completar 100 horas y se logró una conversión de 62 g de sacarosa-6-acetato, 32% de la sacarosa inicial. Los contenidos de la reacción se filtraron para eliminar las células suspendidas y luego se utilizaron para aislar la sacarosa-6-acetato por separación con osmosis inversa. La membrana RO separó todos los compuestos de bajo peso molecular como glucosa y fructosa y se retuvieron los compuestos de mayor peso molecular. Luego, los compuestos retenidos se volvieron a diluir con un volumen de agua equivalente a 1:5 veces y se sometieron a nanofiltración hasta un límite de peso molecular de 500 daltons y se 52-495 recolectó el permeato que consistía principalmente de sacarosa-6-acetato y otros compuestos en el intervalo de peso molecular de 350 -400 daltons. Aquí, la pureza de la sacarosa-6-acetato era aproximadamente de 85% y entonces se pasó por una columna de gel de sílice silanizada. La fase móvil utilizada fue amortiguador de acetato a pH 9.0-9.5, se separaron las fracciones puras de sacarosa-6-acetato y se sometieron a concentración adicional y a eliminación del agua. Al término de la etapa de eliminación del agua, la sacarosa-6-acetato se disolvió en D F y se utilizó para cloración. La sacarosa-6-acetato aislada con 92% de pureza se utilizó para la preparación de TGS.

EJEMPLO 4 Cloración de sacarosa-6-acetato con reactivo Vilsmeier para producir TGS En un matraz de reacción de 3 L, se vertieron 275 mi de dimetilformamida y se enfriaron a 0 - 5°C, luego se adicionaron 158 g de pentacloruro de fósforo lentamente y con agitación para formar un reactivo de Vilsmeier, la temperatura de la masa de reacción se mantuvo por debajo de 30°C. Después, la masa se enfrió hasta una temperatura inferior a 0°C y la sacarosa-6-acetato preparada en el Ejemplo 1 se adicionó lentamente a una temperatura de 0 a 52-495 5°C. Luego, la mezcla de reacción se calentó a 80°C y durante 1 hora, después se calentó a 100°C durante 6 horas y por último a 110 - 115°C durante 2 a 3 horas. El avance de la reacción se monitoreó por análisis con HPLC. Luego, la mezcla de reacción se enfrió a una temperatura entre -5 y - 8°C y lentamente se adicionó una solución al 20% de hidróxido de sodio para cambiar el pH de la masa a 5.5 - 6.5. Esto se hace para conservar el producto en forma de acetato, lo cual facilita la partición del producto deseado en los solventes orgánicos. El rendimiento obtenido por este método fue de 42.3% con respecto a la sacarosa-6-acetato inicial.

EJEMPLO 5 Conversión de glucosa-6-benzoato a sacarosa-6-benzoato mediante células de Aureobasidium inmovilizadas en Eudragit RL 100 (copolimero de resina acrilica) Se preparó una solución al 3% de (600 mi) de glucosa-6-benzoato en amortiguador de acetato de sodio pH 6.5. Esta solución se bombeó, utilizando una bomba peristáltica, a una columna (2cm diámetro X 8cm alto) empacada con 12 g de Eudragit RL 100 que contenia células de Aureobasidium. La salida de la columna se recicló al matraz de alimentación. La velocidad de flujo se mantuvo a 5 ml/min. Se adicionaron 60g de sacarosa al matraz de 52-495 alimentación se disolvieron y se mantuvieron en agitación constante . La reacción continuó durante 3ß horas y se hizo análisis periódico de la conversión de glucosa-6-benzoato a sacarosa-6-benzoato y también de la formación de otras impurezas. Al término de las 36 horas, se habían formado 1.2 g de sacarosa-6-benzoato y la reacción se detuvo. Se encontró que la glucosa-6-benzoato estimada en la solución era menor de 1% por lo que se aumentó hasta 3% mediante la adición de glucosa-6-benzoato nueva. El pH también se ajustó a 6.5 y la reacción se dejó continuar. Esto otra vez dio como resultado una conversión de 3.6 g de sacarosa-e-benzoato al término de 72 horas. 52-495

