CN103451125B - 一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法。一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011，保藏号为:CGMCC No.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址：中国科学院北京微生物研究所。以碳源、氮源、无机盐等有机营养素加以培养，得到反应液葡萄糖-6-乙酸酯；再经分离纯化后得到葡萄糖-6-乙酸酯。本发明所取得的技术进步在于：本发明与现有菌株ATCC10778相比，具有发酵时间短，工艺步骤简单，产量高，传代稳定性高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生化工程领域，具体是一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法。
背景技术
本发明涉及利用生物发酵制备用于生产三氯蔗糖的关键中间体葡萄糖-6-乙酸酯。葡萄糖-6-乙酸酯是生产4,1’,6’-三氯-4,1’,6’-三脱氧半乳蔗糖即三氯蔗糖的关键中间体。三氯蔗糖是蔗糖的氯衍生物，其甜度是蔗糖的600-800倍，其口感醇和、浓郁、稳定性能好、热量低，它可以和传统的甜味剂配合使用，也可以单独使用，其甜味口感不受影响，有利于消费者健康。葡萄糖-6-乙酸酯是合成三氯蔗糖的关键中间体。目前常用的葡萄糖-6-乙酸酯的生产方法是使用微生物发酵方法所得,所用菌种为ATCC10778,但该菌种产量不高、发酵时间长且传代稳定性差,不适于大规模工业化生产。
发明内容
发明人为克服现有技术存在的发酵时间长达120h，最大产量仅为15g/L，且传代6代后产量降为4.8g/L等缺点，进行了广泛的研究。提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.GXU-011）新菌种，该菌具有发酵时间短，产量高，传代稳定性高的优点。使用该菌作为发酵菌种发酵葡萄糖-6-乙酸酯，发酵时间仅为72h，最大产量达到31.71g/L，且传代稳定性高，分离纯化后纯度达92%以上，更适合于工业生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011，保藏号为:CGMCC No.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址：中国科学院北京微生物研究所。
2.芽孢杆菌GXU-011菌落特征和生理生化特征为：细胞形态为直杆状，无孢子形成，革兰氏染色为阳性；平板培养基中30℃培养36h，菌落直径为2～3mm，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，淡黄色，表面光滑。通过电镜扫描如图1所示，可以看出菌株Bacillus sp.GXU-011无鞭毛，染色后未显示有荚膜存在。有接触酶反应；V-P实验阴性；能够利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸；明胶液化：缓慢；能够水解淀粉；能够利用柠檬酸盐；能够还原硝酸盐；不能利用丙二酸；最适生长温度为20～30℃。
3.芽孢杆菌GXU-011序列测定与系统发育树分析：
根据已知的16S rDNA上保守序列设计寡核苷酸引物：
FW：5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇，RV：5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇以GXU-011细菌基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增16S rDNA序列基因,16S rDNA的扩增反应程序：PCR反应程序设定为：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环30个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。
扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果正确则使用PCR产物纯化试剂盒纯化基因片段，再将其连入pMD18-T载体上，PCR验证后送出测序，所得到的测序结果与Genbank数据库中的序列进行比对，从而初步鉴定菌株种属。利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[Clustelx(1.81)]，采用邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法进行系统学分析(MEGA)，确定了菌株GXU-011与其它几株Bacillus sp.菌株的系统发育树，如图2所示，结果显示菌种GXU-011的16S rDNA基因序列与GenBank中许多芽孢杆菌（Bacillussp.)的16S rDNA基因序列的同源性在99％以上，所以将菌种GXU-011命名为芽孢杆菌GXU-011(Bacillus sp.)。
4.芽孢杆菌GXU-011,其特征在于所述的芽孢杆菌GXU-011的16SrDNA序列为：
1 tgcagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg ttagcggcgg acgggtgagt
61 aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg
121 gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga
181 tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcata
241 gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg
301 aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag