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES : 1. Un proceso de producción de un éster de un fructosil disacárido o su derivado a partir de un fructosil disacárido, que comprende: a. poner en contacto el fructosil disacárido con el correspondiente éster de una aldosa o el correspondiente éster de un derivado de una aldosa en presencia de la biomasa de un microorganismo productor de fructosiltranferasa, para producir el éster del fructosil disacárido o su derivado, y b. aislar el éster del fructosil disacárido o su derivado. 2. Un proceso según la reivindicación 1, en donde : a. el derivado de fructosil disacárido comprende uno o más ésteres que incluyen sacarosa-6-acetato, sacarosa-6-benzoato, 6-O-metil sacarosa, 6-deoxisacarosa, galactosacarosa, xilsacarosa, sacarosa-6-glutarato, sacarosa-6-propionato, sacarosa-6-laurato, y lo similar, b. el fructosil disacárido comprende uno o más entre sacarosa, rafinosa o estaquiosa, c. el éster de una aldosa o el correspondiente éster de un derivado de una aldosa constituida por una o más entre glucosa, galactosa, glucosa-6-acetato, glucosa-6- 52-495 benzoato, sacarosa-6-butirato, sacarosa-6-glutarato, sacarosa-6-laurato, sacarosa-6-propionato, sacarosa-6-benzoato y lo similar, d. el asilamiento del fructosil disacárido se logra por uno o más métodos o una combinación de un método de aislamiento y purificación que incluyen filtración, osmosis inversa, nanofiltración, cromatografía en columna y lo similar. 3. Un proceso según la reivindicación 2, en donde el microorganismo comprende uno o más microorganismos productores de fructosiltransferasa que incluyen Aureobasidium pullulans , Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi , Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii , Sachharomyces , Bacillus subtilis, Erwinia y lo similar. 4. Un proceso según la reivindicación 3, en donde la biomasa de células completas de Arabidopsis pullulans se prepara por: a. subcultivos sucesivos de un cultivo puro en un medio líquido que contiene suficientes nutrientes para estimular un rápido crecimiento, b. separar las células del medio mediante uno o más métodos de separación, de preferencia por centrifugación, 52-495 c. de preferencia, lavar las células y eliminar el medio que pudieran contener, d. utilizar tal cual la masa de células completas para la catálisis o después de refinarla o después de un paso de conservación que incluye la liofilización . 5. Un proceso según la reivindicación 4, en donde la biomasa de las células completas se usa en forma libre o inmovilizada en uno o más soportes sólidos. 6. Un proceso según la reivindicación 5 para la preparación de sacarosa-6-O-protegida, de preferencia sacarosa-6-acetato o sacarosa-6-benzoato, que consta de los siguientes pasos: a. poner en contacto sacarosa y glucosa-6-?-protegida, de preferencia glucosa-6-acetato o glucosa-6-benzoato, también, de preferencia, acompañada con agitación, en presencia de biomasa liofilizada de Aureobasidium pullulans en forma libre o inmovilizada mediante un método de inmovilización que incluye la inmovilización en forma de miniesferas de alginato recubiertas con Eudragit RL 100, un copolimero de resina acrilica, b. eliminar las células de la biomasa, libres o inmovilizadas, mediante un método de separación, de preferencia por filtración, y 52-495 c. someter la mezcla de proceso al aislamiento de la sacarosa-6-0-protegida formada. 7. Un proceso según la reivindicación 5 para la preparación de sacarosa-6-0-protegida, de preferencia sacarosa-6-acetato o sacarosa-6-benzoato, que consta de los siguientes pasos: a. empacar en una columna la biomasa de Aureobasidium pullulans inmovilizada en un soporte sólido, y b. pasar repetidamente una solución de sacarosa y glucosa-6-O-protegida para formar sacarosa-6-O-protegida, y c. separar la sacarosa-6-O-protegida de la mezcla de proceso. 8. Un proceso según las reivindicaciones 6 ó 7, que consiste en, a. someter la mezcla de proceso que contiene la sacarosa-6-O-protegida a osmosis inversa para eliminar uno o más componentes de pesos moleculares bajos que incluyen glucosa, fructosa y lo similar y asi obtener un producto retenido que contiene la sacarosa-6-O-protegida e impurezas, b. someter el producto retenido a nanofiltración, de preferencia después de una dilución aproximada de 1:5, a un peso molecular limite de 500 daltons para obtener un a permeato que contiene predominantemente la sacarosa 6-O-protegida, 52-495 c. someter el permeato que contiene la sacarosa 6-0-protegida a osmosis inversa para concentrar el permeato hasta aproximadamente 20% o más de concentración, y d. someter el permeato concentrado a posterior purificación y aislamiento por cromatografía en columna. 9. Un proceso se cromatografía en columna según la reivindicación 8, en donde, el permeato concentrado: a. se pasa por una columna de gel de sílice silanizada, utilizando como fase móvil un amortiguador alcalino aproximadamente a un pH 9.0-9.5, de preferencia, un amortiguador de acetato, y b. separar la sacarosa-6-acetato como fracción pura . 52-495