361 tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta cgagagtaac
421 tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc
481 ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg
541 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg
601 aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg
661 tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa
721 gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta
781 agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg
841 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag
901 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa
961 ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt
1021 cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt
1081 tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg
1141 gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg
1201 tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga
1261 ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc
1321 cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa
1381 cacccgaagt cggtggagta accgtaagga gctagccgcc taaggtggga cagatgattg
1441 gggtgaagt
5.芽孢杆菌GXU-011的培养方法，生产步骤如下：
1）将芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；工艺条件为pH6.5～7.5、温度25～35℃、培养时间24～36小时；
2）将斜面菌株扩大培养作为种子液，所述种子液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份；
3）将种子液接入发酵罐中进行发酵：
所述发酵液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份；
发酵的工艺条件为发酵液接种量为5%～10%，PH值为6.5～7.5，培养温度25～35℃，搅拌速率为150～200转/分钟，发酵时间为48～72小时，得到葡萄糖-6-乙酸酯反应液；
4）将葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤：
（1）将步骤3）葡萄糖-6-乙酸酯反应液经过硅胶柱进行分离纯化，所述硅胶柱为硅胶G柱；
（2）把经过步骤（1）的发酵液真空干燥，真空干燥度为0.1Mpa，温度为65℃，即得淡黄色粉末纯度为92%的葡萄糖-6-乙酸酯。
葡萄糖-6-乙酸酯的分析方法为高效液相色谱法（HPLC），高效液相色谱仪Waters600E，自动进样器Waters717，ELSD2000ES型蒸发光散射检测器。HPLC条件如下，色谱柱：Hypersil NH2，5um；柱温：25℃；流动相V(水)：V(乙腈)=25:75；流速为1mL/min；检测器：ELSD alltech奥泰蒸发光散射检测器；进样量：10uL。检测结果如图3所示。
本发明所取得的技术进步在于：
本发明是通过芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011菌株发酵生产葡萄糖-6-乙酸酯，与现有菌株ATCC10778相比，具有发酵时间短，产量高，传代稳定性高的优点，降低了生产成本，发酵过程中不产生有害物质，工艺步骤简单。采用本发明生产的葡萄糖-6-乙酸酯产量高，每升反应液中含葡萄糖-6-乙酸酯25-32g，通过硅胶分离纯化，纯度可达92%以上，回收率达到80%，以上具有重大工业化意义。
附图说明
图1是本发明芽孢杆菌GXU-011的透射电镜照片。
图2是本发明芽孢杆菌GXU-011的系统发育树图。
图3是本发明芽孢杆菌GXU-011发酵产g-6-a标准品的高相液相谱图。
图4是本发明芽孢杆菌GXU-011发酵液的HPLC谱图。
图5是本发明芽孢杆菌GXU-011发酵液分离纯化后的HPLC谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
生产葡萄糖-6-乙酸酯的发酵分离方法步骤如下：
（1）菌种斜面培养
将芽胞杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由以下重量份组分组成：
蔗糖40g，酵母粉2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，，琼脂粉15g和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.5、温度28℃、培养时间24小时。
（2）接种发酵
将斜面菌种扩大培养为种子液；
将种子液按5%的接种量接入发酵罐中进行发酵；
其中种子液和发酵液由以下重量份组分组成：
葡萄糖40份、蛋白胨5份、酵母粉5份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钾1份，硫酸镁0.5份和水1000份
发酵的工艺条件为发酵液接种量为5%，PH值为6.5，培养温度28℃，搅拌速率为180转/分钟，发酵时间为60小时，得到葡萄糖-6-乙酸酯浓度30.23g/L。
（3）葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤：
a、步骤中的为硅胶柱。
b、步骤中的真空干燥度为0.1Mpa，温度为65℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达90%，回收率78%
（4）葡萄糖-6-乙酸酯的测定方法
选取发酵液。10000rpm离心10min,取上清，使用高效液相色谱仪进行分析。通过得到的葡萄糖-6-乙酸酯的峰面积与葡萄糖-6-乙酸酯标准品的标准曲线对比得到发酵液中葡萄糖-6-乙酸酯的浓度。检测结果见图3、4。
选取分离纯化后的葡萄糖-6-乙酸酯，加一定量的双蒸水配成溶液，使用高效液相色谱仪进行分析，得到分离纯化后葡萄糖-6-乙酸酯的纯度与回收率。检测结果见图5。
HPLC条件如下，色谱柱：Hypersil NH2，5um；柱温：25℃；流动相V(水)：V(乙腈)=25:75；流速为1mL/min；检测器：ELSD alltech奥泰蒸发光散射检测器；进样量：10uL。
实施例2
生产葡萄糖-6-乙酸酯的发酵分离方法步骤如下：
（1）菌种斜面培养
将芽胞杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由以下重量份组分组成：
蔗糖50g，酵母粉6g，KH2PO42g，K2HPO42g，MgSO42g，，琼脂粉20g和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度30℃、培养时间30小时。
（2）接种发酵
将斜面菌种扩大培养为种子液；
将种子液按8%的接种量接入发酵罐中进行发酵；
其中种子液和发酵液由以下重量份组分组成：
葡萄糖50份、蛋白胨8份、酵母粉8份、磷酸氢二钾1.5份、磷酸二氢钾1.5份，硫酸镁1份和水1000份。
发酵的工艺条件为发酵液接种量为8%，pH值为7.0，培养温度28℃，搅拌速率为200转/分钟，发酵时间为72小时，得到葡萄糖-6-乙酸酯浓度29.75g/L。
（3）葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤：
a.步骤中的为硅胶柱。
b.步骤中的真空干燥度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达92%，回收率81%。
（4）葡萄糖-6-乙酸酯的测定方法同实施例1。
实施例3
生产葡萄糖-6-乙酸酯的发酵分离方法步骤如下：
（1）菌种斜面培养
将芽胞杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由以下重量份组分组成：
蔗糖60g，酵母粉8g，KH2PO41.5g，K2HPO41.5g，MgSO41.5g，，琼脂粉25g和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.5、温度32℃、培养时间36小时。
（2）接种发酵
将斜面菌种扩大培养为种子液；
将种子液按10%的接种量接入发酵罐中进行发酵；
其中种子液和发酵液由以下重量份组分组成：
葡萄糖60份、蛋白胨8份、酵母粉9份、磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钾2份，硫酸镁1.5份和水1000份
发酵的工艺条件为发酵液接种量为10%，pH值为7.5，培养温度32℃，搅拌速率为190转/分钟，发酵时间为72小时，得到的葡萄糖-6-乙酸酯为31.42g/L。
（3）葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤：
a、步骤中的为硅胶柱。
b、步骤中的真空干燥度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达92%，回收率82%
（4）葡萄糖-6-乙酸酯的测定方法同实施例1。
Claims (2)
1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-011，保藏号为:CGMCC No.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址：中国科学院北京微生物研究所。
2.如权利要求1的芽孢杆菌GXU-011的培养方法，其特征在于：用权利要求1所述的芽孢杆菌GXU-011生产葡萄糖-6-乙酸酯，生产步骤如下：
1)将芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；工艺条件为pH 6.5～7.5、温度25～35℃、培养时间24～36小时；
2)将斜面菌株扩大培养作为种子液，所述种子液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份；
3)将种子液接入发酵罐中进行发酵：
所述发酵液由以下重量份组分组成：葡萄糖20～60份、酵母粉1～4份、氯化钾0.5～2份、碳酸钙0.5～2份、磷酸氢二钾2～6份、磷酸二氢钾2～6份、硫酸镁2～6份和水1000份；
发酵的工艺条件为发酵液接种量为5％～10％，pH值为6.5～7.5，培养温度25～35℃，搅拌速率为150～200转/分钟，发酵时间为48～72小时，得到葡萄糖-6-乙酸酯反应液；
4)将葡萄糖-6-乙酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤：
(1)将步骤3)葡萄糖-6-乙酸酯反应液经过硅胶柱进行分离纯化，所述硅胶柱为硅胶G柱；
(2)把经过步骤(1)的发酵液真空干燥，真空干燥度为0.1Mpa，温度为65℃，即得淡黄色粉末纯度为92％的葡萄糖-6-乙酸酯。
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